CN107841528A - 一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法 - Google Patents

一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及饮用水领域，具体涉及一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法。本发明PCR扩增得到PPK、ADK基因，插入表达载体pET28a(+)中构建重组表达质粒pET28a(+)‑PPKADK，表达PPK‑ADK融合蛋白，利用表面包裹聚胺醇的磁珠，通过化学反应将腺苷酸双磷酸酶固定于磁珠表面，制备固相腺苷酸双磷酸酶，用于除去与融合蛋白结合的内源性ADP，降低ATP扩增反应的背景，从而使之与生物发光反应相结合，可以快速有效的测定微量外源ATP及细菌菌落数，矿泉水中经过杀菌消毒，只含有微量的大肠杆菌。

Description

一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法
技术领域
本发明涉及饮用水领域，具体涉及一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法。
背景技术
目前，市面上销售的天然矿泉水品种繁多，但品质参差不齐，很多所谓的矿泉水并非取自地下深层水源和山泉，而只是在地表水的基础上进行了加工，微生物含量超标严重，长期饮用危害消费者健康。因此，天然矿泉水中微生物的检测是一项重要的监测指标，它反映出水体受微生物污染的情况，关系矿泉水的水质能够达到直接饮用的标准。传统的微生物检测方法检测周期长，精度不高，难以满足现代企业和质量检测部门的要求。所以，有必要探究天然矿泉水微生物检测新技术。
传统的矿泉水微生物检测方法主要有：总菌计数法、多管发酵法、平板计数法。这些传统的微生物检测方法的最大优势在于测试成本较低，操作难度低。缺点在于测试周期长，往往需要 3～5 d 才能形成肉眼可见的菌落，而且对无菌环境的要求较为严格，测定结果受培养环境的影响较大。同时，传统的微生物检测方法只能检测活菌数量，不能用于检测水体中总微生物数量。总体来说，目前内源性ADP的去除方法有效性差，检测矿泉水中微量的大肠杆菌的方法灵敏度低，传统的微生物检测方法的检测结果准确性不高。
因此，有必要发明一种新型的矿泉水中微生物的检测方法，以此来适应于市场有关行业的需求，这将大大的推动我国微生物检测及饮用水行业的发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：针对目前内源性ADP的去除方法有效性差，检测矿泉水中微量的大肠杆菌的方法灵敏度低，提供了一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是：
一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，该制备方法包括如下步骤：
（1）将大肠杆菌菌株接种至LB培养基中，培养，离心收集菌丝，向菌丝体中加入Tris-HCl溶液，得菌丝混合液，将菌丝混合液与NaCl，EDTA按质量比2:50:1混合，置沸水浴，离心，取上清液加入NaAc，得上清液混合液，向上清液混合液中加入异丙醇，沉淀DNA，用体积分数为70%的乙醇水溶液洗涤沉淀2次，干燥，得大肠杆菌基因组DNA模板，将大肠杆菌基因组DNA模板溶于水，制成大肠杆菌基因组DNA模板水溶液；
（2）在90~94℃条件下将大肠杆菌基因组DNA模板水溶液变性，52~55℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ和大肠杆菌基因组DNA模板退火，然后在70~72℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ延伸，此过程重复30次，得处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液和处理后引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ，将处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液、MgCl2、限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、处理后引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ混合均匀后，得混合液，将混合液加入液体石蜡油覆盖混合液表面，得扩增的PPK、ADK基因；
（3）将扩增的ADK基因，插入质粒pET28a (+)中，构建重组质粒pET28a (+)-ADK，将扩增的PPK基因插入重组质粒pET28a (+)-ADK中，构建重组表达质粒pET28a(+)-PPKADK，将重组菌进行诱导表达，收集菌液，离心，取沉淀菌丝体，超声破碎后，收集上清液，将上清液进行质量分数为12%的SDS-PAGE电泳，得电泳产物，用镍亲和层析系统对电泳产物进行纯化，得洗脱液，将洗脱液用超滤膜进行超滤除盐，得融合蛋白PPK-ADK；
