JP4431334B2 - 改良されたａｔｐの増幅方法およびその利用 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＡＴＰの増幅方法および該方法を用いて微生物の存在を迅速に検出する方法、並びのそのためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
迅速かつ高感度で微生物を検出する方法は、例えば、食中毒予防のための食品製造工場における微生物の検出などの環境微生物の制御、食品（例えば、ミルクなどの乳製品）における微生物の混入の検査など、食品業界、酪農業界などにおいて非常に重要である。従来の栄養培地を用いて生細胞を検出する方法においては、生存微生物をカウントするまでに数日を要する。
【０００３】
このような微生物の検出に、全ての生物に存在するＡＴＰを利用する方法が検討されている。ＡＴＰを検出する方法として、ホタルルシフェラーゼを用いる生物発光アッセイが知られている。この方法は、ＡＴＰを測定する確立された方法であり（非特許文献１参照）、迅速な衛生学的なモニタリングとして用いられている（非特許文献２）。さらに、最近ではバイオテロに対する対抗技術として、ＡＴＰアッセイが提案されている（非特許文献３）。
【０００４】
しかし、従来のＡＴＰのアッセイ法には検出限界（例えば、約１０４大腸菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）／アッセイ）がある。この感度では、工業的な応用には充分な感度とはいえない。
【０００５】
コンピューターシュミレーションでは、アデニレートキナーゼ（ＡＤＫ）およびピルビン酸キナーゼ（ＰＶＫ）を用いるＡＴＰ増幅は、高感度の光度計を用いなくとも、非常に低いレベルのＡＴＰを検出し得る可能性があることが示唆されている（非特許文献４）。しかし、この方法は、実際に行われていない。
【０００６】
微量のＡＴＰをアッセイするために、ＡＴＰを増幅させる方法が提案されている（特許文献１）。この特許文献１に示される方法を図１で説明する。図１において、ＡＤＫはアデニレートキナーゼ（adenylate kinase）、ｐｏｌｙＰはポリリン酸（polyphosphate）、ＰＰＫはポリリン酸キナーゼ（polyphospate kinase）を意味する。以下、本明細書においても、この略号を使用するときがある。図１ａは、ＡＴＰの非存在下では、理論的には、ＡＭＰとポリリン酸とからはＡＴＰが生成しないことを示している。図１ｂに示すように、ＡＴＰが存在すると、ＡＤＫによって、ＡＴＰからＡＭＰへのリン酸基転移反応が起こり、２分子のＡＤＰが生成する（第１反応）。この第１反応で生じた２分子のＡＤＰは、ＰＰＫの作用により、ポリリン酸からリン酸基を受け取り、２分子のＡＴＰを生じる（第２反応）。この第２反応で生じた２分子のＡＴＰは、再度、第１反応に使用され、４分子のＡＤＰを生成し、この４分子のＡＤＰはＰＰＫによって４分子のＡＴＰに変換される。
【０００７】
このように、特許文献１では、過剰のＡＭＰとポリリン酸を存在させて、ＡＤＫとＰＰＫの平衡状態をそれぞれ、ＡＤＰ生成方向（第１反応）およびＡＴＰ生成方向（第２反応）に向かわせるようにし、第１反応と第２反応を１つの反応系として、ｎ回この反応系を繰り返すことにより、１個のＡＴＰが２ｎ個に増幅される。従って、この方法は、優れたＡＴＰの増幅方法である。
【０００８】
この特許文献１の方法は、従来のレベルよりも高い感度で、細胞の存在を検出し得る点では優れた方法であるが、この方法では、理論的には起こらないＡＴＰ非存在下でのＡＴＰの増幅が、低いレベルであるが、時折見られることが判明し、外因性の（外部から添加した）ＡＴＰのみを増幅し、検出するという確実性に欠けるという問題がある。すなわち、細胞１個のレベルのＡＴＰを増幅し、検出し得るまでの感度を確実に提供できないという問題がある。さらに、ＡＤＫとＰＰＫとの活性の調整などの問題もある。
【０００９】
【特許文献１】
特開２００１−２９９３９０号公報
【非特許文献１】
デルカおよびマッケルロイ（DeLuca, M. and W. D. McElroy. ）「Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions」 Biochemistry ２６巻、９２１−９２５頁（１９７４年）
【非特許文献２】
バウティスタ（Bautista, D. A.）ら、「Adenosine triphosphate bioluminescence as a method to determine microbial levels in scald and chill tanks at a poultry abattoir」 Poult. Sci. ７３巻、１６７３−１６７８頁（１９９４年）
【非特許文献３】
スペンサーおよびライトフット（Spencer, R. C. and N. F. Lightfoot） 「Preparedness and response to bioterrorism」 J. Infect. ４３巻１０４−１１０頁（２００１年）
【非特許文献４】
チトック（Chittock, R. S.）ら、「Kinetic aspects of ATP amplification reactions」 Anal. Biochem ２５５巻、１２０−１２６頁（１９９８）
【非特許文献５】
アキヤマ（Akiyama, M.）ら、「The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein」 J. Biol. Chem. ２６７巻、２２５５６−２２５６１頁（１９９２年）
【非特許文献６】
ブルーン（Brune, M.）ら、「Cloning and sequencing of the adenylate kinase gene (adk) of Escherichia coli」 Nucleic Acids Res. １３巻、７１３９−７１５１頁（１９８５年）
【非特許文献７】
ニューハード Ｊ、およびＹ．ニガード（Neuhard, J., and Y. Nygaard） 「Purines and pyrimidines」 ４４５−４７３頁、ネイドハルト（F. C. Neidhardt）ら編、 Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, ASM press, Washington, D. C. （１９８７年）
【非特許文献８】
ネイドハルト（F. C. Neidhardt） 「Chemical composition of Escherichia coli」 ３−６頁、ネイドハルト（F. C. Neidhardt）ら編、 Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology」 ASM press, Washington, D. C.（１９８７年）
【非特許文献９】
ベルト（Bert, F.）ら、「Multi-resistant Pseudomonas aeruginosa outbreak associated with contaminated tap water in a neurosurgery intensive care unit」 J. Hosp. Infect. ３９巻、５３−６２頁（１９９８年）
【非特許文献１０】
オルソン（Olsson, T.）ら、「Extraction and determination of adenosine 5'-triphosphate in bovine milk by the firefly luciferase assay. Biotech」 Appl. Biochem ８巻、３６１−３６９頁（１９８６）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、外因性のＡＴＰの効率的な増幅方法が望まれており、特に、外因性のＡＴＰのみを増幅させる方法およびこの方法を用いて１個の細胞の存在を検出し得る高感度の検出方法が望まれている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決することを目的として行われたものであり、本発明のＡＴＰ増幅方法により、極微量のＡＴＰが検出され、さらに、１個の細胞の存在さえも検出し得る。
【００１２】
本発明は、ＡＴＰ、ＡＭＰおよびポリリン酸化合物を含有する混合物に、ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質を作用させる工程を含む、ＡＴＰの増幅方法を提供する。
【００１３】
好ましい実施態様においては、前記ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質が、ＡＤＰを含まない融合タンパク質である。
【００１４】
また、本発明は、ＡＴＰ、ＡＭＰおよびポリリン酸化合物を含有する混合物に、ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質を作用させて、ＡＴＰを増幅する工程；および、該増幅したＡＴＰを検出する工程；を包含するＡＴＰの検出方法を提供する。
【００１５】
好ましい実施態様においては、前記ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質が、ＡＤＰを含まない融合タンパク質である。
【００１６】
さらに、本発明は、微生物の存在を迅速に検出する方法であって、微生物含有試料を処理して、ＡＴＰ含有試料を調製する工程；該ＡＴＰ含有試料をＡＴＰ増幅系に添加してＡＴＰを増幅する工程；および、該増幅したＡＴＰを検出する工程；を包含し、該ＡＴＰ増幅系がＡＭＰ、ポリリン酸化合物、およびＡＤＰを含まないポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質を含む方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、微生物の存在を迅速に検出するためのキットであって、ＡＭＰ、ポリリン酸化合物、およびＡＤＰを含まないポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質、を含有するＡＴＰ増幅試薬と、ＡＴＰを検出するＡＴＰ検出試薬を包含するキットを提供する。
