JP2005160491A - 各種カンジダ種の培養と特異的同定用培地、及び分析方法 - Google Patents

各種カンジダ種の培養と特異的同定用培地、及び分析方法 Download PDF

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Abstract

【課題】 Ｃ．アルビカンス酵母を迅速に同定するための従来法は、Ｃ．トロピカリス種の酵母に関して減じられた特異性に問題がある。
【解決手段】 本発明はヘキソサミニダーゼ及び任意にグルコシダーゼ群の酵素によって加水分解することができる色素原性又は蛍光原性基質、及び／又は少なくともＣ．トロピカリスのヘキソサミニダーゼ活性を選択的に抑制する化合物を含む酵母の特異的培養及び同定培地、及びその培地を用い、Ｃ．アルビカンス及び／又はＣ．トロピカリス及び／又は他のカンジダ属を選択的に同定するための方法に関する。本発明は生物医学分野、とりわけ細菌学において特に適用可能である。
【選択図】 なし

Description

本発明は、酵母の培養と特異的同定のための培地及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）及びカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）酵母を特異的に同定するための及び／又はＣ．アルビカンスとＣ．トロピカリス酵母を分化するための微生物学的分析方法に関する。
Ｃ．アルビカンス種は、臨床的試料から最も普通に分離されるものの一つであり、正常な免疫防御を持つ個人において皮膚、爪及び粘膜の多かれ少なかれ広範な感染を、及び弱体化した個人における、及び特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に罹ったそれらにおいて非常に重篤な感染を生じる。研究によれば、Ｃ．トロピカリスは、ヒト生体の試料中から分離される二番目又は三番目に最も普通の種である。それは本質的に試料中のこれら酵母の存在を非常に迅速に検出することを可能にするのみではなく、Ｃ．アルビカンス種に属するそれとＣ．トロピカリス種に属するそれとの分化を可能にすることである。
これをなすために、多くの技術はＣ．アルビカンス酵母を迅速に同定するために近年になって提案されている。これらの技術の大部分は、ヘキソサミニダーゼ活性、即ち、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ又はＮ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニダーゼ又はＮ−アセチル−β−Ｄ−マンノサミニダーゼ活性の実証に基づく（ＦＲ−２６８４１１０，ＦＲ−２６５９９８２）。しかしながら、これらの方法は、Ｃ．トロピカリス種の酵母に関して減じられた特異性に問題がある。
本発明者らは、Ｃ．トロピカリス種の酵素活性、特にそのヘキソサミニダーゼ活性を抑制することによって、上述した試験の欠点を克服することが可能であり、かくして酵母、特にＣ．アルビカンスとＣ．トロピカリスを同定する及び／又は分化するための迅速且つ経済的な手段を提供することを発見している。
さらに、グルコシダーゼ酵素活性は、Ｃａｓａｌ，Ｍ．とＬｉｎａｒｅｓ，Ｍ．Ｊ．”Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｗｉｔｈ ｍｅｄｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ”Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８１，１５５−１５９（１９８３）のようなある文献中のリサーチの対象に既になっている。この活性は、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．トロピカリス及びカンジダ・シュードトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）（今日、カンジダ・ケフィー（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ）として知られる）の多数の株で陽性であるが、他のカンジダ種、例えばＣ．パラシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、Ｃ．グイリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）及びＣ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）では陰性である。
かくしてそれは、同じ培地において、２つの異なる酵素活性、即ちヘキソサミニダーゼとグルコシダーゼ活性の調査のための可能性の合体を試みることが有効であることを明らかにした。現に、それは、本発明に従う培地において、この合体は、Ｃ．グイリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．ケフィー（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、Ｃ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）及び／又はＣ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）種から及び他の酵母からＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）をより特異的に分化すること、そればかりでなく、他のカンジダ種からのＣ．グイリエルモンディ、Ｃ．ケフィー、Ｃ．ルシタニエ及び／又はＣ．トロピカリスを分化することを可能にする。
