DE102010033105B4

DE102010033105B4 - Massenspektrometrische Sepsisdiagnose ohne Blutkultur

Info

Publication number: DE102010033105B4
Application number: DE102010033105.8A
Authority: DE
Inventors: Markus Kostrzewa; Wolfgang Pusch; Thomas Maier; Karsten Michelmann; Jochen Franzen
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2010-08-02
Filing date: 2010-08-02
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2030-08-03
Also published as: CN105044257A; US20180265909A1; US10597692B2; WO2012016929A1; EP2601304B1; CN103140589A; EP2601304A1; CN105044257B; ES2842084T3; US10006076B2; DE102010033105A1; US20160251694A1

Abstract

Verfahren für die Identifizierung von Mikroben in Körperflüssigkeit mit den Schritten: a) Auflösen der Humanpartikel in der Körperflüssigkeit durch ein Tensid oder Zerstörung der Humanpartikel durch destilliertes Wasser derart, dass die Mikroben in der Körperflüssigkeit vermehrungsfähig bleiben, b) Abtrennen der Mikroben von der Flüssigkeit, c) Vermehren der Mikroben in einer Nährbouillon, die nicht die antimikrobiellen Bestandteile der Körperflüssigkeit enthält, d) Abtrennen der Mikroben von der Nährbouillon, e) Identifizieren der Mikroben durch Ähnlichkeitsvergleich eines Massenspektrums der Mikrobenproteine mit Referenzspektren.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für den schnellen Nachweis und die schnelle massenspektrometrische Identifizierung von mikrobiellen Infektionserregern in Blut, aber auch in anderen Körperflüssigkeiten.
Die Erfindung erkennt, dass Blut keine gute Umgebung für die Kultivierung von Mikroben darstellt und stellt ein Verfahren bereit, das (a) die Humanpartikel in Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Erythrozyten und Leukozyten in Blut, weitgehend zerstört oder auflöst, ohne die Vermehrungsfähigkeit der Mikroben zu beeinträchtigen, (b) die mikrobiellen Erreger aus der Flüssigkeit abtrennt, (c) sie in einer Nährbouillon vermehrt, die keine der antimikrobiellen Bestandteile der Körperflüssigkeiten enthält, (d) sie von der Nährbouillon abtrennt, und (e) die Mikroben anhand eines Massenspektrums der Mikrobenproteine identifiziert. Das Auflösen der Humanpartikel setzt auch die in Makrophagen nistenden Mikroben frei. Die Kultivierung in einer optisch klaren, optimal zusammengesetzten Nährbouillon beschleunigt nicht nur die Vermehrung der Mikroben gegenüber allen anderen Kultivierungsverfahren, sondern macht es auch möglich, deren Mengenwachstum schon ab geringer Mikrobendichte messend zu verfolgen. Dadurch kann einerseits die massenspektrometrische Identifizierung zum frühestens möglichen Zeitpunkt durchgeführt und andererseits ein positiver Nachweis von Mikroben bereits weit vor ihrer Identifizierung erreicht werden, der für Patienten lebensrettend sein kann; drittens kann auch frühzeitig mit der Bestimmung von Resistenzen begonnen werden.
Stand der Technik
Eine „Identifizierung” von Mikroorganismen (im Folgenden kurz Mikroben genannt) bedeutet deren Einordnung in das taxonomische Hierarchieschema: Domäne (Eukaryoten, Prokaryoten und Archaea), Reich, Abteilung, Klasse, Ordnung, Familie, Gattung, Art (Species) und Unterart (Subspecies). Die Identifizierung einer Mikrobenprobe betrifft die Bestimmung mindestens der Gattung, in der Regel der Art, aber möglichst auch der Unterart, die beispielsweise dann wichtig ist, wenn verschiedenen Unterarten verschiedene Pathogenität besitzen. Im weiteren Sinne kann eine Identifizierung auch eine Charakterisierung in Bezug auf andere, individuellere Eigenschaften der Mikroben bedeuten, beispielsweise auf die Resistenz einer Mikrobe gegenüber Antibiotika.
Viele Arten von Mikroben, darunter insbesondere Bakterien und undifferenzierte Pilzzellen, aber auch Protozoen und Mikroalgen, lassen sich sehr sicher massenspektrometrisch identifizieren, indem von einer Kolonie, die in üblicher Weise auf einem Nährmedium angezüchtet wurde, kleine Mengen von Mikroben auf eine massenspektrometrischen Probenträgerplatte übertragen und dort in einer Probenpräparation aufgeschlossen werden. Das daraus gewonnene Massenspektrum gibt insbesondere Massen und Häufigkeiten der verschiedenen löslichen Proteine wieder, die mit genügender Konzentration in den Mikroben vorhanden sind. Aus diesem Massenspektrum wird die Identität der Mikroben durch eine Ähnlichkeitsanalyse mit Referenzspektren aus einer Spektrenbibliothek festgestellt.
Eine besondere Rolle spielt die Identifizierung der Mikroben bei infektiösen Krankheiten, insbesondere bei einer Sepsis. Bei einer Sepsis werden von einem (meist versteckten) Herd kontinuierlich oder in Schüben Mikroben an Körperflüssigkeiten abgegeben, meist in den Blutkreislauf, aber auch in den Rückenmarkskanal. Hier ist es außerordentlich wichtig, Nachweis und Identifizierung von Erregertypen sehr schnell vornehmen zu können, damit sofort medizinisch gezielt reagiert werden kann. Die Lage ist erschreckend: in Deutschland sterben jährlich über 60000 Menschen an einer Sepsis; es ist die dritthäufigste Todesursache. Die Anzahl der Sepsen stieg in den letzten Jahren kontinuierlich um etwa 1,5 Prozent jährlich an. In den USA versterben nach Schätzungen des Centers of Disease Control (CDC) jährlich etwa 230000 Menschen an einer Sepsis. Die Sterblichkeitsrate liegt bei über 40 Prozent. Eine schnelle Identifizierung erhöht die Chance des Überlebens.
Bei dem üblichen, heute weltweit eingesetzten massenspektrometrischen Identifizierungsverfahren werden die Mikroben zunächst zu Kolonien herangezüchtet. Das Nährmedium für die Anzucht befindet sich gewöhnlich in einem Agar in einer Petrischale, wodurch je nach Wachstumskraft der Mikroben in Stunden, Tagen oder Wochen eine Züchtung von jeweils reinen „Isolaten” in getrennten Mikrobenkolonien erreicht wird. Überlagern oder mischen sich die Kolonien, so können in wiederum üblicher Weise in einer zweiten Züchtung isolierte Kolonien gewonnen werden. Die mit einem kleinen Tupfstempel aus einer ausgewählten Kolonie auf den massenspektrometrischen Probenträger übertragene Mikrobenmenge wird dann mit einer stark angesäuerten Lösung einer üblichen Matrixsubstanz (meist α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure, HCCA, aber auch 2,5-Dihydroxybenzoesäure, DHB) für eine Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) beträufelt. Die Säure (meist Ameisensäure oder Trifluor-Essigsäure) greift die Zellwände an und das organische Lösungsmittel (meist Acetonitril) der Matrixlösung kann in die mikrobiellen Zellen eindringen und deren geschwächte Zellwände platzen lassen. Anschließend wird die Probe durch Verdunstung des Lösungsmittels getrocknet, wobei das gelöste Matrixmaterial auskristallisiert. Die löslichen Proteine der Mikroben, in sehr geringem Umfang auch andere Substanzen der Zelle, werden dabei in die Matrixkristalle eingebaut.
Die Matrixkristalle mit den eingebauten Analytmolekülen werden in einem Massenspektrometer mit fokussierten UV-Laserlichtblitzen beschossen, wobei in den Verdampfungsplasmen Ionen der Analytmoleküle entstehen, die dann im Massenspektrometer nach Ionenmassen getrennt gemessen werden können. Üblicherweise werden zu diesem Zweck Flugzeitmassenspektrometer verwendet. Das Massenspektrum ist das Profil der Massenwerte dieser Analytionen. Es handelt sich dabei ganz vorwiegend um Proteinionen, wobei die Ionen mit nützlichster Information in Bezug auf eine Identifizierung Massen zwischen etwa 3000 Dalton bis 15000 Dalton haben. Die Proteinionen sind bei diesem Verfahren ganz überwiegend nur einfach geladen (Ladungszahl z = 1), weshalb hier auch einfach von der Masse m der Ionen gesprochen werden kann, statt immer den Begriff der „ladungsbezogenen Masse” m/z zu verwenden, wie es eigentlich in der Massenspektrometrie notwendig ist.
Das Profil der löslichen Proteine, also das Massenspektrum, ist sehr charakteristisch für die betreffende Mikrobenart, weil jede Mikrobenart ihre eigenen, genetisch vorgegebenen Proteine mit jeweils charakteristischen Massen produziert. Auch die Häufigkeiten der höher konzentrierten löslichen Proteine, die massenspektrometrisch erfasst werden können, sind weitgehend genetisch vorgegeben und hängen nur geringfügig von Nährbedingungen oder Reife der Kolonie ab. Die Proteinprofile sind ähnlich charakteristisch für eine Mikrobenart wie Fingerabdrücke für einen individuellen Menschen. Heute werden in vielen staatlichen, öffentlich-rechtlichen und privaten Institutionen zuverlässige Referenzmassenspektren für medizin-rechtlich verwendbare Referenzbibliotheken aufgenommen.
