ES2842084T3 - Diagnóstico por espectrometría de masas de septicemia sin hemocultivo - Google Patents

Abstract

Método para la identificación de microbios en sangre que comprende las etapas: (a) Disolver partículas de la sangre humana en la sangre con un tensioactivo, (b) Separar los microbios de la sangre, (c) Cultivar los microbios en un caldo nutritivo que no contenga compuestos antimicrobianos de la sangre, (d) Separar los microbios del caldo nutritivo, (e) Identificar los microbios mediante análisis de similitud de un espectro de masas de las proteínas microbianas y espectros de referencia.

Description

DESCRIPCIÓN

Diagnóstico por espectrometría de masas de septicemia sin hemocultivo

Campo de la invención

La invención se refiere a métodos para la detección rápida y la identificación por espectrometría de masas rápida de microorganismos infecciosos en sangre (septicemia) u otros líquidos corporales.

Estado de la técnica

Una "identificación" de microorganismos (denominados microbios para abreviar a continuación) significa su clasificación en la jerarquía taxonómica: dominio (eucariotas, procariotas y arqueas), reino (plantas, animales, hongos), división, clase, orden, familia, género, especie y subespecies. La identificación de una muestra de microbio significa determinar al menos el género, generalmente la especie y, si es posible, también la subespecie, lo cual es importante cuando diferentes subespecies tienen una patogenicidad diferente, por ejemplo. En un sentido más amplio, una identificación también puede significar una caracterización en términos de otras características más individuales de los microbios, tales como la resistencia de un microbio a los antibióticos.

Muchas especies de microbios, incluidas bacterias en particular, pero también protozoos, microalgas y células fúngicas indiferenciadas como levaduras, pueden identificarse mediante espectrometría de masas con un alto grado de certeza mediante la transferencia de pequeñas cantidades de microbios de una colonia cultivada en un medio nutritivo en la forma habitual a una placa de soporte de muestra de espectrometría de masas, donde se desintegran mediante una preparación de la muestra. El espectro de masas obtenido de esta muestra en particular presenta las masas y abundancias de las diferentes proteínas solubles que están presentes en los microbios en concentración suficiente. La identidad de los microbios se determina a partir de este espectro de masas con la ayuda de un análisis de similitud con espectros de referencia de una biblioteca de referencia.

La identificación de los microbios es particularmente importante en relación con las enfermedades infecciosas, especialmente la septicemia. En una septicemia, los microbios son liberados en los líquidos corporales de manera continua o intermitente desde una fuente (generalmente oculta), principalmente en la circulación sanguínea, pero también en el conducto vertebral. En caso de una septicemia, es extremadamente importante poder detectar e identificar los tipos de patógenos muy rápidamente con el fin de poder proporcionar el tratamiento médico adecuado de inmediato. La situación es alarmante: en Alemania, más de 60.000 personas mueren cada año por septicemia; es la tercera causa más común de muerte. En Estados Unidos, alrededor de 230.000 personas mueren anualmente de septicemia según estimaciones del Centro de Control de Enfermedades (CDC). El número de casos de septicemia ha aumentado continuamente en los últimos años en aproximadamente un 1,5 por ciento anual. La tasa de mortalidad es de más del 40 por ciento. La identificación rápida aumenta las posibilidades de supervivencia.