（4）取融合蛋白PPK-ADK与polyP混合，得混合物A，将混合物A孵育，取孵育后混合物加入Beads-apyrase 继续孵育，得去内源ADP融合蛋白产物；
（5）将AMP，PolyP，MgCl2，Tris-HCl，PPK-ADK混合均匀，得微量ATP扩增反应液，将矿泉水与微量ATP扩增反应液混合，反应，得反应物，将反应物调节pH，向微量ATP扩增反应液中加入ATP，水浴，得反应液，将反应液加入生物发光反应液中，利用荧光反应，即可检测矿泉水中微量的大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中大肠杆菌菌株与LB培养基的质量比1:9，培养条件为35~37℃培养18~24h，菌丝体与Tris-HCl溶液的质量比1:10，菌丝混合液与NaCl，EDTA的质量比为2:50:1，上清液与NaAC的体积比为2:3，上清混合液与异丙醇的质量比为1:1，大肠杆菌基因组DNA模板与水的质量比为1:9。
所述步骤（2）中根据大肠杆菌 PPK、ADK基因序列和载体 pET28a (+)多克隆位点，设计引物ⅠPPK-P1 GTGTGTCATATGATGGGTCAGGAAAAGCTATA，
ⅡPPK-P2 GTGTGTGGATCCTTCAGGTTGTTCGAGTGATT，
ⅢADK-P1 GTGTGTGGATCCATG CGTATCATTCTGCTTGG，
ⅣADK-P2 GTGTGTAAGCTTTTAGCCGAGGATTTTTTCCA。
所述步骤（2）中处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液、MgCl2、限制性内切酶、TaqDNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、处理后引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的质量比20:3:5:6:5:12:9:9:9:9。
所述步骤（4）中融合蛋白PPK-ADK与polyP的质量比为3:1，孵育条件为35~37℃孵育10min。
所述步骤（4）中Beads-apyrase的制备：将聚胺醇与磁珠按质量比3:2混合均匀，加入反应器反应0.5~1h，得固相腺苷酸双磷酸酶。
所述步骤（5）中AMP，PolyP，MgCl2，Tris-HCl，PPK-ADK的质量比为5:80:12:20，微量ATP扩增反应液与ATP的体积比为49:1，反应液与生物发光反应液的体积比为1:10。
所述步骤（5）中生物发光反应液配制：将Tris-Ac，EDTA，Mg (Ac)2，PVP，BSA，DTT，d-虫荧光素，荧光素酶按质量比100:12:9:10:2:1:5混合均匀即得。
本发明与其他方法相比，有益技术效果是：
（1）本发明PCR扩增得到PPK 、ADK 基因， 插入表达载体 pET28a (+)中构建重组表达质粒pET28a (+)-PPKADK ，表达 PPK-ADK 融合蛋白，利用表面包裹聚胺醇的磁珠，通过化学反应将腺苷酸双磷酸酶固定于磁珠表面，制备固相腺苷酸双磷酸酶，用于除去与融合蛋白结合的内源性ADP ，降低 ATP 扩增反应的背景，从而使之与生物发光反应相结合，可以快速有效的测定微量外源ATP及细菌菌落数，矿泉水中经过杀菌消毒，只含有微量的大肠杆菌，本发明对微量的大肠杆菌具有很高的灵敏度，并且经过设计特别的大肠杆菌PCR扩增引物，对大肠杆菌具有专一性。
（2）本发明以利用Beads-apyrase处理PPK-ADK，无需复杂的层析过程，只要用磁铁吸引，就能将apyrase与PPK-ADK分离，并且Beads-apyrase可以回收利用，极大地降低了实验成本，经过 Beads-apyrase处理的融合蛋白可以有效扩增微量的外源ATP，与生物发光测定法结合，将生物发光法测定大肠杆菌菌落数的灵敏度有了极大的提高。
具体实施方式
原料：质粒与菌株：宿主菌大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21及原核表达质粒pET28a (+)，大肠杆菌标准株 CMCC(B)44102 为实验室保存。
试剂：限制性内切酶、 Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、PCR 产物纯化试剂盒，d-虫荧光素，AMP，polyP (average chain-length :65)，Apyrase，Dynabeads M-280 Tosylactivated。
引物：根据大肠杆菌 PPK、ADK基因序列和载体 pET28a (+)多克隆位点，设计引物ⅠPPK-P1 GTGTGTCATATGATGGGTCAGGAAAAGCTATA，
ⅡPPK-P2 GTGTGTGGATCCTTCAGGTTGTTCGAGTGATT，
ⅢADK-P1 GTGTGTGGATCCATG CGTATCATTCTGCTTGG，