Dieses massenspektrometrische Verfahren der Identifizierung hat sich als außerordentlich erfolgreich erwiesen. Die Sicherheit für eine richtige Identifizierung ist weit größer als diejenige der bisher angewandten mikrobiologischen Identifizierungsverfahren. Es konnte nachgewiesen werden, dass über Hunderte von verschiedenartigen Mikroben hinweg die Sicherheit der Identifizierung bei weit über 95 Prozent lag. In Zweifelsfällen, in denen sich Abweichungen zu den bisherigen mikrobiologischen Identifizierungsverfahren ergeben haben, hat die genetische Sequenzierung weit überwiegend die Richtigkeit der massenspektrometrischen Identifizierung bestätigt. Da aus Ähnlichkeiten zwischen den Massenspektren auch Verwandtschaften abgelesen werden können, konnten durch massenspektrometrische Identifizierungen sogar Korrekturen der Einordnung einer Mikrobenart in das taxonomische Hierarchieschema vorgenommen werden.
Für die Identifizierung der Mikroben werden Massenspektren von etwa 2000 Dalton an bis in hohe Massenbereiche von beispielsweise 20000 Dalton gemessen, wobei sich zeigt, dass die Massensignale im unteren Massenbereich bis zu etwa 3000 Dalton weniger gut verwertbar sind, weil sie von außen angelagerten Hüllpeptiden und anderen eher zufällig und variabel vorhandenen Substanzen, wie beispielsweise nahrungsabhängigen Fettsäuren, stammen können. Die besten Identifizierungsergebnisse erhält man, wenn man nur die Massensignale im Massenbereich von etwa 3000 bis 15000 Dalton auswertet. Die dazu heute verwendeten höchstempfindlichen Massenspektrometer haben nur geringe Massenauflösung, daher können in diesem Massenbereich die Isotopengruppen, deren Massensignale sich jeweils um ein Dalton unterscheiden, nicht mehr aufgelöst werden. Es werden nur die Einhüllenden der Isotopengruppen gemessen.
Dieses Verfahren der Identifizierung von Mikroben verlangt eine reine Kultur von Mikroben, ein so genanntes „Isolat”, um ein Massenspektrum ohne Überlagerungen mit Signalen anderer Mikroben zu erhalten. Es hat sich jedoch gezeigt, dass auch Massenspektren von Mischungen aus zwei Mikrobenarten ausgewertet werden können, und dass beide Mikrobenarten identifiziert werden (siehe beispielsweise das Dokument DE 10 2009 007 266 A1 , M. Kostrzewa et al.). Die Identifizierungssicherheit leidet nur geringfügig. Sind mehr als zwei Mikrobenarten am Massenspektrum beteiligt oder sind diese beiden Mikrobenarten in stark unterschiedlichen Konzentrationen vorhanden, so sinken Identifizierungswahrscheinlichkeit und Identifizierungssicherheit sehr stark ab.
Trotz der hohen Gefährdung für das Leben sind bei einer Sepsis die Anzahlen der Mikroben im Volumen Körperflüssigkeit recht klein; bei Erwachsenen mit einer Blutsepsis betragen sie in der Regel nur etwa 0,5 bis 10 vermehrungsfähiger Mikroben pro Milliliter Blut. Bei Kleinkindern können die Dichten wesentlich höher sein, da ihre Abwehr noch nicht voll entwickelt ist. Bei Erwachsenen werden die Mikroben im Blut durch vielfältige Mechanismen bekämpft, beispielsweise nach Erkennung durch Antikörper durch Makrophagen, aber auch durch körpereigene Antibiotika wie beispielsweise die Defensine. Eine Sepsis herrscht, wenn es den Abwehrmechanismen im Blut nicht gelingt, diese Mikroben sehr viel schneller zu vernichten als der Nachschub aus den Infektionsherden erfolgt; es können sich dann sehr schnell Sekundärherde bilden, beispielsweise auf den Herzklappen, was dann meist sofortige Operation erfordert. In einigen klaren Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise in Liquor, können die auf das Volumen bezogenen Anzahlen von Mikroben sehr viel höher sein als im Blut, so dass ein direktes Abscheiden ohne jede vorherige Vermehrung eine gute Chance hat, zu einer massenspektrometrischen Identifizierung zu führen.
Bei Erregern in Körperflüssigkeiten ist die Zeitdauer bis zu ihrer Identifizierung kritisch für eine erfolgreiche Behandlung. In den Dokumenten DE 10 2007 058 516 A1 und WPO 2009/065580 A1 (U. Weller 2007) ist ein Verfahren beschrieben, Infektionserreger aus Körperflüssigkeiten durch Zentrifugieren direkt abzuscheiden und massenspektrometrisch zu identifizieren. Es können beispielsweise Mikroben aus den Ablagerungen (Pellets) direkt auf die massenspektrometrische Probenträgerplatte übertragen werden. Diese Analyse der direkt abgeschiedenen Mikroben ist aber nur bei hohen Konzentrationen der Mikroben in der Körperflüssigkeit möglich, wie sie beispielsweise im Urin gefunden werden, wenn Nierenerkrankungen oder Entzündungen im Genitalbereich vorliegen. Sind in der Körperflüssigkeit Humanzellen vorhanden, so müssen diese vor dem Abscheiden der Mikroben zerstört werden, beispielsweise durch Osmose, jedoch gibt es seit langem auch andere Verfahren.
So ist seit über dreißig Jahren ein „lysis-centrifugation” genanntes Verfahren bekannt, Blutpartikel durch ein Saponin (ein schwaches Tensid) sofort nach Entnahme weitgehend aufzulösen, die Mikroben durch Zentrifugieren abzuscheiden und auf entsprechenden Nährböden in Petrischalen ohne die störenden Einwirkungen des Blutes weiterzuzüchten. Entsprechend präparierte Röhrchen („Isolator^TM”) mit Saponin und anderen Zusätzen und zugehörige Werkzeuge werden seit Jahrzehnten von mehreren Firmen produziert und kommerziell vertrieben, zuerst von DuPont (Wilmington, USA), dann von Wampole Laboratories, Cranbury, NJ, USA, und heute auch von Oxoid Limited, Basingstoke Hunt, England. Isolator^TM ist ein Warenzeichen der Firma Carter-Wallace, Inc., New York, N. Y. 10105 USA.
In der Patentanmeldung US 20100120085 A1 (J. Hyman et al.) wird eine massenspektrometrische Charakterisierung und Identifizierung von Mikroben in einer Probe durch massenspektrometrische Spektrenaufnahme beansprucht, wobei nicht-mikrobielle Zellen durch das bekannte Verfahren des Auflösens durch Detergentien (Tenside) zerstört werden; die Mikroben werden dann durch Zentrifugieren abgeschieden und der Massenspektrometrie zugeführt. Diese Schrift gehört ebenfalls zum nächstliegenden Stand der Technik. Die Patentanmeldung US 2010/0129857 A1 (Walsh et al.) offenbart ein Verfahren zur Separation von Mikroorganismen aus einer Flüssigkeitsprobe, wobei nicht-mikrobielle Zellen der Flüssigkeitsprobe zuerst selektiv lysiert werden und die lysierte Probe danach in einem Zentrifugationsgefäß über ein Dichtepolster („density cushion”) geschichtet und zentrifugiert wird. Die Patentanmeldung US 2010/0120133 A1 (Walsh et al.) offenbart ein Gefäß zum Abtrennen von Mikroorganismen aus einer Flüssigkeitsprobe, wobei das Gefäß in einem oberen Teil einen größeren Durchmesser als in einem unteren Teil aufweist und zudem ein optisches Fenster enthält, das im nahen infraroten, sichtbaren und/oder ultravioletten Spektralbereich transparent ist. Die Patentanmeldung EP 0697460 A2 offenbart eine Vorrichtung, mit der das Wachstum von Mikroorganismen in einem mit flüssigem Nährmedium gefüllten Gefäß detektiert wird, wobei sich auf der Innenseite des Gefäßes zwei fluoreszierende Materialien befinden, deren Abklingzeiten jeweils von einem anderen chemischen Parameter (z. B. Sauerstoff oder Kohlendioxid) abhängen und sich zudem voneinander unterscheiden.
Das Verfahren einer direkten massenspektrometrischen Analyse der aus Körperflüssigkeiten abgeschiedenen Mikroben gelingt nur dann, wenn die Mikroben in hohen Konzentrationen oberhalb von 10⁴ Mikroben pro Milliliter vorhanden sind. Das ist aber praktisch nur in Urin, in stark entzündetem Gewebe, in Eiterherden oder manchmal in Liquor oder Gelenkflüssigkeit der Fall. In anderen Körperflüssigkeiten wie Blut oder Lymphe sind auch bei starken Sepsen die Mengen an Mikroben in aller Regel nur klein. So sind selbst bei akuter Sepsis in einem Milliliter Blut weniger als zehn Mikroben vorhanden. Diese kleine Menge reicht für eine direkte massenspektrometrische Identifizierung nicht aus, so dass eine Kultivierungsstufe mit Vermehrung der Mikroben vorgeschaltet werden muss.
