JP2002186498A

JP2002186498A - 火落菌の検出法

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Publication number: JP2002186498A
Application number: JP2000389775A
Authority: JP
Inventors: Tadamichi Kabutomori; 忠道兜森; Yoshitaka Furuki; 吉孝古木; Tomoyuki Nanbara; 智之南原
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2002-07-02

Abstract

(57)【要約】【課題】ＡＴＰ生物発光法により火落菌を検出する方法
の改良に係り、火落菌を捕捉するための特殊なフィルタ
−、火落菌を増殖するための特殊な培地及び特殊な生物
発光画像解析システム装置を利用することなく、しかも
高度な熟練、勘及び経験を必要としない汎用型ルミノメ
−タを用いて、非常に簡便に、酒類の火落菌を検出でき
る方法を提供する。【解決手段】酒類又はその半製品を無菌水で希釈して、
アルコ−ル濃度を低減した後、そのまま培養し、得られ
た培養液を微生物細胞崩壊処理し、これにルシフェリン
・ルシフェラ−ゼ発光試薬を加えて、生じる発光量を測
定し、火落菌を検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＡＴＰ生物発光法
（ＡＴＰバイオルミネッセンス法）による火落菌の検出
法の改良に係り、特に火落菌を捕捉するための特殊なフ
ィルタ−、火落菌を増殖するための特殊な培地及び特殊
な生物発光画像解析システム装置を利用することなく、
しかも高度な熟練、勘及び経験を必要としない汎用型ル
ミノメ−タを用いて、非常に簡便に、火落菌を検出する
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】上槽後の清酒やみりんなど酒類が貯蔵中
または出荷後に雑菌の増殖で混濁、異臭、酸の増加等を
引き起こす現象を火落（ひおち）といい、その原因とな
る微生物（乳酸菌など）を火落菌と総称する。火落菌が
酒類中で増殖すると、酒類の風味を損ない、その商品価
値を著しく損なう。従って、できるだけ早期に簡便な方
法で酒類の火落菌を把握することは極めて重要である。

【０００３】従来、ＡＴＰ生物発光法により火落菌を検
出する方法として、日本酒を親水性ポリカ−ボネ−トメ
ンブレンフィルタ−で濾過し、その日本酒中に含まれて
いる火落菌を該フィルタ−上に捕捉し、次いで火落菌用
培地を用いてその火落菌を該フィルタ−上で培養した
後、そのフィルタ−の上からアデノシン−３−リン酸
（ＡＴＰ）抽出試薬を噴霧して火落菌中のＡＴＰを抽出
し、続いてその上にルシフェリン・ルシフェラ−ゼ発光
試薬を噴霧して該ＡＴＰを発光せしめた後、直ちに以上
の処理をしたフィルタ−を生物発光画像解析システム装
置に装着してその輝点を撮像し、生菌数を測定すること
を特徴とする日本酒中の火落菌の測定方法が知られてい
る（以下、「ＭＦ捕捉法」という）。

【０００４】しかしながら、この方法は火落菌を捕捉す
るための特殊なフィルタ−、捕捉した火落菌を増殖する
ため特殊な火落菌用培地及び特殊な生物発光画像解析シ
ステム装置などを必要とし、しかも汎用型ルミノメ−タ
では測定できない。また、一連の火落菌の測定操作が非
常に煩雑で、またフィルタ−の取扱い、火落菌用培地の
調製及び火落菌の培養などに高度な熟練や勘、経験を要
し、コストも嵩む難点を有する。さらにまたＡＴＰ抽出
試薬及びルシフェリン・ルシフェラ−ゼ発光試薬は、噴
霧して行なわなければならない問題点を有する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＡＴＰ生物
発光法により火落菌を検出する方法の改良に係り、特に
火落菌を捕捉するための特殊なフィルタ−、火落菌を増
殖するための特殊な培地及び特殊な生物発光画像解析シ
ステム装置を利用することなく、しかも高度な熟練、勘
及び経験を必要としない汎用型ルミノメ−タを用いて、
簡便に、そして安価に火落菌を検出する方法を提供する
ことを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、酒類又は
その半製品を無菌水で希釈して、アルコ−ル濃度を低減
した後、そのまま静置培養し、得られた培養液を微生物
細胞崩壊処理し、これにルシフェリン・ルシフェラ−ゼ
発光試薬を加えて、生じる発光量を測定することによ
り、上記課題を解決できることを知り、この知見に基づ
いて本発明を完成した。すなわち、本発明は、酒類又は
その半製品を無菌水で希釈して、アルコ−ル濃度を低減
した後、そのまま培養し、得られた培養物を微生物細胞
崩壊処理し、これにルシフェリン・ルシフェラ−ゼ発光
試薬を加えて、生じる発光量を測定することを特徴とす
る火落菌の検出法である。また本発明は、清酒又は清酒
原酒を無菌水で希釈して、アルコ−ル濃度を５〜１８ｖ
／ｖ％に低減した後、そのまま静置培養し、得られた培
養液を微生物細胞崩壊処理し、これにルシフェリン・ル
シフェラ−ゼ発光試薬を加えて、生じる発光量を測定す
ることを特徴とする清酒火落菌の検出法である。

