WO2024019166A1 - 溶液中の微生物若しくは細胞、又は微生物関連物質若しくは細胞関連物質を検出する方法及びキット - Google Patents

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WO2024019166A1
WO2024019166A1 PCT/JP2023/026837 JP2023026837W WO2024019166A1 WO 2024019166 A1 WO2024019166 A1 WO 2024019166A1 JP 2023026837 W JP2023026837 W JP 2023026837W WO 2024019166 A1 WO2024019166 A1 WO 2024019166A1
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microorganisms
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PCT/JP2023/026837
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悠子 一柳
繁哉 鈴木
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キッコーマン株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase

Definitions

  • the present invention relates to a method and kit for detecting microorganisms or cells, or microorganism-related substances or cell-related substances in a solution.
  • Adenosine triphosphate (hereinafter referred to as ATP) is a nucleotide found in all living organisms, and is used by cells as a substrate to store and release energy. Microorganisms and cells can be detected by measuring ATP.
  • Non-Patent Document 1 a method is known in which ATP and substrate luciferin are reacted in the presence of luciferase and luminescence is measured. This reaction is catalyzed by luciferase and proceeds as follows in the presence of divalent metal ions. [ka] Luciferin + ATP + O 2 ⁇ Oxyluciferin + Adenosine Monophosphate (AMP) + Pyrophosphate (PPi) + CO 2 + Light
  • Luciferase is found in bacteria, protozoa, molluscs, insects, etc. Insects that have luciferase include beetles such as fireflies and click beetles. Many luciferase genes have been isolated, and their nucleotide sequences have also been determined.
  • ATP ATP
  • kits for this purpose are also commercially available from various companies.
  • Water and beverages contain AMP and ADP in addition to ATP, so attempting to measure ADP and AMP in addition to ATP has been inconvenient, such as increasing background noise.
  • Living bacteria contain a lot of ATP, and in order to measure bacteria contained in drinks and water, it is sufficient to measure only ATP, and it is advantageous to measure only ATP. This was the conventional technical common sense.
  • Non-Patent Document 1 As a method for measuring microorganisms, Sakakibara et al. trapped bacteria on polyvinylidene fluoride (PVDF) filters, extracted them by spraying them with an extractant, and then sprayed them with a luminescent reagent and detected the luminescence using a CCD camera. reported a method for measuring bacterial-derived ATP+AMP (Non-Patent Document 1). However, this measurement does not measure microorganisms by collecting ATP+AMP derived from microorganisms into a solution, but rather by making the microorganisms collected on a filter emit light on the filter and measuring the bright spots.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • Non-Patent Document 1 if you try to add a high concentration of luciferase during measurement in order to obtain a high luminescence amount, ATP will be rapidly consumed, and even if you integrate the luminescence amount for a certain period of time from the start of luminescence, Since a sufficiently high luminescence level could not be obtained, a cycling reaction using pyruvate-phosphate dikinase (PPDK) to return AMP generated by consuming ATP back to ATP was used to maintain the luminescence level at a high level.
  • PPDK pyruvate-phosphate dikinase
  • the filter is made of a hydrophobic material that has been treated to make it hydrophilic in spots, and a devised hydrophobic grid film is used to prevent the ATP attached to the spots from spreading or bleeding. is used.
  • a CCD camera with high sensitivity and suppressed background noise is required as a detection device, but such a device is extremely expensive.
  • a series of measurement operations must be performed in an environment such as a clean bench or clean room to prevent ATP contamination during experimental operations, and these operations are also complicated and require skill.
  • Table 2 of Non-Patent Document 1 also includes the results for ATP+ADP+AMP, but these are not experiments using a PVDF filter but are in vitro results. Moreover, in Table 2, there is no big difference between ATP+AMP and ATP+ADP+AMP. Furthermore, the authors of Non-Patent Document 1 consider that intracellular ATP+AMP is more stable than ATP (left column on page 55). Patent Document 2 also describes a similar technique.
  • Non-Patent Document 1 page 49 left, etc.
  • culturing microorganisms to amplify luminescence signals increases the overall measurement time. This was inconvenient in situations where quick results were required.
  • Patent Document 3 describes a method in which microorganisms are collected on a filter, a solution in which ATP is extracted from the microorganisms with an ATP extractant is recovered, and the amount of luminescence is measured using luciferase.
  • the method described in Patent Document 3 is a method in which alanine, glucose, and phosphoric acid are added in order to highly sensitively measure bacteria (spores, spores, etc.) with low microbial activity and a decreased ATP level.
  • alanine, glucose, and phosphoric acid are added in order to highly sensitively measure bacteria (spores, spores, etc.) with low microbial activity and a decreased ATP level.
  • Non-Patent Document 1 removes free extracellular ATP, ADP, and AMP by centrifugation, removal of supernatant, and resuspension (Non-Patent Document 1, p. 52). Furthermore, Non-Patent Document 1 further decomposes extracellular nucleotides using adenosine phosphate deaminase.
  • a centrifugal separator requires complicated operations, and takes time to eliminate free nucleotides that cause background light emission.
  • An object of the present invention is to provide a method and kit for detecting microorganisms or cells, microorganism-related substances, or cell-related substances, which at least partially solves the above problems.
  • the present inventors have conducted intensive studies on methods for measuring ATP, ADP, and AMP. Instead of centrifugation, supernatant removal, and resuspension, and nucleotide removal steps, the present inventors have determined that the method of measuring ATP, ADP, and AMP can be measured by filtering the sample. It was confirmed that free ATP, ADP, and AMP can be washed away by filtration, and that ATP, ADP, and AMP outside the bacterial cells can be easily eliminated.
  • the filter filtration method we encountered the problem that the measured values varied from bacteria to bacteria, and even from experiment to experiment even for the same bacteria.
  • the present invention includes the following embodiments.
  • the following steps (i) passing the solution through a filter to collect microorganisms or cells on the filter; (ii) contacting the microorganisms or cells collected on the filter with an extractant to extract the adenine nucleotide component of the microorganisms or cells; (iii) contacting the extracted adenine nucleotide component with a luminescent reagent containing luciferase and an enzyme that generates ATP from AMP; (iv) a step of measuring the amount of luminescence;
  • a method for detecting microorganisms or cells in a solution comprising:
  • kits for detecting microorganisms or cells in a solution comprising:
  • the said instruction manual is (i) a step of filtering the solution and collecting microorganisms or cells; (ii) adding an extractant to the collected microorganisms or cells to extract the adenine nucleotide component from the microorganisms or cells; (iii) contacting the extracted adenine nucleotide component with a luminescent reagent containing luciferase and an enzyme that generates ATP from AMP; (iv) a step of measuring the amount of luminescence;
  • the kit described above is for detecting microorganisms or cells.
  • kits for detecting microorganisms or cells in a solution comprising:
  • the said instruction manual is (i) Filtering the solution with a filter to collect microorganisms or cells, (ii) adding an extractant to the collected microorganisms or cells to extract the adenine nucleotide component from the microorganisms or cells; (iii) contacting the extracted adenine nucleotide component with a luminescent reagent containing luciferase and an enzyme that generates ATP from ADP; (iv) Measuring the amount of luminescence;
  • the kit described above is for detecting microorganisms or cells.
  • the luminescent reagent further includes an enzyme that generates ADP from AMP, or an enzyme that generates ADP from ATP and AMP.
  • Embodiment 9 wherein the extractant contains one or more of a surfactant, a cationic surfactant, an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, a nonionic surfactant, or benzalkonium chloride.
  • a surfactant a cationic surfactant, an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, a nonionic surfactant, or benzalkonium chloride.
  • kits contains a reagent for erasing ATP, ADP, or AMP outside the bacterial body, and the instructions for use further describe the steps for erasing ATP, ADP, or AMP outside the bacterial body.
  • the kit according to any one of Forms 9 to 15.
  • microorganisms or cells can be detected easily.
  • Example 1 An example of a procedure for detecting microorganisms by measuring adenine nucleotides is shown. This is an overview of Example 1.
  • the relative luminescence amount in adenine nucleotide measurement of each microorganism is shown.
  • the relative luminescence amount in adenine nucleotide measurement of each microorganism when using an ATP scavenging reagent is shown.
  • the luminescence amount of each microorganism (ATP+AMP measurement, Advantech Toyo filter) is shown.
  • the luminescence amount of each microorganism (ATP+AMP measurement, GVS Filter Technology filter) is shown.
  • the luminescence amount (ATP+AMP measurement, Merck Millipore filter) of each microorganism is shown.
  • the luminescence amount of E.coli (ATP+ADP+AMP measurement, Advantech Toyo filter) is shown.
  • the luminescence amount of E.coli ATP+ADP+AMP measurement, GVS Filter Technology filter) is shown.
  • Shows the luminescence amount of E.coli ATP+ADP+AMP measurement, Membrane Solutions filter).
  • the luminescence amount of E.coli ATP+ADP+AMP measurement, Merck Millipore filter
  • the invention provides a method of detecting microorganisms or cells in solution.
  • This method is (i) passing the solution through a filter to collect microorganisms or cells on the filter; (ii) contacting the microorganisms or cells collected on the filter with an extractant to extract the adenine nucleotide component of the microorganisms or cells; (iii) contacting the extracted adenine nucleotide component with a luminescent reagent containing luciferase and an enzyme that generates ATP from AMP; (iv) a step of measuring the amount of luminescence; may include.
  • the adenine nucleotide component can be ATP, ADP, and/or AMP.
  • nucleotides, adenine nucleotides, ATP, ADP, and AMP are sometimes referred to as microorganism-related substances or cell-related substances.
  • the invention provides a method of detecting microorganisms or cells in solution.
  • This method is (i) passing the solution through a filter to collect microorganisms or cells on the filter; (ii) contacting the microorganisms or cells collected on the filter with an extractant to extract the adenine nucleotide component of the microorganisms or cells; (iii) contacting the extracted adenine nucleotide component with a luminescent reagent containing luciferase and an enzyme that generates ATP from ADP; (iv) Measuring the amount of luminescence; may include.
  • the filter in step (i) collects microorganisms or cells on the filter and allows impurities to pass through to the filtrate side.
  • the filter has a pore size that can trap microorganisms or cells, for example, a filter with a pore size of 0.2 ⁇ m, 0.45 ⁇ m, 0.5 ⁇ m, 0.8 ⁇ m, etc. may be used.
  • a membrane filter unit or the like that can be attached to a syringe or the like for filtration can be used.
  • the filter can be a filter comprising cellulose acetate.
  • the filter is a cellulose acetate filter.
  • the cellulose mixed ester membrane is known as a mixed cellulose ester membrane containing cellulose acetate and nitrocellulose.
  • a filter made of a cellulose mixed ester membrane or a filter containing a cellulose mixed ester membrane does not fall under the "cellulose acetate filter” referred to in this specification.
  • the method of bringing the microorganisms or cells collected on the filter into contact with the extractant is not limited, but for example, the adenine nucleotide component may be extracted by sucking up the extractant with the syringe used for filter filtration while the filter is connected to the syringe. , the drawn solution can then be drawn out of the syringe. See, for example, FIG.
  • the extracted solution that is, the solution containing the extracted adenine nucleotide component
  • a luminescent reagent To contact the solution containing the extracted adenine nucleotide component with the luminescent reagent, the solution containing the extracted adenine nucleotide component may be added to the luminescent reagent using a pipette, and the solution containing the extracted adenine nucleotide component may be added to the luminescent reagent using a pipette.
  • the solution may be added as is to a test tube containing the luminescent reagent, or the solution containing the extracted adenine nucleotide component may be collected with a cotton swab or the like, and the swab may be brought into contact with the luminescent reagent. Alternatively, the cotton swab may be further suspended in a solution and the suspended solution added to the luminescent reagent.
  • the luminescent reagent may include luciferase. In another embodiment, luciferase may be added externally. In certain embodiments, the luminescent reagent comprises luciferin. In another embodiment, luciferin may be added externally. In certain embodiments, the luminescent reagent can include an enzyme that generates ATP from AMP. In certain embodiments, the luminescent reagent may further include an enzyme that generates ATP or AMP from ADP. In certain embodiments, the luminescent reagent may include an enzyme that generates ATP from ADP. In certain embodiments, the enzyme that generates ATP from ADP can be, but is not limited to, pyruvate kinase (PK).
  • PK pyruvate kinase
  • the extractant may include one or more of a surfactant, a cationic surfactant, an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, a nonionic surfactant, or benzalkonium chloride.
  • the invention provides kits for performing the above methods.
  • the kit includes: (i) an extractant containing a surfactant; (ii) a sampling section containing a surfactant adsorbent; (iii) a luminescent reagent; and (iv) instructions for use.
  • the instructions for use may describe procedures for carrying out the method described above.
  • the kit may further include a luminescence measurement unit.
  • the kit may be used in combination with a luminescence measurement unit.
  • the luminescence amount measurement unit commercially available luminescence measurement devices such as Lumitester C-110 and Lumitester Smart can be used, but are not limited thereto.
  • the luminescent reagent may include luciferase and luciferin.
  • the extractant may also include one or more of a surfactant, a cationic surfactant, an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, a nonionic surfactant, or benzalkonium chloride.
  • the luminescent reagent may further include an enzyme that generates ATP from AMP. Moreover, regarding the kit, the luminescent reagent may further include an enzyme that generates ATP from ADP or an enzyme that generates AMP from ADP. Additionally, the kit may further include a filter. The filter may be a cellulose acetate filter.
  • Extractants include surfactants. Additionally, extractants may include cell lysis reagents such as lysozyme (EC 3.2.1.17) and combinations thereof. In certain embodiments, surfactants that can be used in the extractant include nonionic surfactants, cationic surfactants, anionic surfactants, and zwitterionic surfactants, such as benzalkonium chloride. can be mentioned.
  • Nonionic surfactants include polyoxyethylene alkyl ethers, fatty acid sorbitan esters, alkyl polyglucosides, fatty acid diethanolamides, alkyl monoglyceryl ethers, such as Triton (registered trademark) X-100, Triton (registered trademark) X-45 , Tween(R) 20, Tween(R) 60, Tween(R) 80, Span(R) 60, Span(R) 80, and Thesit(R).
  • Triton (registered trademark) X-100 Triton (registered trademark) X-45
  • Tween(R) 20 Tween(R) 60, Tween(R) 80, Span(R) 60, Span(R) 80, and Thesit(R).