Für die Vermehrung von Mikroben in Blut wird seit vielen Jahrzehnten die so genannte „Blutkultur” in besonderen, kommerziell in hohen Stückzahlen vertriebenen Blutkulturfläschchen eingesetzt. Dem Blut werden dazu entsprechende Nährstoffe und Anti-Koagulationsmittel zugesetzt, außerdem Hemmstoffe oder Adsorbentien für Antibiotika, die dem Patienten vor Entnahme des Blutes verabreicht wurden. Die Blutkulturfläschchen verschiedener Hersteller unterscheiden sich grundlegend in der Art der Adsorbentien für diese Antibiotika, wobei beispielsweise Holzkohle oder offenporige Kunstharzschaumkügelchen eingesetzt werden. Beide hemmen aber auch das Wachstum der Mikroben. Meist werden zwei Blutkulturflaschen zeitgleich eingesetzt, eine für aerobe und eine für anaerobe Mikroben. Moderne Blutkulturfläschchen sind mit Signalsystemen ausgestattet, die bei einer Kultivierung in entsprechend ausgerüsteten Inkubatoren automatisch signalisieren, wann genügend Mikroben für eine mikrobiologische Identifizierung gewachsen sind. Die Signale beruhen auf der Messung des Anstiegs des CO₂-Gehaltes oder des Drucks. Die Dichte der Mikroben in Blut ist aber bei Signalauslösung schon sehr hoch; die massenspektrometrische Identifizierung gelingt in der Regel schon Stunden oder Tage vor der Signalauslösung. Für die schnelle massenspektrometrische Identifizierung wird eine wesentlich empfindlichere Signalauslösung gebraucht.
Sind in der Blutkultur genügend viele Mikroben gewachsen, müssen die Mikroben für eine massenspektrometrische Identifizierung durch Zentrifugieren oder Filtrieren aus der Blutkultur abgeschieden werden. Dabei müssen alle Spuren von Humanproteinen oder auch Proteinen aus dem Nährmedium restlos beseitigt werden, um die massenspektrometrische Identifizierung nicht zu stören.
Hat man genügend Mikroben abgeschieden, beispielsweise durch Zentrifugieren nach Auflösen aller Humanzellen, so kann man die Mikroben in den Ablagerungen am besten durch Zugabe von wenigen Mikrolitern einer starken Säure (Ameisensäure oder Trifluoressigsäure) und etwa ebensoviel Acetonitril direkt aufschließen und die Lösung mit den freigesetzten Proteinen anschließend auf die Probenträgerplatte übertragen. Dieser Aufschluss ist sogar dann möglich, wenn durch das Zentrifugieren überhaupt keine sichtbare Ablagerung entstanden ist. Die Sichtbarkeitsgrenze für eine Ablagerung liegt bei etwa 10⁶ Mikroben; die Nachweisgrenze dagegen gegenwärtig bei etwa 10⁴ Mikroben, kann aber in Zukunft wohl noch verbessert werden. 10⁴ Mikroben enthalten in der Regel mehr als 100 Femtogramm an löslichen Proteinen, die massenspektrometrische Nachweisgrenze liegt aber für optimal entwickelte Verfahren weit darunter.
Die Identifizierung der Mikroben in Körperflüssigkeiten ist deshalb erfolgreich, weil in den weitaus meisten Fällen (weit über 70 Prozent) akute mikrobielle Infektionen auf nur eine einzige Mikrobenart zurückgehen. In nur einem geringen Prozentsatz von etwa 15 Prozent sind zwei Mikrobenarten so beteiligt, dass beide in den Massenspektren zu erkennen sind. Diese Artenreinheit der Erreger akuter Infektionen steht im scharfen Gegensatz zum sonstigen Vorkommen von Mikroben in oder auf dem menschlichen Körper, so sind beispielsweise die etwa 10¹⁴ Bakterien der Darmflora im menschlichen Darm auf mindestens 400 Bakterienarten verteilt, die im Gleichgewicht miteinander leben. Blut und auch andere Körperflüssigkeiten sind im Allgemeinen steril, das heißt, sie enthalten im Normalzustand keinerlei Mikroben. Mikroben werden in Körperflüssigkeiten im Normalfall sofort durch mehrere gleichzeitig arbeitende Abwehrmechanismen bekämpft, getötet und beseitigt.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem sich Infektionserreger in Blut oder anderen Körperflüssigkeiten sehr viel schneller nachweisen und identifizieren lassen als bisher.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die oben beschriebene Blutkultur ist keineswegs ein idealer Nährboden für Mikroben; eine Reihe von Mikrobenarten wächst in Blutkulturen fast überhaupt nicht. Das Blut ist prinzipiell mikrobenfeindlich: es enthält neben Mikroben fressenden Makrophagen auch eine Reihe antibiotisch wirkender Stoffe wie beispielsweise die Defensine und antibakterielle Enzyme. Außerdem befinden sich im Blut von Sepsis-Patienten meist Breitband-Antibiotika, die als erste Behandlungsmaßnahme noch vor der endgültigen Diagnose verabreicht wurden.
Die Erfindung erkennt diese Situation und stellt ein Verfahren bereit, (a) die Humanpartikel in den Körperflüssigkeiten, beispielsweise die Erythrozyten und Leukozyten in Blut, möglichst sofort nach Entnahme weitgehend zu zerstören oder aufzulösen, wobei die Mikroben vermehrungsfähig bleiben müssen, sodann (b) die mikrobiellen Erreger beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren von der Flüssigkeit zu trennen, sie (c) in einer Nährbouillon zu vermehren, die nicht die antimikrobiellen Bestandteile der Körperflüssigkeiten enthält, sie (d) wiederum von der Nährbouillon zu trennen, und sie (e) durch eine Ähnlichkeitsanalyse eines Massenspektrums ihrer Proteinprofile mit Referenzspektren zu identifizieren.
Dieses grundsätzliche Verfahren zur massenspektrometrischen Identifizierung der Mikroben kann durch Verfahren zur Messung des Mengenwachstums der Mikroben während der Kultivierung in Schritt (c) begleitet werden, wobei diese dem frühzeitigen Nachweis für die Anwesenheit von Mikroben, aber auch einer groben Klassifikation der Mikroben dienen können. Diese Messungen werden erst durch die Verwendung einer optisch klaren Nährbouillon möglich, manchmal mit besonderer Rezeptur, die das Messverfahren unterstützt. Es können beispielsweise spektrometrische Messungen wie Streulichtanalysen, Extinktionsmessungen, Fluoreszenzmessungen, jeweils in verschiedenen Regionen des elektromagnetischen Spektrums, aber auch akustische oder elektrometrische Messverfahren durchgeführt werden. Die Kultivierung kann vorzugsweise in einem Mikrokulturgefäß mit nur sehr wenig Nährbouillon vorgenommen werden, um die Mikrobendichte und damit die Empfindlichkeit der begleitenden Messverfahren zu erhöhen. Frühe Zwischenergebnisse dieser Wachstumsmessungen können für den Patienten lebensrettend sein, aber auch zu einem Abbruch des Verfahrens führen, wenn keine Mikroben nachgewiesen werden können. Insbesondere aber können die begleitenden Verfahren den frühestens möglichen Zeitpunkt für die Durchführung der massenspektrometrischen Identifizierung bestimmen. Diese beansprucht selbst nur kurze Zeit, und ermöglicht so einen frühen Beginn einer gezielten Therapie.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist es auch, die in Makrophagen eingenisteten Bakterienarten, wie beispielsweise Mycobakterien oder Listerien, freizusetzen.
Es kann auch nach dem Abtrennen der Mikroben in Schritt (b) ein Nachweisverfahren wie beispielsweise Nano-NMR oder Mikro-Raman eingeschaltet werden, um zu erkennen, ob überhaupt Mikroben vorhanden sind. Die heutige Entwicklung moderner spektrometrischer oder elektrometrischer Verfahren verspricht in Zukunft Empfindlichkeiten, die so hoch sind, dass selbst die Anwesenheit einzelner Mikroben erkannt werden kann.