ⅣADK-P2 GTGTGTAAGCTTTTAGCCGAGGATTTTTTCCA。
Beads-apyrase的制备：将聚胺醇与磁珠（magnetic beads）按质量比3:2混合均匀，加入反应器反应0.5~1h，得固相腺苷酸双磷酸酶（Beads-apyrase）。
生物发光反应液配制：将Tris-Ac，EDTA，Mg (Ac)2，PVP，BSA，DTT，d-虫荧光素，荧光素酶按质量比100:12:9:10:2:1:5混合均匀即得。
一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，该方法的制备包括如下步骤：
（1）将大肠杆菌菌株按质量比1:9接种至LB培养基中，35~37℃振荡培养18~24h，离心收集菌丝，将菌丝体按质量比1:10与Tris-HCl溶液混合，得菌丝混合液，将菌丝混合液与NaCl，EDTA按质量比2:50:1混合，置沸水浴1min，12000r /min离心10min，得上清液，取上清液按体积比2:3加入NaAc，上清液与NaAc的体积比为2:3，得上清液混合液，向上清液混合液中按质量比1:1加入异丙醇沉淀DNA，用体积分数为70%的乙醇水溶液洗涤沉淀2次，将沉淀真空干燥，得大肠杆菌基因组DNA模板，按质量比1:9溶于水中，制成大肠杆菌基因组DNA模板水溶液；
（2）在90~94℃条件下将大肠杆菌基因组DNA模板水溶液变性1min，52~55℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ和大肠杆菌基因组DNA模板退火1min，然后在70~72℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ延伸1min，此过程重复30次，得处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液和处理后引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ，将处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液、MgCl2、限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、处理后引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ按质量比20:3:5:6:5:12:9:9:9:9混合均匀后，得混合液，将混合液按体积比20:1加入液体石蜡油覆盖混合液表面，得扩增的PPK、ADK基因；
（3）将扩增的ADK基因，插入质粒pET28a (+)中，构建重组质粒pET28a (+)-ADK，将扩增的PPK基因插入重组质粒pET28a (+)-ADK中，构建重组表达质粒pET28a(+)-PPKADK，将重组菌进行诱导表达至4~5h时，收集菌液，离心，取沉淀菌丝体，超声破碎后，收集上清，将上清液进行质量分数为12%的SDS-PAGE电泳，得电泳产物，用镍亲和层析系统对电泳产物进行纯化，得洗脱液，将洗脱液用截留分子量为10000的超滤膜进行超滤除盐，得融合蛋白PPK-ADK；
（4）取融合蛋白PPK-ADK与polyP按质量比3:1混合，得混合物A，将混合物A在35~37℃条件下孵育10min后，取孵育后混合物按质量比2:1加入Beads-apyrase 继续孵育10 min，在磁铁的作用下，得去内源ADP融合蛋白产物；
（5）将AMP，PolyP，MgCl2，Tris-HCl，PPK-ADK按质量比5:80:12:20混合均匀，得微量ATP扩增反应液，将矿泉水与微量ATP扩增反应液按体积比1:9混合，反应，得反应物，将反应物pH调至7.4±0.2，向微量ATP扩增反应液中按体积比49:1加入ATP，35~37℃水浴，得反应液，将反应液按体积比1:10加入生物发光反应液中，利用荧光反应，即可检测矿泉水中微量的大肠杆菌。
实施例1
原料：质粒与菌株：宿主菌大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21及原核表达质粒 pET28a(+)，大肠杆菌标准株 CMCC(B)44102 为实验室保存。
试剂：限制性内切酶、 Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、PCR 产物纯化试剂盒，d-虫荧光素，AMP，polyP (average chain-length :65)，Apyrase，Dynabeads M-280 Tosylactivated。
引物：根据大肠杆菌 PPK、ADK基因序列和载体 pET28a (+)多克隆位点，设计引物ⅠPPK-P1 GTGTGTCATATGATGGGTCAGGAAAAGCTATA，
ⅡPPK-P2 GTGTGTGGATCCTTCAGGTTGTTCGAGTGATT，
ⅢADK-P1 GTGTGTGGATCCATG CGTATCATTCTGCTTGG，