  • Cationic surfactants include quaternary ammonium salts, pyridinium salts, phosphonium salts, such as alkyltrimethylammonium salts, dialkyldimethylammonium salts, alkylbenzyldimethylammonium salts, alkylpyridinium salts, alkylphosphonium salts, imidazolium salts, alkylimidazo Examples include lium salt, isoquinonium salt, alkylisoquinonium salt, cetyltrimethylammonium or benzyldimethyldodecylammonium bromide, or benzalkonium chloride.
  • quaternary ammonium salts include decyltrimethylammonium chloride or bromide, dodecyltrimethylammonium chloride or bromide, tetradecyltrimethylammonium chloride or bromide, hexadecyltrimethylammonium chloride or bromide, octadecyltrimethylammonium chloride or bromide, eicosyltrimethyl Mention may be made of ammonium chloride or bromide.
  • Examples of the pyridinium salt include 1-decylpyridinium chloride or bromide, 1-dodecylpyridinium chloride or bromide, 1-tetradecylpyridinium chloride or bromide, 1-hexadecylpyridinium chloride or bromide, N-cetyl-2-methylpyridinium chloride. , N-cetyl-3-methylpyridinium chloride, N-cetyl-4-methylpyridinium chloride, 1-octadecylpyridinium chloride or bromide, 1-eicosylpyridinium chloride or bromide.
  • Phosphonium salts include, for example, tetraethylphosphonium chloride or bromide, tributylmethylphosphonium chloride, bromide or iodide, tetrabutylphosphonium chloride or bromide, tetra-n-octylphosphonium chloride or bromide, tributyldodecylphosphonium chloride or bromide, tributylhexadecylphosphonium Mention may be made of chloride or bromide, methyltriphenylphosphonium chloride, bromide or iodide, tetraphenylphosphonium chloride or bromide.
  • Zwitterionic surfactants include sulfobetaine surfactants, such as sulfobetaine 3-10, alkyldimethylamine oxide, alkylcarboxybetaine, CHAPS, CHAPSO, Big Chap, Brij (registered trademark), 3-(N,N -dimethylmyristyl ammonio)propanesulfonic acid (Zwittergent(TM) 3-14) and the like, but are not limited thereto.
  • anionic surfactants include deoxycholate, linear alkylbenzene sulfonate, alkyl sulfate, alpha olefin sulfonate, polyoxyethylene alkyl ether sulfate, ⁇ -sulfo fatty acid ester salt, and alkali of natural fatty acid.
  • metal salts such as sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • the extractant may include a surfactant.
  • the surfactant contained in the extractant has a concentration in the measurement system of 0.0001% to 5% by weight, 0.001% to 3% by weight, 0.01% to 2% by weight, 0.1% by weight.
  • the amount can be from % to 1.5% by weight, etc.
  • the extractant can be a microbial extractant or a cellular extractant.
  • microorganisms and cells are sometimes collectively referred to as a specimen from which ATP and the like contained therein are extracted.
  • the specimen from which ATP and the like contained therein are extracted includes cells.
  • the specimen from which the contained ATP and the like are extracted by extraction contains microorganisms.
  • the terms microorganism and cell are not mutually exclusive. There may be specimens (measurement targets) that are both microorganisms and cells (unicellular microorganisms, etc.). When mutually exclusive terms must be used, the specimen from which the contained ATP etc. are removed by extraction includes microorganisms and non-microbial cells.
  • non-microbial cells include cells that are not derived from microorganisms, such as animal cells, animal-derived cells, plant cells, plant-derived cells, insect cells, and insect-derived cells.
  • microorganisms such as animal cells, animal-derived cells, plant cells, plant-derived cells, insect cells, and insect-derived cells.
  • fungi and fungi are referred to as microorganisms.
  • the luminescent reagent may also contain an enzyme stabilizer, such as bovine serum albumin or gelatin, which protects the reporter molecule, such as luciferase, from degradation.
  • the luminescent reagent may also contain substances that adjust pH or improve storage stability. For example, suitable pH buffers (HEPES, Tricine, Tris, phosphate buffer, acetate buffer, etc.), reducing agents (dithiothreitol (DTT), 2-mercaptoethanol, etc.), sugars (glucose, sucrose, trehalose, etc.) etc.
  • luminescent reagents include luciferase and luciferin.
  • metal ions such as magnesium, manganese, calcium, etc. may also be included.
  • Luciferase converts ATP, O 2 and luciferin into AMP, pyrophosphate, CO 2 and oxyluciferin, resulting in luminescence.
  • the luciferase may be a naturally occurring luciferase or a genetically engineered recombinant luciferase variant. Luciferase variants may be site-directed or random mutagenized. It may also be a fusion protein with a protein having other functions. Luciferase variants can have desired properties, such as those with improved heat resistance or surfactant resistance.
  • the amount of luminescence of luciferase can be measured using an appropriate luminometer, such as a luminometer (manufactured by Berthold, Lumat LB9510, Junior LB9509, Sirius 2 LB9526, or Centro LB963, Kikkoman Biochemifa, Lumitester (registered trademark) C-110).
  • the relative luminescence intensity (RLU) obtained using a Lumitester (registered trademark) Smart, etc.) can be used as an index for evaluation.
  • the luminescence produced during the conversion of luciferin to oxyluciferin is measured.
  • the luciferase is not particularly limited as long as it uses ATP as a substrate, but luciferases derived from bacteria, protozoa, animals, molluscs, and insects can be used.
  • insect-derived luciferases include beetle luciferases, such as those of the genus Photinus, such as the North American firefly (Photinus pyralis), the genus Photuris, such as Photuris lucicrescens, Photuris pennsylvanica, and the genus Luciola, such as Luciola cruciata.
  • luciferase genes have been reported, and their nucleotide sequences and amino acid sequences can be obtained from known databases such as GeneBank.
  • the luciferase gene may be wild type or may have a mutation. Mutations may be site-specifically introduced or may be random mutations. Known mutations include mutations that improve the luminescence amount as described in JP-A No. 2011-188787, mutations that increase the persistence of luminescence as described in JP-A No. 2000-197484, and Japanese Patent No. 2666561. Mutations that change the emission wavelength as described in Publications or Special Publication No. 2003-512071, mutations that increase surfactant resistance as described in JP-A No. 11-239493, and International Publication No. 99/02697 Pamphlets, mutations that increase substrate affinity as described in Japanese Patent Publication No. 10-512750 or Japanese Patent Application Publication No. 2001-518799, Japanese Patent No.
  • Japanese Patent Application Laid-open No. 2000-197487 Japanese Patent Publication No. 1999-9- Examples include, but are not limited to, mutations that increase stability as described in Japanese Patent Publication No. 510610 and Japanese Patent Application Publication No. 2003-518912.
  • the luciferase gene and its recombinant DNA can be prepared by conventional methods.
  • Japanese Patent Publication No. 7-112434 describes the Heike firefly luciferase gene.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-51086 describes the Genji firefly luciferase gene.
  • the luciferase gene can be incorporated into a vector such as a plasmid, bacteriophage, or cosmid, and used to transform or transduce a suitable host.
  • the host can be a microorganism, bacteria such as E. coli, yeast, and the like.
  • a transformed host capable of producing luciferase can be cultured by various known methods.
  • the medium may include one or more nitrogen sources such as tryptone, yeast extract, meat extract, peptone, corn steep liquor, or soybean or wheat bran infusion, plus sodium chloride, monopotassium phosphate, dibasic potassium phosphate, chloride.
  • nitrogen sources such as tryptone, yeast extract, meat extract, peptone, corn steep liquor, or soybean or wheat bran infusion
  • sodium chloride monopotassium phosphate, dibasic potassium phosphate, chloride.
  • examples include those to which one or more inorganic salts such as magnesium, ferric chloride, magnesium sulfate, or manganese sulfate are added, and if necessary, carbohydrate raw materials, vitamins, etc. are added.
  • the initial pH of the medium can be, for example, 7 to 9.
  • Cultivation can be carried out, for example, at 30 to 40°C for 2 to 24 hours by aeration stirring culture, shaking culture, static culture, or the like. After culturing, luciferase is recovered from the culture using a known method.
  • the bacterial cells are subjected to ultrasonic disruption treatment, trituration treatment, etc. using conventional methods, or luciferase is extracted using a lytic enzyme such as lysozyme.
  • the obtained extract is filtered, centrifuged, etc., and if necessary, nucleic acids are removed using streptomycin sulfate, etc., and ammonium sulfate, alcohol, acetone, etc. are added thereto for fractionation to obtain the crude enzyme.
  • the crude enzyme may be further purified by various gel filtration or chromatography techniques.
  • Commercially available luciferases can also be used, for example, luciferase from Kikkoman Biochemifa, catalog number 61314. This luciferase is described in JP-A-11-239493 (Patent No. 3749628), and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • commercially available luciferase from Sigma-Aldrich, Promega, and Life Technologies, available as Molecular Probes (registered trademark) can also be used.
  • Luciferin may be of any type as long as it is recognized as a substrate by the luciferase used, and may be natural or chemically synthesized. Moreover, any known luciferin derivatives can also be used. The basic skeleton of luciferin is imidazopyrazinone, and there are many tautomers. Luciferins include, but are not limited to, firefly luciferin, bacterial luciferin, vargulin, dinoflagellate luciferin, and coelenterazine. Firefly luciferin is a substrate for firefly luciferase (EC 1.13.12.7).
  • Bacterial luciferin is found in bacteria and fish and consists of a long-chain aldehyde and the reduced form of riboflavin phosphate.
  • Vargulin is an imidazolopyrazine derivative found in midshipman fish and ostracods.
  • Dinoflagellate luciferin is a chlorophyll derivative.
  • Coelenterazine is found in radiolarians, ctenophores, cnidarians, squids, trichognaths, radiopods, shrimp, fish, etc.
  • Another example is (E)-2-methyl-4-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohex-1-yli)-1-buten-1-olgiferin from Latia neritoides. Examples include acids.
  • the luciferin derivatives may be those described in JP-A No. 2007-91695, Japanese Patent Application Publication No. 2010-523149 (International Publication No. 2008/127677), and the like.
  • the final concentration of luciferase in the measurement system is 0.001 ⁇ g protein/mL or more, 0.01 ⁇ g protein/mL or more, 0.02 ⁇ g protein/mL or more, when absorbance at 280 nm is taken as luciferase concentration (mg protein/mL).
  • 0.05 ⁇ g protein/mL or more 0.10 ⁇ g protein/mL or more, 0.20 ⁇ g protein/mL or more, 0.25 ⁇ g protein/mL or more, 0.5 ⁇ g protein/mL or more, 0.75 ⁇ g protein/mL or more, 1 ⁇ g protein/mL or more, 5 ⁇ g protein /mL or more, 10 ⁇ g protein/mL or more, 20 ⁇ g protein/mL or more, 30 ⁇ g protein/mL or more, 40 ⁇ g protein/mL or more, 50 ⁇ g protein/mL or more, 60 ⁇ g protein/mL or more, 70 ⁇ g protein/mL or more, 80 ⁇ g protein/mL 90 ⁇ g protein/mL or more, 100 ⁇ g protein/mL or more, 110 ⁇ g protein/mL or more, 120 ⁇ g protein/mL or more, 130 ⁇ g protein/mL or more, 140 ⁇ g protein/mL or more, for example, 150 ⁇ g protein/mL or more.
  • the final concentration of luciferase in the measurement system is 200 ⁇ g protein/mL or less, 150 ⁇ g protein/mL or less, 140 ⁇ g protein/mL or less, or 130 ⁇ g protein/mL, where the absorbance at 280 nm is taken as the luciferase concentration (mg protein/mL).
  • mL or less 120 ⁇ g protein/mL or less, 110 ⁇ g protein/mL or less, 100 ⁇ g protein/mL or less, 90 ⁇ g protein/mL or less, 80 ⁇ g protein/mL or less, 70 ⁇ g protein/mL or less, 60 ⁇ g protein/mL or less, 50 ⁇ g protein/mL or less , 40 ⁇ g protein/mL or less, 30 ⁇ g protein/mL or less, 20 ⁇ g protein/mL or less, 10 ⁇ g protein/mL or less, 5 ⁇ g protein/mL or less, 1 ⁇ g protein/mL or less, 0.5 ⁇ g protein/mL or less, e.g. 0.3 ⁇ g protein/mL It can be as follows.
  • the final concentration of luciferin or a luciferin derivative in the measurement system is 0.01mM to 20mM, 0.02mM to 20mM, 0.03mM to 20mM, 0.04mM to 20mM, 0.05mM to 20mM, 0.1mM to 20mM, 0.5mM to 10mM, For example, it can be 0.75mM to 5mM.
  • the luminescent reagent may further include an enzyme that generates ATP from AMP. This makes it possible to measure not only ATP but also AMP as nucleotides present in the system.
  • Enzymes that generate ATP from AMP include, but are not limited to, pyruvate-phosphate dikinase (PPDK) and pyruvate water dikinase (PWDK).
  • PPDK pyruvate-phosphate dikinase
  • PWDK pyruvate water dikinase
  • PPDK can be used with phosphoenolpyruvate (PEP) and phosphoric acid.
  • PWDK can be used with PEP and water.
  • multiple enzymes may be combined.
  • the luminescent reagent may further include an enzyme that generates ATP from ADP. This makes it possible to measure not only ATP but also ADP as nucleotides present in the system. Enzymes that generate ATP from ADP include, but are not limited to, pyruvate kinase (PK).
  • PK pyruvate kinase
  • the luminescent reagent can further include an enzyme that generates AMP from ADP.
  • an enzyme that generates AMP from ADP For example, AMP, ADP, and ATP can be measured by combining an enzyme that generates AMP from ADP and an enzyme that generates ATP from AMP with luciferase.
  • Enzymes that generate AMP from ADP include, but are not limited to, ADP-dependent hexokinase and apyrase.
  • the luminescent reagent may further include an enzyme that generates ADP from AMP.
  • an enzyme that generates ADP from AMP For example, AMP, ADP, and ATP can be measured by combining an enzyme that generates ADP from AMP and an enzyme that generates ATP from ADP with luciferase.