Mit diesem Verfahren lassen sich genügend Erreger in genügend reiner Form für die massenspektrometrische Identifizierung gewinnen, und zwar schneller als mit jedem anderen bisher bekannten Verfahren. Der behandelnde Arzt kann dann in Kenntnis der Mikrobenart unmittelbar mit einer gezielten Therapie beginnen, da für die meisten Mikroben bekannt ist, auf welche Antibiotika sie ansprechen. Häufig sind die Resistenzlagen, die gebietsweise oder auch von Krankenhaus zu Krankenhaus verschieden sein können, für diese Mikrobenart bekannt. Es kann aber auch ein Teil der gezüchteten Mikroben für eine Bestimmung ihrer Resistenz gegenüber Antibiotika verwendet werden. Der frühe Beginn einer gezielten und erfolgversprechenden Therapie eines Patienten, der mit einer Sepsis, einer schweren Sepsis oder einem septischen Schock auf einer Intensivstation liegt, kann nicht nur öfter als heute das Leben des Patienten retten, sondern spart bei früher Heilung wegen des kürzeren Aufenthalts in der Intensivpflege auch in höchstem Maße Kosten für die Behandlung ein.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
zeigt ein Kultivierungsgefäß für Verfahren nach dieser Erfindung in Form eines Zentrifugenröhrchens (1), dessen Verschluss (2) ein Septum (3) und ein Differenzdruckmesssystem (4) enthält. Das vorevakuierte Kultivierungsgefäß (1) trägt ein Beschriftungsfeld (5) mit einem zusätzlichen Barcode (6), eine Innenbelegung (7), deren Farbumschlag einen Zuwachs an CO₂ anzeigt, und ist mit einer Lösung (8) befüllt, die Humanpartikel auflöst.
zeigt ein Beispiel für ein einfaches Mikrokulturgefäß (12) mit Einlasskapillaren (11) und (13), die jeweils mit Septen (10) und (14) abgeschlossen sind. Das Mikrokulturgefäß mit nur etwa 100 Mikroliter Volumen kann gebrauchsfertig vorevakuiert sein, so dass Mikroben in einer Bouillon leicht mit einer Injektionsspritze durch eines der Septen hindurch eingefüllt werden können. Das Wachstum von Mikroben im Mikrokulturvolumen (12) kann durch äußere Messeinrichtungen (17) oder (19) verfolgt werden, indem die Schwächung, das Streulicht oder das Fluoreszenzlicht (18) eines Lichtstrahls (16) einer äußeren Laserdiode (15) gemessen werden. Es kann hier beispielsweise die Extinktion des Lichtstrahls (16) in einem Lichtdetektor (17) gemessen werden und zu einem Signal führen, wenn genügend Mikroben gewachsen sind. Es kann aber auch in einem Streulicht- oder Fluoreszenzdetektor (19) das Streulicht oder Fluoreszenzlicht (18) gemessen werden. Der Beginn der Extinktions-, Streulicht- oder Fluoreszentlichtkurven gibt frühe Auskunft über die Anwesenheit von Mikroben. In ähnlicher Weise können auch andere Arten von Spektrometrien angewendet werden. Die Verschraubung (20) dient dem Öffnen des Mikrokulturgefäßes, nachdem die Mikroben nach dem Abschluss des Kultivierens durch Zentrifugieren abgeschieden wurden. Die Mikroben können nach Entfernen der Nährbouillon im Mikrokulturgefäß aufgeschlossen und die Extraktionsflüssigkeit kann mit den gelösten Mikrobenproteinen entnommen werden.
Bevorzugte Ausführungsformen
Die Erfindung stellt ein Verfahren mit folgenden Schritten bereit:

a) Auflösen der Humanpartikel in der Körperflüssigkeit durch ein Tensid oder Zerstören der Humanpartikel durch destilliertes Wasser derart, dass die Mikroben in der Körperflüssigkeit vermehrungsfähig bleiben,
b) Abtrennen der Mikroben von der Flüssigkeit, beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren,
c) Vermehren der Mikroben in einer Nährbouillon, die nicht die antimikrobiellen Bestandteile der Körperflüssigkeiten enthält,
d) Abtrennen der Mikroben von der Nährbouillon, beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren,
e) Identifizieren der Mikroben durch Ähnlichkeitsvergleich eines Massenspektrums der Mikrobenproteine mit Referenzspektren.

Unter dem Begriff „Körperflüssigkeiten” werden in weitem Sinne alle internen oder ausgeschiedenen Flüssigkeiten des Körpers verstanden, die mit Mikroben infiziert sein können. Insbesondere sind das neben dem Blut auch Lymphe, Gelenkflüssigkeit (Synovialflüssigkeit), Rückenmarksflüssigkeit (Liquor), Urin, Tränenflüssigkeit, homogenisiertes Gewebe bis hin zu Flüssigkeiten aus eitrigen Abszessen oder entzündetem Nasenschleim. In manchen dieser Flüssigkeiten sind die Konzentrationen der Mikroben so hoch, dass die Identifizierung nach sauberem Abscheiden der Mikroben auch ohne weitere Kultivierung gelingt. Diese Flüssigkeiten sind von dieser Erfindung nicht betroffen; Mikroben in diesen Flüssigkeiten können nach einem der Verfahren in WPO 2009/065580 A1 (U. Weller 2007) direkt abgeschieden und identifiziert werden. In vielen dieser Körperflüssigkeiten sind die Mikrobenkonzentrationen aber so gering, dass eine Vermehrung der Mikroben durch eine Kultivierung für eine Identifizierung notwendig wird. Hier greift diese Erfindung.
Im Folgenden wird das Verfahren für Blut als Körperflüssigkeit beschrieben; es ist aber auch für andere Körperflüssigkeiten einsetzbar, wobei aber die Mengen an zugesetzten Tensiden und anderen Stoffen angepasst werden müssen. Die Beschreibung wird des Weiteren hier auf das Zentrifugieren als Mittel zum Abtrennen der Mikroben von der Flüssigkeit eingeschränkt, ohne dass damit aber das Filtrieren oder andere Abscheidungsverfahren, wie beispielsweise die Anlagerung an Magnetkügelchen, ausgeschlossen werden sollen.
Es ist besonders wichtig, dass das Auflösen der Blutkörperchen in Schritt (a) durch eine genau bemessene Menge an untoxischen Tensiden erfolgt, damit auch empfindliche Mikroben voll vermehrungsfähig bleiben. Günstig ist beispielsweise eine Lösung mit verdünntem, untoxischem Saponin. Die zarte Zellmembran der Blutkörperchen besteht vorwiegend aus Phospholipiden, die sich in nichtkovalenter Bindung zur Membran zusammenfügen. Tenside lösen die nichtkovalenten Bindungen von Proteinen und Lipiden auf. Die Phospholipide der Zellmembranen sind selbst amphiphil, also tensidisch, und können durch andere Tenside durch Bildung von Mizellen nano-kolloidal gelöst werden, wodurch sich die zugegebenen Tenside so weit binden, dass sie die Mikroben kaum weiter schädigen können.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist es auch, durch das Auflösen der Blutkörperchen in Schritt (a) auch die in Makrophagen oder anderen Humanzellen des Blutes eingenisteten Bakterienarten, wie beispielsweise Mycobakterien oder Listerien, freizusetzen.
Das Auflösen der Blutkörperchen und das anschließende Abscheiden der Mikroben aus dem Blut sollte möglichst sofort nach Entnahme des Blutes erfolgen, da ein längeres Verweilen empfindlicher Mikroben im Blut zu ihrer Vermehrungsunfähigkeit führen kann. Die Halbwertszeit für das Überleben vermehrungsfähiger Mikroben im Blut beträgt für empfindliche Mikroben nur wenige Stunden, während sich robuste Mikroben sogar im Blut vermehren können. Aber auch im saponingelösten Blut ist die Halbwertszeit für empfindliche Mikroben nicht wesentlich länger; daher ist zu empfehlen, die Mikroben höchstens zwei Stunden nach Auflösen der Blutkörperchen durch Zentrifugieren oder Filtrieren von der Flüssigkeit zu trennen.
Die Blutkörperchen können aber auch in einem besonderen Schritt (a) nach vorherigem Zentrifugieren durch destilliertes Wasser zerstört werden, wobei die meisten Blutkörperchen durch Osmose platzen. Eine Wiederholung von Zentrifugieren und Zugabe von destilliertem Wasser zerstört praktisch fast alle Blutkörperchen. Die verbleibenden Zellmembranfetzen, die zusammen mit den Mikroben durch Zentrifugieren abgeschieden werden, stören die nachfolgende Kultivierung in der Nährbouillon praktisch nicht.
In beiden Fällen, sowohl bei Auflösung durch eine knappe Menge an Tensiden wie auch bei Zerstörung durch destilliertes Wasser, können mehr oder weniger Rückstände wie nicht vollständig aufgelöste Zellwände und andere nichtlösliche Bestandteile der Blutkörperchen in der Flüssigkeit zurückbleiben, die jedoch das weitere Verfahren nicht wesentlich stören. Diese Bestandteile können später durch einen besonderen Waschschritt der in Schritt (d) abgetrennten Mikroben mit Auflösung durch starke Tenside entfernt werden. Es kommt in Schritt (a) darauf an, die Blutkörperchen so zu zerstören, dass alle in Zellen eingebetteten Mikroben freigesetzt und beim Abtrennen der Mikroben von der Flüssigkeit in Schritt (b) alle löslichen Humanproteine entfernt werden, einschließlich der löslichen Proteine aus Blutkörperchen, zusammen mit allen für das Vermehren der Mikroben schädlichen körpereigenen Abwehrstoffe wie beispielsweise Defensine und antimikrobielle Enzyme. Defensine bilden bis zu 30 Prozent der Granulasubstanz von neutrophilen Granulozyten, die etwa 60 Prozent der Leukozyten ausmachen.
Besonders wichtig ist auch die Beseitigung aller Breitband-Antibiotika aus begonnener Therapie der Sepsis-Patienten, die hier in Schritt (b) automatisch erfolgt. In den kommerziell vertriebenen Blutkulturfläschchen werden für das Unschädlichmachen dieser Antibiotika verschiedenartige Partikelchen zugesetzt, die von Holzkohlebröckchen bis zu harten, offenporigen Kunstharzschaumkügelchen reichen. Dieser Zugaben wegen werden Glaubenskriege zwischen den Herstellern ausgefochten. Diese Zugaben sind aber alle schädlich für das ungestörte Wachstum der Mikroben in den Blutkulturen, zum Teil, weil sie Mikroben fest adsorbieren, zum Teil, weil sie bei der Bewegung der Blutkulturfläschchen in den Inkubationskammern die Mikroben regelrecht zermahlen.