【００１８】
好ましい実施態様においては、さらに細胞溶解用試薬を備えるキットである。
【００１９】
本発明は、さらに、ＡＴＰ、ＡＭＰ、およびポリリン酸化合物の混合物に、アデニレートキナーゼ、およびＡＤＰを含まないポリリン酸キナーゼを作用させてＡＴＰを増幅する方法を提供する。
【００２０】
また、本発明は、ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質、並びに、ＡＤＰを含まないポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質を提供する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
（融合タンパク質）
本発明に用いられるポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質（以下、ＰＰＫ−ＡＤＫということがある）は、ＰＰＫ活性およびＡＤＫ活性を有していれば、結合状態に特に制限はない。Ｎ末端側にＰＰＫを、Ｃ末端側にＡＤＫを含む融合タンパク質であることが好ましい。この融合蛋白質は、ＰＰＫとＡＤＫとが直接結合されていてもよいが、スペーサーを介して結合されていてもよい。また、融合タンパク質のＣ末端には、それぞれの酵素の発現に影響を与えないタグを付着させることが、融合タンパク質の精製に有用である。
【００２２】
ＰＰＫをコードする遺伝子ｐｐｋおよびＡＤＫをコードする遺伝子ａｄｋは、これらの遺伝子配列が特定されていれば、その由来に特に制限はない。大腸菌の配列が好ましく用いられる。これらの遺伝子配列に基づいて適切なプライマーを調製し、ＰＣＲを行うことにより、それぞれの遺伝子配列を得ることができる。
【００２３】
ｐｐｋ遺伝子を調製するための適切なプライマーとして、例えば、以下のプライマーの組合せが好ましい：（１）ｐｐｋ遺伝子の５’末端の上流に適切な制限酵素認識配列を導入するための配列を有するプライマー；および（２）スペーサー（例えば、グリシン）配列、およびスペーサー部位またはその下流に適切な制限酵素認識配列を導入するための配列を有するプライマー。この２つのプライマーをセットにしてＰＣＲを行うと、Ｃ末端にスペーサーを有するＰＰＫを発現するｐｐｋ遺伝子を含む断片が容易に回収される。
【００２４】
ａｄｋ遺伝子を調製するための適切なプライマーとしては、ｐｐｋ遺伝子と同様、以下のプライマーが好ましい：（１）ａｄｋ遺伝子の５’末端の上流に適切な制限酵素認識配列を導入するための配列を有するプライマー；および（２）Ｃ末端タグ（例えば、ヒスチジン）配列を有し、かつＣ末端タグの下流に適切な制限酵素認識配列を導入するための配列を有するプライマー。この２つのプライマーをセットにしてＰＣＲを行うと、Ｃ末端にタグを有するＡＤＫを発現するａｄｋ遺伝子を含む断片が容易に回収される。
【００２５】
上記プライマーの制限酵素は、ｐｐｋあるいはａｄｋの遺伝子配列、組込むベクターのクローニング部位を考慮して、決定すればよい。
【００２６】
大腸菌の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を、それぞれ、制限酵素で切断し、ｐｐｋ遺伝子を含む断片、およびａｄｋ遺伝子を含む断片を回収する。得られたそれぞれの遺伝子を含む断片を、ｐｐｋ−ａｄｋの順となるように適切なベクターに組み込むことにより、ＰＰＫ−ＡＤＫの融合タンパク質を発現する組換えベクターが得られる。
【００２７】
得られたベクターを適切な宿主（例えば、大腸菌）に導入し、組換えベクターを発現させることにより、ＰＰＫ−ＡＤＫ融合タンパク質が生産される。ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を有するように設計された融合タンパク質は、ハイトラップキレートカラム（Hitrap chelating column）を用いることにより、容易に精製、回収される。
【００２８】
得られた融合タンパク質であるＰＰＫ−ＡＤＫは、このまま、ＡＴＰ増幅反応に用いることができる。しかし、後述のように、外因性のＡＴＰのみを測定する場合、不都合があることが判明した。この原因として、ＡＤＰがＰＰＫと結合した状態で存在することが考えられる。このＰＰＫに結合しているＡＤＰは、ポリリン酸化合物の存在下、ＰＰＫの基質とされ得、このＡＤＰがＰＰＫによりＡＴＰに変換され得る。すなわち、図１に示すような反応系において、ＡＴＰ非存在下であっても、まず第２反応であるＡＤＰからＡＴＰへの反応が生じ、このＡＴＰが第１反応で使用されることにより、自動的にＡＴＰ増幅反応が開始すると考えられる。従って、外因性のＡＴＰのみを測定するためには、ＰＰＫに結合したＡＤＰを予め除去しておくことが必要である。
【００２９】
ＰＰＫに結合している不純物であるＡＤＰの除去は、例えば、アピラーゼ処理により行われる。アピラーゼは、ＡＴＰまたはＡＤＰからリン酸基を除去し、ＡＭＰを生成する。アピラーゼ処理は、適切な量のピロリン酸存在下で行うことが好ましい。ピロリン酸により、ＰＰＫ−ＡＤＫに結合したＡＤＰの遊離が促進され、ＡＤＰがアピラーゼによるアタックを受けやすくなる。アピラーゼ処理したＰＰＫ−ＡＤＫは、再び、ハイトラップキレートカラムを用いて、回収される。回収されたＰＰＫ−ＡＤＫは、アピラーゼ処理によっても、それぞれの活性（すなわち、ＰＰＫ活性およびＡＤＫ活性）を維持している。
【００３０】
（ＰＰＫ−ＡＤＫを用いるＡＴＰの増幅）
本発明のＰＰＫ−ＡＤＫを用いるＡＴＰの増幅は、ＡＴＰ、過剰のＡＭＰ、および過剰のポリリン酸化合物にＰＰＫ−ＡＤＫを作用させることによって行なわれる。すなわち、ＡＭＰ、ポリリン酸化合物およびＰＰＫ−ＡＤＰの混合物にＡＴＰを添加することにより、あるいは、ＡＴＰ、ＡＭＰ、およびポリリン酸化合物の混合物にＰＰＫ−ＡＤＫを添加することにより、行なわれる。反応形式は、図１と同じであり、図１に示す第１反応および第２反応が繰り返されて、ＡＴＰが増幅される。
【００３１】
ＡＴＰの増幅は、適切な緩衝液中で、適切な温度（例えば、３０〜４０℃）で、適切な時間（例えば、５分〜２時間）行われる。ＡＴＰの存在が微量と思われる場合は、１時間ほど増幅反応を行うことが好ましい。
【００３２】
なお、ポリリン酸化合物としては、ポリリン酸あるいはその塩が用いられる。好ましくは、１０〜１０００個、好ましくは１０〜１００個のリン酸が直鎖状に重合したものが好ましく用いられる。ポリリン酸は、バクテリア由来でもよく、化学合成で得られたものでもよい。あるいは、ポリリン酸合成酵素を用いてＡＴＰから合成してもよい。
【００３３】
（ＡＴＰの検出）
増幅されたＡＴＰの検出方法には、当業者が通常用いる方法が使用されるが、特に制限がない。一般には、ルシフェラーゼとＡＴＰとの反応による蛍光発光量を測定することにより行われる。例えば、市販のルシフェラーゼを用いるＡＴＰ測定キットが用いられる。
【００３４】
（微生物の存在を迅速に検出する方法）
この方法は、すべての生物の細胞にはＡＴＰが含まれることに着目して、微生物含有試料からＡＴＰを含む試料を調製し、上記ＡＴＰ増幅方法を用いて、ＡＴＰを増幅し、検出する方法である。ＡＤＰ除去処理を行ったＰＰＫ−ＡＤＫを用いることにより、外因性ＡＴＰのみを測定することが可能となる。例えば、１個の細胞に含まれるＡＴＰを測定可能なレベルまで増幅できることから、微生物の存在を検出することができる。従来の方法では、１アッセイあたり、１０４個のコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）の大腸菌が検出限界であったことを考慮すると、検出感度が少なくとも１０，０００倍に上昇する。
【００３５】
なお、微生物には、ＡＤＰも含まれる。ＡＤＰ除去処理を行ったＰＰＫ−ＡＤＫを用いる場合、本発明の増幅系にＡＤＰを加えると、ＡＤＰがＡＴＰに変換され、ＡＴＰ増幅反応が開始される。従って、微生物を検出するための前処理中にＡＴＰがＡＤＰに分解されても、本発明の感度に影響しない点で、本発明の増幅方法は優れている。以下、微生物の検出において、測定するＡＴＰの試料について言及するときは、試料中にＡＤＰが含まれる場合も意図する。
【００３６】
微生物含有試料からのＡＴＰ含有試料の調製方法には、特に制限はない。細胞を溶解してもよいが、その細胞に含まれるＰＰＫ、ＡＤＫなどの酵素の影響を考慮すると、加熱処理を行って、ＡＴＰを溶出させるか、細胞を溶解して、ＡＴＰを溶出させ、そして他の酵素を失活させる加熱処理を行う方法が最も好ましく用いられる。加熱処理は、例えば、１００℃、１〜５分行われる。細胞溶解処理は、例えば、市販のＡＴＰアッセイキットに附属しているような、溶解緩衝液を用いて、行うことができる。
【００３７】
このような、ＡＴＰ溶出処理を行って得られるＡＴＰを含むと思われる試料を、ＡＭＰ、ポリリン酸化合物およびＰＰＫ−ＡＤＫの混合物に添加して、ＡＴＰ増幅反応を行い、例えばルシフェラーゼを用いるＡＴＰ検出方法を用いて、ＡＴＰの存在を検出する。試料中にＡＴＰが含まれていれば、ルシフェラーゼと反応して蛍光が観察される。なお、ＡＴＰが増幅されているので、高感度の発光分析器は必ずしも要求されない。
【００３８】
本発明では、また、このような微生物の存在を迅速に検出するためのキットを提供する。すなわち、ＡＭＰ、ポリリン酸、およびＡＤＰを含まないＰＰＫ−ＡＤＫを含有するＡＴＰ増幅試薬と、ＡＴＰを検出するＡＴＰ検出試薬を包含するキットが提供される。このキットには、さらに、細胞溶解用試薬が含まれる。細胞溶解用試薬は、対象となる細胞（例えば、微生物、体細胞など）に応じて、その組成を変化させ得る。
【００３９】
微生物を含有すると思われる試料を加熱処理し、このキットのＡＴＰ増幅試薬に添加して、適切な時間、増幅反応を行い、ついで、ＡＴＰ検出試薬で、ＡＴＰの存在を確認することによって、微生物の存在が迅速に確認できる。この方法は、ＡＤＰ除去処理を行って得られたＰＰＫ−ＡＤＫを用いることによって、外因性のＡＴＰのみを検出できることが可能になったことにより、達成された。なお、ＡＴＰ検出試薬としては、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応系を用いる試薬が一般的であり、用語「ＡＴＰ検出試薬」は生物発光（蛍光）測定器をも含む概念で使用する。