【０００７】以下、本発明について詳細に説明する。

【０００８】（酒類の種類）まず、本発明で用いられる
酒類としては、清酒、みりん、ワイン、ビール及び蒸留
酒原酒（焼酎原酒）などが挙げられる。本発明は、これ
らの酒類のうち清酒及びみりんの火落菌の検出に威力を
発揮するので、清酒及びみりんが好ましい。

【０００９】（酒類又はその半製品）酒類としては、包
装容器に詰められ出荷予定の、あるいは出荷され店先で
陳列された酒類製品が挙げられ、また酒類の半製品とし
ては酒類の醪を上槽（圧搾）した後の醪液汁、貯蔵中の
醪液汁（例えば、清酒原酒、蒸留酒原酒）などが挙げら
れる。

【００１０】（水希釈用の無菌水）本発明で用いられる
無菌水としては、煮沸（殺菌）した水道水、煮沸（殺
菌）した井戸水又は蒸留水などが挙げられる。なお、検
出結果に影響を与える濃度の遊離ＡＴＰを含有する水道
水及び井戸水を使用する場合には、該無菌水にアデノシ
ンリン酸デアミナ−ゼ、アピラ−ゼなどのＡＴＰ消去剤
を適宜添加して、該遊離ＡＴＰを予め消去しておくこと
が好ましい（特開平９−１８２６００）。

【００１１】（水希釈後のアルコ−ル濃度）本発明は、
酒類又はその半製品を無菌水で希釈して、アルコ−ル濃
度を低減した後、そのまま培養することを特徴としてい
る。この際、アルコ−ル低減率は、酒類又はその半製品
の本来有するアルコ−ル濃度を２０％以上減、特に３０
〜６０％減したものが好ましい。そして、水希釈後のア
ルコ−ル濃度が５〜１８ｖ／ｖ％、特に８〜１５ｖ／ｖ
％に低減することが好ましい。無菌水の添加により酒類
のアルコ−ルが５ｖ／ｖ％未満に低減（希釈）すると、
酒類に混入した火落菌以外の雑菌（これらは一般に高濃
度アルコ−ル中では増殖できないが、アルコ−ル濃度が
低下すると増殖が可能となる）が旺盛に増殖し、酒類の
火落菌を選択的に検出することが困難になるので好まし
くない。反対に１８ｖ／ｖ％を越えると、火落菌の生育
が緩慢となり、検出の結果を得るのにより時間がかかる
ので好ましくない。これに対し、酒類を無菌水で希釈し
てアルコ−ル濃度を特に５〜１８ｖ／ｖ％に低減する
（または調整する）と、火落菌が選択的に旺盛に増殖
し、火落菌を迅速に検出することが可能となる。

【００１２】（水希釈液の培養条件：温度）また培養の
温度は、２０〜４０℃、特に２５〜３５℃で、１２時間
以上、特に１〜３日行うことが好ましい。

【００１３】（培養手段）また、培養手段は、任意の培
養法が挙げられるが、静置培養法が特に好ましい。

【００１４】（ＡＴＰ生物発光法による火落菌の検出
法：微生物細胞崩壊処理）次いで、水希釈液を培養して
得られた培養液を超音波処理するか、又は該培養液に微
生物ＡＴＰ抽出試薬を添加して、微生物細胞崩壊処理
し、火落菌由来のＡＴＰを培養液に抽出し遊離する。