Der erwähnte Zwischenschritt zur Reinigung der in Schritt (d) abgelagerten Mikroben bezweckt die Entfernung aller Spuren restlicher Fremdproteine, die nicht den Mikroben zugehören, also aller Humanproteine, aber auch aller Proteine, die aus der Nährbouillon stammen und sich an die Mikroben angelagert haben könnten. Durch die Arbeit der Mikroben können auch aus nicht aufgelösten Zellwänden der Blutkörperchen lösliche Proteine entstanden sein. Wenn sich im Massenspektrum Signale von Fremdproteinen den Signalen der Mikrobenproteine überlagern, ist eine Identifizierung stark erschwert, wenn nicht unmöglich. Diese Reinigung nach der Kultivierung der Mikroben kann mit starken Tensiden wie beispielsweise SDS (Natriumdodecylsulfat) erfolgen, da hier eine Vermehrungsfähigkeit der Mikroben nicht mehr notwendig ist.
Für die Aufnahme des Massenspektrums der Mikrobenproteine in Schritt (e) sind die Mikroben aufzuschließen und es sind die löslichen Proteine freizusetzen. Dieser Aufschluss der Mikroben kann bevorzugt, wie schon einleitend beschrieben, durch wenige Mikroliter scharfer, organischer Säure wie Ameisensäure oder Trifluoressigsäure mit wenigen Mikrolitern Acetonitril noch im Zentrifugenröhrchen vorgenommen werden; es können die Mikroben aber auch, wie heute meist üblich, nach Aufschmieren einiger Mikroben auf eine massenspektrometrische Probenträgerplatte aufgeschlossen werden. Die Aufnahme des Massenspektrums der Mikrobenproteine und die Identifizierung durch Ähnlichkeitsvergleiche mit Referenzspektren in Schritt (e) folgt den üblichen Verfahren.
Wenn das Zentrifugieren eingesetzt wird, so kann beispielsweise das ganze Verfahren von den Schritten (a) bis über den Schritt (d) hinaus bis zum Aufschluss der Mikroben zur Gewinnung einer Lösung der Mikrobenproteine für die Aufnahme der Massenspektren im selben Zentrifugenröhrchen ablaufen. Es können hier beispielsweise 1,5 Milliliter Standard-Zentrifugenröhrchen verwendet werden. Um aber eine Sepsis mit nur 0,5 vermehrungsfähiger Mikroben pro Milliliter statistisch genügend sicher erkennen zu können, ist es günstiger, besondere Kultivierungsgefäße mit etwa 15 Milliliter Volumen zu verwenden, in denen acht bis zehn Milliliter Blut eingesetzt werden können. Ihr Volumen ist dem der bisher verwendeten Blutkulturfläschchen ähnlich, sollten aber ein Zentrifugieren ermöglichen, was mit Blutkulturfläschchen nicht möglich ist. Die 1,5 Milliliter Standard-Zentrifugenröhrchen können beispielsweise für Untersuchungen am Blut von Kleinkindern verwendet werden, da hier nur geringe Mengen an Blut zur Verfügung stehen, meist aber auch bei einer Sepsis höhere Konzentrationen von Mikroben im Blut zu finden sind. Das Verfahren wird hier für die größeren Zentrifugengefäße beschrieben.
Bei Verwendung eines 15 ml Zentrifugenröhrchen, das für dieses Verfahren benutzungsfertig vorbereitet ist, wird eine Menge von etwa acht Milliliter Blut eingegeben. Das Zentrifugenröhrchen ist vorzugsweise durch ein Septum verschlossen und vorevakuiert; es enthält vorgefertigt zwei bis vier Milliliter einer sterilen Lösung, in der sich etwa 240 Mikrogramm untoxisches Saponin, eine geringe Menge Schaumhemmer, und mindestens ein Antikoagulanz befinden. Genaue Vorschriften zum sterilen Einfüllen des Blutes sind von Verfahren zur Behandlung von Blutkulturen her bekannt. Die Flüssigkeiten im Zentrifugenröhrchen werden sofort durch vorsichtiges fünfmaliges Schwenken gemischt und nach etwa 30 Sekunden für 10 Minuten bei 3000 g zentrifugiert, wobei sich die Mikroben als lockeres Pellet absetzen. Der Überstand wird vorsichtig mit einer sterilen Injektionsspritze entfernt und entsorgt, wobei für das Nachströmen von keimfreier Luft eine sterile Kapillarnadel mit Mikrofilter eingestochen werden kann. Die Mikroben werden jetzt wiederum mit einer sterilen Injektionsspritze mit zehn Milliliter einer Nährbouillon versetzt. Die Mikroben werden durch Schütteln aufgenommen; das Zentrifugenröhrchen wird für eine festgelegte Zeitdauer bei festgelegter Temperatur inkubiert. Besonders günstig ist eine Inkubation mit leichter Bewegung, um ein Absetzen der Mikroben zu verhindern.
Kommerziell erhältliche Blutkulturfläschchen sind meist mit Signaleinrichtungen versehen, die in entsprechend ausgerüsteten Inkubationskammern anzeigen können, wann genügend Mikroben gewachsen sind. Diese Signaleinrichtungen beruhen teils auf Farbumschlägen von Wandbelägen durch Veränderungen des CO₂-Gehaltes, teils auf andersartigen Messungen des Anstieges des CO₂, oder einfach auf der Anzeige eines Druckanstiegs. Bei Messungen des CO₂-Gehaltes müssen jeweils zwei Blutkulturfläschchen verwendet werden: eines für aerobe Mikroben und eines für anaerobe Mikroben.
Auch wenn diese Signaleinrichtungen bisher für massenspektrometrische Identifizierungen wegen zu geringer Empfindlichkeit nicht ideal günstig sind, können sie auch in Kultivierungsgefäßen für Verfahren nach dieser Erfindung angebracht werden. Wegen der fehlenden Abgabe von CO₂ durch die Blutkörperchen arbeiten sie hier sogar besser. zeigt ein solches Kultivierungsgefäß in Form eines Zentrifugenröhrchens (1), dessen Verschluss (2) ein durchstechbares Septum (3) und ein mikrosystemtechnisches Differenzdruckmesssystem (4) enthält. Das Kultivierungsgefäß (1) trägt ein Beschriftungsfeld (5) mit einem zusätzlichen Barcode (6); es ist zum Befüllen vorevakuiert. Alternativ zum Differenzdruckmesssystem (4) kann das Röhrchen eine Innenbelegung (7) tragen, deren Farbumschlag einen Zuwachs an CO₂ anzeigt. Das Zentrifugenröhrchen ist mit einer genau bemessenen Menge einer Lösung (8) befüllt, die Humanpartikel auflöst und beispielsweise aus Saponin, Antikoagulantien und Schaumhemmern in sterilem Wasser besteht. Zum Befüllen werden wie oben sterile Injektionsspritzen und Nadeln mit Mikrofiltern verwendet. Das sorgfältige Vermeiden jeder Kontamination mit Mikroben aus der Umwelt muss bis nach der Inkubation anhalten. Für die Kultivierung von aeroben und anaeroben Mikroben können zwei gleiche Kultivierungsgefäße mit verschiedenen Arten von Nährbouillon verwendet werden.
Nach genügend langer Inkubation werden die Mikroben wiederum durch Zentrifugieren abgeschieden, wobei jetzt drei Minuten bei 10000 g genügen, wenn die Kultivierungsgefäße dafür ausgelegt sind. Der Überstand wird entfernt, und die Mikroben werden durch Schütteln mit einer 0,5-prozentigen SDS-Lösung in Wasser aufgenommen, um alle Reste von Human- oder Bouillonproteinen zu entfernen. Nach erneutem Zentrifugieren und Entfernung des Überstandes wird mit destilliertem Wasser gewaschen und nochmals zentrifugiert. Die Entfernung aller Spuren von SDS ist wichtig, da SDS (wie auch andere starke Tenside) die Ionisierung der Proteine in der Ionenquelle des Massenspektrometers stark behindert.
Der Aufschluss der Mikroben, die Aufnahme von Massenspektren und die Identifizierung anhand der Massenspektren folgt üblichen Verfahren und wird hier nicht näher beschrieben.
Statt die Mikroben durch Zentrifugieren abzuscheiden, können diese auch durch Mikrofiltration abgeschieden und gewaschen werden. Für die Mikrofiltration werden meist ebenfalls Zentrifugen eingesetzt. Da sich durch die Tensid-Zugabe die Zellmembranen der Blutpartikel und deren innere Strukturen praktisch vollkommen auflösen, wird auch durch Mikrofiltration ein reines Isolat der Mikroben gewonnen.