  • Examples of enzymes that generate ADP from AMP include, but are not limited to, ADP-dependent hexokinase. Note that ADP-dependent hexokinase normally generates AMP from ADP, but it can also catalyze the reverse reaction, and therefore, by appropriately adjusting the substrate concentration, it can be used as an enzyme that generates ADP from AMP.
  • the luminescent reagent can further include an enzyme that generates ADP from ATP and AMP.
  • AMP, ADP, and ATP can be measured by combining an enzyme that generates ADP from ATP and AMP with an enzyme that generates ATP from ADP.
  • Enzymes that generate ADP from ATP and AMP include, but are not limited to, adenylate kinase (AK).
  • Enzymes that generate ATP from AMP and enzymes that generate ATP from ADP are sometimes collectively referred to as enzymes that have ATP-generating ability. Any known enzyme can be used as the enzyme capable of producing ATP, including, but not limited to, a kinase capable of producing ATP.
  • Kinases with ATP generating ability include, for example, pyruvate kinase, pyruvate-phosphate dikinase, creatine kinase, acetate kinase, polyphosphate kinase, hexokinase, glucokinase, glycerol kinase, fructokinase, phosphofructokinase, and riboflavin kinase. , fructose bisphosphatase, and combinations thereof.
  • Pyruvate kinase (EC 2.7.1.40) converts phosphoenolpyruvate to pyruvate in glycolysis, during which ADP is converted to ATP. This reaction is an exergonic reaction with negative Gibbs energy and is irreversible under natural conditions. PEP + ADP ⁇ Pyruvate + ATP The reverse reaction is catalyzed by pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase in gluconeogenesis, producing PEP and ADP from ATP and pyruvate. When cell extraction is performed, various enzymes are mixed in the system, and the above reaction can proceed in both directions.
  • ADP can be converted to ATP if phosphoenolpyruvate is present in high concentrations. Furthermore, if not only phosphoenolpyruvate but also pyruvate kinase is present in the system, it is thought that more ADP will be converted to ATP.
  • Creatine kinase (EC 2.7.3.2) mediates the conversion reaction between creatine and ATP and creatine phosphate and ADP. Creatine + ATP ⁇ ⁇ Creatine phosphate + ADP Creatine kinase (CK) is also called creatine phosphokinase (CPK) or phosphocreatine kinase. These terms can be used interchangeably herein. Normally, in animal muscles, creatine phosphate and ADP are generated from creatine and ATP. However, this reaction is reversible, and if high concentrations of creatine phosphate and ADP are present in the system, the reaction can proceed in the opposite direction, producing creatine and ATP.
  • cytoplasmic creatine kinase is composed of two subunits, B or M. Therefore, three types of isozymes, CK-MM, CK-BB, and CK-MB, can exist depending on the combination of subunits. Although isozyme patterns vary from tissue to tissue, any combination can be used in the present invention.
  • Pyruvate-phosphate dikinase (EC 2.7.9.1) mediates the reaction between ATP, pyruvate, and orthophosphate and adenosine monophosphate (AMP), phosphoenolpyruvate (PEP), and pyrophosphate (PPi). catalyze.
  • PPDK Pyruvate-phosphate dikinase
  • ATP pyruvate, phosphate phosphotransferase, pyruvate orthophosphate dikinase, and pyruvate phosphate ligase. These terms can be used interchangeably herein.
  • PPDK normally converts pyruvate to PEP, which consumes one molecule of ATP and converts it to AMP.
  • the reaction can be divided into the following three reversible reactions. 1.
  • the enzyme PPDK binds to ATP, converting it to AMP and producing diphosphorylated PPDK. 2.
  • Diphosphorylated PPDK binds to inorganic phosphate, producing diphosphate and monophosphorylated PPDK.
  • Monophosphorylated PPDK binds to pyruvate, generating PEP and regenerating PPDK. At this time, if the PEP concentration present in the system is high, the reaction proceeds in the opposite direction as shown below.
  • PEP binds to PPDK, producing monophosphorylated PPDK and pyruvate.
  • Diphosphorylated PPDK and inorganic phosphate are generated from diphosphate and monophosphorylated PPDK.
  • PPDK and ATP are generated from diphosphorylated PPDK and AMP.
  • Acetate kinase (EC 2.7.2.1) catalyzes the conversion between ATP and acetate and ADP and acetylated phosphate in the presence of cations.
  • ATP + acetic acid ⁇ ⁇ ADP + acetylated phosphate acetate kinase (AK) is also called ATP:acetate phosphotransferase or acetyl kinase.
  • ATP + acetic acid ⁇ ⁇ ADP + acetylated phosphate acetate kinase (AK) is also called ATP:acetate phosphotransferase or acetyl kinase. These terms can be used interchangeably herein.
  • ADP and acetylated phosphate are generated from ATP and acetic acid, and ultimately it promotes the reaction that produces acetyl-CoA. If acetylated phosphate and ADP generated from acetyl-CoA are present in
  • Polyphosphate kinase (EC 2.7.4.1) catalyzes the reaction that converts polyphosphate (PolyP n ) and ADP into polyphosphate (PolyP n-1 ) and ATP.
  • Polyphosphate kinase (PPK) is also called ATP:polyphosphate phosphotransferase. These terms can be used interchangeably herein.
  • PPK is involved in oxidative phosphorylation in vivo. If polyphosphate (n) and ADP are present in the system, this can be converted to polyphosphate (n-1) and ATP.
  • Riboflavin kinase (EC 2.7.1.26), also described as FMNK, catalyzes the reaction that converts riboflavin and ATP to riboflavin phosphate (FMN) and ADP.
  • FMNK riboflavin phosphate
  • ATP + riboflavin ⁇ ⁇ ADP + FMN Riboflavin kinase belongs to ATP:riboflavin 5'-phosphotransferase (also called flavokinase).
  • Phosphofructokinase 1 (EC 2.7.1.11), also described as PFK1, converts fructose-6-phosphate (Fru6P) and ATP to fructose-1,6-bisphosphate (Fru1,6-BP) and ADP. catalyze the reaction of Fru6P+ATP ⁇ Fru1,6-BP+ADP Phosphofructokinase 1 belongs to phosphofructokinase. In this specification, phosphofructokinase 1 may be referred to as Fru-1,6BPK.
  • Fructose bisphosphatase (EC 3.1.3.11), also described as FBPase, is responsible for the reaction that converts fructose-1,6-bisphosphate (Fru1,6-BP) and ADP into fructose-6-phosphate (Fru6P) and ATP. catalyze. Fru1,6-BP+ADP ⁇ Fru6P+ATP Fructose bisphosphatase is also sometimes described as FBP or FBP1.
  • any known enzyme can be used, such as those derived from microorganisms, bacteria, eukaryotes, protists, plants, animals, etc.
  • commercially available enzymes can be used. be able to.
  • the amount of the enzyme capable of producing ATP can be appropriately set depending on the desired concentration and reaction system.
  • the enzyme capable of producing ATP is added so that the activity unit in the measurement system is 0.001U or more, 0.01U or more, 0.1U or more, 1U or more, 2U or more, 3U or more, 4U or more, or 5U or more. be able to.
  • the enzyme capable of producing ATP can be added so that the activity unit in the measurement system is 1000 U or less, 100 U or less, 50 U or less, 10 U or less, 9 U or less, 8 U or less, 7 U or less, or 6 U or less. .
  • the sample to be measured is a solution that may contain cells, a medium that may contain cells or microorganisms, such as tap water, river water, treated river water, drinking water, drinking water, manufacturing water, bath water, hot spring water, and fountain water.
  • microorganisms include prokaryotes, bacteria, yeast, protists, and fungi.
  • cells include microbial cells, animal cells, animal-derived cells, plant cells, plant-derived cells, insect cells, and insect-derived cells.
  • the presence or absence of microorganisms or cells can be determined qualitatively or quantitatively. This can be used for contamination of beverages and food products with microorganisms or cells, contamination of water with microorganisms or cells, quantification of propagated microorganisms, quantification of proliferated cells, sanitary monitoring, etc.
  • Lucipak (registered trademark) II (Kikkoman Biochemifa, product number: 60375), for ATP + AMP measurement
  • Lucipak (registered trademark) Pen (Kikkoman Biochemifa, product number: 60331) for ATP + ADP + AMP measurement
  • Lucipak (registered trademark) A3 Surface (Kikkoman Biochemifa, product number: 60361)
  • an extraction reagent a 0.01% benzalkonium chloride solution can be used. Nucleotides may be measured by a similar method with reference to the instructions for use of these commercially available kits.
  • Lumitester (registered trademark) C-110 can be used for ATP measurement
  • Lumitester (registered trademark) Smart can be used for ATP + AMP measurement and ATP + ADP + AMP measurement.
  • the amount of luminescence can be measured by adding 0.2 mL of a sample solution containing benzalkonium chloride at each concentration to 0.1 mL of the ATP measurement reagent, and then adding 0.01 mL of a 1 ⁇ 10 ⁇ 7 M ATP solution.
  • the amount of luminescence can be measured using Lumitester (registered trademark) C-110 (Kikkoman Biochemifa).
  • Luminescence can be described as a relative luminescence unit (RLU) based on a certain standard.
  • the method and kit of the present disclosure is a method for measuring microorganisms or cells in a solution, it also measures not only ATP but also other adenine nucleotides.
  • Conventional methods for measuring microorganisms in solutions have generally measured only ATP. This is because water and beverages contain AMP and ADP in addition to ATP, so measuring ADP and AMP in addition to ATP would be inconvenient, such as increasing background noise.
  • the conventional method requires nucleotide removal steps such as centrifugation, supernatant removal, resuspension, and treatment with adenosine phosphate deaminase, and is complicated.
  • the method and kit of the present disclosure can wash away free ATP, ADP, and AMP in the solution by filtering the sample, and can easily remove ATP, ADP, and AMP outside the bacterial cells. Can be erased. Furthermore, the method and kit of the present disclosure can suppress variations between measurements by measuring the three components ATP+ADP+AMP. Note that this does not mean that nucleotide removal steps such as treatment with adenosine phosphate deaminase should not be used in the methods of the present disclosure.
  • the disclosed method may further include a nucleotide removal step.
  • the method of the present disclosure may include the step of depleting ATP, ADP, and/or AMP outside the microbial cell.
  • the kit of the present disclosure may include a reagent that eliminates ATP, ADP, and/or AMP outside the bacterial body. ATP, ADP, and/or AMP can be eliminated using known reagents or commercially available reagents.
  • ATP, ADP, and/or AMP can be eliminated using known reagents or commercially available reagents.
  • a method for ATP decomposition when only ATP is measured, a method using apyrase is known (Patent Document 4).
  • apyrase is an enzyme that decomposes ATP into ADP and then AMP, it does not catalyze any further dephosphorylation reaction, and in ATP+AMP measurement and ATP+ADP+AMP, which includes an enzyme that generates ATP from AMP. does not function as a clearing reagent.
  • Known reagents include, but are not limited to, adenosine phosphate deaminase.
  • Non-Patent Document 1 uses a method using adenosine phosphate deaminase to erase adenine nucleotides, but it requires standing for 30 minutes to degrade ATP. Examples of commercially available reagents include, but are not limited to, Lucifer ATP elimination reagent (Kikkoman Biochemifa, product number: 60254).
  • the kit for detecting microorganisms or cells of the present disclosure is for detecting microorganisms or cells in a solution.
  • a filter refers to a filter for filtering liquid.
  • a member for filtering gas is referred to as an air filter in this specification.
  • a kit for detecting microorganisms or cells of the present disclosure does not have an air filter.
  • kits for detecting microorganisms or cells of the present disclosure exclude those having air filters.
  • kits of the invention may include an RNA degrading enzyme.
  • the methods of the invention may also use RNA degrading enzymes. Note that the RNA degrading enzyme used here means an RNA degrading enzyme that is not derived from a sample.
  • RNA degrading enzyme refers to an enzyme that catalyzes a reaction that produces 5'-mononucleotides (AMP, GMP, CMP, and UMP) from RNA, and includes, for example, the following: (1) Endonuclease S 1 (EC3.1.30.1), (2) Venom exonuclease (EC3.1.15.1), (3) Phosphodiesterase One (Phospho diesterase 1) (EC3.1.4.1). Note that the endonuclease S- 1 includes Nuclease P1, Mung beans nuclease, and Neurospora crassa nuclease.
  • the kit of the invention does not contain RNAse, or does not contain a substantial amount of RNAse.
  • the methods of the invention do not use RNAse, or do not use a substantial amount of RNAse.
  • an RNA degrading enzyme derived from the sample may be included in the reaction system.
  • "a substantial amount of RNA degrading enzyme” refers to the effect of the kit or method of the present invention (for example, the effect of providing an accurate contamination detection method that is less susceptible to ATP degrading activity). It means an amount of RNA degrading enzyme that does not have any effect.
  • RNA degrading enzyme examples include, for example, the final concentration in the reaction system is 0.3 U/ml or less, 0.15 U/ml or less, 0.1 U/ml or less, 0.05 U/ml or less, 0.01 U/ml Examples include a kit containing RNA decomposing enzyme in an amount of 0.001 U/ml or less, or a method using such an amount of RNA degrading enzyme.
  • the enzyme unit of RNA degrading enzyme refers to the activity unit (U) of an enzyme having RNA degrading ability, which is an acid-soluble Defined as the amount of enzyme converted into nucleotides.
  • the enzymatic unit of Nuclease P 1 is defined as the amount of enzyme that converts 1.0 ⁇ mol of substrate into acid-soluble nucleotides per minute at 37°C and pH 5.3 (the enzymatic activity of Nuclease P 1 is For details of the definition, please refer to the Merck catalog (http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/nuclease_p1.pdf).
  • Example 1 Cronobacter sakazakii IAM12660, Klebsiella pneumoniae NBRC14940, Escherichia coli ATCC25922, Staphylococcus aureus ATCC6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Pseudomonas fluorescence NISL420, Sphingomonas parapaucimobilis, Bacillus subtilis ATCC9372 , Bacillus cereus NBRC3836 in 2.5 mL of trypto soy broth medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) The cells were inoculated and cultured overnight at 30°C and 160 rpm.