【００４０】
（ＡＤＫおよびＡＤＰを含まないＰＰＫ用いるＡＴＰ増幅）
また、本発明は、ＡＴＰ、ＡＭＰ、およびポリリン酸を含む混合物に、ＡＤＫおよび、ＡＤＰを含まないＰＰＫを作用させてＡＴＰを増幅する方法をも提供する。ＡＤＰを含まないＰＰＫ遺伝子は、例えば、上記融合タンパク質の調製と同様の方法で調製される。簡潔に述べると、ｐｐｋ遺伝子の５’末端の上流に適切な制限酵素認識配列を有するプライマーと、Ｈｉｓタグ配列を有し、かつその下流に適切な制限酵素認識配列を有するプライマーとを用いて、Ｈｉｓ−タグを有するＰＰＫを発現するｐｐｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収する。得られたＤＮＡを適切なベクターに導入して組換えプラスミドを得、これを大腸菌に導入して、ＰＰＫを発現させる。ＰＰＫを、ハイトラップキレートカラムを用いて生成し、ピロリン酸存在下、アピラーゼ処理を行い、再びハイトラップキレートカラムにかけて、ＡＤＰを除去したＰＰＫを回収する。このＰＰＫを、図１に示す反応系に用いることにより、外因性ＡＴＰのみを増幅し、検出する方法が提供される。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されることはない。
【００４２】
この実施例において、ＡＭＰおよびＡＴＰは和光純薬（大阪）およびシグマから、それぞれ購入して用いた。ＡＭＰは、ＴＳＨゲルＳＡＸカラム（トーソー）を用いて０．２Ｍ ＫＣｌおよび１％ＥＤＴＡ（ｐＨ１０）を溶媒として用いて、さらに精製して用いた。ポリリン酸は、平均鎖長６５のポリリン酸（シグマ）を用いた。生物発光アッセイキット（ＣＬＳＩＩ）はルシフェリンとルシフェラーゼを含み、ロシュから購入して用いた。アピラーゼはシグマから購入して用いた。
【００４３】
（実施例１：ＰＰＫ−ＡＤＫの調製）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のポリリン酸キナーゼをコードする遺伝子（ｐｐｋ）（非特許文献４参照）を取得するためのプライマーは、以下の通りである：
GGATCTAGATGAATAAAACGGAGTAAAAGT（配列番号：１）、および
GGAGGATCCGCCGCCGCCGCCTTCAGGTTGTTCGAGTGATTT（配列番号：２）。
【００４４】
配列番号１のプライマーはｐｐｋ遺伝子の５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ認識配列を導入するための配列を有する。配列番号２は、４つのグリシンがＰＰＫのＣ末端に付着するように設計され、さらに３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を導入するための配列を有している。
【００４５】
大腸菌のアデニル酸キナーゼ遺伝子をコードする遺伝子（ａｄｋ）（非特許文献５）を取得するためのプライマーは、以下の通りである：
GGAGGATCCATGCGTATCATTCTGCTTGGC（配列番号：３）および
GGAAAGCTTGCCGAGGATTTTTTCCAG（配列番号：４）。
【００４６】
配列番号３のプライマーはａｄｋ遺伝子の５’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を導入するための配列を有する。配列番号４のプライマーは、Ｃ末端タグであるヒスチジンがＡＤＫのＣ末端に付着するように設計され、さらに３’末端側に制限酵素ＨｉｎｄIII認識配列を導入するための配列を有する。
【００４７】
大腸菌の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーを用いて、常法によりＰＣＲを行い、それぞれｐｐｋ遺伝子およびａｄｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。得られたｐｐｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭＴベクター(プロメガ)に導入し、ｐＧＥＭＴｐｐｋを得た。得られたａｄｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭＴベクター(プロメガ)に導入し、ｐＧＥＭＴａｄｋを得た。
【００４８】
ｐＧＥＭＴｐｐｋをＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ処理して得られた２．１ｋｂの断片、およびｐＧＥＭＴａｄｋをＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII処理して得られた０．６ｋｂ断片を、ｐＥＴベクター（ストラタジーン）のＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII消化物に連結させることによって、プラスミドｐＥＴｐｐｋａｄｋを構築した。このプラスミドは、ＰＰＫとＡＤＫとが４つのグリシンを介して結合され、Ｃ末端にＨｉｓタグを有するような融合タンパク質をコードする遺伝子を含有している。
【００４９】
このプラスミドｐＥＴｐｐｋａｄｋを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１）に導入し、得られた形質転換体を２時間培養し、ついで、１ｍＭのＩＰＴＧを生育培地に添加した。４時間培養後に、形質転換体を遠心分離して集め、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した。細胞をＢ−ＰＥＲ溶液 (ピアース)を用いて溶解し、ついで１ｍＭ ＰＭＳＦ存在下、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅで処理した。遠心分離により上清を得、０．２μｍのフィルターを用いて濾過し、ついで、ハイトラップキレートカラム（Hitrap chelating column） (Amersham Bioscience)にロードした。カラムを０．１Ｍ ピロリン酸、２０ｍＭ リン酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ イミダゾール、および２０％グリセロール（ｐＨ７．４）を用いて洗浄した。ＰＰＫ−ＡＤＫ融合タンパク質は、０．１Ｍ ピロリン酸、２０ｍＭ リン酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾールおよび２０％グリセロール（ｐＨ７．４）で溶出した。
【００５０】
得られたＰＰＫ−ＡＤＫ融合タンパク質は、ＡＤＫ（４３Ｕ／ｍｇ）およびＰＰＫ（３８Ｕ／ｍｇ）の活性を有しており、ＡＭＰとポリリン酸からＡＴＰを生成した。なお、１ユニットのＰＰＫは、３７℃で、ＡＤＰおよびポリリン酸から１．０μｍｏｌ／分のＡＴＰを合成する。１ユニットのＡＤＫは、３７℃で、ＡＤＰから１．０μｍｏｌ／分のＡＴＰを合成する。
【００５１】
０．１６μｇのＰＰＫ−ＡＤＫ、１０μＭ ＡＭＰ、４００μＭ ポリリン酸、８ｍＭ ＭｇＣｌ２および６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含む混合液５０μｌを調製し、５μｌの反応混液をサンプリングして、４０μｌのＡＴＰ生物発光アッセイ試薬（ロシュ）と混合し、直ちに、マルチプレート蛍光測定計（アルボ、ワラス）を用いて、発光を測定した。
【００５２】
図２のＰＰＫ−ＡＤＫに示すように、このＡＴＰを含まない反応系で、ＡＴＰの増幅が起こり、蛍光が観察された。この原因を検討したところ、ＡＤＰがＰＰＫに結合しており、このＡＤＰがＰＰＫに利用されて、最初に図１に示す第２反応が起こってＡＴＰが生成し、このＡＴＰが増幅された可能性が示唆された。
【００５３】
（実施例２：ＰＰＫ−ＡＤＫに結合したＡＤＰの除去）
実施例１で取得したＰＰＫ−ＡＤＫに結合している不純物のＡＤＰを除くために、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および８ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ ポリリン酸の存在下、１８０μｇのＰＰＫ−ＡＤＫとアピラーゼ（ａｐｙｒａｓｅ）（２００Ｕ）とを１時間反応させた。反応終了後、再度、ハイトラップキレートカラムを用いて、ＡＤＰが除去されたＰＰＫ−ＡＤＫを回収した。以下、このＰＰＫ−ＡＤＫを、アピラーゼ処理したＰＰＫ−ＡＤＫという。なお、１ユニットのアピラーゼは、ＡＴＰまたはＡＤＰから、３０℃で、１μｍｏｌのリン酸を遊離する。
【００５４】
０．１６μｇのアピラーゼ処理したＰＰＫ−ＡＤＫ、１０μＭ ＡＭＰ、４００μＭ ポリリン酸、８ｍＭ ＭｇＣｌ２および６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含む混合液５０μｌを調製し、５μｌの反応混液をサンプリングして、４０μｌのＡＴＰ生物発光アッセイ試薬（ロシュ）と混合し、直ちに、マルチプレート蛍光測定計（アルボ、ワラス）を用いて、発光を測定した。
【００５５】
図２に示すように、アピラーゼ処理したＰＰＫ−ＡＤＫを用いた反応では、６０分間反応させた後でも、蛍光が観察されなかった。なお、図示していないが、この混合液にＡＴＰを添加したところ、蛍光が観察された。このことから、アピラーゼ処理は、ＰＰＫ−ＡＤＫのＡＤＫ活性およびＰＰＫ活性に影響を与えないこと、およびアピラーゼ処理により不純物のＡＤＰが除去された結果、内因性のＡＴＰ増加が認められなかったことが判明した。従って、ＡＴＰ添加による蛍光の観察は、純粋に外因性のＡＴＰによると考えられる。従って、アピラーゼ処理した（ＡＤＫを含まない）ＰＰＫ−ＡＤＫは、外因性ＡＴＰのアッセイに極めて有用である。
【００５６】