Die Erfahrung lehrt, dass nur etwa 15 Prozent der Blutkulturen ein positives Ergebnis zeigen. Da es für das Überleben eines Patienten mit einem Verdacht auf eine Sepsis außerordentlich günstig ist, möglichst frühzeitig das Vorliegen einer Sepsis nachzuweisen, kann nach dem ersten Abscheiden der Mikroben in Schritt (b) ein spektrometrisches Nachweisverfahren wie beispielsweise Nano-NMR oder Mikro-Raman für abgelagerte Mikroben eingeschaltet werden. Es sind gegenwärtig höchstempfindliche mikrospektrometrische und elektrometrische Verfahren in Entwicklung, die darauf abzielen, die Anwesenheit einzelner Mikroben im Zentrifugenpellet zu erkennen. Die frühe Kenntnis über die sichere Abwesenheit von Mikroben spart nicht nur die Kosten des weiteren Verfahrens, es ist auch wichtig für den behandelnden Arzt, der seine Therapie früh darauf einstellen kann. Diese Nachweise sind heute noch nicht gelungen, können aber in Zukunft sehr wichtig werden.
Erfolgversprechender sind aber Verfahren, die während der Kultivierung der Mikroben mit höchster Empfindlichkeit durch Messungen der Mikrobendichte deren Wachstum messen, dabei frühzeitig durch die Erkennung einer Zunahme der Mikrobendichte die Anwesenheit von vermehrungsfähigen Mikroben feststellen und vor allem auch den frühesten Zeitpunkt ermitteln können, zu dem eine massenspektrometrische Identifizierung einsetzen kann. Diese Verfahren werden überhaupt erst durch den erfindungsgemäßen Ersatz der Blutkultur durch eine Kultivierung in einer klaren Nährbouillon mit definierten optischen Eigenschaften ermöglicht. In einer klaren, in ihrer Zusammensetzung maßgeschneiderten Nährbouillon lassen sich verschiedenartige Spektrometrien in weiten Bereichen des elektromagnetischen Spektrums anwenden, beispielsweise Infrarotspektrometrie, Ramanspektrometrie, Streulicht- und Extinktionsspektrometrie und viele andere. Besonders nachweisstark ist beispielsweise die Fluoreszenzspektrometrie. Diese kann eingeleitet oder unterstützt werden durch die Zugabe von Substanzen zur Nährbouillon, deren Metabolismus in Mikroben zu fluoreszierenden Abbauprodukten führt, oder deren Anlagerung an die Zellwände der Mikroben zur Fluoreszenz führt. Da häufig ein Wachstum der Mikroben auch an den Wänden des Kultivierungsgefäßes stattfindet, können auch Oberflächen-Messverfahren eingesetzt werden, wie beispielsweise Plasmonenresonanz-Spektrometrie (PRS) oder Surface-enhanced Raman-Spektrometrie (SERS). Auch verschiedenartige Schall- und Schwingungsspektrometrien können zur Anwendung kommen. Des Weiteren können elektrische Messverfahren eingesetzt werden, beispielsweise eine Messung der dielektrischen Konstante in geeignet geformten Gefäßen. Die verschiedenen Messverfahren können dabei häufig nicht nur das Wachstum verfolgen, sondern auch grobe Klassifikationen der Mikroben kommunizieren. Schon die Wachstumsgeschwindigkeit ist ein Indikator für eine erste Klassifizierung, und zwar eine Klassifizierung, die medizinisch sehr relevant ist.
Für den Einsatz dieser Messverfahren ist es besonders günstig, wenn die in Schritt (b) abgeschiedenen Mikroben in einer Nährbouillon vermehrt werden, deren Volumen viel kleiner als das des Blutes ist. Da die Vermehrung in einer guten Nährbouillon weitgehend ungestört exponentiell bis zu einer Dichte von 10⁷ bis 10⁸ Mikroben pro Milliliter verläuft, und nur etwa 10⁴ Mikroben für die massenspektrometrische Identifizierung gebraucht werden, kann die Kultivierung auch in Mikromengen unter einem Milliliter, beispielsweise in nur 100 Mikroliter Nährbouillon erfolgen. Das macht es möglich, die Mikroben nach kurzer Anfangsphase von etwa ein bis zwei Stunden Kultivierung im ursprünglichen Zentrifugengefäß in beispielsweise nur 100 Mikroliter Nährbouillon in eine besonders geformte Mikrokultivierungskammer mit nur 100 Mikroliter Volumen zu überführen. In diesem geringen Volumen an Nährbouillon ist die Beimpfungsdichte und damit auch im weiteren Verlauf die Mikrobendichte zu jedem Zeitpunkt der Kultivierung etwa 100-mal höher als in einem Volumen, das der Menge an Blut entspricht. Ein Beispiel für eine solche Mikrokultivierungskammer ist in gezeigt. Diese Mikrokultivierungskammer ist für die verschiedenartigen Arten von Spektrometrien wegen der 100-mal höheren Mikrobendichte besonders geeignet.
So kann die Mikrokultivierungskammer (12), wie in dargestellt, sehr einfach mit einer Einrichtung (17) für die Messung der Extinktion abgetastet werden, die die Abschwächung eines hindurch geschickten Lichtstrahls (16) durch Lichtstreuung misst. Die Extinktionsmesseinheit (17) muss nicht mit der Mikrokultivierungskammer verbunden sein, sondern kann, montiert in einer Kammer für die Inkubation, mehrere Mikrokultivierungskammern zyklisch nacheinander abtasten. Es kann aber nicht nur die Extinktion, sondern mit einer ähnlichen Messeinrichtung (19) auch das Streulicht (18) oder das Fluoreszenzlicht (18), das von den wachsenden Mikroben unter der Einstrahlung eines Lichtstrahls (16) ausgeht, gemessen werden. Diese Messeinrichtungen können bei günstiger Form der Mikrokultivierungskammer vor allem genau anzeigen, wann etwa 10⁴ Mikroben für die massenspektrometrische Identifizierung gewachsen sind. Dadurch lässt sich gegenüber jetzt üblichen Signaleinrichtungen in Blutkulturen ein Zeitgewinn von vielen Stunden oder sogar Tagen erreichen, oft entscheidend für das Überleben des Patienten. Ein solches Messsystem kann aber auch, wie bereits erwähnt, frühzeitig zu einem sicheren Anzeigen der Anwesenheit von Mikroben, und sogar zu einer groben Klassifizierung führen, was ebenfalls für eine frühzeitige Therapie des Patienten entscheidend wichtig ist. Auch diese Möglichkeit zur Kultivierung in Mikrokultivierungskammern ist erst durch das Grundprinzip dieser Erfindung gegeben, die Mikroben in einer besonderen Nährbouillon zu kultivieren.
Eine Mikrokultivierungskammer ähnlich der in gezeigten ist für viele der oben erwähnten Arten von Spektrometrien geeignet, wobei gegebenenfalls Form und Material der Wände und Fenster an die Art der Spektrometrie angepasst werden muss. Dabei kann sie beispielsweise auch so geformt sein, dass sie direkt für das Abtrennen der Mikroben von der Flüssigkeit durch Zentrifugieren und für den Aufschluss der Mikroben geeignet ist. Auch Mikrokultivierungskammern auf Silizium-Chips können hier verwendet werden, wobei elektrische Schaltungen zur Messung des Mikrobenwachstums auf dem Chip vorhanden sein können („Lab-on-the-chip”).
Bei Einsatz besonders empfindlicher Spektrometrien, wie beispielsweise der oben erwähnten Fluoreszenzspektrometrie mit Einsatz besonderer Substanzen, kann das Wachstum der Mikroben sehr frühzeitig festgestellt werden. Dabei werden nur wachstumsfähige, also wirklich gefährliche Mikroben analysiert; im Gegensatz zu Untersuchungen des Pellets nach Schritt (b), bei dem auch abgestorbene oder sonst nicht mehr vermehrungsfähige Mikroben gemessen werden könnten. Wie nicht häufig genug betont werden kann, ist der frühzeitige Nachweis einer realen Sepsis entscheidend wichtig für die Chance einer Heilung des Patienten, ja überhaupt für eine Chance zum Überleben.
Die Erfindung basiert insbesondere darauf, die Kultivierung der Mikroben nicht in den mikrobenfeindlichen Körperflüssigkeiten durchzuführen, sondern in einer besonders günstigen Nährbouillon. Wie dargelegt, macht es die besondere Nährbouillon möglich, auch begleitende Messungen des Mikrobenwachstums vorzunehmen. Zunächst müssen die Mikroben aber erst einmal von der Körperflüssigkeit sauber abgetrennt werden. Das geschieht ähnlich wie in einem Verfahren, das vor mehr als dreißig Jahren für die Isolator-Röhrchen für das saubere Abscheiden von Mikroben aus Blut entwickelt wurde und sich inzwischen millionenfach bewährt hat. Dabei werden die verschiedenartigen Blutkörperchen schnell in einer genau bemessenen Menge eines schwachen Tensids aufgelöst, ohne die Mikroben zu zerstören oder vermehrungsunfähig zu machen. Als schwaches Tensid hat sich ein gereinigtes, untoxisches Saponin bewährt, es können jedoch auch viele andere Arten von Tensiden verwendet werden. Die zarte Zellmembran der Blutkörperchen besteht vorwiegend aus Phospholipiden, die sich in nichtkovalenter Bindung zur Membran zusammenfügen. Tenside lösen die nichtkovalenten Bindungen von Proteinen und Lipiden auf, zerstören aber auch durch ionische Anlagerungen die Quartär- und Tertiärstruktur der großmolekularen Proteine im Inneren der Zellen. Die Phospholipide der Zellmembranen sind selbst amphiphil, also tensidisch, und können durch andere Tenside durch Bildung von Mizellen nano-kolloidal gelöst werden. Die Zellmembranen gehen dadurch weitgehend in Lösung. Dadurch werden aber auch die dem Blut zugegebenen Tenside weitgehend gebunden, so dass sie nachfolgend die Mikroben nicht mehr schädigen können. Auch die inneren Strukturen der Blutkörperchen werden von Tensiden zerstört und weitgehend aufgelöst, einschließlich der Zellkernmembran und der DNA der Leukozyten. Alle gelösten Bestandteile werden nach dem Zentrifugieren mit dem Überstand entfernt. Auch die Makrophagen werden aufgelöst, wodurch die gegebenenfalls im Inneren nistenden Mikroben freigesetzt werden.