  • Lucifer ATP elimination reagent manufactured by Kikkoman Biochemifa, product number: 60254
  • adenine nucleotides ATP
  • AMP AMP
  • ADP adenine nucleotides
  • ATP measurement was performed using Lucipak (registered trademark) II (manufactured by Kikkoman Biochemifa, product number: 60375), and ATP+AMP measurement was performed using Lucipak (registered trademark) Pen (Kikkoman Biochemifa, Inc., product number: 60375). ATP+ADP+AMP was measured using Lucipak (registered trademark) A3 Surface (manufactured by Kikkoman Biochemifa, product number: 60361).
  • the amount of luminescence measured when 0.01 mL of ATP solution (1 x 10 -7 M) was added to 0.1 mL of the extract obtained by filtering and extracting sterile ultrapure water that does not contain microorganisms was determined as ATP addition.
  • ATP+ADP (ATP+ADP+AMP amount) + (ATP+AMP amount) + ATP amount
  • Figure 1 shows an overview of this embodiment.
  • Figure 2 shows the relative luminescence amount of each microorganism, assuming that the luminescence amount (corrected value) when using the ATP+ADP+AMP measurement reagent is 100%.
  • the ratio of the amount of ATP contained in the microorganisms in the water was very low, and the ratio of the amount of ATP+AMP was also a low value. This result was an unexpected and surprising value from the result in Non-Patent Document 1 that in a sugar-free solution, 79.8 to 89.0% was ATP+AMP.
  • Non-Patent Document 1 unlike Non-Patent Document 1, it is presumed that this is due to the difference in that the measurement was performed in microorganisms collected on a filter rather than in a solution; It was shown that by performing +AMP measurement, ATP+ADP measurement, and ATP+ADP+AMP measurement, a high amount of luminescence can be obtained and measurement with high sensitivity is possible.
  • detecting microorganisms such as harmful bacteria contained in a liquid by collecting them on a filter it is possible to measure not only ATP but also ATP+AMP, ATP+ADP, and even ATP+ADP+AMP. It was suggested that microorganisms could be detected with high sensitivity.
  • Escherichia coli ATCC25922 was inoculated in 2.5 mL of five bottles of trypto soy broth medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) and cultured overnight at 30° C. and 160 rpm with shaking. 10 mL of the diluted culture solution obtained by diluting each microbial society solution 100 times with sterile ultrapure water was filtered in its entirety using a 10 mL syringe (manufactured by Terumo Corporation) equipped with a syringe filter DISMIC (registered trademark)-25CS045AS (manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd.). did.
  • ATP measurement was performed using Lucipak (registered trademark) II (manufactured by Kikkoman Biochemifa, product number: 60375), and ATP+AMP measurement was performed using Lucipak (registered trademark) Pen (Kikkoman Biochemifa, Inc., product number: 60375). ATP+ADP+AMP was measured using Lucipak (registered trademark) A3 Surface (manufactured by Kikkoman Biochemifa, product number: 60361).
  • the amount of luminescence measured when 0.01 mL of ATP solution (1 ⁇ 10 -7 M) was added to the extract obtained by filtering and extracting sterile ultrapure water that does not contain microorganisms is the luminescence upon addition of ATP.
  • 0.1 mL of an appropriately diluted microbial suspension was applied to an R2A agar medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), and after culturing at 30°C overnight, the formed colonies were counted to determine the number of viable bacteria, which was obtained by luminescence measurement.
  • the luminescence amount per 10 9 CFU of viable bacteria was determined by dividing the corrected value by the number of viable bacteria and multiplying by 10 9 .
  • Table 1 shows the luminescence amount (corrected value) per 109 CFU of viable bacteria when measured using each test reagent, its average value, standard deviation (SD), and coefficient of variation (CV).
  • Non-Patent Document 1 ATP+AMP measurement is stable, although it cannot be compared as it is a measurement using a solution, and ATP+AMP measurement is adopted.
  • the coefficient of variation in ATP+AMP measurement is lower than that in ATP measurement, and the coefficient of variation in ATP+ADP+AMP measurement is even more significantly lower than that in non-patent literature. This was a surprising result that was unexpected from the results of 1. It was suggested that by performing ATP+AMP measurement or ATP+ADP+AMP measurement, stable measurement without variation is possible and it is possible to estimate the number of microorganisms more accurately.
  • Klebsiella pneumoniae NBRC14940 Saccharomyces cerevisiae NISL3399, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Micrococcus luteus IFO3333, Bacillus cereus NBRC3836, Cronobacter sakazakii IAM12660, Escherichia coli ATCC25922, Staphylococcus aureus ATCC6538 into 2.5 mL of trypto soy broth medium (manufactured by Eiken Kagaku Co., Ltd.). , cultured overnight at 30°C and 160 rpm with shaking.
  • Each microbial culture solution was diluted with sterile ultrapure water to prepare microbial dilutions in 10-fold increments.
  • 10 mL of each microbial culture solution was diluted 100 times with sterile ultrapure water, and the entire amount was filtered using a 10 mL syringe (manufactured by Terumo Corporation) equipped with various syringe filters to collect microorganisms.
  • a 10 mL syringe manufactured by Terumo Corporation
  • various filters manufactured by Advantech Toyo, GVS Filter Technology, and Merck Millipore were used. All pores used had a diameter of 0.45 ⁇ m.
  • the housing structure of the filter unit differs depending on the manufacturer, which may affect the extraction efficiency, we compared the amount of light emitted by each microorganism based on the difference in filter material within the same manufacturer.
  • the luminescence amount measured by ATP+AMP of each microorganism at Advantech Toyo is shown in Figure 4, also at GVS in Figure 5, and at Merck Millipore in Figure 6.
  • the luminescence amount of ATP+ADP+AMP measurement of E.coli by Advantech Toyo Co., Ltd. is shown in Figure 7, GVS in Figure 8, Membrane Solutions in Figure 9, and Merck Millipore in Figure 10.
  • CA cellulose acetate
  • PES polyethersulfone
  • CA can extract the most adenine nucleotides (ATP, ADP, AMP) from the microorganisms captured on the membrane.
  • MCE cellulose mixed ester
  • CA cellulose acetate
  • samples can be filtered to wash away free ATP, ADP, and AMP, and luminescence can be measured.
  • ATP + ADP the measured value varied from bacteria to bacteria, and even from experiment to experiment even for the same bacteria. Therefore, when we tried two-component measurements, ATP + ADP, and three-component measurements, ATP + ADP + AMP, which were thought to increase background noise according to conventional technical knowledge, in both cases, we found that it was actually about bacteria. It was found that the variation between experiments and the variation between experiments were suppressed, and the measured values became stable. It is thought that similar results can be obtained when cells are used as specimens.
  • microorganisms or cells can be detected by measuring adenine nucleotides.

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Abstract

簡便な溶液中の微生物又は細胞検出方法及びキットを提供することを課題とする。　まず、フィルターにより微生物又は細胞を捕集し、抽出剤によりアデニンヌクレオチド成分を抽出し、その後、発光試薬により発光量を測定する工程を含む、溶液中の微生物又は細胞の検出方法及びそのためのキットが提供される。

Description

溶液中の微生物若しくは細胞、又は微生物関連物質若しくは細胞関連物質を検出する方法及びキット
　本発明は、溶液中の微生物若しくは細胞、又は微生物関連物質若しくは細胞関連物質を検出する方法及びキットに関する。
　アデノシン三リン酸（以下、ATPという）は、あらゆる生体内に見られるヌクレオチドであり、エネルギーを貯蔵したり、放出したりする基質として細胞に利用される。ATPを測定することで微生物や細胞を検出することができる。