なお、アピラーゼ処理に際して、ハイトラップキレートカラムへのＰＰＫ−ＡＤＫの吸着および同カラムからの溶出に際し、洗浄緩衝液および溶出緩衝液にピロリン酸を添加することが好ましい。０．１Ｍのピロリン酸は、ＰＰＫ−ＡＤＫからＡＤＰを遊離させる効果があり、ＡＤＰの除去をより効果的に行うことができる。
【００５７】
（実施例３：超高感度生物発光アッセイ）
０．１６μｇのアピラーゼ処理したＰＰＫ−ＡＤＫ、１０μＭ ＡＭＰ、４００μＭ ポリリン酸、８ｍＭ ＭｇＣｌ２および６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含む混合液４８μｌを調製し、ついで、２μｌのＡＴＰサンプルをこの混合液に添加し、ＡＴＰを増幅した。５μｌの反応混液を経時的にサンプリングして、４０μｌのＡＴＰ生物発光アッセイ試薬と混合し、直ちに、マルチプレート蛍光測定計を用いて、蛍光を測定した。なお、ＡＴＰの増幅を行わず（ＰＰＫ−ＡＤＫを添加せず）、そのまま、蛍光を測定したものを比較とした。蛍光値は、それぞれ異なった３回の測定の平均値±標準偏差を表す。蛍光の経時的増加を図３に、６０分後のＡＴＰ増幅の結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】
図３に示すように、アピラーゼ処理したＰＰＫ−ＡＤＫは、外因性のＡＴＰがないときは、６０分の増幅処理にもかかわらず、全くＡＴＰの増幅がないことがわかった。さらに、図３および表１に示すように、ＡＴＰの初期濃度が低いにもかかわらず、蛍光測定可能な程度まで増幅できることがわかった。この結果は、このＡＴＰ増幅反応が、超高感度生物発光アッセイに応用可能であることを示している。すなわち、０．００３３フェムトモル（ｆｍｏｌ：１０−１５ｍｏｌ＝３．３アトモル：１０−１８ｍｏｌ）濃度のＡＴＰを含む試料を、６０分間ＡＴＰ増幅処理を行うことにより、検出可能なレベルまで、ＡＴＰを増幅できることが示された。すなわち、数アトモル（ａｍｏｌ：１０−１８ｍｏｌ）濃度のＡＴＰが検出可能となった。これに対して、従来の生物発光は、数十フェムトモル（ｆｍｏｌ：１０−１５ｍｏｌ）のＡＴＰが、その発光を測定するために必要である（表１）。このように、本発明のＡＴＰ増幅法を用いることにより、生物発光の感度が、少なくとも１０，０００倍向上したことを示している。
【００６０】
（実施例４：単一微生物の検出における超高感度生物発光アッセイの応用）
大腸菌の培養液（２×１０９ＣＦＵ／ｍｌ）を、純水を用いて適切な濃度に希釈した。細胞懸濁液（５００μｌ）を溶解緩衝液５００μｌ（生物発光アッセイキット、ロシュ）に加えて、１００℃、２分間加熱して、細胞からＡＴＰを放出させた。加熱サンプル２μｌをＡＴＰ増幅アッセイにかけ、生物発光を測定した。
なお、ＡＴＰ増幅を行わず（ＰＰＫ−ＡＤＫを添加せず）、そのまま、蛍光を測定したものを比較とした。蛍光値は、それぞれ異なった３回の測定の平均値±標準偏差を表す。蛍光の経時的増加を図４に、６０分後のＡＴＰ増幅の結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】
表２および図４に示すように、アッセイに用いた大腸菌の数に依存して、蛍光量が変化した（図４）。表２に示すように、ＡＴＰ増幅を行わなかった場合に比べ、ＡＴＰ増幅を行った場合の蛍光発色は著しく増強された。ＡＴＰ増幅がない場合、表２の１０，０００ＣＦＵの場合でも蛍光発光の程度は極めて低く、有意な生物発光のレベルに達するには、数万ＣＦＵの大腸菌が必要であった。これに対して、本発明のＡＴＰ増幅技術を用いた場合、単一の大腸菌（１ＣＦＵの大腸菌のレベル）という、最も低レベルでも、明確な蛍光が観察された。このことは、ＡＴＰ増幅をしなかった場合に比べて、１０，０００倍以上の感度があることを示している。
【００６３】
大腸菌生細胞の細胞内ＡＴＰレベルは、約７μｍｏｌ／ｇ乾燥菌体と報告されている（非特許文献７）。大腸菌１個の乾燥重量は約２．８×１０−１３ｇである（非特許文献８）から、大腸菌は、細胞１個あたり、約２アトモルのＡＴＰを含有している。このレベルのＡＴＰは、この超高感度生物発光アッセイの検出限界の値とほとんど同じである。
【００６４】
（実施例５：衛生学上のモニタリングへの超高感度生物発光アッセイの応用）
本発明の方法が、大腸菌のスワブモニタリングに応用できるか否かについて検討した。大腸菌の細胞懸濁液をポリスチレン製ペトリ皿にひろげ、空気乾燥して市販の綿棒で拭き取った。市販の綿棒は有意な量のＡＴＰを含有しているので、予め１２１℃、７５分のオートクレーブ処理を行い、ＡＴＰをＡＭＰとリン酸に分解した。４ｃｍ２の表面積から拭き取ったサンプルを４００μｌの溶解緩衝液に浸漬し、ついで１００℃、２分間加熱した。加熱サンプル（１０μｌ）をＡＴＰ増幅反応溶液（４０μｌ）に添加し、６０分間、ＡＴＰ増幅反応を行った。そのうちの２５μｌを生物発光アッセイに用いた。結果を表３に示す。
【００６５】
【表３】
【００６６】
このスワブモニタリングにより、約１２大腸菌ＣＦＵ／ｃｍ２のレベルでの測定が可能となった。本発明の方法が大腸菌のスワブモニタリングに応用できることが判った。
【００６７】
（実施例６：飲料水中のバクテリアの検出）
本発明の方法が、飲料水中のバクテリアの検出に有効か否かを検討した。加熱した水サンプル（２μｌ）を、ＡＴＰ増幅反応溶液（５０μｌ）に添加し、６０分間、ＡＴＰ増幅反応を行った。表４に結果を示す。表４において、水道水（１）は、広島市の上水道から得られたものである。水道水（２）は、広島大学内で再生された水である。ボトル詰めの水は、市販品を購入した。滅菌水は、蒸留水をオートクレーブして、調製した。池水は、広島大学の池の水である。コロニー数（ＣＦＵ）は、１ｍｌの水のサンプルをニュートリエント寒天培地（１．６ｇのトリプトン、１ｇのイーストエキス、０．５ｇのＮａＣｌ、１５ｇの寒天、水１Ｌ）に塗布し、２８℃、３日間培養後、形成されたコロニーをカウントして、求めた。
【００６８】
【表４】
【００６９】
この結果は、従来の生物発光アッセイでは検出できないレベルでも、バクテリアが検出できたことを示している。表４の結果が示すように、本発明の方法を用いて、水サンプルについて６０分間のＡＴＰ増幅処理を行うことにより、１ＣＦＵ／ｍｌのバクテリアが検出可能であることがわかる。従来の栄養培地を用いる方法は、バクテリアの混入を検出するのに、典型的には数日を要した（表４）。病原菌である緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）が水道水で検出されたとの報告がある（非特許文献９）が、本発明により、このような微生物の存在が容易にかつ迅速に、検出される。
【００７０】
（実施例７：ミルク中のバクテリアの検出）
酪農業における応用について検討した。バクテリアの混入は、ミルク業界に大きなダメージを与えるため、ミルク中のバクテリアを検出するための、迅速で信頼のおけるテストが開発されている。本発明者は、さらに、ミルク中の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を検出する感度の高いアッセイを検討した。黄色ブドウ球菌の培養液を適切な濃度に希釈し、ミルク中に加えた。ミルク中に含まれる乳腺および体細胞からの非バクテリア性ＡＴＰを除去するために、０．５ｍｌのミルクを、０．４５μｍのメンブランを用いて濾過した。このメンブランを０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）および２ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍｌの溶液（非特許文献１０）で洗浄した。洗浄後、このメンブランを２００μｌの溶解緩衝液に浸漬し、１００℃、５分加熱した。加熱サンプル（２０μｌ）を６０分間のＡＴＰ増幅にかけた。次いで、生物発光アッセイに供した。結果を表５に示す。
【００７１】
【表５】
【００７２】
アッセイの結果、７５ＣＦＵ（黄色ブドウ球菌）／０．５ｍｌミルクが検出できた。黄色ブドウ球菌の検出感度は大腸菌の検出感度より低いが、ミルク中の黄色ブドウ球菌を検出する感度は、従来の生物発光アッセイを用いた場合の感度の約１０，０００倍に増大した。本発明の微生物の存在を迅速に決定する方法は、環境中の微生物のみならず、幅広い範囲の衛生学上のモニタリングに応用可能である。
【００７３】
【発明の効果】
本発明のＰＰＫ−ＡＤＫ融合タンパク質は、ＡＴＰ、ＡＭＰおよびポリリン酸化合物の混合物に作用して、ＡＴＰを増幅する。特に、不純物であるＡＤＰを含まないＰＰＫ−ＡＤＫを用いることによって、外因性ＡＴＰのみを増幅することが可能となり、細胞１個のレベルの微生物のＡＴＰを増幅できる。増幅したＡＴＰは、ルシフェラーゼアッセイなどで、検出できる。従って、従来、数日間かかってやっと検出できた微生物を、極めて迅速に検出でき、しかも、たった１個の細胞でも検出可能である。
【００７４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＤＫおよびＰＰＫを用いるＡＴＰ増幅機構を示す模式図である。
【図２】ＰＰＫ−ＡＤＫおよびアピラーゼ処理したＰＰＫ−ＡＤＫを用いるＡＴＰ増幅の結果を示す図である。
【図３】極微量のＡＴＰを含有するサンプルについて、ＡＴＰ増幅反応を行った結果を示す図である。
【図４】所定の細胞濃度を含有するサンプルについて、ＡＴＰ増幅反応を行った結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＡＴＰの増幅方法および該方法を用いて微生物の存在を迅速に検出する方法、並びのそのためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
迅速かつ高感度で微生物を検出する方法は、例えば、食中毒予防のための食品製造工場における微生物の検出などの環境微生物の制御、食品（例えば、ミルクなどの乳製品）における微生物の混入の検査など、食品業界、酪農業界などにおいて非常に重要である。従来の栄養培地を用いて生細胞を検出する方法においては、生存微生物をカウントするまでに数日を要する。
【０００３】