言うまでもなく、それは、同じ培地中で、ヘキソサミニダーゼとグルコシダーゼ活性に特異的な基質と共に、本発明に従うインヒビター、及びさらにヘキソサミニダーゼ活性のアクチベーターを組み合わせることが意図される。
本発明の主題は、かくして、ヘキソサミニダーゼファミリーの酵素によって加水分解することができる色素原性又は蛍光原性基質を含む、酵母の培養と特異的同定用の培地において、該培地がＣ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）のヘキソサミニダーゼ活性を選択的に抑制する少なくとも１の化合物をも含むことを特徴とする培地である。
本発明によって、その培養培地は、Ｃ．アルビカンス及び／又はＣ．トロピカリス種の酵母の特異的な同定を特に与える。
本発明の好適な実施態様に従って、その培養培地は、選択的抑制化合物（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｖｉｔｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として、式（Ｉ）：
（Ｉ） Ｒ−（ＣＯ−ＮＲ′Ｒ”）ｎ
［式中、まず第１に、互いに独立したＲ，Ｒ′及びＲ”のいずれかは：
−水素原子、
−少なくとも１のヘテロ原子を任意に含む飽和又は不飽和脂肪族又は環式炭化水素ベースの鎖、
又は基Ｒ及び／又はＲ′及び／又はＲ”のそれぞれは、少なくとも１のヘテロ原子を任意に含む環式、飽和又は不飽和炭化水素ベース鎖を一緒に形成する、
からなり、
及び、第２に、ｎは１以上の整数である］
のアミドを含む。
本発明に従い、表現「少なくとも１のヘテロ原子を「含む」炭化水素ベースの鎖」は、その炭化水素ベースの鎖が、特に−ＮＨ2，−ＣＯＯＨ，−ＳＨ及びハロゲン原子のような少なくとも１の置換基で置換することができ、及び／又は特にＯ，Ｓ及びＮのような少なくとも１のヘテロ原子によって中断（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）することができることを意味する。
本発明の好ましい実施態様の一つに従えば、培養培地は、選択的抑制化合物として、式（Ｉ）：
（Ｉ） Ｒ−（ＣＯ−ＮＲ′Ｒ”）ｎ
［式中、まず第１に、互いに独立したＲ，Ｒ′及びＲ”のいずれかは：
−水素原子、
−少なくとも１のヘテロ原子によって任意に中断される飽和又は不飽和脂肪族又は環式炭化水素ベースの鎖、
又は基Ｒ及び／又はＲ′及び／又はＲ”のそれぞれは、少なくとも１のヘテロ原子によって任意に中断される環式、飽和又は不飽和炭化水素ベース鎖を一緒に形成する、
からなり、
及び、第２に、ｎは１以上の整数である］
のアミドを含む。
本発明の別の好適な実施態様に従えば、培養培地は、選択的抑制化合物として、式（Ｉ）：
（Ｉ） Ｒ−（ＣＯ−ＮＲ′Ｒ”）ｎ
［式中、まず第１に、互いに独立したＲ，Ｒ′及びＲ”は：
−水素原子、
−脂肪族炭化水素ベースの鎖、
からなり、
及び、第２に、ｎは１又は２である］
のアミドを含む。
本発明の非常に好適な実施態様に従えば、選択的抑制化合物はアセトアミドである。
本発明の別の実施態様に従えば、培養培地は、Ｃ．アルビカンスのヘキソサミニダーゼ酵素に特異的であるアクチベーターを含む。
本発明の好適な実施態様の一つに従えば、ヘキソサミニダーゼ酵素に特異的であるアクチベーターは、Ｎ−アセチルグルコサミンである。
本発明の別な実施態様に従えば、培養培地は、選択的抑制化合物の混合物を含む。
本発明の好適な実施態様の一つに従えば、選択的抑制化合物の混合物は、アセトアミドとホルムアミドからなる。
本発明の好適な実施態様の一つに従えば、その培地は液体であるか又はゲル化されている。
本発明の実施態様の一つに従って、培養培地はゲル化され、且つリットル当たり：
− ペプトン又はペプトンの混合物０．０１−４０ｇ
− 酵母エキス０．０１−４０ｇ
− グルコース（炭素源）０−１０ｇ
− リン酸緩衝液（５と８．５の間のｐＨ）２．５−１００ｍＭ
− ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）２０−６００×１０−６Ｍ
− アセトアミド０．０１−２０ｇ
− 細菌のインヒビター０−２０ｇ
− 寒天１１−２０ｇ
を含む。
本発明の別の好適な実施態様に従えば、上述したゲル化した又は液状の培養培地は、１．０ｇ／ｌの濃度でＮ−アセチルグルコサミンを更に含む。
本発明の別の好適な実施態様に従えば、上述したゲル化した又は液状の培養培地は、０．５ｇ／ｌの濃度でホルムアミドを更に含む。
本発明の別な主題は、Ｃ．アルビカンス及び／又はＣ．トロピカリス酵母を選択的に同定するため及び／又はＣ．アルビカンスとＣ．トロピカリス酵母を分化するための微生物学的分析方法であり、分析されるべき試料が、上述した少なくとも１の同定培地と直接接触して配されることを特徴とする。
これを達成するために、本発明はまた、酵母の検出と特異的同定用の培地において、ヘキソサミニダーゼファミリーからの酵素によって加水分解できる第１の色素原性（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）又は蛍光原性（ｆｌｕｏｒｉｇｅｎｉｃ）基質、及びグルコシダーゼファミリーからの酵素によって加水分解できる第２の色素原性又は蛍光原性基質との２つの基質を含むことを特徴とする培地にも関する。
