JPH09504683A

JPH09504683A - 生物発光に使用される試薬

Info

Publication number: JPH09504683A
Application number: JP7500408A
Authority: JP
Inventors: フート、ニコラス・ペーター・マーチン; グラント、ピーター・レオナルド
Original assignee: セルシス・インターナショナル・パブリック・リミテッド・カンパニー
Priority date: 1993-06-01
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 1997-05-13
Also published as: DE69409107D1; SG69976A1; GB9311241D0; EP0701625A1; US5770391A; ES2113105T3; AU672707B2; DE69409107T2; EP0701625B1; AU6802494A; WO1994028169A1

Abstract

(57)【要約】ＡＴＰ減成酵素と、ホタル・ルシフェラーゼによる発光反応の基質物質(ＡＴＰを除く)を減成しうる１またはそれ以上の酵素との組合わせを提供する。これら活性体を用い、増殖培地を処理して、その後の生物発光検定においてバックグラウンドを無視できるほどの量に減少させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】生物発光に使用される試薬発明の分野本発明は、生物発光に使用される試薬およびその使用に関する。発明の背景ホタル・ルシフェラーゼ反応を用い、原形質細胞や真核細胞由来のアデノシン 5'-三リン酸(ＡＴＰ)の濃度を測定する場合、しばしば、生物発光バックグラウンドシグナル(基底値シグナル)のレベルが問題となっている。特に、試料が天然供給源からの増殖培地を含んでいる場合に問題が生じ、これは、しばしば微生物検定の場合に起こる。このような増殖培地は、生体材料から調製されるため、多量のＡＴＰを含む傾向を示す。かかる培地から発生する生物発光バックグラウンドシグナルは、酵素ＡＴＰアーゼ(例えばアピラーゼ)またはＡＴＰ利用酵素（例えばキナーゼ）と共にその同時使用の基質との反応によって、その大半を除去することができる。しかしながら、常に、ある比率のシグナルが残留し、これは、鋭敏な生物発光測定を妨害しうるのである。また、その供給源は常に、非微生物系のＡＴＰや非細胞系のＡＴＰを含んでいるようであり、このタイプＡＴＰは、恐らくはキレートを形成しているためであろうが、いずれにせよ酵素ＡＴＰアーゼによって利用することができない。発明の概要本発明は、残留した生物発光バックグラウンドシグナルをある種の酵素との反応によって除去できることの知見に基づくもので、かかる酵素として、例えばヘビ毒液由来のホスホジエステラーゼＩ(E.C.3.1.4.1：Enzyme Nomenclature、198 4年、アカデミックプレス)、酸性ホスファターゼ(E.C.3.1.3.2)、アルカリ性ホスファターゼ(E.C.3.1.3.1)などが挙げられる。前記「減成不能なＡＴＰ」の同様な候補として、酵素アピラーゼやＡＴＰを基質とする他の酵素類によって攻撃されないがホタル・ルシフェラーゼが作用すると発光が起こるような構造的にＡＴＰに関連する物質が挙げられる。この物質は、ルシフェラーゼの真の基質であってよく、またルシフェラーゼの作用によってＡＴＰのような真の基質を形成するものであってもよく、さらに他の未確認の方法によって破断してＡＴＰや別のルシフェラーゼ基質を形成するものでもよい。他のかかる物質の１つとして、フラビン・アデニン・ジヌクレオチド(ＦＡＤ) が確認されている。それは、多数の微生物増殖培地や生体試料中において生じるものあって、構造的にＡＴＰに関連しており、またホタル・ルシフェラーゼの発光基質として作用するようではあるが、アピラーゼによっては減成せずに、ヘビ毒液ホスホジステラーゼＩによって破壊されるものである。他のかかる物質には、アデノシン5'-テトラホスフェート(p₄Ａ)や他のアデノシンポリホスフェート類、ジアデノシン5',5'"-Ｐ¹,Ｐ⁴-テトラホスフェート(Ａp₄Ａ)や他のジアデノシン・ポリホスフェート類および他のジヌクレオシド・ポリホスフェート類(例えば、Ｇp₄ＡおよびＧp₅Ａ)が包含される。未確認ではあるが他のＡＴＰ誘導体も同様な特性を有しているようである。これらの幾つかは、低効率の発光ルシフェラーゼ基質として作用することが従来から示唆されている〔モーゼン(1978年)、B iochem.Biophys.Res.Commun.84巻、816〜822頁、およびサイレロら(1991年)、Eur.J.Bi ochem.202巻、507〜513頁、参照〕。前記したこれらの化合物は、好適な酵素活性、例えばヘビ毒液ホスホジエステラーゼＩまたは他のホスファターゼ類によって破壊することができる。またかかるヌクレオチド誘導体に作用すると共に種々の程度の特異性を示すような他の酵素類も存在する。