ⅣADK-P2 GTGTGTAAGCTTTTAGCCGAGGATTTTTTCCA。
Beads-apyrase的制备：将聚胺醇与磁珠（magnetic beads）按质量比3:2混合均匀，加入反应器反应0.5h，得固相腺苷酸双磷酸酶（Beads-apyrase）。
生物发光反应液配制：将Tris-Ac，EDTA，Mg (Ac)2，PVP，BSA，DTT，d-虫荧光素，荧光素酶按质量比100:12:9:10:2:1:5混合均匀即得。
一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，该方法的制备包括如下步骤：
（1）将大肠杆菌菌株按质量比1:9接种至LB培养基中，35℃振荡培养18h，离心收集菌丝，将菌丝体按质量比1:10与Tris-HCl溶液混合，得菌丝混合液，将菌丝混合液与NaCl，EDTA按质量比2:50:1混合，置沸水浴1min，12000r /min离心10min，得上清液，取上清液按体积比2:3加入NaAc，上清液与NaAc的体积比为2:3，得上清液混合液，向上清液混合液中按质量比1:1加入异丙醇沉淀DNA，用体积分数为70%的乙醇水溶液洗涤沉淀2次，将沉淀真空干燥，得大肠杆菌基因组DNA模板，按质量比1:9溶于水中，制成大肠杆菌基因组DNA模板水溶液；
（2）在90℃条件下将大肠杆菌基因组DNA模板水溶液变性1min，52℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ和大肠杆菌基因组DNA模板退火1min，然后在70℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ延伸1min，此过程重复30次，得处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液和处理后引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ，将处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液、MgCl2、限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、处理后引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ按质量比20:3:5:6:5:12:9:9:9:9混合均匀后，得混合液，将混合液按体积比20:1加入液体石蜡油覆盖混合液表面，得扩增的PPK、ADK基因；
（3）将扩增的ADK基因，插入质粒pET28a (+)中，构建重组质粒pET28a (+)-ADK，将扩增的PPK基因插入重组质粒pET28a (+)-ADK中，构建重组表达质粒pET28a(+)-PPKADK，将重组菌进行诱导表达至4~5h时，收集菌液，离心，取沉淀菌丝体，超声破碎后，收集上清，将上清液进行质量分数为12%的SDS-PAGE电泳，得电泳产物，用镍亲和层析系统对电泳产物进行纯化，得洗脱液，将洗脱液用截留分子量为10000的超滤膜进行超滤除盐，得融合蛋白PPK-ADK；
（4）取融合蛋白PPK-ADK与polyP按质量比3:1混合，得混合物A，将混合物A在35℃条件下孵育10min后，取孵育后混合物按质量比2:1加入Beads-apyrase 继续孵育10 min，在磁铁的作用下，得去内源ADP融合蛋白产物；
（5）将AMP，PolyP，MgCl2，Tris-HCl，PPK-ADK按质量比5:80:12:20混合均匀，得微量ATP扩增反应液，将矿泉水与微量ATP扩增反应液按体积比1:9混合，反应，得反应物，将反应物pH调至7.4±0.2，向微量ATP扩增反应液中按体积比49:1加入ATP，35℃水浴，得反应液，将反应液按体积比1:10加入生物发光反应液中，利用荧光反应，即可检测矿泉水中微量的大肠杆菌。
实施例2
原料：质粒与菌株：宿主菌大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21及原核表达质粒 pET28a(+)，大肠杆菌标准株 CMCC(B)44102 为实验室保存。
试剂：限制性内切酶、 Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、PCR 产物纯化试剂盒，d-虫荧光素，AMP，polyP (average chain-length :65)，Apyrase，Dynabeads M-280 Tosylactivated。
引物：根据大肠杆菌 PPK、ADK基因序列和载体 pET28a (+)多克隆位点，设计引物ⅠPPK-P1 GTGTGTCATATGATGGGTCAGGAAAAGCTATA，
ⅡPPK-P2 GTGTGTGGATCCTTCAGGTTGTTCGAGTGATT，
ⅢADK-P1 GTGTGTGGATCCATG CGTATCATTCTGCTTGG，
ⅣADK-P2 GTGTGTAAGCTTTTAGCCGAGGATTTTTTCCA。