このような微生物の検出に、全ての生物に存在するＡＴＰを利用する方法が検討されている。ＡＴＰを検出する方法として、ホタルルシフェラーゼを用いる生物発光アッセイが知られている。この方法は、ＡＴＰを測定する確立された方法であり（非特許文献１参照）、迅速な衛生学的なモニタリングとして用いられている（非特許文献２）。さらに、最近ではバイオテロに対する対抗技術として、ＡＴＰアッセイが提案されている（非特許文献３）。
【０００４】
しかし、従来のＡＴＰのアッセイ法には検出限界（例えば、約１０４大腸菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）／アッセイ）がある。この感度では、工業的な応用には充分な感度とはいえない。
【０００５】
コンピューターシュミレーションでは、アデニレートキナーゼ（ＡＤＫ）およびピルビン酸キナーゼ（ＰＶＫ）を用いるＡＴＰ増幅は、高感度の光度計を用いなくとも、非常に低いレベルのＡＴＰを検出し得る可能性があることが示唆されている（非特許文献４）。しかし、この方法は、実際に行われていない。
【０００６】
微量のＡＴＰをアッセイするために、ＡＴＰを増幅させる方法が提案されている（特許文献１）。この特許文献１に示される方法を図１で説明する。図１において、ＡＤＫはアデニレートキナーゼ（adenylate kinase）、ｐｏｌｙＰはポリリン酸（polyphosphate）、ＰＰＫはポリリン酸キナーゼ（polyphospate kinase）を意味する。以下、本明細書においても、この略号を使用するときがある。図１ａは、ＡＴＰの非存在下では、理論的には、ＡＭＰとポリリン酸とからはＡＴＰが生成しないことを示している。図１ｂに示すように、ＡＴＰが存在すると、ＡＤＫによって、ＡＴＰからＡＭＰへのリン酸基転移反応が起こり、２分子のＡＤＰが生成する（第１反応）。この第１反応で生じた２分子のＡＤＰは、ＰＰＫの作用により、ポリリン酸からリン酸基を受け取り、２分子のＡＴＰを生じる（第２反応）。この第２反応で生じた２分子のＡＴＰは、再度、第１反応に使用され、４分子のＡＤＰを生成し、この４分子のＡＤＰはＰＰＫによって４分子のＡＴＰに変換される。
【０００７】
このように、特許文献１では、過剰のＡＭＰとポリリン酸を存在させて、ＡＤＫとＰＰＫの平衡状態をそれぞれ、ＡＤＰ生成方向（第１反応）およびＡＴＰ生成方向（第２反応）に向かわせるようにし、第１反応と第２反応を１つの反応系として、ｎ回この反応系を繰り返すことにより、１個のＡＴＰが２ｎ個に増幅される。従って、この方法は、優れたＡＴＰの増幅方法である。
【０００８】
この特許文献１の方法は、従来のレベルよりも高い感度で、細胞の存在を検出し得る点では優れた方法であるが、この方法では、理論的には起こらないＡＴＰ非存在下でのＡＴＰの増幅が、低いレベルであるが、時折見られることが判明し、外因性の（外部から添加した）ＡＴＰのみを増幅し、検出するという確実性に欠けるという問題がある。すなわち、細胞１個のレベルのＡＴＰを増幅し、検出し得るまでの感度を確実に提供できないという問題がある。さらに、ＡＤＫとＰＰＫとの活性の調整などの問題もある。
【０００９】
【特許文献１】
特開２００１−２９９３９０号公報
【非特許文献１】
デルカおよびマッケルロイ（DeLuca, M. and W. D. McElroy. ）「Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions」 Biochemistry ２６巻、９２１−９２５頁（１９７４年）
【非特許文献２】
バウティスタ（Bautista, D. A.）ら、「Adenosine triphosphate bioluminescence as a method to determine microbial levels in scald and chill tanks at a poultry abattoir」 Poult. Sci. ７３巻、１６７３−１６７８頁（１９９４年）
【非特許文献３】
スペンサーおよびライトフット（Spencer, R. C. and N. F. Lightfoot） 「Preparedness and response to bioterrorism」 J. Infect. ４３巻１０４−１１０頁（２００１年）
【非特許文献４】
チトック（Chittock, R. S.）ら、「Kinetic aspects of ATP amplification reactions」 Anal. Biochem ２５５巻、１２０−１２６頁（１９９８）
【非特許文献５】
アキヤマ（Akiyama, M.）ら、「The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein」 J. Biol. Chem. ２６７巻、２２５５６−２２５６１頁（１９９２年）
【非特許文献６】
ブルーン（Brune, M.）ら、「Cloning and sequencing of the adenylate kinase gene (adk) of Escherichia coli」 Nucleic Acids Res. １３巻、７１３９−７１５１頁（１９８５年）
【非特許文献７】
ニューハード Ｊ、およびＹ．ニガード（Neuhard, J., and Y. Nygaard） 「Purines and pyrimidines」 ４４５−４７３頁、ネイドハルト（F. C. Neidhardt）ら編、 Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, ASM press, Washington, D. C. （１９８７年）
【非特許文献８】
ネイドハルト（F. C. Neidhardt） 「Chemical composition of Escherichia coli」 ３−６頁、ネイドハルト（F. C. Neidhardt）ら編、 Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology」 ASM press, Washington, D. C.（１９８７年）
【非特許文献９】
ベルト（Bert, F.）ら、「Multi-resistant Pseudomonas aeruginosa outbreak associated with contaminated tap water in a neurosurgery intensive care unit」 J. Hosp. Infect. ３９巻、５３−６２頁（１９９８年）
【非特許文献１０】
オルソン（Olsson, T.）ら、「Extraction and determination of adenosine 5'-triphosphate in bovine milk by the firefly luciferase assay. Biotech」 Appl. Biochem ８巻、３６１−３６９頁（１９８６）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、外因性のＡＴＰの効率的な増幅方法が望まれており、特に、外因性のＡＴＰのみを増幅させる方法およびこの方法を用いて１個の細胞の存在を検出し得る高感度の検出方法が望まれている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決することを目的として行われたものであり、本発明のＡＴＰ増幅方法により、極微量のＡＴＰが検出され、さらに、１個の細胞の存在さえも検出し得る。
【００１２】
本発明は、ＡＴＰ、ＡＭＰおよびポリリン酸化合物を含有する混合物に、ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質を作用させる工程を含む、ＡＴＰの増幅方法を提供する。
【００１３】
好ましい実施態様においては、前記ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質が、ＡＤＰを含まない融合タンパク質である。
【００１４】
また、本発明は、ＡＴＰ、ＡＭＰおよびポリリン酸化合物を含有する混合物に、ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質を作用させて、ＡＴＰを増幅する工程；および、該増幅したＡＴＰを検出する工程；を包含するＡＴＰの検出方法を提供する。
【００１５】
好ましい実施態様においては、前記ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質が、ＡＤＰを含まない融合タンパク質である。
【００１６】
さらに、本発明は、微生物の存在を迅速に検出する方法であって、微生物含有試料を処理して、ＡＴＰ含有試料を調製する工程；該ＡＴＰ含有試料をＡＴＰ増幅系に添加してＡＴＰを増幅する工程；および、該増幅したＡＴＰを検出する工程；を包含し、該ＡＴＰ増幅系がＡＭＰ、ポリリン酸化合物、およびＡＤＰを含まないポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質を含む方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、微生物の存在を迅速に検出するためのキットであって、ＡＭＰ、ポリリン酸化合物、およびＡＤＰを含まないポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質、を含有するＡＴＰ増幅試薬と、ＡＴＰを検出するＡＴＰ検出試薬を包含するキットを提供する。
【００１８】
好ましい実施態様においては、さらに細胞溶解用試薬を備えるキットである。
【００１９】
本発明は、さらに、ＡＴＰ、ＡＭＰ、およびポリリン酸化合物の混合物に、アデニレートキナーゼ、およびＡＤＰを含まないポリリン酸キナーゼを作用させてＡＴＰを増幅する方法を提供する。
【００２０】
また、本発明は、ポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質、並びに、ＡＤＰを含まないポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質を提供する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
（融合タンパク質）