　代表的なATP測定法としては、ルシフェラーゼの存在下でATPと基質ルシフェリンを反応させ、発光を測定する方法が知られている（非特許文献１）。この反応はルシフェラーゼにより触媒され、２価金属イオンの存在下で以下のように進行する。
[化]
ルシフェリン＋ATP＋O2→オキシルシフェリン＋アデノシン一リン酸（AMP）＋ピロリン酸（PPi）＋CO2＋光
　ルシフェラーゼは細菌、原生動物、軟体動物、昆虫などに見出される。ルシフェラーゼを有する昆虫としては甲虫、例えばホタルやコメツキムシが挙げられる。ルシフェラーゼ遺伝子は多数単離されており、その塩基配列も決定されている。
　従来の溶液中の微生物を測定する方法としては、微生物由来のATPのみを測定する方法が広く普及しており、そのためのキットも各社から市販されている。水や飲料にはATP以外にAMPやADPも含まれるため、ATP以外にADPやAMPも測定しようとするとバックグラウンドノイズが増大してしまうなど、不都合があった。生きた細菌の中にはATPが多く含まれており、飲料や水に含まれる細菌を測定するには、ATPのみを測定すれば足りる、また、ATPのみを測定するのが有利である、というのが従来の技術常識であった。
　微生物を測定する方法として、榊原らは、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)フィルター上に細菌をトラップし、抽出剤を噴霧して抽出を行い、次いで発光試薬を噴霧して発光をCCDカメラにより検出して、細菌由来ATP＋AMPを測定する方法を報告している（非特許文献１）。ただし、これは微生物由来のATP+AMPを溶液に回収して微生物を測定するのではなく、フィルター上に捕集した微生物をフィルター上で発光させて、輝点を計測する測定である。非特許文献１では、高い発光量を得たいという目的で、測定中に高濃度のルシフェラーゼを加えようとするとATPが急激に消費されてしまい、発光開始から一定時間の発光量を積算した場合でも十分に高い発光量が得られないため、ピルビン酸－リン酸ジキナーゼ（PPDK）を用いて、ATPを消費して生成したAMPを再びATPに戻すサイクリング反応により、発光量を高いレベルで維持させている。また、発光量が十分に多くないことを補うため、フィルターは疎水性の材質にスポット状に親水化処理されており、そこに付着したATPが広がったり滲んだりしないよう、工夫された疎水グリッド膜が使用されている。また、発光量が多くないため、検出装置としては高感度でかつバックグラウンドノイズを抑えたCCDカメラが必要となるが、このような装置は非常に高価である。さらに非常に高感度であるため、実験操作中にATP汚染がないように、一連の測定操作をクリーンベンチやクリーンルームなどの環境で行う必要があり、こうした操作も煩雑で、熟練を必要とする。非特許文献１の表２にはATP+ADP+AMPの結果もあるが、これはPVDFフィルターでの実験ではなく、試験管内の結果である。また、表２では、ATP+AMPとATP+ADP+AMPとの間に大きな違いはない。また、非特許文献１の著者らは、細胞内ATP+AMPがATPより安定していたと考察している（５５頁左欄）。特許文献２も類似の技術を記載している。
　微生物を測定する場合において、少ない細菌数を測定するときは、微生物を培養するという手段がとられることが多かった（非特許文献１、４９頁左等）。しかしながら、発光シグナルを増幅するために微生物を培養すると、測定時間全体が長くなってしまう。これは迅速な結果が求められる場面では不都合であった。
　特許文献３は、フィルターに微生物を捕集して、ATP抽出剤で微生物からATPを抽出した溶液を回収し、ルシフェラーゼを用いて発光量を測定する方法を記載している。特許文献３に記載の方法は、微生物の活性が低くATPレベルが低下した菌（芽胞、胞子等）を高感度に測定するために、アラニンやグルコース、リン酸を添加する、という方法である。しかしながら菌のATPレベルを回復させるために、インキュベーターで40または45℃にて1時間加熱する必要がある。この方法は測定に時間もかかり、また、高価な装置が必要となる。
　溶液中の微生物を測定する場合、溶液内に存在する、遊離の菌体外ATP、ADP、AMPを、何らかの手段により除去する必要がある。例えば、非特許文献１は遠心分離、上清除去、再懸濁を行うことにより遊離の菌体外ATP、ADP、AMPを除去している（非特許文献１、５２頁）。また、非特許文献１は、さらに、アデノシンリン酸デアミナーゼにより菌体外ヌクレオチドを分解している。しかしながら、こうした工程は、遠心分離装置が必要であったり、煩雑な作業が必要で、バックグラウンド発光となる遊離ヌクレオチドを消去するために時間を要する。
　微生物、特に水に含まれる細菌を高感度にて、迅速に検出することができる方法が必要とされている。
特表２００４－５２８０２４ 特開平１１－１３７２９３ 特開２０１３－９９３４０ 特開平１１－８９５９２
Anal Biochem, 312 (2003) pp. 48-56
　本発明は、上記の問題を少なくとも部分的に解決する、微生物若しくは細胞、又は微生物関連物質若しくは細胞関連物質を検出する方法及びキットを提供することを課題とする。
　上記の問題に鑑み、本発明者らは、ATP、ADP、AMPを測定する方法について鋭意検討した結果、遠心分離、上清除去、及び再懸濁や、ヌクレオチド除去工程の代わりに、サンプルをフィルターでろ過することにより、遊離のATP、ADP、AMPを洗い流すことができ、簡便に菌体外のATP、ADP、AMPを消去することができることを確認した。しかしながら、フィルターろ過法をさらに検討したところ、細菌ごとに、また同じ細菌であっても実験毎に、測定値がばらつく、という問題に遭遇した。そこで、従来の技術常識によればバックグラウンドノイズが増大すると考えられてきたATP+ADP+AMPという三成分測定を試みたところ、むしろ、細菌についてのばらつきや、実験毎のばらつきが抑制され、測定値が安定することを見出し、これを一実施形態として包含する本発明を完成させた。
　すなわち本発明は以下の実施形態を含む。
[１]　以下の工程、
(i)　溶液をフィルターに通して微生物若しくは細胞をフィルター上に捕集する工程、
(ii)　フィルター上に捕集された微生物若しくは細胞を抽出剤と接触させ、微生物若しくは細胞のアデニンヌクレオチド成分を抽出する工程、
(iii)　抽出されたアデニンヌクレオチド成分を、ルシフェラーゼ、及び、AMPからATPを生成する酵素を含む発光試薬と接触させる工程、及び
(iv)　発光量を測定する工程、
を含む、溶液中の微生物若しくは細胞を検出する方法。 　
[２]　発光試薬がさらに、ADPからATPを生成する酵素、又は、ADPからAMPを生成する酵素を含む、実施形態１に記載の方法。 　
[３]　以下の工程、
(i)溶液をフィルターに通して微生物若しくは細胞をフィルター上に捕集する工程、
(ii)フィルター上に捕集された微生物若しくは細胞を抽出剤と接触させ、微生物若しくは細胞のアデニンヌクレオチド成分を抽出する工程、
(iii)抽出されたアデニンヌクレオチド成分を、ルシフェラーゼ、及び、ADPからATPを生成する酵素を含む発光試薬と接触させる工程、及び
(iv)発光量を測定する工程、
を含む、溶液中の微生物若しくは細胞を検出する方法。 　
[４]　発光試薬がさらに、AMPからADPを生成する酵素、又は、ATP及びAMPからADPを生成する酵素を含む、実施形態３に記載の方法。 　
[５]　フィルターが酢酸セルロースフィルターである、実施形態１～４のいずれかに記載の方法。 　
[６]　発光試薬がルシフェリンを含む、実施形態１～５のいずれかに記載の方法。 　
[７]　抽出剤が界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又は塩化ベンザルコニウムの１以上を含む、実施形態１～６のいずれかに記載の方法。 
[８]　菌体外のATP、ADP、又はAMPを消去する工程を含む、実施形態１～７のいずれかに記載の方法。
[９]　(A)　フィルター、
　(B)　抽出剤、
　(C)　ルシフェラーゼ、及び、AMPからATPを生成する酵素を含む発光試薬、及び
　(D)使用説明書
を含む、溶液中の微生物若しくは細胞を検出するためのキットであって、
前記使用説明書は、
(i)　溶液をフィルターでろ過し、微生物若しくは細胞を捕集する工程、
(ii)　捕集された微生物若しくは細胞に抽出剤を添加し、微生物若しくは細胞からアデニンヌクレオチド成分を抽出する工程、
(iii)　抽出されたアデニンヌクレオチド成分を、ルシフェラーゼ、及び、AMPからATPを生成する酵素を含む発光試薬と接触させる工程、及び
(iv)　発光量を測定する工程、
により微生物若しくは細胞を検出することを記載したものである、前記キット。 　
[１０]　発光試薬がさらに、ADPからATP又はAMPを生成する酵素を含む、実施形態９に記載のキット。 　
[１１]　(A)　フィルター、
　(B)　抽出剤、
　(C)　ルシフェラーゼ、及び、ADPからATPを生成する酵素を含む発光試薬、及び
　(D)使用説明書
を含む、溶液中の微生物若しくは細胞を検出するためのキットであって、
前記使用説明書は、
(i)溶液をフィルターでろ過し、微生物若しくは細胞を捕集する工程、
(ii)捕集された微生物若しくは細胞に抽出剤を添加し、微生物若しくは細胞からアデニンヌクレオチド成分を抽出する工程、
(iii)抽出されたアデニンヌクレオチド成分を、ルシフェラーゼ、及び、ADPからATPを生成する酵素を含む発光試薬と接触させる工程、及び
(iv)発光量を測定する工程、
により微生物若しくは細胞を検出することを記載したものである、前記キット。
[１２]　発光試薬がさらに、AMPからADPを生成する酵素、又は、ATP及びAMPからADPを生成する酵素を含む、実施形態１１に記載のキット。
[１３]　フィルターが酢酸セルロースフィルターである、実施形態９～１２のいずれかに記載のキット。
[１４]　発光試薬がルシフェリンを含む、実施形態９～１３のいずれかに記載のキット。
[１５]　抽出剤が界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又は塩化ベンザルコニウムの１以上を含む、実施形態９～１４のいずれかに記載のキット。
[１６]　キットが菌体外のATP、ADP、又はAMPを消去する試薬を含み、使用説明書が、さらに菌体外のATP、ADP、又はAMPを消去する工程を記載したものである、実施形態９～１５のいずれかに記載のキット。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-116931号の開示内容を包含する。
　本発明の効果として、微生物若しくは細胞を簡便に検出することができる。
アデニンヌクレオチド測定による微生物検出の手順の例を示す。実施例１の概要である。 各微生物のアデニンヌクレオチド測定における相対発光量を示す。 ATP消去試薬を用いた場合の各微生物のアデニンヌクレオチド測定における相対発光量を示す。 各微生物の発光量（ATP+AMP測定、アドバンテック東洋社のフィルター）を示す。 各微生物の発光量（ATP+AMP測定、GVS Filter Technology社のフィルター）を示す。 各微生物の発光量（ATP+AMP測定、メルクミリポア社のフィルター）を示す。 E.coliの発光量（ATP+ADP+AMP測定、アドバンテック東洋社のフィルター）を示す。 E.coliの発光量（ATP+ADP+AMP測定、GVS Filter Technology社のフィルター）を示す。 E.coliの発光量（ATP+ADP+AMP測定、Membrane Solutions社のフィルター）を示す。 E.coliの発光量（ATP+ADP+AMP測定、メルクミリポア社のフィルター）を示す。
　ある実施形態において、本発明は溶液中の微生物若しくは細胞を検出する方法を提供する。この方法は、
(i)　溶液をフィルターに通して微生物若しくは細胞をフィルター上に捕集する工程、
(ii)　フィルター上に捕集された微生物若しくは細胞を抽出剤と接触させ、微生物若しくは細胞のアデニンヌクレオチド成分を抽出する工程、
(iii)　抽出されたアデニンヌクレオチド成分を、ルシフェラーゼ、及び、AMPからATPを生成する酵素を含む発光試薬と接触させる工程、及び
(iv)　発光量を測定する工程、
を含み得る。アデニンヌクレオチド成分（アデニンヌクレオチド類）は、ATP、ADP、及び／又はAMPであり得る。本明細書において、ヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、ATP、ADP、及びAMPのことを微生物関連物質若しくは細胞関連物質ということがある。
　ある実施形態において、本発明は溶液中の微生物若しくは細胞を検出する方法を提供する。この方法は、
(i)溶液をフィルターに通して微生物若しくは細胞をフィルター上に捕集する工程、
(ii)フィルター上に捕集された微生物若しくは細胞を抽出剤と接触させ、微生物若しくは細胞のアデニンヌクレオチド成分を抽出する工程、
(iii)抽出されたアデニンヌクレオチド成分を、ルシフェラーゼ、及び、ADPからATPを生成する酵素を含む発光試薬と接触させる工程、及び
(iv)発光量を測定する工程、
を含み得る。
　工程(i)のフィルターは、特に断らない限り、微生物若しくは細胞をフィルター上に捕集し、不純物をろ液側に透過させるものである。溶液をフィルターに通すと、微生物若しくは細胞がフィルター上に捕集され、不純物はろ液側に除去される。ある実施形態において、フィルターとしては、微生物若しくは細胞を捕集できる孔径のものを使用し、例えば0.2μm、0.45μm、0.5μm、0.8μmなどの孔径のフィルターを使用し得る。例えばシリンジ等に取り付けてろ過することができるメンブレンフィルターユニット等を使用することができる。フィルターの材質としては、セルロース混合エステル、酢酸セルロース、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、親水性ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ＰＴＦＥ、ニトロセルロース等が挙げられるがこれに限らない。ある実施形態において、フィルターは、酢酸セルロースを含むフィルターであり得る。ある実施形態において、フィルターは、酢酸セルロースフィルターである。なお、セルロース混合エステル膜は、酢酸セルロースとニトロセルロースとを含む混合されたセルロースエステル膜として知られている。しかしながら、本明細書において「酢酸セルロースフィルター」というとき、これは酢酸セルロースからなるフィルターを意味するものとする。また、セルロース混合エステル膜からなるフィルターや、セルロース混合エステル膜を含むフィルターは、本明細書にいう「酢酸セルロースフィルター」に該当しないものとする。
　フィルター上に捕集された微生物若しくは細胞を抽出剤と接触させる方法は限定されないが、例えばフィルターろ過に用いたシリンジにフィルターを接続したまま、抽出剤をシリンジで吸い上げ、アデニンヌクレオチド成分の抽出を行い、次いで、吸い上げた溶液をシリンジから出すことができる。例えば図１を参照されたい。
　次に、抽出を行った溶液、すなわち抽出されたアデニンヌクレオチド成分を含む溶液を、発光試薬と接触させることができる。抽出されたアデニンヌクレオチド成分を含む溶液を、発光試薬と接触させるには、ピペットを用いて抽出されたアデニンヌクレオチド成分を含む溶液を発光試薬に添加してもよく、抽出されたアデニンヌクレオチド成分を含む溶液をそのまま発光試薬を含む試験管に添加してもよく、又は抽出されたアデニンヌクレオチド成分を含む溶液を綿棒等により採取し、該綿棒を発光試薬に接触させてもよい。或いは、該綿棒をさらに溶液に懸濁させ、懸濁溶液を発光試薬に添加してもよい。
　ある実施形態において、発光試薬は、ルシフェラーゼを含み得る。別の実施形態では、ルシフェラーゼを外部から添加してもよい。ある実施形態において、発光試薬はルシフェリンを含む。別の実施形態ではルシフェリンを外部から添加してもよい。ある実施形態において、発光試薬はAMPからATPを生成する酵素を含み得る。ある実施形態において、発光試薬はさらに、ADPからATP又はAMPを生成する酵素を含み得る。ある実施形態において、発光試薬はADPからATPを生成する酵素を含み得る。特定の実施形態において、ADPからATPを生成する酵素はピルビン酸キナーゼ(PK)であり得るがこれに限らない。
　ある実施形態において、抽出剤は界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又は塩化ベンザルコニウムの１以上を含み得る。
　ある実施形態において、本発明は、上記の方法を行うためにキットを提供する。ある実施形態において、キットは、
　(i)界面活性剤を含む抽出剤、
　(ii)界面活性剤吸着剤を含むサンプリング部、
　(iii)発光試薬、及び
　(iv)使用説明書
を含み得る。前記使用説明書は、上記の方法を行う手順を記載したものであり得る。特定の実施形態において、キットはさらに発光量測定部を含み得る。別の実施形態では、キットを、発光量測定部と組み合わせて使用し得る。発光量測定部としては、ルミテスターC-110、ルミテスターSmartなど市販の発光測定装置を使用し得るがこれに限らない。
　キットに関し、発光試薬はルシフェラーゼ及びルシフェリンを含み得る。また、抽出剤は界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又は塩化ベンザルコニウムの１以上を含み得る。