Beads-apyrase的制备：将聚胺醇与磁珠（magnetic beads）按质量比3:2混合均匀，加入反应器反应0.7h，得固相腺苷酸双磷酸酶（Beads-apyrase）。
生物发光反应液配制：将Tris-Ac，EDTA，Mg (Ac)2，PVP，BSA，DTT，d-虫荧光素，荧光素酶按质量比100:12:9:10:2:1:5混合均匀即得。
一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，该方法的制备包括如下步骤：
（1）将大肠杆菌菌株按质量比1:9接种至LB培养基中，36℃振荡培养22h，离心收集菌丝，将菌丝体按质量比1:10与Tris-HCl溶液混合，得菌丝混合液，将菌丝混合液与NaCl，EDTA按质量比2:50:1混合，置沸水浴1min，12000r /min离心10min，得上清液，取上清液按体积比2:3加入NaAc，上清液与NaAc的体积比为2:3，得上清液混合液，向上清液混合液中按质量比1:1加入异丙醇沉淀DNA，用体积分数为70%的乙醇水溶液洗涤沉淀2次，将沉淀真空干燥，得大肠杆菌基因组DNA模板，按质量比1:9溶于水中，制成大肠杆菌基因组DNA模板水溶液；
（2）在92℃条件下将大肠杆菌基因组DNA模板水溶液变性1min，53℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ和大肠杆菌基因组DNA模板退火1min，然后在71℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ延伸1min，此过程重复30次，得处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液和处理后引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ，将处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液、MgCl2、限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、处理后引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ按质量比20:3:5:6:5:12:9:9:9:9混合均匀后，得混合液，将混合液按体积比20:1加入液体石蜡油覆盖混合液表面，得扩增的PPK、ADK基因；
（3）将扩增的ADK基因，插入质粒pET28a (+)中，构建重组质粒pET28a (+)-ADK，将扩增的PPK基因插入重组质粒pET28a (+)-ADK中，构建重组表达质粒pET28a(+)-PPKADK，将重组菌进行诱导表达至5h时，收集菌液，离心，取沉淀菌丝体，超声破碎后，收集上清，将上清液进行质量分数为12%的SDS-PAGE电泳，得电泳产物，用镍亲和层析系统对电泳产物进行纯化，得洗脱液，将洗脱液用截留分子量为10000的超滤膜进行超滤除盐，得融合蛋白PPK-ADK；
（4）取融合蛋白PPK-ADK与polyP按质量比3:1混合，得混合物A，将混合物A在36℃条件下孵育10min后，取孵育后混合物按质量比2:1加入Beads-apyrase 继续孵育10 min，在磁铁的作用下，得去内源ADP融合蛋白产物；
（5）将AMP，PolyP，MgCl2，Tris-HCl，PPK-ADK按质量比5:80:12:20混合均匀，得微量ATP扩增反应液，将矿泉水与微量ATP扩增反应液按体积比1:9混合，反应，得反应物，将反应物pH调至7.4±0.2，向微量ATP扩增反应液中按体积比49:1加入ATP，36℃水浴，得反应液，将反应液按体积比1:10加入生物发光反应液中，利用荧光反应，即可检测矿泉水中微量的大肠杆菌。
实施例3
原料：质粒与菌株：宿主菌大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21及原核表达质粒 pET28a(+)，大肠杆菌标准株 CMCC(B)44102 为实验室保存。
试剂：限制性内切酶、 Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、PCR 产物纯化试剂盒，d-虫荧光素，AMP，polyP (average chain-length :65)，Apyrase，Dynabeads M-280 Tosylactivated。
引物：根据大肠杆菌 PPK、ADK基因序列和载体 pET28a (+)多克隆位点，设计引物ⅠPPK-P1 GTGTGTCATATGATGGGTCAGGAAAAGCTATA，
ⅡPPK-P2 GTGTGTGGATCCTTCAGGTTGTTCGAGTGATT，
ⅢADK-P1 GTGTGTGGATCCATG CGTATCATTCTGCTTGG，
ⅣADK-P2 GTGTGTAAGCTTTTAGCCGAGGATTTTTTCCA。
Beads-apyrase的制备：将聚胺醇与磁珠（magnetic beads）按质量比3:2混合均匀，加入反应器反应1h，得固相腺苷酸双磷酸酶（Beads-apyrase）。