本発明の一つの好適な実施態様に従えば、この培地において、それぞれの基質は酵素の特異的部分と標識部分とからなり、第１の基質の標識部分は第２の基質の標識部分と異なることを特徴とする。
別の好適な実施態様に従えば、その培地は、ヘキソサミニダーゼアクチベーター及び／又はインヒビターを含む。
アクチベーター及び／又はインヒビターがある場合、アクチベーターは、ヘキソサミン及び／又はヘキソサミニジンからなり、及びこのインヒビターは上述した特徴を保持する。
本発明の更に別の実施態様に従えば、ヘキソサミニダーゼ基質がインドキシル誘導体からなる及び／又はグルコシダーゼ基質がインドキシル誘導体からなる。
全てのケースにおいて、該培地は液体であるか又はゲル化されている。
本発明はまた、試料が請求項１３と１８のいずれか１項記載の培地と直接接触して配され、時間が該培地中に着色が出現するまで与えられ、且つ同定が、着色における相違に基づいて、一方ではＣ．グイリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．ケフィー（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、Ｃ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）及び／又はＣ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）種からＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）種をもたらし、及び他方では、他のカンジダ種からのＣ．グイリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．ケフィー（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、Ｃ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）及び／又はＣ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）種をもたらすことを特徴とする、カンジダ属酵母の一定種を検出する及び選択的に同定するための微生物学的分析方法にも関する。
その培地がアクチベーター又はインヒビターを含んでいない場合、３６と６０時間の間、有利には本質的に４８時間の待機期間が与えられる。
その培地がアクチベーター又はインヒビターを含む場合、１８と３０時間の間、有利には本質的に２４時間の待機期間が与えられる。
第１の実施態様に従い、これらの方法は、その培地が：
− ヘキソサミニダーゼ基質、及び／又は
− グルコシダーゼ基質、及び／又は
− ヘキソサミニダーゼアクチベーター、及び／又は
− ヘキソサミニダーゼインヒビター
を含む場合、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．グイリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．ケフィー（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、Ｃ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）及び／又はＣ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）を、他のカンジダ種から同定することを可能にする。
第２の実施態様に従い、これらの方法は、その培地が：
− ヘキソサミニダーゼ基質及びグルコシダーゼ基質、及び／又は
− ヘキソサミニダーゼアクチベーター、及び／又は
− ヘキソサミニダーゼインヒビター
を含む場合、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）を、Ｃ．グイリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．ケフィー（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、Ｃ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）及び／又は他のカンジダ種から同定することを可能にする。
表現「Ｃ．トロピカリスのヘキソサミニダーゼ活性を選択的に抑制する化合物」は、Ｃ．トロピカリスのヘキソサミニダーゼ活性を選択的に抑制することが可能な何れかの化合物を意味する。例えば、上述した式のアミド型の化合物は、Ｃ．トロピカリスのヘキソサミニダーゼ活性を、Ｃ．アルビカンスのそれに影響を与えることなしに特異的に抑制する特性を有する。
用語「同定」は、検出及び／又は定量化を意味する。
用語「試料」は、特に、例えば培養後、単離した酵母株又は一連の酵母株を取り出す生物学的なタイプの何れかの試料を意味する。
最終培地のｇ／ｌで表される、培養培地の組成は、一般の用語で以下に概要される。
該培地は、酵母の増殖のために要求される栄養成分と、本発明に従うＣ．トロピカリスのヘキソサミニダーゼの特異的なインヒビターとを含む。
栄養成分の構成要素は：