Die Zellwände von Bakterien hingegen sind sehr stabil; sie bestehen überwiegend aus vernetzt polymerisierten Mureinen. Bei gram-positiven Bakterien gibt es eine zusätzliche Verflechtung mit Teichonsäuren, die ebenfalls polymerisiert sind. Diese kovalent gebundenen Netzwerke widerstehen zumindest für die kurze Zeit von einigen Minuten der auflösenden Wirkung der Tenside. Tenside können aber auch in die Mikroben eindringen und die Faltungsstrukturen der Proteine zerstören, wodurch die Vermehrungsfähigkeit beeinträchtigt wird; daher ist es wichtig, für das erste Auflösen der Humanpartikel ein schwaches Tensid, vorzugsweise ein untoxisches Saponin, in genau bemessener Menge zu verwenden und die Einwirkung kurz zu halten.
Die Halbwertszeit für das Überleben empfindlicher Mikroben in einer Saponin-Blut-Lösung liegt bei wenigen Stunden. Daher müssen die Mikroben in möglichst kurzer Zeit aus der Flüssigkeit abgeschieden werden. Es ist empfehlenswert, die Mikroben nicht für mehr als zwei Stunden in der Flüssigkeit zu belassen. Die mit Blut befüllten Kultivierungsgefäße müssen also rasch durch Boten oder besondere Fördereinrichtungen in das Labor gefördert werden, in dem das weitere Verfahren durchgeführt werden kann. Es ist ebenfalls möglich, das Blut in normalen Blutgefäßen mit Antikoagulantien in das Labor zu schicken, wobei es hier aber ebenfalls auf möglichst kurze Verzögerungszeiten ankommt.
Für die massenspektrometrische Identifizierung der durch Inkubation gezüchteten Mikroben ist es gleichgültig, ob die Mikroben abgestorben oder vermehrungsunfähig sind, solange nur die im Inneren befindlichen löslichen Proteine nicht freigesetzt oder in ihrer Primärstruktur verändert werden. Daher kann für das Reinigen dieser Mikroben von allen Resten von Fremdproteinen, das nach der Kultivierung, also nach Schritt (c), vorzunehmen ist, ein starkes Tensid, beispielsweise SDS (Natriumdodecylsulfat), eingesetzt werden. Das starke Tensid muss allerdings anschließend wieder gut ausgewaschen werden, da es auch in Spuren die Ionisierung der Proteine für die massenspektrometrische Spektrenaufnahme hemmt.
In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das in die Zentrifugenröhrchen eingefüllte Blut zuerst zentrifugiert werden. Das überstehende klare Blutplasma wird dann entfernt und die tiefrote Ablagerung wird mit einer schwachen Tensid-Lösung aufgenommen, beispielsweise mit einer 1-prozentigen Saponinlösung. Die tiefrote Ablagerung, die neben den Mikroben insbesondere die 5 Millionen Erythrozyten, 7 Tausend Leukozyten und 50 Tausend Thrombozyten aus jedem Milliliter Blut enthält, wird in einem Schüttelgerät mit der zugegebenen Tensidlösung vermischt, wobei in diesem Vorgang die Zellmembranen der Blutkörperchen zerstört und die löslichen Proteine freigesetzt werden. Die tiefrote Lösung wird nun wieder zentrifugiert, wobei dieses Mal der Überstand tief rot bleibt, und die Ablagerung, soweit sichtbar, rein weiß. Die Ablagerung kann nunmehr mit der Nährbouillon versehen und inkubiert werden.
In Abwandlung dieser Ausführungsform kann auch die tiefrote Ablagerung der Blutkörperchen einfach durch destilliertes Wasser aufgenommen werden. Allein hierdurch werden die meisten Blutkörperchen zerstört. Ein Wiederholen des Zentrifugierens und Aufnehmens mit destilliertem Wasser ergibt genügend saubere Mikroben für die Kultivierung in der Nährbouillon.
Vor der Spektrenaufnahme in Schritt (e) werden die Mikroben unter Extraktion der löslichen Mikrobenproteine aufgeschlossen. Dazu werden die abgelagerten Mikroben mit einigen Mikrolitern einer 70-prozentigen Ameisensäure versetzt, die die Peptidoglykane (Mureine) der Zellwände der Mikroben stark angreift und die Zellstruktur zerstört. Anschließend wird ein gleiches Volumen Acetonitril zugegeben, um möglichst viele Proteine in Lösung zu bringen. Der Ansatz wird nochmals zentrifugiert, um die festen Bestandteile wie beispielsweise Zellwandfetzen der Mikroben abzusetzen.
Von den gelösten Proteinen der Mikroben im Überstand ist jetzt ein Massenspektrum aufzunehmen. Das kann in vielfältiger Weise mit bekannten Ionisierungsverfahren in bekannten Massenspektrometern geschehen; bisher wurde aber die Aufnahme durchwegs in speziellen MALDI-Flugzeitmassenspektrometern vorgenommen.
Für die übliche Aufnahme des Massenspektrums in einem MALDI-Flugzeitmassenspektrometer werden jetzt je etwa anderthalb Mikroliter des Überstandes auf jeweils einen Messprobenfleck eines MALDI-Probenträgers aufgetragen und eingetrocknet. Danach werden jeweils etwa anderthalb Mikroliter einer Lösung von Matrixsubstanz, vorzugsweise HCCA gelöst in 50 Prozent Aceton in Wasser mit einem geringen Zusatz (etwa 3%) an Trifluor-Essigsäure, zugesetzt. Es werden dazu beispielsweise Probenträger verwendet, die hydrophile Anker von zwei Millimeter Durchmesser in hydrophober Umgebung enthalten. Es können aber auch Einmal-Probenträger verwendet werden, auf denen eingeätzte Kreise die Lösung am Zerfließen hindern. Die Lösung bildet dort halbrunde Tröpfchen von zwei Millimeter Durchmesser. Nach dem Eintrocknen aller Messproben ist der Probenträger bereit für die Aufnahme der Massenspektren.
Dieses einfachste Vorbereitungsverfahren für die Messproben kann in vielfältiger Weise abgewandelt werden. So können beispielsweise Probenträgerplatten verwendet werden, die bereits eine Dünnschicht der Matrixsubstanz, beispielsweise HCCA, tragen. Der Überstand aus Ameisensäure und Acetonitril wird dann direkt auf diese Dünnschicht pipettiert. Die Dünnschicht hat die Eigenschaft, alle Proteine sofort oberflächlich zu binden, so dass nach etwa einer Minute die restliche Flüssigkeit abgenommen werden kann. Dadurch werden auch Verunreinigungen entfernt. Durch anschließende optionale Zugabe eines Tröpfchens Aceton kann erreicht werden, dass die Proteine in die Kriställchen der Dünnschicht eingelagert werden.
Nach Beendigung der Kultivierung dauern die Vorgänge der Messprobenvorbereitung für die Aufnahme eines Massenspektrums in einem MALDI-Flugzeitmassenspektrometer insgesamt nur etwa 10 bis 15 Minuten. Der Probenträger mit den Probenpräparationen wird nun in üblicher Weise über eine Vakuumschleuse in die Ionenquelle eines handelsüblichen Massenspektrometers eingefahren. Das Massenspektrometer ist in etwa fünf Minuten betriebsbereit. In einem MALDI-Massenspektrometer, dessen UV-Pulslaser mit 200 Hertz arbeitet, können von einer Messprobe in wenigen Sekunden genügend viele Einzelspektren aufgenommen werden, um ein gut brauchbares Summenspektrum zu erhalten. Die Aufnahme der Massenspektren kann daher nach wenigen Minuten abgeschlossen sein.
Für die anschließende Identifizierung der Mikroben anhand ihrer Massenspektren gibt es handelsübliche Computerprogramme. Die Dauer der Identifizierung der Mikroben aus guten Massenspektren hängt von der Leistungsfähigkeit des Rechners, der Größe der Bibliothek mit Referenzspektren, und dem Algorithmus der Ähnlichkeitsanalyse ab. Mit handelsüblichen Rechnern in Massenspektrometern dauert die Identifizierung der Massenspektren aus den Proben einschließlich der Bestätigungsproben nur einige Minuten; die Identifizierung der Mikrobenart liegt also spätestens eine halbe Stunde nach Beendigung der Kultivierung der Mikroben vor.