【００１５】（微生物ＡＴＰ抽出試薬）上記微生物ＡＴ
Ｐ抽出試薬としては、界面活性剤、トリクロロ酢酸（Ｔ
ＣＡ）、アルコール、エーテル、エステル、ハロゲン化
炭水化物、アセトニトリル、トリエチルアミン、溶菌酵
素などを含んだ試薬を挙げることができる。

【００１６】（ルシフェリン・ルシフェラ−ゼ発光試薬
の添加）微生物細胞崩壊処理液（火落菌由来の遊離ＡＴ
Ｐを含有する）にルシフェリン・ルシフェラ−ゼ発光試
薬を添加して、生じる発光量を測定し、火落菌を検出す
る。微生物ＡＴＰ抽出剤及びルシフェリン・ルシフェラ
−ゼ発光試薬としては、従来公知の試薬、または市販品
が用いられる。市販品としては、微生物ＡＴＰ抽出剤及
びルシフェリン・ルシフェラ−ゼ発光試薬がセットとな
ったＡＴＰ測定キット「ルシフェール２５０プラス（キ
ッコーマン社製）」などが挙げられる。

【００１７】（発光量測定機器）生じる発光量の測定
は、汎用型ルミノメーターが好ましい。ルミノメ−タに
よれば、発光強度より火落菌由来のＡＴＰ濃度を測定
し、火落菌による汚染菌の有無及び汚染の程度を迅速に
判断することが可能となる。ここで用いるルミノメータ
ーとしては、例えば小型でしかも高性能なルミテスター
Ｋ−２１０やルミテスターＣ−１００（キッコーマン社
販売）が挙げられる。これらのルミテスタ−は、運転及
び測定操作が楽に行え、高度な熟練、勘および経験を必
要としない特徴を有する。

【００１８】（火落菌の検出結果を得る）発光量の測定
結果に基づき、酒類及びその半製品の火落菌汚染の有無
及び汚染があった場合、その汚染程度を推定し、検出結
果とする。

【００１９】

【実施例】以下、実施例を示して本発明をより具体的に
説明する。

【００２０】実施例１（清酒原酒の火落菌の検出法）１）検体液の調製火落菌を含まない清酒原酒（エタノール濃度約２０ｖ／
ｖ％）を用いた。これに、火落した清酒から分離した火
落菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）を接種し、３×
１０⁰cells/mlから３×１０³cells/mlまで、火落菌を各
濃度で含む希釈系列を作成、検体原酒液とした。なお火
落菌を接種していない清酒原酒をテストブランクに用い
た。検体原酒液を蒸留水（無菌水）で希釈し、エタノー
ル濃度が約１０ｖ／ｖ％の検体液を調製した。

【００２１】２）検体液の培養検体液を滅菌済みの蓋付きプラスチック製試験管に入
れ、密封し、３０℃の恒温室に入れ、２４時間及び４８
時間静置培養を行った。

【００２２】３）火落菌の検出培養直前、培養２４時間後、同４８時間後の検体液の火
落菌由来ＡＴＰをＡＴＰ生物発光法により測定した。即
ち、検体液０．１ｍｌをディスポーザブルタイププラス
チック試験管（製品名：ルミチューブ、キッコーマン社
製）に採り、これに微生物ＡＴＰ抽出剤（「ルシフェー
ル２５０プラス」、キッコーマン社製）０．１ｍｌを添
加、火落菌細胞を崩壊処理し、細胞内ＡＴＰを抽出し
た。続いて、これにルシフェリン・ルシフェラーゼ発光
試薬（「ルシフェール２５０プラス」、キッコ−マン社
製）を０．１ｍｌ加え、発光させた。発光試薬を加えた
後、直ちに生じる発光量をルミノメーター（商品名：ル
ミテスターＣ−１００、浜松ホトニクス社製、キッコー
マン社販売品）を用いて測定し、その含有ＡＴＰ量に比
例した発光量を相対発光量（ＲＬＵ）で示した。初発
（培養直前）、培養２４時間後及び同４８時間後におけ
る検体液の発光量（ＲＬＵ）の経時的変化を表１に示
す。