− 商標名ｂｉｏＳｏｙａｓｅの下にｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社によって販売される製品などの、肉ペプトンのようなペプトン、又は代替的にペプトンの混合物の０．０１から４０ｇ／ｌまで；好ましくは、該ペプトン又はペプトンの混合物は、約６ｇ／ｌ±０．５ｇ／ｌの濃度で培地中に存在させる；
− 酵母の増殖のためのビタミンを供給する、酵母エキスの０．０１から４０ｇ／ｌまで、好ましくは約１．５ｇ／ｌ；
− ０から１０ｇ／ｌまでの割合で、グルコース、グリセリン、酢酸塩、ピルビン酸塩、乳酸塩、アルギニン、アミノ酪酸塩、又はこれら化合物の混合物のような炭素源；該炭素源は、１ｇ／ｌでのグルコースが好適である；
− Ｃ．アルビカンスの増殖に適した５と８．５の間のｐＨを与えるように培地に加える緩衝剤；該緩衝剤は、２．５から１００ｍＭまでの割合で、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、Ｈｅｐｅｓ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）緩衝剤及びクエン酸緩衝剤から選択される；好ましくは、該緩衝剤は、７の領域内の値に培地のｐＨを調整するための１０ｍＭリン酸緩衝剤である；
− 寒天の１１から２０ｇ／ｌ、好ましくは１５ｇ／ｌ；
を含む。
色素原性又は蛍光原性基質は、着色した又は蛍光生成物を放出するため、ガラクトサミニダーゼ、グルコサミニダーゼ又はマンノサミニダーゼのような、ヘキソサミニダーゼによって加水分解することができる、何れかの色素原性又は蛍光原性基質とすることができる。好ましくは、該基質は、幾つかの分子による強い着色又は蛍光を示し、且つ望まれる酵素活性以外の、微生物の代謝における変化に含まれないそれらから選択される。これらの基質は、色素原性基質として、置換した又は未置換のインドリルのような色素原性基を含むそれらから、特に２０から６００ｍＭまでの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド、６−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド及び５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、有利には２００ｍＭの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドから選択され、且つ蛍光原性基質としては、４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−ｂ−Ｄ−ガラクトサミニド及び４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−ｂ−Ｄ−グルコサミニドから選択される。
Ｃ．トロピカリス種の酵母のヘキソサミニダーゼに特異的であるインヒビターは、アミド型（Ｉ）の化合物の群から又はその混合物から好ましくは選択される。それは特に、ホルムアミド、アセトアミド、プロピオンアミド、グリシンアミド、スクシンアミドなどのようなアミドから選択される。アミド型の化合物の量は、０．０１と２０ｇ／ｌの間である。好ましくは、選択したインヒビターは１ｇ／ｌのアセトアミドである。
Ｃ．アルビカンス種の酵母についての強烈な及び早い活性を得るために、ヘキソサミニダーゼアクチベーターが、文献ＦＲ−Ａ−２６８４１１０に記載されたように、培養培地に有利に加えることができる。同様に、酵母の増殖に影響を及ぼすことなしに、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌の、及びもし可能であれば真菌の増殖を抑制するために、細菌のインヒビター又は細菌インヒビターの混合物を培地に加えることができる。好ましくは、その細菌インヒビターは、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ペニシリン、ストレプトマイシン、シクロヘキシミド、ネオマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリンのような抗生物質又は抗生物質の混合物の群から、及び／又はテルル化合物、モリブデン化合物など、又はそれの混合物から選択される。有利には、クロラムフェニコール（０．５ｇ／ｌ）又はゲンタマイシン（０．１ｇ／ｌ）とクロラムフェニコール（０．０５ｇ／ｌ）の混合物が選択される。酸性のｐＨに培地のｐＨを減じることによって細菌の増殖を抑制することもまた、可能である。
以下の実施例において示されるような、酵素の加水分解反応は、インキュベーションの２４時間を越えて特異性を保持する。
実施例１：
試験は、酵母のヘキソサミニダーゼ活性についてのアセトアミドの作用を調べるために実施した。
２つの培地を、通常の技術に従って作製した。培地Ｉとして以下に称す第１の培地は、栄養成分の全ての要素、同じくヘキソサミニダーゼ用の色素原性基質及び細菌のインヒビター混合物を含む。
最終培地のリットル当たりの培地Ｉの組成は、以下の通りである：
− ｂｉｏＳｏｙａｓｅ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）…… ６．０ｇ
− 酵母エキス（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）…… １．５ｇ
− グルコース（メルク）…… １．０ｇ
− リン酸緩衝剤（メルク）…… １０．０ｍＭ
− Ｍｎ２＋（メルク）…… １．０ｍＭ
− ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）…… ０．１ｇ
− ゲンタマイシン…… ０．１ｇ
− クロラムフェニコール…… ０．０５ｇ
− 寒天（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）…… １５．０ｇ
該培地のｐＨは約７に調節した。
培地ＩＩと称す第２の培地は、本発明に従う培地に相当し、培地Ｉについて上述した全ての要素にプラスして、Ｃ．トロピカリスのヘキソサミニダーゼに特異的であるインヒビター、即ち１．０ｇでアセトアミド化合物（シグマ）を含む。
酵母の１２の株を、これら２つの培地の入ったペトリ皿中で直接培養した。出願人の保存品からの株は、以下の種に属する：Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）（３株）、Ｃ．グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）（２株）、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）（１株）、Ｃ．パラシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）（１株）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）（３株）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（１株）、トリコスポロンｓｐｐ．（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｓｐｐ．）（１株）。その皿は３７℃で４８時間インキュベーションした。生じたコロニーは、以下の説明に従い、それぞれ、２４時間と４８時間のインキュベーション後に視覚的に調べた：
− 青色のコロニーは、Ｃ．アルビカンスに原則として属している、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼを生産する株に相当する；
− 白色のコロニーは、上述した酵素を生産しない株又はアミド型の化合物によってこの酵素が抑制される株に相当し、これらのコロニーは、かくしてこのケースにおいて普通の技術を用いて同定されるであろう他の酵母株に属している。
この結果は、以下の表１中に与えられる：
Figure 2005160491
上記表１から明らかなように、アミド型の化合物の供給は、Ｃ．アルビカンス株、同じく４８時間インキュベーション後でのみトリコスポロンの１株のみが、本発明に従う培地上で着色したコロニーを生成したことから、Ｃ．アルビカンス株の特異的な検出を与える。培地Ｉ上で４８時間後に青色だったＣ．トロピカリスのコロニーは、４８時間のインキュベーション後に非常にかすかな着色は別として、培地ＩＩ上で無色コロニーを与える。
実施例２：
実施例１の実験を繰り返すが、しかしゲル化した培地に変えて、液体の培地を用いた。培地ＩＩＩとＩＶは、かくして実施例１の培地ＩとＩＩに相当するが、寒天を含まない。更に、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−ｂ−Ｄ−グルコサミニドの濃度は、液体培地中での使用のために最終培地の１５０ｍｇ／ｌとした。その培地は、アンプル毎に３ｍｌの割合で、ガラス製アンプル中に分配した。実験株は実施例１と同じである。比濁計を用いたＭａｃＦａｒｌａｎｄスコア上で２と計測された懸濁液を、培地を含むアンプル中に直接それぞれの株で調製した。かくして接種したアンプルは、３７℃で４８時間インキュベーションした。それらは、実施例１の説明に従い、それぞれ２４時間と４８時間後に調べた。
その結果は、以下の表２中に与えられる：
Figure 2005160491
上記表２から明らかなように、アミド化合物の供給は、Ｃ．アルビカンス株の特異的な検出を与える。特に、２４時間のインキュベーション後、Ｃ．アルビカンスのみが、本発明に従う培地中で青色に着色したチューブを与える。培地ＩＩＩで着色したチューブを与えるＣ．トロピカリス株は、培地ＩＶでは無色のチューブを与える。４８時間のインキュベーション後、Ｃ．トロピカリス株を含むチューブの着色はまた、抑制され又は少なくとも非常に減じられる。
実施例３：
試験は、この酵素に特異的であるアクチベーターの存在中で、酵母のヘキソサミニダーゼ活性についてのアセトアミドの作用を調べるために実施した。
実施例１の実験が再現されるが、しかし培地にＮ−アセチルグルコサミン添加を伴う。培地ＶとＶＩはかくして、Ｎ−アセチルグルコサミンが最終培地の１．０ｇ／ｌの濃度に加えられている実施例１の培地ＩとＩＩに相当する。実験株は実施例１と同じである。それらは、ペトリ皿中で直接培養した。その皿は３７℃で４８時間インキュベーションした。生じたコロニーは、実施例１の説明に従って、それぞれ２４時間と４８時間のインキュベーション後、視覚的に調べた。
その結果は、以下の表３中に与えられる：
Figure 2005160491
上記表３から明らかなように、アミド型の化合物の供給は、Ｃ．アルビカンス株の特異的な検出を与える。特に、Ｃ．アルビカンス株、同じく４８時間インキュベーション後でのみトリコスポロンの１株のみが、本発明に従う培地上で着色したコロニーを生成した。培地Ｖ上で青色だったＣ．トロピカリス株は、培地ＶＩ上で無色コロニーを与える。これら２つの培地は共に、４８時間のインキュベーション後、それが培地Ｖ上で陽性であり且つ培地ＶＩ上で陰性であることから、Ｃ．トロピカリス種の酵母の特異的同定をも与える。