本発明に用いられるポリリン酸キナーゼとアデニレートキナーゼとの融合タンパク質（以下、ＰＰＫ−ＡＤＫということがある）は、ＰＰＫ活性およびＡＤＫ活性を有していれば、結合状態に特に制限はない。Ｎ末端側にＰＰＫを、Ｃ末端側にＡＤＫを含む融合タンパク質であることが好ましい。この融合蛋白質は、ＰＰＫとＡＤＫとが直接結合されていてもよいが、スペーサーを介して結合されていてもよい。また、融合タンパク質のＣ末端には、それぞれの酵素の発現に影響を与えないタグを付着させることが、融合タンパク質の精製に有用である。
【００２２】
ＰＰＫをコードする遺伝子ｐｐｋおよびＡＤＫをコードする遺伝子ａｄｋは、これらの遺伝子配列が特定されていれば、その由来に特に制限はない。大腸菌の配列が好ましく用いられる。これらの遺伝子配列に基づいて適切なプライマーを調製し、ＰＣＲを行うことにより、それぞれの遺伝子配列を得ることができる。
【００２３】
ｐｐｋ遺伝子を調製するための適切なプライマーとして、例えば、以下のプライマーの組合せが好ましい：（１）ｐｐｋ遺伝子の５’末端の上流に適切な制限酵素認識配列を導入するための配列を有するプライマー；および（２）スペーサー（例えば、グリシン）配列、およびスペーサー部位またはその下流に適切な制限酵素認識配列を導入するための配列を有するプライマー。この２つのプライマーをセットにしてＰＣＲを行うと、Ｃ末端にスペーサーを有するＰＰＫを発現するｐｐｋ遺伝子を含む断片が容易に回収される。
【００２４】
ａｄｋ遺伝子を調製するための適切なプライマーとしては、ｐｐｋ遺伝子と同様、以下のプライマーが好ましい：（１）ａｄｋ遺伝子の５’末端の上流に適切な制限酵素認識配列を導入するための配列を有するプライマー；および（２）Ｃ末端タグ（例えば、ヒスチジン）配列を有し、かつＣ末端タグの下流に適切な制限酵素認識配列を導入するための配列を有するプライマー。この２つのプライマーをセットにしてＰＣＲを行うと、Ｃ末端にタグを有するＡＤＫを発現するａｄｋ遺伝子を含む断片が容易に回収される。
【００２５】
上記プライマーの制限酵素は、ｐｐｋあるいはａｄｋの遺伝子配列、組込むベクターのクローニング部位を考慮して、決定すればよい。
【００２６】
大腸菌の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を、それぞれ、制限酵素で切断し、ｐｐｋ遺伝子を含む断片、およびａｄｋ遺伝子を含む断片を回収する。得られたそれぞれの遺伝子を含む断片を、ｐｐｋ−ａｄｋの順となるように適切なベクターに組み込むことにより、ＰＰＫ−ＡＤＫの融合タンパク質を発現する組換えベクターが得られる。
【００２７】
得られたベクターを適切な宿主（例えば、大腸菌）に導入し、組換えベクターを発現させることにより、ＰＰＫ−ＡＤＫ融合タンパク質が生産される。ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を有するように設計された融合タンパク質は、ハイトラップキレートカラム（Hitrap chelating column）を用いることにより、容易に精製、回収される。
【００２８】
得られた融合タンパク質であるＰＰＫ−ＡＤＫは、このまま、ＡＴＰ増幅反応に用いることができる。しかし、後述のように、外因性のＡＴＰのみを測定する場合、不都合があることが判明した。この原因として、ＡＤＰがＰＰＫと結合した状態で存在することが考えられる。このＰＰＫに結合しているＡＤＰは、ポリリン酸化合物の存在下、ＰＰＫの基質とされ得、このＡＤＰがＰＰＫによりＡＴＰに変換され得る。すなわち、図１に示すような反応系において、ＡＴＰ非存在下であっても、まず第２反応であるＡＤＰからＡＴＰへの反応が生じ、このＡＴＰが第１反応で使用されることにより、自動的にＡＴＰ増幅反応が開始すると考えられる。従って、外因性のＡＴＰのみを測定するためには、ＰＰＫに結合したＡＤＰを予め除去しておくことが必要である。
【００２９】
ＰＰＫに結合している不純物であるＡＤＰの除去は、例えば、アピラーゼ処理により行われる。アピラーゼは、ＡＴＰまたはＡＤＰからリン酸基を除去し、ＡＭＰを生成する。アピラーゼ処理は、適切な量のピロリン酸存在下で行うことが好ましい。ピロリン酸により、ＰＰＫ−ＡＤＫに結合したＡＤＰの遊離が促進され、ＡＤＰがアピラーゼによるアタックを受けやすくなる。アピラーゼ処理したＰＰＫ−ＡＤＫは、再び、ハイトラップキレートカラムを用いて、回収される。回収されたＰＰＫ−ＡＤＫは、アピラーゼ処理によっても、それぞれの活性（すなわち、ＰＰＫ活性およびＡＤＫ活性）を維持している。
【００３０】
（ＰＰＫ−ＡＤＫを用いるＡＴＰの増幅）
本発明のＰＰＫ−ＡＤＫを用いるＡＴＰの増幅は、ＡＴＰ、過剰のＡＭＰ、および過剰のポリリン酸化合物にＰＰＫ−ＡＤＫを作用させることによって行なわれる。すなわち、ＡＭＰ、ポリリン酸化合物およびＰＰＫ−ＡＤＰの混合物にＡＴＰを添加することにより、あるいは、ＡＴＰ、ＡＭＰ、およびポリリン酸化合物の混合物にＰＰＫ−ＡＤＫを添加することにより、行なわれる。反応形式は、図１と同じであり、図１に示す第１反応および第２反応が繰り返されて、ＡＴＰが増幅される。
【００３１】
ＡＴＰの増幅は、適切な緩衝液中で、適切な温度（例えば、３０〜４０℃）で、適切な時間（例えば、５分〜２時間）行われる。ＡＴＰの存在が微量と思われる場合は、１時間ほど増幅反応を行うことが好ましい。
【００３２】
なお、ポリリン酸化合物としては、ポリリン酸あるいはその塩が用いられる。好ましくは、１０〜１０００個、好ましくは１０〜１００個のリン酸が直鎖状に重合したものが好ましく用いられる。ポリリン酸は、バクテリア由来でもよく、化学合成で得られたものでもよい。あるいは、ポリリン酸合成酵素を用いてＡＴＰから合成してもよい。
【００３３】
（ＡＴＰの検出）
増幅されたＡＴＰの検出方法には、当業者が通常用いる方法が使用されるが、特に制限がない。一般には、ルシフェラーゼとＡＴＰとの反応による蛍光発光量を測定することにより行われる。例えば、市販のルシフェラーゼを用いるＡＴＰ測定キットが用いられる。
【００３４】
（微生物の存在を迅速に検出する方法）
この方法は、すべての生物の細胞にはＡＴＰが含まれることに着目して、微生物含有試料からＡＴＰを含む試料を調製し、上記ＡＴＰ増幅方法を用いて、ＡＴＰを増幅し、検出する方法である。ＡＤＰ除去処理を行ったＰＰＫ−ＡＤＫを用いることにより、外因性ＡＴＰのみを測定することが可能となる。例えば、１個の細胞に含まれるＡＴＰを測定可能なレベルまで増幅できることから、微生物の存在を検出することができる。従来の方法では、１アッセイあたり、１０４個のコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）の大腸菌が検出限界であったことを考慮すると、検出感度が少なくとも１０，０００倍に上昇する。
【００３５】
なお、微生物には、ＡＤＰも含まれる。ＡＤＰ除去処理を行ったＰＰＫ−ＡＤＫを用いる場合、本発明の増幅系にＡＤＰを加えると、ＡＤＰがＡＴＰに変換され、ＡＴＰ増幅反応が開始される。従って、微生物を検出するための前処理中にＡＴＰがＡＤＰに分解されても、本発明の感度に影響しない点で、本発明の増幅方法は優れている。以下、微生物の検出において、測定するＡＴＰの試料について言及するときは、試料中にＡＤＰが含まれる場合も意図する。
【００３６】
微生物含有試料からのＡＴＰ含有試料の調製方法には、特に制限はない。細胞を溶解してもよいが、その細胞に含まれるＰＰＫ、ＡＤＫなどの酵素の影響を考慮すると、加熱処理を行って、ＡＴＰを溶出させるか、細胞を溶解して、ＡＴＰを溶出させ、そして他の酵素を失活させる加熱処理を行う方法が最も好ましく用いられる。加熱処理は、例えば、１００℃、１〜５分行われる。細胞溶解処理は、例えば、市販のＡＴＰアッセイキットに附属しているような、溶解緩衝液を用いて、行うことができる。
【００３７】
このような、ＡＴＰ溶出処理を行って得られるＡＴＰを含むと思われる試料を、ＡＭＰ、ポリリン酸化合物およびＰＰＫ−ＡＤＫの混合物に添加して、ＡＴＰ増幅反応を行い、例えばルシフェラーゼを用いるＡＴＰ検出方法を用いて、ＡＴＰの存在を検出する。試料中にＡＴＰが含まれていれば、ルシフェラーゼと反応して蛍光が観察される。なお、ＡＴＰが増幅されているので、高感度の発光分析器は必ずしも要求されない。
【００３８】
本発明では、また、このような微生物の存在を迅速に検出するためのキットを提供する。すなわち、ＡＭＰ、ポリリン酸、およびＡＤＰを含まないＰＰＫ−ＡＤＫを含有するＡＴＰ増幅試薬と、ＡＴＰを検出するＡＴＰ検出試薬を包含するキットが提供される。このキットには、さらに、細胞溶解用試薬が含まれる。細胞溶解用試薬は、対象となる細胞（例えば、微生物、体細胞など）に応じて、その組成を変化させ得る。
【００３９】
微生物を含有すると思われる試料を加熱処理し、このキットのＡＴＰ増幅試薬に添加して、適切な時間、増幅反応を行い、ついで、ＡＴＰ検出試薬で、ＡＴＰの存在を確認することによって、微生物の存在が迅速に確認できる。この方法は、ＡＤＰ除去処理を行って得られたＰＰＫ−ＡＤＫを用いることによって、外因性のＡＴＰのみを検出できることが可能になったことにより、達成された。なお、ＡＴＰ検出試薬としては、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応系を用いる試薬が一般的であり、用語「ＡＴＰ検出試薬」は生物発光（蛍光）測定器をも含む概念で使用する。
【００４０】
（ＡＤＫおよびＡＤＰを含まないＰＰＫ用いるＡＴＰ増幅）
また、本発明は、ＡＴＰ、ＡＭＰ、およびポリリン酸を含む混合物に、ＡＤＫおよび、ＡＤＰを含まないＰＰＫを作用させてＡＴＰを増幅する方法をも提供する。ＡＤＰを含まないＰＰＫ遺伝子は、例えば、上記融合タンパク質の調製と同様の方法で調製される。簡潔に述べると、ｐｐｋ遺伝子の５’末端の上流に適切な制限酵素認識配列を有するプライマーと、Ｈｉｓタグ配列を有し、かつその下流に適切な制限酵素認識配列を有するプライマーとを用いて、Ｈｉｓ−タグを有するＰＰＫを発現するｐｐｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収する。得られたＤＮＡを適切なベクターに導入して組換えプラスミドを得、これを大腸菌に導入して、ＰＰＫを発現させる。ＰＰＫを、ハイトラップキレートカラムを用いて生成し、ピロリン酸存在下、アピラーゼ処理を行い、再びハイトラップキレートカラムにかけて、ＡＤＰを除去したＰＰＫを回収する。このＰＰＫを、図１に示す反応系に用いることにより、外因性ＡＴＰのみを増幅し、検出する方法が提供される。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されることはない。