例えば、アデノシン・テトラフォスファターゼ(E.C.3.6.1.14) を本発明の方法に使用することができ、例えば、ルシフェラーゼ基質のアデノシン5'-四リン酸を加水分解してＡＴＰを形成し、このＡＴＰはその後、アピラーゼによって分解される。また、ジアデノシン5',5'"-Ｐ¹,Ｐ⁴-テトラホスファターゼ(E.C.3.6.1.17)は、黄色ルピナス種子から単離されるが〔ジャックボウスキイら(19 83年)、J.Bio.Chem.258巻(16)、9982〜9989頁〕、これも、同様にその基質からＡＴＰを形成できるため、残留生物発光シグナルの一部がＡp₄Ａから生じる場合に、アピラーゼと一緒に使用することができる。したがって、液体処理用の試薬は、生物発光ＡＴＰ検定におけるかかる応答を減少させるため、ＡＴＰ減成酵素類（例えば、ポテト・アピラーゼ）と、ＡＴＰ以外のルシフェラーゼ基質を減成する１またはそれ以上の酵素類とを含むと共に、要すれば付加的に２価金属イオン(例えばＭg²+)を含んでなる。発明の説明本発明の試薬を微生物増殖培地に使用する場合、通常、非滅菌溶液中において実質的な微生物増殖が起こらないように、そのブロスは数時間の調製期間の間に処理される。この酵素処理ののち、ブロスは、常法、例えばろ過またはオートクレーブを用いて滅菌処理することができる。オートクレーブ処理や加熱処理は、酵素活性を破壊する作用を有するため、高レベルの酵素を使用できるが、その後の検定が妨害されることはない。別法として、ブロスおよび酵素を相互に混合したのちに滅菌／ろ過を行うことができ、この方法は、酵素活性を破壊することがない。滅菌混合物を採用した場合、長い処理時間と低レベルの酵素を用いて、添加酵素がその後のＡＴＰ検定に対し無視できるほどの作用しか示さないことを保証することができる。他方、高レベルの活性酵素は、生物発光による検定前に試料を処理ブロスに添加してインキュベートするような多量の微生物が存在する検定法に有利である。なぜなら、試料中に存在しうる、遊離のＡＴＰやＦＡＤなどのルシフェラーゼ基質が、インキュベーション工程の間に除去されてしまうからである。豊富化工程を用いることなく試料を分析すべき場合、試料のマトリックスは著しいバックグラウンドシグナルを生じさせないため(例えば、殆どの食品や飲料や、食品または飲料を含む綿棒(スワッブ)の場合)、前記と同様な方法で酵素試薬を予め添加してバックグラウンドノイズを減少させることができる。その後、微生物および／または細胞ＡＴＰを放出して、これを、バックグラウンドノイズの妨害を受けることなく直接測定することができる。次に、実施例を挙げて、本発明を説明する。実施例１新たに調製したニュートリエント・ブロス２番(オキソイド)２５０mlに、ポテト・アピラーゼおよびヘビ毒液のホスホジエステラーゼＩに添加して、各々、最終の活性２および０.２国際単位／リットルを得た。次いで、得られた混合物を０.２２μmのメンブラン・フィルターを介して滅菌容器へろ過し、２５℃で１６時間インキュベートした。ホタル・ルシフェラーゼ反応の応答を、処理前後に、ＨＳ(高感度)ルシフェラーゼ-ルシフェリン試薬(セルシル)およびバーソルド・バイオルーマット・ルミノメータを用いて測定した。得られた応答は、処理前が５５０pＭ-ＡＴＰに相当するのに対し、処理後は０.０３pＭ-ＡＴＰ以下に相当した。実施例２ニュートリエント・ブロス２番(オキソイド)を異なるバッチから滅菌水を用いて調製した。その一部を保存すると共に、アビラーゼ(１０ I.U./リットル)を単独で添加するか、またはアピラーゼ(１０ I.U./リットル)＋ヘビ毒液ホスホジエステラーゼＩ(１ I.U./リットル)を添加したが、この時点で、混合物は滅菌処理しなかった。室温で１時間後、ルシフェラーゼ検定の応答を実施例１と同様に記録した。その結果は次のとおりである。実施例３滅菌水で調製したサボユーラウド液体培地(オキソイド)を、室温にて種々の市販グレイドのポテト・アピラーゼ(０.２５ I.U./ml)によってサツマイモ由来の酸性ホスファターゼ(０.２５ I.U./ml)を用いるかまたは用いずに、処理した。２時間後、見掛ＡＴＰ含量を生物発光によって測定し、以下の結果を得た。用いたアピラーゼは、真のＡＴＰのレベルを検定の検出限界以下に低下させるのに、充分な量で存在させた。検定において発光を生じさせる残留物質は、アピラーゼ単独でも、広範なレベルで除去され、これは、調製物において汚染酵素が種々のレベルで存在することを示すものである。酸性ホスファターゼの添加は、生物発光シグナルを所定の値へ更に減少させた。実施例４サボユーラウド液体培地の別のバッチを滅菌水で調製し、これを３つの試料に分けた。第１の試料は添加を行わず、第２の試料にはポテト・アピラーゼとサツマイモの酸性ホスファターゼ(０.２５ I.U./ml)を添加し、第３の試料にはヘビ毒液ホスホジエステラーゼＩ(０.０１ I.U./ml)を添加した。次いで、各混合物を滅菌ろ過し、室温で滅菌条件下に２４時間放置し、この時点で、生物発光によって検定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者グラント、ピーター・レオナルドイギリス、ピーイー17・３ユーイー、ケンブリッジシェア、ニーディングワース、ルセット・アヴェニュー28番