実施例４：
試験は、この酵素に特異的であるアクチベーターの存在中で、酵母のヘキソサミニダーゼ活性についてのアミド化合物の混合物の作用を調べるために実施した。
実施例１の実験が再現されるが、しかし最終培地の０．５ｇ／ｌ濃度でホルムアミドが培地ＶＩＩに加えられ（培地ＶＩＩＩ）、培地ＶＩＩは実施例３の培地Ｖと同一とした。実験株は実施例３と同じである。それらは、ペトリ皿中で直接培養した。その皿は３７℃で４８時間インキュベーションした。生じたコロニーは、実施例１の説明に従って、それぞれ２４時間と４８時間のインキュベーション後、視覚的に調べた。
その結果は、以下の表４中に与えられる：
Figure 2005160491
上記表４から明らかなように、アミド型の第２の化合物の供給は、Ｃ．アルビカンス株のみが、本発明に従う培地上で顕著に着色したコロニーを生産することから、Ｃ．アルビカンス株の更により特異的な検出を与える。培地ＶＩＩ上で青色であるＣ．トロピカリスは、培地ＶＩＩＩ上で無色のコロニーを与え、且つ培地ＶＩＩ上で４８時間のインキュベーション後に高度に着色したトリコスポロン株は、培地ＶＩＩＩ上で非常に微かな着色のみであった。
実施例５：
試験は、酵母を単離する及び同定するための培地中に、ヘキソサミニダーゼ基質とβ−グルコシダーゼ基質との組合せの効果を調べるために実施した。
β−グルコシダーゼ基質、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコシドを、実施例１の培地Ｉに０．０７ｇ／ｌの濃度で加えた（培地ＩＸ）。この培地に、１ｇ／ｌでヘキソサミニダーゼアクチベーター（Ｎ−アセチルグルコサミン）（培地Ｘ）または１ｇ／ｌでＣ．トロピカリスのインヒビター（アセトアミド）（培地ＸＩ）のいずれかを、又は同じ濃度で上記アクチベーターとインヒビターの組合せを（培地ＸＩＩ）加えた。
酵母の１８の株を、これら４つの培地の入ったペトリ皿中で直接培養した。出願人の保存品からの株は、以下の種に属する：Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）（３株）、Ｃ．グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）（２株）、Ｃ．グイリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）（２株）、Ｃ．ケフィー（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）（２株）、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）（１株）、Ｃ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）（２株）、Ｃ．パラシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）（１株）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）（３株）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（１株）、トリコスポロンｓｐｐ．（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｓｐｐ．）（１株）。その皿は３７℃で４８時間インキュベーションした。生じたコロニーは、以下の説明に従い、それぞれ、２４時間と４８時間のインキュベーション後に視覚的に調べた：
− 青色のコロニーは、Ｃ．アルビカンスに原則として属している、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼを生産する株に相当する；
− 桃色のコロニーは、Ｃ．グイリエルモンディ、Ｃ．ケフィー、Ｃ．ルシタニエ及びＣ．トロピカリス種に原理的に属している、β−Ｄ−グルコシダーゼを生成する株に相当する；
− 藤色のコロニーは、２つの酵素活性を生成する株に相当する；
− 白色のコロニーは、上述した酵素を生産しない株又はこれらの酵素が抑制される株に相当し、そのコロニーは、かくしてこのケースにおいて普通の技術を用いて同定されるであろう他の酵母株に属する。
この結果は、以下の表５中に与えられる：
Figure 2005160491
上記表５から明らかなように、ヘキソサミニダーゼ基質とβ−グルコシダーゼ基質との組合せの供給は、一方でＣ．グイリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．ケフィー（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、Ｃ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）及び／又はＣ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）株と、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）とを、及び他方では、他のカンジダ種から区別することが本発明に従う培地上で可能となったことから、多数の酵母種の検出を与える。培地Ｘ，ＸＩとＸＩＩは、Ｃ．トロピカリスのヘキソサミニダーゼに特異的であるインヒビターと、ヘキソサミニダーゼアクチベーターとの又はその２つの混合物との基質組合せの効果を示す。培地Ｘについて、Ｃ．アルビカンス株は、培地ＩＸよりもより迅速に検出され；培地ＭＩについて、Ｃ．アルビカンス株とＣ．トロピカリス株の間の相違がより明白となり、且つ培地ＸＩＩは培地ＸとＸＩの効果が結合される。