【００４２】
この実施例において、ＡＭＰおよびＡＴＰは和光純薬（大阪）およびシグマから、それぞれ購入して用いた。ＡＭＰは、ＴＳＨゲルＳＡＸカラム（トーソー）を用いて０．２Ｍ ＫＣｌおよび１％ＥＤＴＡ（ｐＨ１０）を溶媒として用いて、さらに精製して用いた。ポリリン酸は、平均鎖長６５のポリリン酸（シグマ）を用いた。生物発光アッセイキット（ＣＬＳＩＩ）はルシフェリンとルシフェラーゼを含み、ロシュから購入して用いた。アピラーゼはシグマから購入して用いた。
【００４３】
（実施例１：ＰＰＫ−ＡＤＫの調製）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のポリリン酸キナーゼをコードする遺伝子（ｐｐｋ）（非特許文献４参照）を取得するためのプライマーは、以下の通りである：
GGATCTAGATGAATAAAACGGAGTAAAAGT（配列番号：１）、および
GGAGGATCCGCCGCCGCCGCCTTCAGGTTGTTCGAGTGATTT（配列番号：２）。
【００４４】
配列番号１のプライマーはｐｐｋ遺伝子の５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ認識配列を導入するための配列を有する。配列番号２は、４つのグリシンがＰＰＫのＣ末端に付着するように設計され、さらに３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を導入するための配列を有している。
【００４５】
大腸菌のアデニル酸キナーゼ遺伝子をコードする遺伝子（ａｄｋ）（非特許文献５）を取得するためのプライマーは、以下の通りである：
GGAGGATCCATGCGTATCATTCTGCTTGGC（配列番号：３）および
GGAAAGCTTGCCGAGGATTTTTTCCAG（配列番号：４）。
【００４６】
配列番号３のプライマーはａｄｋ遺伝子の５’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を導入するための配列を有する。配列番号４のプライマーは、Ｃ末端タグであるヒスチジンがＡＤＫのＣ末端に付着するように設計され、さらに３’末端側に制限酵素ＨｉｎｄIII認識配列を導入するための配列を有する。
【００４７】
大腸菌の染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーを用いて、常法によりＰＣＲを行い、それぞれｐｐｋ遺伝子およびａｄｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。得られたｐｐｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭＴベクター(プロメガ)に導入し、ｐＧＥＭＴｐｐｋを得た。得られたａｄｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭＴベクター(プロメガ)に導入し、ｐＧＥＭＴａｄｋを得た。
【００４８】
ｐＧＥＭＴｐｐｋをＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ処理して得られた２．１ｋｂの断片、およびｐＧＥＭＴａｄｋをＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII処理して得られた０．６ｋｂ断片を、ｐＥＴベクター（ストラタジーン）のＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII消化物に連結させることによって、プラスミドｐＥＴｐｐｋａｄｋを構築した。このプラスミドは、ＰＰＫとＡＤＫとが４つのグリシンを介して結合され、Ｃ末端にＨｉｓタグを有するような融合タンパク質をコードする遺伝子を含有している。
【００４９】
このプラスミドｐＥＴｐｐｋａｄｋを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１）に導入し、得られた形質転換体を２時間培養し、ついで、１ｍＭのＩＰＴＧを生育培地に添加した。４時間培養後に、形質転換体を遠心分離して集め、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した。細胞をＢ−ＰＥＲ溶液 (ピアース)を用いて溶解し、ついで１ｍＭ ＰＭＳＦ存在下、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅで処理した。遠心分離により上清を得、０．２μｍのフィルターを用いて濾過し、ついで、ハイトラップキレートカラム（Hitrap chelating column） (Amersham Bioscience)にロードした。カラムを０．１Ｍ ピロリン酸、２０ｍＭ リン酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ イミダゾール、および２０％グリセロール（ｐＨ７．４）を用いて洗浄した。ＰＰＫ−ＡＤＫ融合タンパク質は、０．１Ｍ ピロリン酸、２０ｍＭ リン酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾールおよび２０％グリセロール（ｐＨ７．４）で溶出した。
【００５０】
得られたＰＰＫ−ＡＤＫ融合タンパク質は、ＡＤＫ（４３Ｕ／ｍｇ）およびＰＰＫ（３８Ｕ／ｍｇ）の活性を有しており、ＡＭＰとポリリン酸からＡＴＰを生成した。なお、１ユニットのＰＰＫは、３７℃で、ＡＤＰおよびポリリン酸から１．０μｍｏｌ／分のＡＴＰを合成する。１ユニットのＡＤＫは、３７℃で、ＡＤＰから１．０μｍｏｌ／分のＡＴＰを合成する。
【００５１】
０．１６μｇのＰＰＫ−ＡＤＫ、１０μＭ ＡＭＰ、４００μＭ ポリリン酸、８ｍＭ ＭｇＣｌ２および６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含む混合液５０μｌを調製し、５μｌの反応混液をサンプリングして、４０μｌのＡＴＰ生物発光アッセイ試薬（ロシュ）と混合し、直ちに、マルチプレート蛍光測定計（アルボ、ワラス）を用いて、発光を測定した。
【００５２】
図２のＰＰＫ−ＡＤＫに示すように、このＡＴＰを含まない反応系で、ＡＴＰの増幅が起こり、蛍光が観察された。この原因を検討したところ、ＡＤＰがＰＰＫに結合しており、このＡＤＰがＰＰＫに利用されて、最初に図１に示す第２反応が起こってＡＴＰが生成し、このＡＴＰが増幅された可能性が示唆された。
【００５３】
（実施例２：ＰＰＫ−ＡＤＫに結合したＡＤＰの除去）
実施例１で取得したＰＰＫ−ＡＤＫに結合している不純物のＡＤＰを除くために、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および８ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ ポリリン酸の存在下、１８０μｇのＰＰＫ−ＡＤＫとアピラーゼ（ａｐｙｒａｓｅ）（２００Ｕ）とを１時間反応させた。反応終了後、再度、ハイトラップキレートカラムを用いて、ＡＤＰが除去されたＰＰＫ−ＡＤＫを回収した。以下、このＰＰＫ−ＡＤＫを、アピラーゼ処理したＰＰＫ−ＡＤＫという。なお、１ユニットのアピラーゼは、ＡＴＰまたはＡＤＰから、３０℃で、１μｍｏｌのリン酸を遊離する。
【００５４】
０．１６μｇのアピラーゼ処理したＰＰＫ−ＡＤＫ、１０μＭ ＡＭＰ、４００μＭ ポリリン酸、８ｍＭ ＭｇＣｌ２および６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含む混合液５０μｌを調製し、５μｌの反応混液をサンプリングして、４０μｌのＡＴＰ生物発光アッセイ試薬（ロシュ）と混合し、直ちに、マルチプレート蛍光測定計（アルボ、ワラス）を用いて、発光を測定した。
【００５５】
図２に示すように、アピラーゼ処理したＰＰＫ−ＡＤＫを用いた反応では、６０分間反応させた後でも、蛍光が観察されなかった。なお、図示していないが、この混合液にＡＴＰを添加したところ、蛍光が観察された。このことから、アピラーゼ処理は、ＰＰＫ−ＡＤＫのＡＤＫ活性およびＰＰＫ活性に影響を与えないこと、およびアピラーゼ処理により不純物のＡＤＰが除去された結果、内因性のＡＴＰ増加が認められなかったことが判明した。従って、ＡＴＰ添加による蛍光の観察は、純粋に外因性のＡＴＰによると考えられる。従って、アピラーゼ処理した（ＡＤＫを含まない）ＰＰＫ−ＡＤＫは、外因性ＡＴＰのアッセイに極めて有用である。
【００５６】
なお、アピラーゼ処理に際して、ハイトラップキレートカラムへのＰＰＫ−ＡＤＫの吸着および同カラムからの溶出に際し、洗浄緩衝液および溶出緩衝液にピロリン酸を添加することが好ましい。０．１Ｍのピロリン酸は、ＰＰＫ−ＡＤＫからＡＤＰを遊離させる効果があり、ＡＤＰの除去をより効果的に行うことができる。
【００５７】
（実施例３：超高感度生物発光アッセイ）
０．１６μｇのアピラーゼ処理したＰＰＫ−ＡＤＫ、１０μＭ ＡＭＰ、４００μＭ ポリリン酸、８ｍＭ ＭｇＣｌ２および６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含む混合液４８μｌを調製し、ついで、２μｌのＡＴＰサンプルをこの混合液に添加し、ＡＴＰを増幅した。５μｌの反応混液を経時的にサンプリングして、４０μｌのＡＴＰ生物発光アッセイ試薬と混合し、直ちに、マルチプレート蛍光測定計を用いて、蛍光を測定した。なお、ＡＴＰの増幅を行わず（ＰＰＫ−ＡＤＫを添加せず）、そのまま、蛍光を測定したものを比較とした。蛍光値は、それぞれ異なった３回の測定の平均値±標準偏差を表す。蛍光の経時的増加を図３に、６０分後のＡＴＰ増幅の結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
