JPH09500791A - 少なくとも２種の色原体を用いて微生物を同定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 培地中の特定の微生物菌株の存在を検出する方法であり、この菌株の酵素基質である少なくとも２種の色原体を培地中に添加し、この色原体は、培地中における菌株の存在が第３の色（付随色）により明らかにされるように選択されることを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】 少なくとも２種の色原体を用いて微生物を同定する方法 本発明は、培地中に特定の微生物菌株が存在するかどうかを検出するための方 法に関する。 微生物が病原性であるかもしれないだけでなく、何らかの種類の汚染を示す可 能性があることから、微生物の検出は非常に重要であり、特に食品工業、水質管 理、または医薬において重要である。 ある種の培地中において微生物の存在を検出することができる方法は種々あり 、それらは、対象とする培地の試料を採取し、次いで適宜培地上または培地中で 培養することにより存在する微生物の成長を促進することからなる。 存在する微生物の検出を簡便にするために、検出培地において、ある微生物に 特有の着色化合物を使用することが提案されてきた。 発色が、問題の微生物と関連した酵素活性を表すことはよくあり、この活性の 発現により、着色指示薬により示される培地のpH変化がもたらされる（EP-A-O39 5532）か、あるいは発色団化合物(chromophoric compound)もしくは発蛍光団化 合物(fluorophoric compound)の遊離かもたらされる（FR-A-２-684,110号）。 発色団あるいは発蛍光団とは、一般的には、培地中の、対応する色原体化合物 （発色団を含む化合物、chromogenic compound）もしくは発蛍光団を含む化合物 (fluorogenic compound)が酵素により加水分解されることにより得られる化合物 である。 発蛍光団は蛍光により特有の光を放射する。 発色団化合物は主波長による色を特徴とする。 既知の発色団化合物としては、特に、インドキシル誘導体、ヒドロキノリン誘 導体、あるいはナフトエ酸誘導体やナフチルおよびフェニル誘導体が挙げられる 。 培地中の異なる２種の属の微生物を区別するために、それぞれが個々の微生物 の存在に特有の色を有する発色団化合物を遊離するような、２種の色原体を導入 する提案がなされた(US-A-5-210,022)。 これらの培地はすべて、特定属の微生物、例えばサルモネラ、カンジダ、また は大腸菌(E.coli)などを検出し、それらを他の種類と区別するのに有効であるが 、同じ培地上の異なる属の多数の微生物を検出することはできず、また同じ属の 微生物の中で病原性の種類とその他を区別できない。 このような区別はすべて、ある種の酵母、例えば酵母に関連した病状の50％以 上の原因であるカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、にとってはより重 要であるようだ。 ここに、特定の菌株の酵素に対する基質である、次のような少なくとも２種の 色原体を培地中に導入することにより、菌株を特徴づける少なくとも４種の異な る発色がみられることが予想外にも見出された：この２種の色原体は、培地中に おいて少なくとも１種の菌株の存在が以下のような第３の色(tierce couleur)( 付随色、accessorry color)により明らかになるように選択されたものである： −選択した色原体に対応する発色団の２種類の色、 −発色団の混合に対応する色、および −第３の色（付随色）。 多くの場合、付随色は、対応する２種の発色団の色の混合には対応せず、その 主波長が、培地中に存在する色原体から遊離させた別々の発色団の混合物の主波 長には対応しない色である。 発色団および付随色の主波長は、対象物の色を測定する任意の標準的方法、特 に分光比色計を用いて、光源Ｄ₆₅としてＣＩＥ（エネルギーに関する国際委員会 、Internatlonal Commission on Energy）に定義するように、日光を対照として 評価すればよい。 従って、本発明は、培地中の特定の微生物菌株の有無を検出する方法であり、 この特定の微生物菌株の酵素基質である少なくとも２種の色原体を導入すること からなり、この色原体は培地中において前記菌株の存在が第３の色（付随色）に より現れるように選択されることを特徴とする。 特に、色原体は次のような酵素の基質である．β−ガラクトシダーゼ、β−グ ルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダ ーゼ、ホスファターゼ、Ｎ−アセチルーβ−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチルーβ −ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ、スルファターゼ、エステラーゼ、リ パーゼおよびペプチダーゼ。 色原体は、化学的に同族の化合物、好ましくはカップリング反応を受けること ができる２種の異なる発色団を加水分解により遊離する化合物から有利に選択さ れる。 カップリング反応は、得られる主波長が、別々にとった、２種の発色団の混合 物の主波長とは異なるような物理化学的相互作用を意味する。 好ましくは、色原体はインドキシル系、殊にアルキル化、ハロゲン化またはジ ハロゲン化インドキシル誘導体である。 