In anderer Ausführungsform kann auch, wenn die Ablagerung nach einem letzten Waschschritt sichtbar ist, in üblicher Weise eine kleine Menge der so isolierten Mikroben mit einem Tupfstempel auf die Probenträgerplatte übertragen und dort wie üblich präpariert werden. Die Massenspektren dieser üblichen Schmiertechnik sind den Massenspektren der Aufschlusstechnik durch Säure im Zentrifugenröhrchen weitgehend ähnlich. Sind hier Unterschiede erkennbar, so können Massenspektren beider Arten der Probenaufbereitung als Referenzspektren in die Bibliothek eingestellt werden.
Die Erfindung stellt hauptsächlich ein Verfahren für eine sichere Identifizierung von mikrobiellen Infektionserregern in Blut zur Verfügung, das wesentlich schneller ist als bisherige Verfahren, die ganz überwiegend mit einer Kultivierung der Mikroben in Blutkulturgefäßen und einer anschließenden Kultivierung in Petrischalen arbeiten. Die Erfindung züchtet die Mikroben nicht im mikrobenfeindlichen Blut, sondern in einer vermehrungsgünstigen Nährbouillon, aus der sie abgeschieden, gewaschen, und sofort massenspektrometrisch identifiziert werden. Die Nährbouillon erlaubt auch den Einsatz von Verfahren für die empfindliche Messung des Mikrobenwachstums, so dass die Kultivierung abgebrochen werden kann, wenn die 10⁴ Mikroben gewachsen sind, die für die massenspektrometrische Identifizierung erforderlich sind. Durch das massenspektrometrische Verfahren kann eine Identifizierung ohne weitere Vorkenntnis über die Mikroben durchgeführt werden und führt direkt zur Identifizierung auf der Ebene der Mikrobenart oder Unterart. Es gibt kein anderes Identifizierungsverfahren, das so schnell und sicher ist.
Die Identifizierung der so gewonnenen, isolierten Mikroben folgt in seinen letzten Schritten üblichen Verfahren, die allerdings sonst meist auf einer Isolation einer Mikrobensorte durch Anzüchtung einer Kolonie basieren. Die Isolation ist hier automatisch dadurch gegeben, dass bei akuten Infektionen nur eine oder höchstens zwei Arten von Mikroben als Erreger zu finden sind. Dadurch werden genügend reine Mikrobenkulturen (Isolate) gewonnen. Selbst bei Anwesenheit von zwei Mikrobenarten arbeitet das Verfahren noch zufriedenstellend.
Wie mehrfach betont, ist eine schnelle Identifizierung der Mikroben einer Sepsis außerordentlich wichtig. Handelt es sich dabei um häufig vorkommende Arten, so ist auch meist die Resistenzlage bekannt, so dass die Resistenz nicht vordringlich bestimmt werden muss. Bei seltener vorkommenden Mikroben, aber auch bei einigen der häufigen Mikrobenarten, die in stark gemischten Resistenzlagen vorkommen, kann dagegen die Kenntnis ihrer Resistenz gegenüber verschiedenen Antibiotika und vor allem auch Kenntnis über die Stärke dieser Resistenz erforderlich sein. Hier können Teilmengen der in Schritt (d) isolierten Mikrobenablagerungen auch für die Bestimmung der Resistenz der Mikroben mit den dafür üblichen funktionellen Verfahren der versuchten Anzüchtung im Beisein abgestufter Konzentrationen von Antibiotika eingesetzt werden. Bei frühzeitigem Verdacht auf ungewöhnliche Mikroben können aber auch die Mikroben zunächst in der Nährbouillon angezüchtet werden, woraufhin die Nährbouillon auf einzelne Mikrokulturfläschchen aufgeteilt wird. In einer dieser Fläschchen werden die Mikroben für die massenspektrometrische Identifizierung, in anderen zur Charakterisierung ihrer Resistenz gegenüber verschiedenen Antibiotika weitergezüchtet.
Das Verfahren dieser Erfindung mit schneller Abtrennung der Mikroben von den körpereigenen Zellen kann auch auf Abszesse oder andere Entzündungsherde angewendet werden, da diese ebenfalls körpereigene Zellen enthalten. Ein Beispiel dafür ist ein Eiterherd, also eine Ansammlung von teils lebenden, teils angedauten Mikroben im Gemisch mit bestimmten Arten von Leukozyten, die sie bekämpfen. Auch hier können die körpereigenen Zellen durch Tensidlösungen aufgelöst werden. Ein weiteres Beispiel ist Nasenschleim, der als Streichprobe der Nasenschleimhaut gewonnen wird und bei dem die Identifizierung der Mikroben (insbesondere von MRSA) von höchstem Interesse ist. Auch von anderen Schleimhäuten können derartige Proben gewonnen werden. Obwohl in den meisten Fällen für diese Proben eine direkte Abscheidung genügend Mikroben für eine Identifizierung liefert, kann auch hier notfalls eine Kultivierung in einer geeigneten Nährbouillon vorgenommen werden.
In den oben geschilderten Verfahren wurden die Massenspektren der Mikroben in Flugzeitmassenspektrometern mit Ionisierung durch matrix-unterstützte Laserdesorption (MALDI) aufgenommen. Das ist zwar üblich, jedoch nicht zwingend. Aufschlussflüssigkeiten von Mikroben können beispielsweise auch durch Elektrosprühen ionisiert werden. Durch diese Art der Ionisierung entstehen starke Überlagerungen von vielfach geladenen Ionen im Massenbereich von etwa 600 bis 1600 Dalton, die zwingend ein Massenspektrometer mit hoher Auflösung erfordern. Günstiger ist hier das Verfahren der chemischen Ionisierung an Atmosphärendruck (APCI), das ganz überwiegend einfach geladenen Ionen der Analytsubstanzen liefert. Als Massenspektrometer können hier Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF-MS), aber auch Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer (ICR-MS) oder andere hochauflösende Massenspektrometer Verwendung finden.
Die oben geschilderten, verschiedenartigen Kultivierungsgefäße für das Verfahren nach dieser Erfindung können auch kommerziell hergestellt und vertrieben werden. Sie können beispielsweise auch mit sterilen Einmal-Injektionsspritzen zum Entleeren, mit verbrauchsbereiter Bouillon, die beispielsweise in Injektionsspritzen bereitgestellt wird, mit Einstechnadeln mit Mikrofiltern zur keimfreien Belüftung, mit Einmal-Probenträgern und mit der Matrixsubstanz zu einer kommerziell vertreibbaren Verbrauchspackung (Kit) zusammengefasst sein.
Die hier geschilderten Verfahren können vom einschlägigen Fachmann in Kenntnis der Erfindung in vielfältiger Weise abgeändert werden. Einige dieser Abänderungen sind bereits oben geschildert; es gibt aber durchaus weitere Verfahren, die auf der grundlegenden Basis der Kultivierung in einer Nährbouillon nebst einer frühen massenspektrometrischen Identifizierung der Mikroben auch frühzeitig weitere Informationen über die Mikroben erzeugen können.

Claims

Verfahren für die Identifizierung von Mikroben in Körperflüssigkeit mit den Schritten: a) Auflösen der Humanpartikel in der Körperflüssigkeit durch ein Tensid oder Zerstörung der Humanpartikel durch destilliertes Wasser derart, dass die Mikroben in der Körperflüssigkeit vermehrungsfähig bleiben, b) Abtrennen der Mikroben von der Flüssigkeit, c) Vermehren der Mikroben in einer Nährbouillon, die nicht die antimikrobiellen Bestandteile der Körperflüssigkeit enthält, d) Abtrennen der Mikroben von der Nährbouillon, e) Identifizieren der Mikroben durch Ähnlichkeitsvergleich eines Massenspektrums der Mikrobenproteine mit Referenzspektren.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Körperflüssigkeit um Blut handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Körperflüssigkeit um Lymphe, Gelenkflüssigkeit (Synovialflüssigkeit), Rückenmarksflüssigkeit (Liquor) oder homogenisiertes Gewebe handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Humanpartikel in einer wässrigen Lösung von Saponin mit Zusatz eines Schaumhemmers aufgelöst werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) eine Vermehrung der in Schritt b) abgeschiedenen Mikroben in weniger als einem Milliliter Nährbouillon stattfindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass während des Vermehrens der Mikroben in Schritt c) das Mengenwachstum der Mikroben durch spektrometrische, akustische oder elektrische Messungen verfolgt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Vermehren der Mikroben in Schritt c) nur so lange erfolgt, bis die Messung genügend Mikroben für eine massenspektrometrische Identifizierung anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung des Mengenwachstums der Mikroben durch spektrometrische Messungen der Extinktion, des Streulichts oder der Fluoreszenz erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass für die Messung des Mengenwachstums der Mikroben durch Fluoreszenz der Nährbouillon eine Substanz zugesetzt wird, deren Abbau durch die Mikroben oder deren Anlagerung an die Mikroben zu einer messbaren Fluoreszenz führt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt d) von der Nährbouillon abgetrennten Mikroben durch eine wässrige Lösung von SDS (Natriumdodecylsulfat) von Fremdproteinen gereinigt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass für die Aufnahme des Massenspektrums in Schritt e) die Mikrobenproteine durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) ionisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein Teil der in der Bouillonkultur wachsenden Mikroben für eine Prüfung ihrer Resistenz gegen Antibiotika verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt a) ein Antikoagulanz, ein Schaumhemmer oder beides zugefügt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährbouillon optisch klar ist.