Claims

【特許請求の範囲】１．ＡＴＰ減成酵素を含むと共に、ホタル・ルシフェラーゼによる発光反応の基質物質（ＡＴＰを除く）を減成しうる１またはそれ以上の酵素を含んでなる組成物。２．１またはそれ以上の前記酵素と前記非ＡＴＰ基質物質との反応生成物がＡＴＰである請求項１記載の組成物。３．１またはそれ以上の前記酵素がＦＡＤ減成活性を示す請求項１または２記載の組成物。４．ＡＴＰアーゼと、ホスホジエステラーゼＩ活性を示す酵素とを含んでなる請求項１〜３の１つに記載の組成物。５．ＡＴＰアーゼと、ホスファターゼ活性を示す酵素とを含んでなる請求項１〜４の１つに記載の組成物。６．ＡＴＰアーゼがポテト・アピラーゼである請求項１〜５の１つに記載の組成物。７．当該組成物が凍結乾燥形態である請求項１〜６の１つに記載の組成物。８．さらに、Ｍg²+または他の２価金属イオンを含んでなる請求項１〜７の１つに記載の組成物。９．さらに、１またはそれ以上の他の生物発光試薬を含んでなる請求項１〜８の１つに記載の組成物。１０．前記各成分が、２またはそれ以上の容器に収納されたキット形態で提供される請求項７または８記載の組成物。１１．請求項１〜６の１つに記載の酵素活性体を成長培地へ添加することを含んでなる成長培地の処理方法。１２．請求項１〜６の１つに記載の酵素活性体を試料に添加する予備工程を含んでなる、生物発光検定法によって試料を検定する方法。１３．酵素活性体を、請求項１〜８の１つに記載の組成物として添加する請求項１１または１２記載の方法。