生物发光反应液配制：将Tris-Ac，EDTA，Mg (Ac)2，PVP，BSA，DTT，d-虫荧光素，荧光素酶按质量比100:12:9:10:2:1:5混合均匀即得。
一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，该方法的制备包括如下步骤：
（1）将大肠杆菌菌株按质量比1:9接种至LB培养基中，37℃振荡培养24h，离心收集菌丝，将菌丝体按质量比1:10与Tris-HCl溶液混合，得菌丝混合液，将菌丝混合液与NaCl，EDTA按质量比2:50:1混合，置沸水浴1min，12000r /min离心10min，得上清液，取上清液按体积比2:3加入NaAc，上清液与NaAc的体积比为2:3，得上清液混合液，向上清液混合液中按质量比1:1加入异丙醇沉淀DNA，用体积分数为70%的乙醇水溶液洗涤沉淀2次，将沉淀真空干燥，得大肠杆菌基因组DNA模板，按质量比1:9溶于水中，制成大肠杆菌基因组DNA模板水溶液；
（2）在94℃条件下将大肠杆菌基因组DNA模板水溶液变性1min，55℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ和大肠杆菌基因组DNA模板退火1min，然后在72℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ延伸1min，此过程重复30次，得处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液和处理后引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ，将处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液、MgCl2、限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、处理后引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ按质量比20:3:5:6:5:12:9:9:9:9混合均匀后，得混合液，将混合液按体积比20:1加入液体石蜡油覆盖混合液表面，得扩增的PPK、ADK基因；
（3）将扩增的ADK基因，插入质粒pET28a (+)中，构建重组质粒pET28a (+)-ADK，将扩增的PPK基因插入重组质粒pET28a (+)-ADK中，构建重组表达质粒pET28a(+)-PPKADK，将重组菌进行诱导表达至5h时，收集菌液，离心，取沉淀菌丝体，超声破碎后，收集上清，将上清液进行质量分数为12%的SDS-PAGE电泳，得电泳产物，用镍亲和层析系统对电泳产物进行纯化，得洗脱液，将洗脱液用截留分子量为10000的超滤膜进行超滤除盐，得融合蛋白PPK-ADK；
（4）取融合蛋白PPK-ADK与polyP按质量比3:1混合，得混合物A，将混合物A在37℃条件下孵育10min后，取孵育后混合物按质量比2:1加入Beads-apyrase 继续孵育10 min，在磁铁的作用下，得去内源ADP融合蛋白产物；
（5）将AMP，PolyP，MgCl2，Tris-HCl，PPK-ADK按质量比5:80:12:20混合均匀，得微量ATP扩增反应液，将矿泉水与微量ATP扩增反应液按体积比1:9混合，反应，得反应物，将反应物pH调至7.4±0.2，向微量ATP扩增反应液中按体积比49:1加入ATP，37℃水浴，得反应液，将反应液按体积比1:10加入生物发光反应液中，利用荧光反应，即可检测矿泉水中微量的大肠杆菌。
对比例：上海某化工技术有限公司发明的微生物检测方法
方法：使用由实施例与对比例所发明的微生物检测方法检测同一份250ml的矿泉水中的微量大肠杆菌的含量（样品中大肠杆菌含量约在45~50CFu/ml之间)。
微生物检测方法检测具体情况如表1
表1
检测项目 实施例1 实施例2 实施例3 对比例
大肠杆菌含量（CFu/ml） 46 49 50 38
由上可知，本发明的微生物检测方法检测数值具体，操作简便，是一种安全且高效的微生物检测方法，值得推广和使用。

Claims (8)

1.一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：
将大肠杆菌菌株接种至LB培养基中，培养，离心收集菌丝，向菌丝体中加入Tris-HCl溶液，得菌丝混合液，将菌丝混合液与NaCl，EDTA按质量比2:50:1混合，置沸水浴，离心，取上清液加入NaAc，得上清液混合液，向上清液混合液中加入异丙醇，沉淀DNA，用体积分数为70%的乙醇水溶液洗涤沉淀2次，干燥，得大肠杆菌基因组DNA模板，将大肠杆菌基因组DNA模板溶于水，制成大肠杆菌基因组DNA模板水溶液；