　キットに関し、発光試薬はさらに、AMPからATPを生成する酵素を含み得る。また、キットに関し、発光試薬はさらに、ADPからATPを生成する酵素、又は、ADPからAMPを生成する酵素を含み得る。また、キットはフィルターをさらに含み得る。フィルターは酢酸セルロースフィルターであり得る。
抽出剤
　抽出剤は界面活性剤を含む。さらに、抽出剤は、リゾチーム（EC 3.2.1.17）などの細胞溶解試薬及びこれらの組み合わせを含み得る。ある実施形態において、抽出剤に用いることのできる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、及び両イオン性界面活性剤、例えば塩化ベンザルコニウムが挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル、例えばTriton(登録商標)X-100、Triton(登録商標)X-45、Tween(登録商標)20、Tween(登録商標)60、Tween(登録商標)80、Span(登録商標)60、Span(登録商標)80、Thesit(商標)が挙げられるがこれに限らない。カチオン性界面活性剤としては第四級アンモニウム塩、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩、例えばアルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、アルキルホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、アルキルイミダゾリウム塩、イソキノニウム塩、アルキルイソキノニウム塩、セチルトリメチルアンモニウム又はベンジルジメチルドデシルアンモニウムブロミド、又は塩化ベンザルコニウムなどが挙げられる。第四級アンモニウム塩としては、例えば、デシルトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミド、エイコシルトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミドが挙げられる。ピリジニウム塩としては、例えば、１－デシルピリジニウムクロリド又はブロミド、１－ドデシルピリジニウムクロリド又はブロミド、１－テトラデシルピリジニウムクロリド又はブロミド、１－ヘキサデシルピリジニウムクロリド又はブロミド、Ｎ－セチル－２－メチルピリジニウムクロリド、Ｎ－セチル－３－メチルピリジニウムクロリド、Ｎ－セチル－４－メチルピリジニウムクロリド、１－オクタデシルピリジニウムクロリド又はブロミド、１－エイコシルピリジニウムクロリド又はブロミドが挙げられる。ホスホニウム塩としては、例えば、テトラエチルホスホニウムクロリド又はブロミド、トリブチルメチルホスホニウムクロリド、ブロミド又はヨージド、テトラブチルホスホニウムクロリド又はブロミド、テトラ－ｎ－オクチルホスホニウムクロリド又はブロミド、トリブチルドデシルホスホニウムクロリド又はブロミド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムクロリド又はブロミド、メチルトリフェニルホスホニウムクロリド、ブロミド又はヨージド、テトラフェニルホスホニウムクロリド又はブロミドが挙げられる。両性イオン性界面活性剤としてはスルホベタイン系界面活性剤、例えばスルホベタイン3-10、アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタイン、CHAPS、CHAPSO、Big Chap、Brij(登録商標)、3-(N,N-ジメチルミリスチルアンモニオ)プロパンスルホン酸（Zwittergent(商標) 3-14）等が挙げられるがこれに限らない。アニオン性界面活性剤としては、デオキシコール酸塩、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルファーオレフィンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、α－スルホ脂肪酸エステル塩及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩などが挙げられ、例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）が挙げられる。
　抽出剤は界面活性剤を含み得る。ある実施形態において、抽出剤に含まれる界面活性剤は、当該界面活性剤の測定系における濃度が0.0001重量％～5重量％、0.001重量％～3重量％、0.01重量％～2重量％、0.1重量％～1.5重量％等となる量であり得る。抽出剤は微生物用抽出剤又は細胞用抽出剤であり得る。
　微生物及び細胞を、本明細書において便宜上、まとめて、抽出されることによって内包されていたATP等が取り出される検体ということがある。ある実施形態において、抽出されることによって内包されていたATP等が取り出される検体は細胞を含む。別の実施形態において、抽出されることによって内包されていたATP等が取り出される検体は微生物を含む。微生物と細胞という用語は相互に排他的ではない。微生物でもあり細胞でもある検体（測定対象）は存在しうる（単細胞微生物等）。相互に排他的な用語を使用しなければならない場合には、抽出されることによって内包されていたATP等が取り出される検体は、微生物、及び、非微生物細胞を含む。非微生物細胞としては、細胞であるが微生物由来ではない細胞、例えば動物細胞、動物由来細胞、植物細胞、植物由来細胞、昆虫細胞、昆虫由来細胞等が挙げられる。本明細書では便宜上、真菌及び菌類は微生物とする。
　発光試薬はまた、ルシフェラーゼ等のレポーター分子を分解から保護するウシ血清アルブミン又はゼラチンのような酵素安定化剤を含み得る。発光試薬はまた、pH調整や保存性を向上させる物質を添加してもよい。例えば適当なpH緩衝剤（HEPES、Tricine、Tris、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等）、還元剤（ジチオトレイトール（DTT）、2-メルカプトエタノール等）、糖（グルコース、スクロース、トレハロース等）等が挙げられる。
発光試薬
　ある実施形態において、発光試薬は、ルシフェラーゼ及びルシフェリンを含む。この場合、マグネシウム、マンガン、カルシウムなどの金属イオンも含まれ得る。ルシフェラーゼによりATP、O2及びルシフェリンはAMP、ピロリン酸、CO2及びオキシルシフェリンに変換され、このとき発光がもたらされる。ルシフェラーゼは、天然ルシフェラーゼでもよく、遺伝子工学的に操作された組換えルシフェラーゼ変異体であってもよい。ルシフェラーゼ変異体は、部位特異的突然変異導入又はランダム突然変異導入されたものであってもよい。他の機能を有するタンパク質との融合タンパク質でもよい。ルシフェラーゼ変異体は、耐熱性が向上したもの、界面活性剤耐性が向上したもの等、所望の性質を有するものであり得る。
　ルシフェラーゼの発光量は、適当な発光測定装置、例えば、ルミノメーター（ベルトールド社製、Lumat LB9510、Junior LB9509、Sirius 2 LB9526、或いはCentro LB963、キッコーマンバイオケミファ社製、ルミテスター(登録商標) C-110、ルミテスター(登録商標) Smart等）を用いて得られる相対発光強度（RLU）を指標に評価することができる。通常、ルシフェリンからオキシルシフェリンへの変換の際に生じる発光を測定する。
　ルシフェラーゼは、ATPを基質とするものであれば、特に限定されないが細菌、原生動物、動物、軟体動物、昆虫由来のものを用いることができる。昆虫由来としては甲虫ルシフェラーゼが挙げられ、例えばフォーチヌス（Photinus）属、例えば北米ボタル(Photinus pyralis)、フォーツリス（Photuris）属、例えばPhoturis lucicrescens、Photuris pennsylvanica、ルシオラ（Luciola）属、例えばゲンジボタル（Luciola cruciata）、ヘイケボタル(Luciola lateralis)、ヒメボタル(Luciola parvula)、マドボタル(Pyrocoelia属)、オバボタル(Lucidina biplagiata)のホタルやピロフォールス（Pyrophorus）属のコメツキムシ由来のものが挙げられる。ルシフェラーゼ遺伝子は多数報告されており、GeneBankなどの公知のデータベースよりその塩基配列及びアミノ酸配列を取得することができる。
　ルシフェラーゼ遺伝子は、野生型のものでもよく、変異を有するものでもよい。変異は、部位特異的に導入されたものでもよく、ランダム変異でもよい。公知の変異としては、特開２０１１－１８８７８７号公報に記載されるような発光量を向上させる変異、特開２０００－１９７４８４号公報に記載されるような発光持続性を高める変異、特許第２６６６５６１号公報又は特表２００３－５１２０７１号公報に記載されるような発光波長を変化させる変異、特開平１１－２３９４９３号公報に記載されるような界面活性剤耐性を高める変異、国際公開第９９／０２６９７号パンフレット、特表平１０－５１２７５０号公報又は特表２００１－５１８７９９号公報に記載されるような基質親和性を高める変異、特許第３０４８４６６号公報、特開２０００－１９７４８７号公報、特表平９－５１０６１０号公報及び特表２００３－５１８９１２号公報に記載されるような、安定性を高める変異等が挙げられるがこれに限らない。
　ルシフェラーゼ遺伝子及びその組換え体DNAは慣用法により調製できる。例えば、特公平７－１１２４３４号公報はヘイケボタルルシフェラーゼ遺伝子を記載している。また特開平１－５１０８６号公報はゲンジボタルルシフェラーゼ遺伝子を記載している。
　ルシフェラーゼ遺伝子は、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド等のベクターに組み入れ、これで適当な宿主を形質転換する又は形質導入することができる。宿主は微生物、大腸菌等の細菌、酵母等であり得る。形質転換されルシフェラーゼ産生能を有する宿主は各種公知の方法で培養することができる。
　培地としては、トリプトン、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、或いはダイズ若しくは小麦ふすまの浸出液等の１以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸マグネシウム、若しくは硫酸マンガン等の無機塩類を１種以上添加し、必要により糖質原料、ビタミン等を添加したものが挙げられる。
　培地の初期pHは例えば７～９とすることができる。培養は例えば30～40℃で2～24時間、通気撹拌培養、振とう培養、静置培養等により行うことができる。培養後、公知の手法により培養物からルシフェラーゼを回収する。
　具体的には、慣用法により菌体を超音波破砕処理、磨砕処理等に供するか、又はリゾチーム等の溶菌酵素を用いてルシフェラーゼを抽出する。得られた抽出液を濾過、遠心分離等し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩等により核酸を除去し、これに硫酸アンモニウム、アルコール、アセトン等を加えて分画し、粗酵素を得ることができる。
　粗酵素はさらに各種のゲルろ過やクロマトグラフィー手法により精製してもよい。市販されているルシフェラーゼを用いることもでき、例えばキッコーマンバイオケミファ社、カタログ番号61314のルシフェラーゼを使用し得る。このルシフェラーゼは特開平１１－２３９４９３号公報（特許第３７４９６２８号）に記載されているものであり、そのアミノ酸配列を配列番号１に示す。また市販されているシグマ・アルドリッチ社、プロメガ社、ライフテクノロジー社のモレキュラープローブ(登録商標)のルシフェラーゼを用いることもできる。
　ルシフェリンは、用いるルシフェラーゼにより基質として認識されるものであればどのようなものでもよく、天然のもの又は化学合成されたものでもよい。また任意の公知のルシフェリン誘導体を用いることもできる。ルシフェリンの基本骨格はイミダゾピラジノンであり、多くの互変異性体がある。ルシフェリンとしては、ホタルルシフェリン、バクテリアルシフェリン、ヴァルグリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、セレンテラジンが挙げられるがこれに限らない。ホタルルシフェリンはホタルルシフェラーゼ(EC 1.13.12.7)の基質である。バクテリアルシフェリンは細菌や魚類に見出され、長鎖アルデヒドと還元型のリン酸リボフラビンからなる。ヴァルグリン(vargulin)はガマアンコウ(midshipman fish)や貝虫(ostracods)に見出されるイミダゾロピラジン誘導体である。渦鞭毛藻類ルシフェリンはクロロフィル誘導体である。セレンテラジンは放散虫、有櫛動物、刺胞動物、イカ、毛顎動物、橈脚類、エビ、魚等に見出される。他にはラティア・ネリトイデス（Latia neritoides）のラティアルシフェリンである(E)-2-メチル-4-(2,6,6-トリメチル-1-シクロヘキシ-1-イリ)-1-ブテン-1-オールギ酸が挙げられる。ルシフェリン誘導体は特開２００７－９１６９５、特表２０１０－５２３１４９（国際公開２００８／１２７６７７号）等に記載されているものであり得る。
　ある実施形態においてルシフェラーゼの測定系における終濃度は、280nmにおける吸光度をルシフェラーゼ濃度（mg protein/mL）としたときに0.001μg protein/mL以上、0.01μg protein/mL以上、0.02μg protein/mL以上、0.05μg protein/mL以上、0.10μg protein/mL以上、0.20μg protein/mL以上、0.25μg protein/mL以上、0.5μg protein/mL以上、0.75μg protein/mL以上、1μg protein/mL以上、5μg protein/mL以上、10μg protein/mL以上、20μg protein/mL以上、30μg protein/mL以上、40μg protein/mL以上、50μg protein/mL以上、60μg protein/mL以上、70μg protein/mL以上、80μg protein/mL以上、90μg protein/mL以上、100μg protein/mL以上、110μg protein/mL以上、120μg protein/mL以上、130μg protein/mL以上、140μg protein/mL以上、例えば150μg protein/mL以上とすることができる。ある実施形態においてルシフェラーゼの測定系における終濃度は、280nmにおける吸光度をルシフェラーゼ濃度（mg protein/mL）としたときに200μg protein/mL以下、150μg protein/mL以下、140μg protein/mL以下、130μg protein/mL以下、120μg protein/mL以下、110μg protein/mL以下、100μg protein/mL以下、90μg protein/mL以下、80μg protein/mL以下、70μg protein/mL以下、60μg protein/mL以下、50μg protein/mL以下、40μg protein/mL以下、30μg protein/mL以下、20μg protein/mL以下、10μg protein/mL以下、5μg protein/mL以下、1μg protein/mL以下、0.5μg protein/mL以下、例えば0.3μg protein/mL以下とすることができる。ある実施形態においてルシフェリン又はルシフェリン誘導体の測定系における終濃度は0.01mM～20mM、0.02mM～20mM、0.03mM～20mM、0.04mM～20mM、0.05mM～20mM、0.1mM～20mM、0.5mM～10mM、例えば0.75mM～5mMとすることができる。
AMPからATPを生成する酵素
　ある実施形態において、発光試薬はさらに、AMPからATPを生成する酵素を含み得る。これにより、系に存在するヌクレオチドとして、ATPのみならず、AMPをも測定することができる。AMPからATPを生成する酵素としては、ピルビン酸－リン酸ジキナーゼ（PPDK）、及びピルビン酸ウォータージキナーゼ（PWDK）等が挙げられるがこれに限らない。例えばPPDKはホスホエノールピルビン酸（PEP）およびリン酸と共に使用し得る。例えばPWDKはPEP及び水と共に使用し得る。別の実施形態では、複数の酵素を組み合わせてもよい。
ADPからATPを生成する酵素
　ある実施形態において、発光試薬はさらに、ADPからATPを生成する酵素を含み得る。これにより、系に存在するヌクレオチドとして、ATPのみならず、ADPをも測定することができる。ADPからATPを生成する酵素としては、ピルビン酸キナーゼ(PK)が挙げられるがこれに限らない。
ADPからAMPを生成する酵素
　ある実施形態において、発光試薬はさらに、ADPからAMPを生成する酵素を含み得る。例えばADPからAMPを生成する酵素と、AMPからATPを生成する酵素をルシフェラーゼと組み合わせることにより、AMP、ADP及びATPを測定し得る。ADPからAMPを生成する酵素としては、ADP依存ヘキソキナーゼやアピラーゼなどが挙げられるがこれに限らない。
AMPからADPを生成する酵素
　ある実施形態において、発光試薬はさらに、AMPからADPを生成する酵素を含み得る。例えばAMPからADPを生成する酵素と、ADPからATPを生成する酵素をルシフェラーゼと組み合わせることにより、AMP、ADP及びATPを測定し得る。AMPからADPを生成する酵素としては、例えばADP依存ヘキソキナーゼ等が挙げられるがこれに限らない。なお、ADP依存ヘキソキナーゼは通常、ADPからAMPを生成するが、逆反応も触媒することができ、したがって、基質濃度を適当に調節することにより、AMPからADPを生成する酵素として利用し得る。