【００２３】表１培養液の発光量（ＲＬＵ）の経時的変化清酒原酒発光量発光量発光量火落菌濃度（初発）（２４時間後）（４８時間後）（cells / ml）（RLU）（RLU）（RLU）３×１０³ ６６１，１００３３，０００３×１０² １５１１６３，２２９３×１０¹ １０２０２９８３×１０⁰ ９１１３６テストブランク１０９１１

【００２４】表１の結果から、火落菌を比較的高濃度
（３×１０²cells/ml、３×１０³cells/ml）含む検体液
は僅か２４時間後に発光量（ＲＬＵ）が、それぞれ１，
１００及び１１６を示し、火落菌を接種していない検体
液（テストブランク）のそれ９と比べると、発光量に有
意な差が認められ、また、火落菌を低濃度（３×１０¹c
ells/ml、３×１０⁰cells/ml）含む検体液では４８時間
後に発光量（ＲＬＵ）が、それぞれ２９８及び３６を示
し、テストブランクのそれ１１と比べると、発光量に有
意な差が認められた。以上のことから、本発明によれ
ば、検体原酒液の火落菌による汚染の有無と検体原酒液
の火落菌濃度をわずか２４〜４８時間で、推定もしくは
判定できることが判る。即ち、本発明によれば、清酒原
酒の既知火落菌濃度と、該原酒を水希釈後特定条件で培
養したときのＡＴＰ生物発光法に基づく火落菌由来ＡＴ
Ｐ発光量との関係を、検量線などを作成して、調べてお
けば、検体原酒液の火落菌による汚染の有無と火落菌濃
度をわずか２４〜４８時間で、推定もしくは判定、即ち
検出できることが判る。

【００２５】次に、火落菌の検出について、ＭＦ捕捉法
と本発明法の相違点を、表２に示す。

【００２６】表２火落菌の検出法（ＭＦ捕捉法と本発明法の相違点一覧表）（ＭＦ捕捉法）（本発明法）被検液の水希釈の有無 × ○ 火落菌培養の有無 ○ ○ 被検液の菌捕捉フィルタ−の使用 ○ × 菌捕捉フィルタ−培養 ○ × 火落菌用培地の使用 ○ × 微生物ＡＴＰ抽出剤噴霧器による添加液状のまま添加ルシフェリン・ルシフェラ−ゼ発光噴霧器による添加液状のまま添加試薬培養並びに検出操作操作が煩雑操作が容易注）○：「有り」を意味する。×：「無し」を意味する。