図３に示すように、アピラーゼ処理したＰＰＫ−ＡＤＫは、外因性のＡＴＰがないときは、６０分の増幅処理にもかかわらず、全くＡＴＰの増幅がないことがわかった。さらに、図３および表１に示すように、ＡＴＰの初期濃度が低いにもかかわらず、蛍光測定可能な程度まで増幅できることがわかった。この結果は、このＡＴＰ増幅反応が、超高感度生物発光アッセイに応用可能であることを示している。すなわち、０．００３３フェムトモル（ｆｍｏｌ：１０−１５ｍｏｌ＝３．３アトモル：１０−１８ｍｏｌ）濃度のＡＴＰを含む試料を、６０分間ＡＴＰ増幅処理を行うことにより、検出可能なレベルまで、ＡＴＰを増幅できることが示された。すなわち、数アトモル（ａｍｏｌ：１０−１８ｍｏｌ）濃度のＡＴＰが検出可能となった。これに対して、従来の生物発光は、数十フェムトモル（ｆｍｏｌ：１０−１５ｍｏｌ）のＡＴＰが、その発光を測定するために必要である（表１）。このように、本発明のＡＴＰ増幅法を用いることにより、生物発光の感度が、少なくとも１０，０００倍向上したことを示している。
【００６０】
（実施例４：単一微生物の検出における超高感度生物発光アッセイの応用）
大腸菌の培養液（２×１０９ＣＦＵ／ｍｌ）を、純水を用いて適切な濃度に希釈した。細胞懸濁液（５００μｌ）を溶解緩衝液５００μｌ（生物発光アッセイキット、ロシュ）に加えて、１００℃、２分間加熱して、細胞からＡＴＰを放出させた。加熱サンプル２μｌをＡＴＰ増幅アッセイにかけ、生物発光を測定した。
なお、ＡＴＰ増幅を行わず（ＰＰＫ−ＡＤＫを添加せず）、そのまま、蛍光を測定したものを比較とした。蛍光値は、それぞれ異なった３回の測定の平均値±標準偏差を表す。蛍光の経時的増加を図４に、６０分後のＡＴＰ増幅の結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】
表２および図４に示すように、アッセイに用いた大腸菌の数に依存して、蛍光量が変化した（図４）。表２に示すように、ＡＴＰ増幅を行わなかった場合に比べ、ＡＴＰ増幅を行った場合の蛍光発色は著しく増強された。ＡＴＰ増幅がない場合、表２の１０，０００ＣＦＵの場合でも蛍光発光の程度は極めて低く、有意な生物発光のレベルに達するには、数万ＣＦＵの大腸菌が必要であった。これに対して、本発明のＡＴＰ増幅技術を用いた場合、単一の大腸菌（１ＣＦＵの大腸菌のレベル）という、最も低レベルでも、明確な蛍光が観察された。このことは、ＡＴＰ増幅をしなかった場合に比べて、１０，０００倍以上の感度があることを示している。
【００６３】
大腸菌生細胞の細胞内ＡＴＰレベルは、約７μｍｏｌ／ｇ乾燥菌体と報告されている（非特許文献７）。大腸菌１個の乾燥重量は約２．８×１０−１３ｇである（非特許文献８）から、大腸菌は、細胞１個あたり、約２アトモルのＡＴＰを含有している。このレベルのＡＴＰは、この超高感度生物発光アッセイの検出限界の値とほとんど同じである。
【００６４】
（実施例５：衛生学上のモニタリングへの超高感度生物発光アッセイの応用）
本発明の方法が、大腸菌のスワブモニタリングに応用できるか否かについて検討した。大腸菌の細胞懸濁液をポリスチレン製ペトリ皿にひろげ、空気乾燥して市販の綿棒で拭き取った。市販の綿棒は有意な量のＡＴＰを含有しているので、予め１２１℃、７５分のオートクレーブ処理を行い、ＡＴＰをＡＭＰとリン酸に分解した。４ｃｍ２の表面積から拭き取ったサンプルを４００μｌの溶解緩衝液に浸漬し、ついで１００℃、２分間加熱した。加熱サンプル（１０μｌ）をＡＴＰ増幅反応溶液（４０μｌ）に添加し、６０分間、ＡＴＰ増幅反応を行った。そのうちの２５μｌを生物発光アッセイに用いた。結果を表３に示す。
【００６５】
【表３】
このスワブモニタリングにより、約１２大腸菌ＣＦＵ／ｃｍ２のレベルでの測定が可能となった。本発明の方法が大腸菌のスワブモニタリングに応用できることが判った。
【００６７】
（実施例６：飲料水中のバクテリアの検出）
本発明の方法が、飲料水中のバクテリアの検出に有効か否かを検討した。加熱した水サンプル（２μｌ）を、ＡＴＰ増幅反応溶液（５０μｌ）に添加し、６０分間、ＡＴＰ増幅反応を行った。表４に結果を示す。表４において、水道水（１）は、広島市の上水道から得られたものである。水道水（２）は、広島大学内で再生された水である。ボトル詰めの水は、市販品を購入した。滅菌水は、蒸留水をオートクレーブして、調製した。池水は、広島大学の池の水である。コロニー数（ＣＦＵ）は、１ｍｌの水のサンプルをニュートリエント寒天培地（１．６ｇのトリプトン、１ｇのイーストエキス、０．５ｇのＮａＣｌ、１５ｇの寒天、水１Ｌ）に塗布し、２８℃、３日間培養後、形成されたコロニーをカウントして、求めた。
【００６８】
【表４】
この結果は、従来の生物発光アッセイでは検出できないレベルでも、バクテリアが検出できたことを示している。表４の結果が示すように、本発明の方法を用いて、水サンプルについて６０分間のＡＴＰ増幅処理を行うことにより、１ＣＦＵ／ｍｌのバクテリアが検出可能であることがわかる。従来の栄養培地を用いる方法は、バクテリアの混入を検出するのに、典型的には数日を要した（表４）。病原菌である緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）が水道水で検出されたとの報告がある（非特許文献９）が、本発明により、このような微生物の存在が容易にかつ迅速に、検出される。
【００７０】
（実施例７：ミルク中のバクテリアの検出）
酪農業における応用について検討した。バクテリアの混入は、ミルク業界に大きなダメージを与えるため、ミルク中のバクテリアを検出するための、迅速で信頼のおけるテストが開発されている。本発明者は、さらに、ミルク中の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を検出する感度の高いアッセイを検討した。黄色ブドウ球菌の培養液を適切な濃度に希釈し、ミルク中に加えた。ミルク中に含まれる乳腺および体細胞からの非バクテリア性ＡＴＰを除去するために、０．５ｍｌのミルクを、０．４５μｍのメンブランを用いて濾過した。このメンブランを０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）および２ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍｌの溶液（非特許文献１０）で洗浄した。洗浄後、このメンブランを２００μｌの溶解緩衝液に浸漬し、１００℃、５分加熱した。加熱サンプル（２０μｌ）を６０分間のＡＴＰ増幅にかけた。次いで、生物発光アッセイに供した。結果を表５に示す。
【００７１】
【表５】
アッセイの結果、７５ＣＦＵ（黄色ブドウ球菌）／０．５ｍｌミルクが検出できた。黄色ブドウ球菌の検出感度は大腸菌の検出感度より低いが、ミルク中の黄色ブドウ球菌を検出する感度は、従来の生物発光アッセイを用いた場合の感度の約１０，０００倍に増大した。本発明の微生物の存在を迅速に決定する方法は、環境中の微生物のみならず、幅広い範囲の衛生学上のモニタリングに応用可能である。
【００７３】
【発明の効果】
本発明のＰＰＫ−ＡＤＫ融合タンパク質は、ＡＴＰ、ＡＭＰおよびポリリン酸化合物の混合物に作用して、ＡＴＰを増幅する。特に、不純物であるＡＤＰを含まないＰＰＫ−ＡＤＫを用いることによって、外因性ＡＴＰのみを増幅することが可能となり、細胞１個のレベルの微生物のＡＴＰを増幅できる。増幅したＡＴＰは、ルシフェラーゼアッセイなどで、検出できる。従って、従来、数日間かかってやっと検出できた微生物を、極めて迅速に検出でき、しかも、たった１個の細胞でも検出可能である。
【００７４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＤＫおよびＰＰＫを用いるＡＴＰ増幅機構を示す模式図である。
【図２】ＰＰＫ−ＡＤＫおよびアピラーゼ処理したＰＰＫ−ＡＤＫを用いるＡＴＰ増幅の結果を示す図である。
【図３】極微量のＡＴＰを含有するサンプルについて、ＡＴＰ増幅反応を行った結果を示す図である。
【図４】所定の細胞濃度を含有するサンプルについて、ＡＴＰ増幅反応を行った結果を示す図である。
Claims (6)
- ＡＴＰ、ＡＭＰおよびポリリン酸化合物を含有する混合物に、Ｎ末端側から順にポリリン酸キナーゼ−アデニレートキナーゼを有しかつＡＤＰ除去処理が施された融合タンパク質を作用させる工程を含み、該ＡＤＰ除去処理が、アピラーゼ処理およびピロリン酸処理を含む、ＡＴＰの増幅方法。
- ＡＴＰ、ＡＭＰおよびポリリン酸化合物を含有する混合物に、Ｎ末端側から順にポリリン酸キナーゼ−アデニレートキナーゼを有しかつＡＤＰ除去処理が施された融合タンパク質を作用させて、ＡＴＰを増幅する工程；および、該増幅したＡＴＰを検出する工程；を包含し、該ＡＤＰ除去処理が、アピラーゼ処理およびピロリン酸処理を含む、ＡＴＰの検出方法。
- 微生物の存在を迅速に検出する方法であって、
微生物含有試料を処理して、ＡＴＰ含有試料を調製する工程；
該ＡＴＰ含有試料をＡＴＰ増幅系に添加してＡＴＰを増幅する工程；および、
該増幅したＡＴＰを検出する工程；を包含し、
該ＡＴＰ増幅系がＡＭＰ、ポリリン酸化合物、およびＮ末端側から順にポリリン酸キナーゼ−アデニレートキナーゼを有しかつＡＤＰ除去処理が施された融合タンパク質を含み、
該ＡＤＰ除去処理が、アピラーゼ処理およびピロリン酸処理を含む、方法。 - 微生物の存在を迅速に検出するためのキットであって、ＡＭＰ、ポリリン酸化合物、およびＮ末端側から順にポリリン酸キナーゼ−アデニレートキナーゼを有しかつＡＤＰ除去処理が施された融合タンパク質、を含有するＡＴＰ増幅試薬と、ＡＴＰを検出するＡＴＰ検出試薬とを包含し、該ＡＤＰ除去処理が、アピラーゼ処理およびピロリン酸処理を含む、キット。
- さらに細胞溶解用試薬を備える、請求項４に記載のキット。
- Ｎ末端側から順にポリリン酸キナーゼ−アデニレートキナーゼを有しかつＡＤＰ除去処理が施された融合タンパク質であって、該ＡＤＰ除去処理が、アピラーゼ処理およびピロリン酸処理を含む、融合タンパク質。
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