ATP及びAMPからADPを生成する酵素
　ある実施形態において、発光試薬はさらに、ATP及びAMPからADPを生成する酵素を含み得る。ATP及びAMPからADPを生成する酵素を、ADPからATPを生成する酵素と組み合わせることにより、AMP、ADP及びATPを測定し得る。ATP及びAMPからADPを生成する酵素としては、アデニル酸キナーゼ（AK）が挙げられるがこれに限らない。
　AMPからATPを生成する酵素及びADPからATPを生成する酵素を、まとめて、ATP生成能を有する酵素ということがある。ATP生成能を有する酵素としては、任意の公知のものを用いることができ、例えばATP生成能を有するキナーゼが挙げられるがこれに限らない。ATP生成能を有するキナーゼとしては、例えばピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸－リン酸ジキナーゼ、クレアチンキナーゼ、酢酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、グリセロールキナーゼ、フルクトキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、リボフラビンキナーゼ、フルクトースビスホスファターゼ及びその組み合わせが挙げられるがこれに限らない。
　ピルビン酸キナーゼ（EC 2.7.1.40）は、解糖系においてホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に変換し、その際、ADPがATPに変換される。この反応はギブスエネルギーが負の発エルゴン反応であり、天然の条件下では不可逆的である。
PEP＋ADP→ピルビン酸＋ATP
逆方向の反応は、糖新生において、ピルビン酸カルボキシラーゼ及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼが触媒し、ATP及びピルビン酸からPEP及びADPを生じる。細胞抽出を行うと、系には種々の酵素が混在し、上記反応は両方向に進行し得る。その際、ホスホエノールピルビン酸が高濃度に存在するとADPがATPに変換され得る。また、ホスホエノールピルビン酸のみならずピルビン酸キナーゼが系に存在すれば、よりADPがATPに変換されると考えられる。
　クレアチンキナーゼ(EC 2.7.3.2)は、クレアチン及びATPと、クレアチンリン酸及びADPとの間の変換反応を媒介する。
クレアチン＋ATP←→クレアチンリン酸＋ADP
クレアチンキナーゼ（CK）は別名をクレアチンホスホキナーゼ（CPK）又はホスホクレアチンキナーゼともいう。本明細書ではこれらの用語は互いに置き換えることができる。通常、動物の筋肉などではクレアチン及びATPからクレアチンリン酸及びADPを生じる。しかしながらこの反応は可逆反応であり、系にクレアチンリン酸及びADPが高濃度で存在すると、反応は逆方向に進行し、クレアチン及びATPが生じ得る。生体内では細胞質性クレアチンキナーゼは２つのサブユニットB又はMから構成される。したがってサブユニットの組み合わせにより３種のアイソザイム、CK-MM、CK-BB及びCK-MBが存在し得る。アイソザイムパターンは組織によって異なるが、本発明ではどのような組み合わせも使用可能である。
　ピルビン酸－リン酸ジキナーゼ(EC 2.7.9.1)はATP、ピルビン酸、及びオルトリン酸と、アデノシン一リン酸(AMP)、ホスホエノールピルビン酸（PEP）及びピロリン酸（PPi）との間の反応を触媒する。
ATP＋ピルビン酸＋リン酸←→AMP＋PEP＋PPi
ピルビン酸－リン酸ジキナーゼ（PPDK）は別名をATP：ピルビン酸，リン酸ホスホトランスフェラーゼ、ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ、ピルビン酸リン酸リガーゼともいう。本明細書ではこれらの用語は互いに置き換えることができる。PPDKは通常、ピルビン酸をPEPに変換し、そのプロセスでATPが１分子消費されAMPに変換される。反応は次の３つの可逆反応に分けられる。
１．酵素PPDKがATPに結合し、AMPに変換と二リン酸化PPDKを生じる。
２．二リン酸化PPDKが無機リン酸に結合し、二リン酸と一リン酸化PPDKを生じる。  
３．一リン酸化PPDKがピルビン酸に結合し、PEPを生じるとともにPPDKを再び生じる。　このとき、系に存在するPEP濃度が高いと反応は以下のように逆方向に進行する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　便宜上、反応段階は上と同じ番号で説明する。
３．PEPがPPDKに結合し、一リン酸化PPDK及びピルビン酸を生じる。
２．二リン酸と一リン酸化PPDKから二リン酸化PPDKと無機リン酸が生じる。
１．二リン酸化PPDKとAMPからPPDKとATPが生じる。
　酢酸キナーゼ(EC 2.7.2.1)は陽イオンの存在下で、ATP及び酢酸と、ADP及びアセチル化リン酸との間の変換を触媒する。
ATP＋酢酸←→ADP＋アセチル化リン酸
酢酸キナーゼ（AK）は別名をATP:酢酸ホスホトランスフェラーゼ、アセチルキナーゼともいう。本明細書ではこれらの用語は互いに置き換えることができる。生体内ではATP及び酢酸から、ADP及びアセチル化リン酸を生じ、最終的にはアセチルCoAを生成する反応を促進する。系にアセチルCoAから生じたアセチル化リン酸及びADPが存在する場合、これを酢酸及びATPに変換し得る。
　ポリリン酸キナーゼ(EC 2.7.4.1)は、ポリリン酸（PolyPn）及びADPを、ポリリン酸（PolyPn-1）及びATPに変換する反応を触媒する。
ADP＋PolyPn←→ATP＋PolyPn-1
ポリリン酸キナーゼ（PPK）は別名をATP:ポリリン酸ホスホトランスフェラーゼともいう。本明細書ではこれらの用語は互いに置き換えることができる。PPKは生体内では酸化的リン酸化に関与する。系にポリリン酸（n）及びADPが存在する場合、これをポリリン酸（n-1）及びATPに変換し得る。
　リボフラビンキナーゼ(EC 2.7.1.26)は、FMNKとも記載され、リボフラビン及びATPを、リン酸リボフラビン（FMN）及びADPに変換する反応を触媒する。
ATP＋リボフラビン←→ADP＋FMN
　リボフラビンキナーゼはATP:リボフラビン5'-ホスホトランスフェラーゼ（フラボキナーゼともいう）に属する。
　ホスホフルクトキナーゼ1(EC 2.7.1.11)は、PFK1とも記載され、フルクトース-6-リン酸（Fru6P）及びATPを、フルクトース-1,6-ビスリン酸（Fru1,6-BP）及びADPに変換する反応を触媒する。
Fru6P＋ATP←→Fru1,6-BP＋ADP
　ホスホフルクトキナーゼ1はホスホフルクトキナーゼに属する。本明細書ではホスホフルクトキナーゼ1をFru-1,6BPKと記載することがある。
　フルクトースビスホスファターゼ(EC 3.1.3.11)は、FBPaseとも記載され、フルクトース-1,6-ビスリン酸（Fru1,6-BP）及びADPをフルクトース-6-リン酸（Fru6P）及びATPに変換する反応を触媒する。
Fru1,6-BP＋ADP←→Fru6P＋ATP
　フルクトースビスホスファターゼはFBP、FBP1とも記載されることがある。
　上記の酵素を本開示の方法に使用し得る。
　ATP生成能を有する酵素は微生物由来、細菌由来、真核生物由来、原生生物由来、植物由来、動物由来のもの等、任意の公知のものを用いることができ、例えば市販されているものを用いることができる。ATP生成能を有する酵素の添加量は、目的の濃度や反応系に応じて適宜設定することができる。
　ATP生成能を有する酵素としては種々のものが知られ、種々の基質を認識するが、本発明は特にそのATP生成能に着目する。したがって本明細書ではATP生成能を有する酵素の活性単位（U）を37℃でpH 7.8にて、1分当たり1.0μmolの基質をATPに変換する酵素量と定義する（1U=1μmol ATP/min, pH7.8, 37℃）。ある実施形態においてATP生成能を有する酵素は、測定系における活性単位が0.001U以上、0.01U以上、0.1U以上、1U以上、2U以上、3U以上、4U以上、又は5U以上となるよう添加することができる。ある実施形態においてATP生成能を有する酵素は、測定系における活性単位が1000U以下、100U以下、50U以下、10U以下、9U以下、8U以下、7U以下、又は6U以下となるよう添加することができる。
　測定する試料は、細胞を含み得る溶液、細胞や微生物を含む可能性のある媒体、例えば水道水、河川水、河川水処理水、飲料、飲料水、製造用水、風呂水、温泉水、噴水の水、定置洗浄(CIP洗浄)のリンス水、製造排水、遊戯施設の池の水、プールの水、水槽注入用水、クーリングタワーの冷却水、血液の人工透析液、工業用処理水、液状の医薬品、サプリメント、生理食塩水を含み得る。微生物としては、原核生物、細菌、酵母、原生生物、真菌等が挙げられる。細胞としては、微生物細胞のほか、動物細胞、動物由来細胞、植物細胞、植物由来細胞、昆虫細胞、昆虫由来細胞が挙げられる。
　試料中のATP、ADP、AMPなどのヌクレオチドを測定することで微生物又は細胞の存在又は不在を定性的に或いは定量的に決定することができる。これは飲料や食品製品への混入微生物又は混入細胞、水中の微生物又は細胞の混入、繁殖した微生物の定量、増殖した細胞の定量、衛生上の監視等に利用できる。
　ATP測定にはルシパック(登録商標) II（キッコーマンバイオケミファ、製品番号：60375）、ATP+AMP測定には、ルシパック(登録商標) Pen（キッコーマンバイオケミファ、製品番号：60331）ATP+ADP+AMP測定にはルシパック(登録商標) A3 Surface（キッコーマンバイオケミファ、製品番号：60361）を使用し得る。抽出試薬は、0.01% 塩化ベンザルコニウム溶液を使用し得る。これらの市販キットの使用説明書を参照して類似の方法によりヌクレオチドを測定してもよい。
　ATP測定にはルミテスター(登録商標)C-110（キッコーマンバイオケミファ）を、ATP＋AMP測定、及びATP+ADP+AMP測定にはルミテスター(登録商標) Smart（キッコーマンバイオケミファ）を使用することができる。例えばATP測定試薬0.1mLに、各濃度の塩化ベンザルコニウムを含む試料溶液0.2mLを添加し、さらに1×10-7MのATP溶液を0.01mL添加し、発光量を測定することができる。発光量の測定は、ルミテスター(登録商標)C-110（キッコーマンバイオケミファ）を用いて測定を行うことができる。
　発光は、ある基準を定めて、それに対する相対発光単位（RLU）と記載することができる。
　本開示の方法及びキットは、溶液中の微生物又は細胞を測定する方法でありながら、ATPのみを測定するのではなく、他のアデニンヌクレオチドも測定するものである。従来の溶液中の微生物を測定する方法は、ATPのみを測定する方法が一般的であった。これは、水や飲料にATP以外にAMPやADPも含まれるため、ATP以外にADPやAMPも測定するとバックグラウンドノイズが増大してしまうなど、不都合があったためである。また、従来の方法は、遠心分離、上清除去、及び再懸濁や、アデノシンリン酸デアミナーゼでの処理といったヌクレオチド除去工程が必要であり、煩雑であった。本開示の方法及びキットは、こうした工程の代わりに、サンプルをフィルターでろ過することにより、溶液中の遊離ATP、ADP、AMPを洗い流すことができ、簡便に菌体外のATP、ADP、AMPを消去することができる。さらに、本開示の方法及びキットは、ATP+ADP+AMPという三成分測定により、測定毎のばらつきを抑えることができる。なお、これはアデノシンリン酸デアミナーゼでの処理といったヌクレオチド除去工程を本開示の方法に使用してはならないことを意味するものではない。本開示の方法は、ヌクレオチド除去工程をさらに含み得る。
　ある実施形態において、本開示の方法は、菌体外のATP、ADP、及び／又はAMPを消去する工程を含み得る。また、本開示のキットは、菌体外のATP、ADP、及び／又はAMPを消去する試薬を含み得る。ATP、ADP、及び／又はAMPは公知の試薬や、市販の試薬により消去し得る。ATP分解を行う方法として、ATPのみを測定する場合、アピラーゼを用いる方法が知られている（特許文献４）。ただし、アピラーゼはATPをADPさらにAMPへと分解する酵素であるが、それ以上の脱リン酸反応は触媒せず、AMPからATPを生成する酵素を含むATP+AMP測定やATP+ADP+AMPにおいては消去試薬としては機能しない。公知の試薬としては、アデノシンリン酸デアミナーゼが挙げられるがこれに限らない。非特許文献１ではアデニンヌクレオチドの消去として、アデノシンリン酸デアミナーゼによる方法を行っているが、ATP分解のため、30分間静置する必要がある。
　市販の試薬としては、例えばルシフェールATP消去試薬（キッコーマンバイオケミファ、製品番号：60254）が挙げられるがこれに限らない。
　ある実施形態において、本開示の微生物又は細胞を検出するキットは、溶液中の微生物又は細胞を検出するためのものである。本明細書において、特に断らない限り、フィルターとは、液体をろ過するためのフィルターをいう。これとは別に、気体をろ過するための部材を本明細書では、エアーフィルターというものとする。ある実施形態において、本開示の微生物又は細胞を検出するキットは、エアーフィルターを有しない。ある実施形態において、本開示の微生物又は細胞を検出するキットから、エアーフィルターを有するものは除かれる。
　［RNA分解酵素］
　ある実施形態において、本発明のキットはRNA分解酵素を含んでもよい。またある実施形態において、本発明の方法は、RNA分解酵素を使用してもよい。なお、ここでいうRNA分解酵素は、サンプルに由来しないRNA分解酵素を意味する。
　本明細書において、RNA分解酵素とは、RNAから5'-モノヌクレオチド（AMP、GMP、CMP、及びUMP）を生成する反応を触媒する酵素を意味し、例えば以下に記載のものが挙げられる：（1）エンドヌクレアーゼ・エス・ワン（Endonuclease S1）（EC3.1.30.1）、（2）ベノム・エキソヌクレアーゼ（Venom exonuclease）（EC3.1.15.1）、（3）ホスホ・ジエステラーゼ・ワン（Phospho diesterase 1）（EC3.1.4.1）。なお、上記エンドヌクレアーゼ・エス・ワンには、ヌクレアーゼ・ピイ・ワン（Nuclease P1）、マング・ビーン・ヌクレアーゼ（Mung beans nuclease）、ニューロスポラ・クラッサ・ヌクレアーゼ（Neurospora crassa nuclease）が含まれる。
　別の実施形態において、本発明のキットはRNA分解酵素を含まないか、又は実質的な量のRNA分解酵素を含まない。またある実施形態において、本発明の方法は、RNA分解酵素を使用しないか、又は実質的な量のRNA分解酵素を使用しない。この実施形態において、サンプルに由来するRNA分解酵素が反応系に含まれてもよい。本明細書において、「実質的な量のRNA分解酵素」とは、本発明のキット又は方法の効果（例えばATP分解活性の影響を受けにくい、正確な汚染の検出方法を提供するという効果）に影響を与えない量のRNA分解酵素を意味する。実質的なRNA分解酵素の量を含まない例として、例えば反応系での終濃度として0.3U/ml以下、0.15U/ml以下、0.1U/ml以下、0.05U/ml以下、0.01U/ml以下、又は0.001U/ml以下のRNA分解酵素を含むキット、又はこのような量のRNA分解酵素を用いる方法が挙げられる。本明細書において、RNA分解酵素の酵素単位は、酵素のRNA分解能に着目し、RNA分解能を有する酵素の活性単位（U）を37℃にて、1分当たり1.0μモルの基質を酸可溶性のヌクレオチドに変換する酵素量と定義する。例えば、Nuclease P1の酵素単位は、37℃にて、pH5.3で、1分当たり1.0μモルの基質を酸可溶性のヌクレオチドに変換する酵素量と定義される（Nuclease P1の酵素活性の定義の詳細については、Merck社のカタログ（http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/nuclease_p1.pdf）を参照されたい。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
（実施例１）
　Cronobacter sakazakii IAM12660、Klebsiella pneumoniae NBRC14940、Escherichia coli ATCC25922、Staphylococcus aureus ATCC6538、Pseudomonas aeruginosa ATCC27853、Pseudomonas fluorescence NISL420、Sphingomonas parapaucimobilis、Bacillus subtilis ATCC9372、Bacillus cereus NBRC3836を2.5mLのトリプトソイブイヨン培地（栄研化学社製）に植菌し、30℃、160rpmにて一晩振とう培養した。各微生物培養液を滅菌超純水にて100倍希釈した培養希釈液10mLをシリンジフィルターDISMIC(登録商標)- 25CS045AS（アドバンテック東洋社製）を装着した10mLシリンジ（テルモ社製）にて全量ろ過した。