在90~94℃条件下将大肠杆菌基因组DNA模板水溶液变性，52~55℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ和大肠杆菌基因组DNA模板退火，然后在70~72℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ延伸，此过程重复30次，得处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液和处理后引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ，将处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液、MgCl2、限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、处理后引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ混合均匀后，得混合液，将混合液加入液体石蜡油覆盖混合液表面，得扩增的PPK、ADK基因；
将扩增的ADK基因，插入质粒pET28a (+)中，构建重组质粒pET28a (+)-ADK，将扩增的PPK基因插入重组质粒pET28a (+)-ADK中，构建重组表达质粒pET28a(+)-PPKADK，将重组菌进行诱导表达，收集菌液，离心，取沉淀菌丝体，超声破碎后，收集上清液，将上清液进行质量分数为12%的SDS-PAGE电泳，得电泳产物，用镍亲和层析系统对电泳产物进行纯化，得洗脱液，将洗脱液用超滤膜进行超滤除盐，得融合蛋白PPK-ADK；
（4）取融合蛋白PPK-ADK与polyP混合，得混合物A，将混合物A孵育，取孵育后混合物加入Beads-apyrase 继续孵育，得去内源ADP融合蛋白产物；
（5）将AMP，PolyP，MgCl2，Tris-HCl，PPK-ADK混合均匀，得微量ATP扩增反应液，将矿泉水与微量ATP扩增反应液混合，反应，得反应物，将反应物调节pH，向微量ATP扩增反应液中加入ATP，水浴，得反应液，将反应液加入生物发光反应液中，利用荧光反应，即可检测矿泉水中微量的大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中大肠杆菌菌株与LB培养基的质量比1:9，培养条件为35~37℃培养18~24h，菌丝体与Tris-HCl溶液的质量比1:10，菌丝混合液与NaCl，EDTA的质量比为2:50:1，上清液与NaAC的体积比为2:3，上清混合液与异丙醇的质量比为1:1，大肠杆菌基因组DNA模板与水的质量比为1:9。
3.根据权利要求1所述的矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中根据大肠杆菌 PPK、ADK基因序列和载体 pET28a (+)多克隆位点，设计引物ⅠPPK-P1GTGTGTCATATGATGGGTCAGGAAAAGCTATA，
ⅡPPK-P2 GTGTGTGGATCCTTCAGGTTGTTCGAGTGATT，
ⅢADK-P1 GTGTGTGGATCCATG CGTATCATTCTGCTTGG，
ⅣADK-P2 GTGTGTAAGCTTTTAGCCGAGGATTTTTTCCA。
4.根据权利要求1所述的矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液、MgCl2、限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、处理后引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的质量比20:3:5:6:5:12:9:9:9:9。
5.根据权利要求1所述的矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中融合蛋白PPK-ADK与polyP的质量比为3:1，孵育条件为35~37℃孵育10min。
6.根据权利要求1所述的矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中Beads-apyrase的制备：将聚胺醇与磁珠按质量比3:2混合均匀，加入反应器反应0.5~1h，得固相腺苷酸双磷酸酶。
7.根据权利要求1所述的矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述步骤（5）中AMP，PolyP，MgCl2，Tris-HCl，PPK-ADK的质量比为5:80:12:20，微量ATP扩增反应液与ATP的体积比为49:1，反应液与生物发光反应液的体积比为1:10。
8.根据权利要求1所述的矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述步骤（5）中生物发光反应液配制：将Tris-Ac，EDTA，Mg (Ac)2，PVP，BSA，DTT，d-虫荧光素，荧光素酶按质量比100:12:9:10:2:1:5混合均匀即得。
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