Claims (11)

  1. 酵母の検出と特異的同定用の培地において、ヘキソサミニダーゼファミリーからの酵素によって加水分解できる第１の色素原性又は蛍光原性基質、及びグルコシダーゼファミリーからの酵素によって加水分解できる第２の色素原性又は蛍光原性基質との２つの基質を含むことを特徴とする培地。
  2. それぞれの基質が酵素の特異的部分と標識部分とからなり、第１の基質の標識部分が第２の基質の標識部分と異なることを特徴とする請求項１記載の培地。
  3. ヘキソサミニダーゼアクチベーター及び／又はインヒビターを含むことを特徴とする請求項１と２のいずれか１項記載の培地。
  4. アクチベーターが、ヘキソサミン及び／又はヘキソサミニジンからなることを特徴とする請求項３記載の培地。
  5. ヘキソサミニダーゼ基質がインドキシル誘導体からなること及び／又はグルコシダーゼ基質がインドキシル誘導体からなることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の培地。
  6. 培地が液体又はゲル化されることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の培地。
  7. 試料が請求項１と６のいずれか１項記載の培地と直接接触して配され、時間が該培地中に着色が出現するまで与えられ、且つ同定は、着色における相違に基づいて、一方ではＣ．グイリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．ケフィー（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、Ｃ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）及び／又はＣ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）種からＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）種をもたらし、及び他方では、他のカンジダ種からＣ．グイリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．ケフィー（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、Ｃ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）及び／又はＣ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）種をもたらすことを特徴とする、カンジダ属酵母の一定種を検出する及び選択的に同定するための微生物学的分析方法。
  8. ３６と６０時間の間、有利には本質的に４８時間の待機期間が、その培地が請求項１５と１６のいずれか１項記載のアクチベーター又はインヒビターを含まない場合に与えられることを特徴とする請求項７記載の方法。
  9. １８と３０時間の間、有利には本質的に２４時間の待機期間が、その培地が請求項１５と１６のいずれか１項記載のアクチベーター又はインヒビターを含む場合に与えられることを特徴とする請求項７記載の方法。
  10. その培地が
    − ヘキソサミニダーゼ基質、及び／又は
    − グルコシダーゼ基質、及び／又は
    − ヘキソサミニダーゼアクチベーター、及び／又は
    − ヘキソサミニダーゼインヒビター
    を含む場合、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．グイリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．ケフィー（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、Ｃ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）及び／又はＣ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）が、他のカンジダ種から同定されることを特徴とする請求項７から９のいずれか１項記載の方法。
  11. その培地が
    − ヘキソサミニダーゼ基質及びグルコシダーゼ基質、及び／又は
    − ヘキソサミニダーゼアクチベーター、及び／又は
    − ヘキソサミニダーゼインヒビター
    を含む場合、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）が、Ｃ．グイリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．ケフィー（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、Ｃ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）及び／又は他のカンジダ種から同定されることを特徴とする請求項７から１０のいずれか１項記載の方法。
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