　培養希釈液10mLに0.5mLのルシフェールATP消去試薬（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60254）を添加して30分間放置したものについても、同様にろ過した。あらかじめ容器に測り取った0.24mLの抽出試薬（0.01%塩化ベンザルコニウム）を、微生物を捕集したフィルターで吸引し、容器に排出することにより、フィルター上に捕集した微生物からアデニンヌクレオチド（ATP、AMP、ADP）を抽出した。回収した抽出液中のアデニンヌクレオチドについて、ATP測定はルシパック(登録商標)II（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60375）を用いて、ATP+AMP測定はルシパック(登録商標)Pen（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60331）を用いて、ATP+ADP+AMP測定はルシパック(登録商標) A3 Surface（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60361）を用いて測定した。各検査試薬の綿球部に0.1mL添加し、ATP測定はルミテスター(登録商標) C-110（キッコーマンバイオケミファ社製）、ATP+AMP測定、ATP+ADP+AMP測定はルミテスター(登録商標) Smart（キッコーマンバイオケミファ社製）にて発光量を測定した。発光量は各種検査キットのロット間差を補正するため、ロットごとに既知濃度のATP溶液を添加して発光量を測定した。微生物を含まない滅菌超純水を同様にフィルターろ過し抽出して得た抽出液0.1mLにATP溶液（1×10-7M）を0.01ｍL添加した時の発光量を測定した値をATP添加時発光量とし、検体での発光量をATP添加時発光量で除し、各アデニンヌクレオチド検査試薬の平均的な発光量、3000RLUを乗ずることにより補正値を求めた（補正値＝検体での発光量÷ATP添加時発光量×3000）。また、ATP+ADP量は、ATP+ADP+ADP量からATP+AMP量を引いた値を、ATP量に加えることによって算出した。
[数１]
（ATP+ADP量）＝（ATP+ADP+AMP量）－（ATP+AMP量）＋ATP量
　図１に本実施例の概要を示す。ATP+ADP+AMP測定試薬を用いた場合の発光量（補正値）を100％とし、各微生物の相対発光量を図２に示す。本実施例におけるすべての微生物において、水中微生物に含まれるATP量の割合は非常に低く、ATP+AMP量の割合についても低い値であった。この結果は、非特許文献1において、糖を含まない溶液中では、79.8～89.0％がATP+AMPであるという結果からは、予想外の驚くべき値であった。本実施例では、非特許文献１と異なり、溶液での測定ではなく、フィルターに捕集された微生物中での測定であること等の違いによるものであると推測されるが、ATP測定よりATP+AMP測定、ATP+ADP測定をすることにより、さらにはATP+ADP+AMP測定をすることにより、高い発光量が得られ、高感度に測定することが可能となることが示された。液体中に含まれる危害菌などの微生物をフィルターに捕集した方法で検出する場合、ATP測定するだけではなく、ATP+AMP測定、ATP+ADP測定、さらにはATP+ADP+AMP測定することにより、高感度に微生物を検出できることが示唆された。
（実施例２）
　Escherichia coli ATCC25922を、5本のトリプトソイブイヨン培地（栄研化学社製）2.5mL植菌し、30℃、160rpmにて一晩振とう培養した。各微生物会溶液を滅菌超純水にて100倍希釈した培養希釈液10mLを、シリンジフィルターDISMIC(登録商標)- 25CS045AS（アドバンテック東洋社製）を装着した10mLシリンジ（テルモ社製）にて全量ろ過した。あらかじめ容器に測り取った0.24mLの抽出試薬（0.01%塩化ベンザルコニウム）を、微生物を捕集したフィルターで吸引し、容器に排出することにより、フィルター上に捕集した微生物からアデニンヌクレオチド（ATP、AMP、ADP）を抽出し、回収した。
　回収した抽出液中のアデニンヌクレオチドについて、ATP測定はルシパック(登録商標)II（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60375）を用いて、ATP+AMP測定はルシパック(登録商標)Pen（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60331）を用いて、ATP+ADP+AMP測定はルシパック(登録商標) A3 Surface（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60361）を用いて測定した。各検査試薬の綿球部に0.1mL添加し、ATP測定はルミテスター(登録商標)C-110（キッコーマンバイオケミファ社製）、ATP+AMP、ATP+ADP+AMP測定はルミテスター(登録商標)Smart（キッコーマンバイオケミファ社製）にて発光量を測定した。発光量は各種検査キットのロット間差を補正するため、ロットごとに既知濃度のATP溶液を添加して発光量を測定した。微生物を含まない滅菌超純水を同様にフィルターろ過し抽出して得た抽出液にATP溶液（1×10-7M）を0.01ｍL添加した時の発光量を測定した値をATP添加時発光量とし、検体での発光量をATP添加時発光量で除し、各アデニンヌクレオチド検査試薬の平均的な発光量、3000RLUを乗ずることにより補正値を求めた（補正値＝検体での発光量÷ATP添加時発光量×3000）。また、適宜希釈した微生物懸濁液0.1mLをR2A寒天培地（日水製薬）に塗布し、30℃で一晩培養した後、形成したコロニーを計測し、生菌数を求め、発光測定で得られた補正値を生菌数で除し、109を乗ずることにより、生菌数109CFUあたりの発光量を求めた。各検査試薬を用いて測定した際の生菌数109CFUあたりの発光量（補正値）とその平均値、標準偏差（SD）、変動係数（CV）を表1に示す。表1より、ATP測定の変動係数は大きく、測定値がばらついているのに対して、ATP+AMP測定ではやや低値になり、さらにATP+ADP+AMP測定で変動係数が顕著に低値であった。非特許文献1では、溶液での測定であり、比較はできないが、ATP+AMP測定は安定であり、ATP＋AMP測定を採用しているのに対して、フィルターで微生物を捕集し、抽出液で回収する本実施例においては、ATP測定と比較して、ATP+AMP測定では変動係数が低値となり、ATP+ADP+AMP測定における変動係数はさらに顕著に低値となることは、非特許文献１の結果からは予想外の驚くべき結果であった。ATP+AMP測定、さらにはATP+ADP+AMP測定を行うことにより、ばらつきなく安定した測定が可能になり、微生物数をより正確に推定することが可能であることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例３）
　Klebsiella pneumoniae NBRC14940、Saccharomyces cerevisiae NISL3399、Pseudomonas aeruginosa ATCC27853、Micrococcus luteus IFO3333、Bacillus cereus NBRC3836、Cronobacter sakazakii IAM12660、Escherichia coli ATCC25922、Staphylococcus aureus ATCC6538を2.5mLのトリプトソイブイヨン培地（栄研化学社製）に植菌し、30℃、160rpmにて一晩振とう培養した。各微生物培養液を滅菌超純水にて希釈し、10倍ごとの微生物希釈液を作製した。各微生物培養液を滅菌超純水にて100倍希釈した培養希釈液10ｍLを、各種シリンジフィルターを装着した10mLシリンジ（テルモ社製）にて全量ろ過し、微生物を捕集した。フィルターは表２のうち、アドバンテック東洋、GVS Filter Technology、メルクミリポア社製の各種フィルターを使用した。孔径はすべて0.45μmのものを使用した。0.24mLの抽出試薬（0.01%塩化ベンザルコニウム）を容器に測り取り、微生物を捕集したフィルターで吸引し、容器内に排出することにより、フィルター上に捕集した微生物からアデニンヌクレオチド（ATP、AMP）を抽出した。アデニンヌクレオチド抽出液をルシパック(登録商標) Pen（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60331）の綿棒を用いてサンプリングし、ルミテスター(登録商標) Smart（キッコーマンバイオケミファ社製）にて発光量を測定した。また、適宜希釈した微生物懸濁液0.1mLをR2A寒天培地（日水製薬社製）に塗布し、30℃で一晩培養した後、形成したコロニーを計測し、生菌数とした。
　同様にE.coliについて、ルシパック(登録商標) A3 Surface（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号：60361）を用いて、各種ATP+ADP+AMP量を同様に測定した。フィルターは表２のアドバンテック東洋、GVS Filter Technology、Membrane Solutions、メルクミリポア社製の各種フィルターを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　メーカーによってフィルターユニットのハウジング構造などが異なり、抽出効率に影響することが考えられるため、同じメーカー内でフィルターの材質の違いによる各微生物の発光量を比較した。アドバンテック東洋社での各微生物のATP+AMP測定の発光量を図４に、同じくGVS社を図５に、メルクミリポア社を図６に示した。同様に、アドバンテック東洋社でのE.coliのATP+ADP+AMP測定の発光量を図７に、同じくGVSを図８に、Membrane Solutionsを図９に、メルクミリポアを図１０に示した。
　アドバンテック東洋、GVS、Membrane Solutions社における酢酸セルロース（CA）とポリエーテルサルフォン（PES）の比較では、CAの発光量が高く、CAのほうが微生物からアデニンヌクレオチドを多く抽出できていることがわかる。メルクミリポア社フィルターでの比較では、ATP+AMP測定では各微生物においてPESの発光量が最も高く、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）、セルロース混合エステル（MCE）よりも微生物からアデニンヌクレオチドを多く抽出できており、ATP+ADP+AMP測定ではPESはPVDFとほぼ同等、MCEよりも発光量が高いことがわかる。これらの結果を総合すると、CAが最も膜上に捕集された微生物から、アデニンヌクレオチド（ATP、ADP、AMP）を多く抽出することができると言える。セルロース混合エステル（MCE）も成分としては酢酸セルロース（CA）を含んでいることから技術常識上、両者に性能差は無いか又はほとんどないと予測されたが、実験を行ってみると実際にはセルロース混合エステル（MCE）フィルターよりも、酢酸セルロース（CA）フィルターの発光量が高いことが確認された。この結果は非常に驚きであった。
　上清除去、及び再懸濁や、アデノシンリン酸デアミナーゼでの処理といったヌクレオチド除去工程の代わりに、サンプルをフィルターでろ過することにより、遊離のATP、ADP、AMPを洗い流すことができ、発光を測定することができた。フィルターろ過法をさらに検討したところ、ATPのみを測定する場合や、ATP＋AMPを測定する場合、細菌ごとに、また同じ細菌であっても実験毎に、測定値がばらつく、という問題に遭遇した。そこで、従来の技術常識によればバックグラウンドノイズが増大すると考えられてきたATP＋ADPという二成分測定、及び、ATP+ADP+AMPという三成分測定を試みたところ、いずれの場合も、むしろ、細菌についてのばらつきや、実験毎のばらつきが抑制され、測定値が安定することを見出した。検体として細胞を用いた場合も、同様の結果が得られ得るものと考えられる。
　本発明によれば、アデニンヌクレオチドを測定することで、微生物又は細胞を検出し得る。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (16)

  1. 　以下の工程、
    (i)　溶液をフィルターに通して微生物又は細胞をフィルター上に捕集する工程、
    (ii)　フィルター上に捕集された微生物又は細胞を抽出剤と接触させ、微生物又は細胞のアデニンヌクレオチド成分を抽出する工程、
    (iii)　抽出されたアデニンヌクレオチド成分を、ルシフェラーゼ、及び、AMPからATPを生成する酵素を含む発光試薬と接触させる工程、及び
    (iv)　発光量を測定する工程、
    を含む、溶液中の微生物又は細胞を検出する方法。
  2. 　発光試薬がさらに、ADPからATPを生成する酵素、又は、ADPからAMPを生成する酵素を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　以下の工程、
    (i)溶液をフィルターに通して微生物又は細胞をフィルター上に捕集する工程、
    (ii)フィルター上に捕集された微生物又は細胞を抽出剤と接触させ、微生物又は細胞のアデニンヌクレオチド成分を抽出する工程、
    (iii)抽出されたアデニンヌクレオチド成分を、ルシフェラーゼ、及び、ADPからATPを生成する酵素を含む発光試薬と接触させる工程、及び
    (iv)発光量を測定する工程、
    を含む、溶液中の微生物又は細胞を検出する方法。
  4. 　発光試薬がさらに、AMPからADPを生成する酵素、又は、ATP及びAMPからADPを生成する酵素を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 　フィルターが酢酸セルロースフィルターである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　発光試薬がルシフェリンを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　抽出剤が界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又は塩化ベンザルコニウムの１以上を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　菌体外のATP、ADP、又はAMPを消去する工程を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　(A)　フィルター、
    　(B)　抽出剤、
    　(C)　ルシフェラーゼ、及び、AMPからATPを生成する酵素を含む発光試薬、及び
    　(D)使用説明書
    を含む、溶液中の微生物又は細胞を検出するためのキットであって、
    前記使用説明書は、
    (i)　溶液をフィルターでろ過し、微生物又は細胞を捕集する工程、
    (ii)　捕集された微生物又は細胞に抽出剤を添加し、微生物又は細胞からアデニンヌクレオチド成分を抽出する工程、
    (iii)　抽出されたアデニンヌクレオチド成分を、ルシフェラーゼ、及び、AMPからATPを生成する酵素を含む発光試薬と接触させる工程、及び
    (iv)　発光量を測定する工程、
    により微生物又は細胞を検出することを記載したものである、前記キット。
  10. 　発光試薬がさらに、ADPからATP又はAMPを生成する酵素を含む、請求項９に記載のキット。
  11. 　(A)　フィルター、
    　(B)　抽出剤、
    　(C)　ルシフェラーゼ、及び、ADPからATPを生成する酵素を含む発光試薬、及び
    　(D)使用説明書
    を含む、溶液中の微生物又は細胞を検出するためのキットであって、
    前記使用説明書は、
    (i)溶液をフィルターでろ過し、微生物又は細胞を捕集する工程、
    (ii)捕集された微生物又は細胞に抽出剤を添加し、微生物又は細胞からアデニンヌクレオチド成分を抽出する工程、
    (iii)抽出されたアデニンヌクレオチド成分を、ルシフェラーゼ、及び、ADPからATPを生成する酵素を含む発光試薬と接触させる工程、及び
    (iv)発光量を測定する工程、
    により微生物又は細胞を検出することを記載したものである、前記キット。
  12. 　発光試薬がさらに、AMPからADPを生成する酵素、又は、ATP及びAMPからADPを生成する酵素を含む、請求項１１に記載のキット。
  13. 　フィルターが酢酸セルロースフィルターである、請求項９～１２のいずれか一項に記載のキット。
  14. 　発光試薬がルシフェリンを含む、請求項９～１３のいずれか一項に記載のキット。
  15. 　抽出剤が界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又は塩化ベンザルコニウムの１以上を含む、請求項９～１４いずれか一項に記載のキット。
  16. 　キットが菌体外のATP、ADP、又はAMPを消去する試薬を含み、使用説明書が、さらに菌体外のATP、ADP、又はAMPを消去する工程を記載したものである、請求項９～１５のいずれか１項に記載のキット。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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