【００２７】

【発明の効果】１）火落菌の検出方法としては、財団法
人、「日本醸造協会」販売の火落菌検出培地「ＳＩ培
地」を用いる方法及び検酒ビンを用いる方法が知られて
いるが、これらの方法は、火落菌のコロニ−や混濁の形
成に３日〜１週間待たねばならない。また、ＰＣＲ反応
キット（宝酒造社製）を用いる方法も知られているが、
操作が煩雑であるばかりでなく、熟練及び経験を要し、
費用が嵩む難点を有する。これに対し、本発明は、だれ
でも１２時間〜３日で非常に簡単に、費用も安く行うこ
とができる。２）本発明は、火落菌を捕捉するための特殊なフィルタ
−、火落菌を増殖するための特殊な培地及び特殊な生物
発光画像解析システム装置を利用することなく、汎用型
ルミノメ−タを用いて、火落菌を検出することができ
る。３）本発明は酒類又はその半製品を無菌水で希釈し、こ
れを包装用容器や蓋付きプラスチック試験管などに入
れ、密封した後、１２時間〜３日静置するだけの前処理
を行えば、極めて簡単に火落菌の測定が行える特徴を有
し、高度な熟練や勘、経験を要しない。４）本発明は清酒、みりん等の酒類における火落菌汚染
の有無、汚染の程度が迅速、的確に、しかも極めて容易
に把握できるので、速やかに火落菌による酒類品質の劣
化防止対策を講ずることによって、火落ちによる損害を
未然に防止することが可能となり、酒類製造業界の品質
管理に多大な貢献をもたらす効果を奏する。５）本発明は、ヘテロ発酵型真性火落菌（Ｌａｃｔｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）、ホモ型
真性火落菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｏｍｏｈ
ｉｏｃｈｉｉ）、ヘテロ発酵型火落性乳酸菌（Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｉｌｇａｒｄｉｉなど）、ホモ
発酵型火落性乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃ
ａｓｅｉなど）、火落した清酒などから分離される微生
物及び酒類に混入すると火落を招来する微生物などを酒
類中より検出することができる。６）ＡＴＰ生物発光法は、生きた微生物には必ず存在す
るＡＴＰを生物発光法を用いて測定する方法で、細胞を
含む試料を、ＡＴＰ抽出試薬と接触させて細胞崩壊処理
し、細胞内ＡＴＰを細胞外に抽出した後、抽出したＡＴ
Ｐをルシフェリン・ルシフェラ−ゼ発光試薬と接触し、
酵素反応により生物発光させ、その生成した発光量を測
定して細胞内ＡＴＰを測定し、細胞の測定を行う方法で
ある。ところが、ＡＴＰは本来、その量の差こそあれ、
すべての生物の細胞内に含まれるもので、微生物ばかり
でなく、単細胞生物にも、そして動植物組織の細胞にも
存在し、またさらに生物細胞の周辺にはフリ−（遊離）
のＡＴＰが存在する。従って、ある生物細胞を含有する
試料から生物細胞だけに存在するＡＴＰを検出しようと
しても、生物細胞中のＡＴＰと、その周辺に存在する遊
離ＡＴＰが一緒になって検出されてくる。即ち、生物細
胞の測定にＡＴＰを指標にしようと思っても、今述べた
生物細胞以外の遊離ＡＴＰがバックグランド発光量（ノ
イズ）として同時に測定され、検出感度の低下を招来す
る欠点を有する。そのため、一般にＡＴＰ生物発光法に
より火落菌を測定するには、火落菌を含有する試料か
ら、予め遊離ＡＴＰを消去しておくことが非常に重要な
操作となる。さて、一般に知られている火落菌検出培地
「ＳＩ培地」は、ＡＴＰ関連物質が高濃度に含まれてい
るため、この培地をルシフェリン・ルシフェラ−ゼ発光
試薬と接触させると、強い発光反応が起こり、その発光
が菌体から抽出されたＡＴＰの発光と混同して火落菌の
正確な測定が全くできない。従って、先に紹介したＭＦ
捕捉法では、ＡＴＰ関連物質の含量が非常に少ないＴＭ
培地を用いることにより、上記不都合を解消している
（特開平７−１９５参照）。これに対し、本発明では、
水希釈した酒類又はその半製品を、火落菌検出培地とし
て用いるものであるが、驚くべきことに、これらの試料
（酒類又はその半製品）は遊離ＡＴＰの含量が非常に少
ないため、火落菌の検出操作に当たり、予め試料の遊離
ＡＴＰを消去しておく必要がないことを発見した。した
がって、本発明は、ＡＴＰ消去剤、並びに予め酒類又は
その半製品から遊離ＡＴＰを消去するための操作を省略
できる利点を有する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ63 QR02 QR66 QR69 QS14 QS24 QS28 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酒類又はその半製品を無菌水で希釈して、
アルコ−ル濃度を低減した後、そのまま培養し、得られ
た培養液を微生物細胞崩壊処理し、これにルシフェリン
・ルシフェラ−ゼ発光試薬を加えて、生じる発光量を測
定することを特徴とする火落菌の検出法。
【請求項２】酒類が、清酒又はみりんである請求項１に
記載の火落菌の検出法。
【請求項３】無菌水が、水道水、井戸水又は蒸留水であ
る請求項１に記載の火落菌の検出法。
【請求項４】培養を、２０〜４０℃で１２時間〜３日行
う請求項１に記載の火落菌の検出法。
【請求項５】培養が、静置培養である請求項１に記載の
火落菌の検出法。
【請求項６】酒類又はその半製品を無菌水で希釈して、
アルコ−ル濃度を５〜１８ｖ／ｖ％に低減することを特
徴とする請求項１に記載の火落菌の検出法。
【請求項７】清酒又は清酒原酒を無菌水で希釈して、ア
ルコ−ル濃度を５〜１８ｖ／ｖ％に低減した後、そのま
ま静置培養し、得られた培養液を微生物細胞崩壊処理
し、これにルシフェリン・ルシフェラ−ゼ発光試薬を加
えて、生じる発光量を測定することを特徴とする清酒火
落菌の検出法。