インドキシルから誘導される好ましい発色団には、ブロモインドキシル、クロ ロインドキシル、ジクロロインドキシル、クロロブロモインドキシル、トリクロ ロインドキシルおよびメチルインドキシルのインドキシル誘導体、殊に次のよう な誘導体がある：６-クロロインドキシル、５-ブロモインドキシル、３-ブロモ インドキシル、４,６-ジクロロインドキシル、６,７-ジクロロインドキシル、５ -ブロモ−４-クロロインドキシル、５-ブロモ−６-クロロインドキシルまたは４ ,６,７-トリクロロインドキシル。 本発明方法によって検出される微生物とは、酵母類、カビ類または単細胞菌類 および細菌類を意味する。 本発明方法はカンジダ属、殊にカンジダ・アルビカンスやカンジダ・トロピカ リス(Candida tropicalis)の酵母類の存在の有無を検出するのに特に適している 。 同様に、本発明方法によって存在の有無を検出しうる細菌類には、特にストレ プトコッカス(Streptococcus)属、クレブシェラ(Klebsiella)属、エンテロバク ター(Enterobacter)属、エシェリヒア(Escherichia)属、シトロバクター(Citrob acter )属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属、リステリア（Listerla）属 、クロストリジウム(Clostridium)属またはプロテウス(Proteus)属の細菌類が含 まれる。 さらに、培地中に高濃度で炭水化物を添加すると、本発明方法によって得られ る色の数を増加させる、すなわち、限られた数の色原体で、より多くの異なる微 生物が区別できるような多数の異なる色を得ることができることも見出された。 従って、本発明は、培地が高濃度の炭水化物、好ましくはグルコースを、ペプ トン基本培地中に含有する、上記方法にも関する。 炭水化物の高濃度とは、有利には10〜30g/lの範囲である。 同様に、色原体のうちの少なくとも１種がホスファターゼの基質である場合は 、高濃度、好ましくは１〜３g/lの範囲内のホスフェートを含有させるのが有利 である。 以下に示す例は、本発明方法を説明するものであるが、その範囲を限定するも のではない。 上記結果は、グルコースおよびホスフェートの添加により、同じ培地で利用し うる色の範囲が広がり、この例では異なる７つの種を区別すること、特にカンジ ダ・アルビカンスを明確に同定しうることが明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:145 1:44 1:01）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．培地中の特定の微生物菌株の存在を検出する方法であり、前記菌株に対する 酵素基質である少なくとも２種の色原体を培地中に添加し、前記色原体は、培地 中における前記菌株の存在が第３の色（付随色）により明らかにされるように選 択されることを特徴とする、前記方法。 ２．色原体が化学的に同族の化合物である、請求の範囲第１項記載の方法。 ３．２種の色原体が、カップリング反応を生じうる、２種の異なる発色団を加水 分解により遊離する、請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 ４．色原体が、インドキシル系、特にアルキル化、ハロゲン化またはジハロゲン 化インドキシル誘導体である、請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の方 法。 ５．発色団が、インドキシル誘導体であるブロモインドキシル、クロロインドキ シル、ジクロロインドキシル、クロロブロモインドキシル、トリクロロインドキ シルおよびメチルインドキシルから、特に６-クロロインドキシル、5５ブロモイ ンドキシル、３-ブロモインドキシル、４,６-ジクロロインドキシル、６,７-ジ クロロインドキシル、５-ブロモ-４-クロロインドキシル、５-ブロモ-６-クロロ インドキシルまたは４,６,７-トリクロロインドキシルのインドキシル誘導体か ら選択される、請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。 ６．微生物が酵母類である、請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の方法 ７．酵母がカンジダ属に属するものである、請求の範囲第６項に記載の方法。 ８．微生物が細菌類である、請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の方法 。 ９．細菌が、ストレプトコッカス属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、エ シェリヒア属、シトロバクター属、スタフィロコッカス属、リステリア属、クロ ストリジウム属またはプロテウス属に属するものである、請求の範囲第８項に記 載の方法。 10．培地が、高濃度の炭水化物を含有する、請求の範囲第１項〜第９項のいずれ かに記載の方法。 11．培地が、ペプトン基本培地に高濃度のグルコースを含有するものである、請 求の範囲第10項に記載の方法。 12．炭水化物の濃度が10〜30g/lの範囲内である、請求の範囲第10項および第11 項のいずれかに記載の方法。 13．１つの色原体がホスファターゼの基質である、請求の範囲第１項〜第12項の いずれかに記載の方法。 14．培地が高濃度のホスフェートを含有する、請求の範囲第13項に記載の方法。 15．ホスフェートの濃度が１〜３g/lの範囲内である、請求の範囲第14項に記載 の方法。