En el método convencional de identificación por espectrometría de masas de uso mundial en la actualidad, los microbios se cultivan primero para formar colonias. El medio nutritivo para el cultivo normalmente es un agar en una placa de Petri, lo que permite cultivar "aislados" puros en colonias de microbios separadas en horas, días o semanas, dependiendo del vigor de los microbios. Si las colonias están superpuestas o mezcladas, se pueden obtener colonias aisladas de nuevo de la forma habitual en un segundo cultivo. Los microbios transferidos por medio de un hisopo pequeño de una colonia seleccionada al soporte de muestra de espectrometría de masas después se desintegran rociando con una solución fuertemente acidificada de una sustancia de matriz convencional (generalmente ácido aciano-4-hidroxicinámico, HCCA, pero también ácido 2,5 dihidroxibenzoico, DHB) para la ionización por desorción por láser asistida por matriz (MALDI). El ácido (generalmente ácido fórmico o ácido trifluoroacético) ataca las paredes celulares, y el disolvente orgánico (generalmente acetonitrilo) de la solución de matriz puede penetrar en las células microbianas y hacer que las paredes celulares debilitadas estallen. A continuación, la muestra se seca evaporando el disolvente, con lo que cristaliza el material de matriz disuelto. Las proteínas solubles de los microbios, y algunas otras sustancias de la célula también en un grado muy pequeño, se incorporan a los cristales de la matriz en el proceso.

Los cristales de la matriz con las moléculas de analito incorporadas se bombardean con pulsos de luz UV láser enfocados en un espectrómetro de masas, generando iones de las moléculas de analito en los plasmas de vaporización, y después estos iones pueden medirse en el espectrómetro de masas, separados por sus masas de iones. Generalmente se utilizan espectrómetros de masas de tiempo de vuelo para este propósito. El espectro de masas es el perfil de estos iones del analito, que son predominantemente iones de proteínas. Los iones con la información más útil para una identificación tienen masas de entre aprox. 3.000 y 15.000 unidades de masa atómica. En este método, los iones de proteínas tienen predominantemente solo una carga (número de cargas z = 1), lo que permite hacer referencia simplemente a la masa m de los iones, en lugar de utilizar siempre el término "relación masacarga" m/z, como es realmente necesario en espectrometría de masas.

El perfil de los iones de proteínas solubles, es decir el espectro de masas, es muy característico de las especies de microbios en cuestión porque cada especie de microbio produce su propia mezcla de proteínas determinadas genéticamente, y cada proteína tiene una masa característica. La abundancia de las proteínas solubles más concentradas que pueden detectarse por espectrometría de masas también está determinada genéticamente en gran medida y sólo depende en menor grado de las condiciones de los nutrientes o de la madurez de la colonia. Los perfiles de proteínas son tan característicos para una especie de microbio como lo son las huellas dactilares para una persona individual. Hoy en día, muchos institutos públicos y privados están adquiriendo espectros de masas de referencia fiables para bibliotecas de referencia que puedan utilizarse con fines de diagnóstico en medicina. Sin embargo, todos los métodos de diagnóstico deben ser aprobados por instituciones oficiales de acuerdo con las leyes nacionales correspondientes. El método de identificación por espectrometría de masas con bibliotecas validadas en instrumentos validados ha sido aprobado en varios estados.

Este método de identificación por espectrometría de masas ha demostrado ser extremadamente exitoso. La certeza de una identificación correcta es mucho mayor que con los métodos de identificación microbiológica actualmente en uso. Ha sido posible demostrar que, para muchos cientos de especies diferentes de microbios, la certeza de identificación era mucho mayor de 95 por ciento. En caso de duda, donde había desviaciones de los métodos de identificación microbiológica actuales, la secuenciación genética ha confirmado que la identificación por espectrometría de masas era correcta en la mayoría de los casos. Dado que las relaciones entre las especies de microbios también se pueden identificar a partir de las similitudes entre los espectros de masas, incluso era posible corregir las clasificaciones de las especies de microbios en la jerarquía taxonómica con la ayuda de identificaciones por espectrometría de masas simples, finalmente confirmadas por la secuenciación de ADN mucho más complicada.

Para identificar los microbios, los espectros de masas se miden desde aproximadamente 2.000 unidades de masa atómica hasta intervalos de masa altos de 20.000 unidades de masa atómica, aunque las señales de masa en el intervalo de masa más bajo de hasta aproximadamente 3.000 unidades de masa atómica son menos utilizables porque pueden originarse en péptidos de la cubierta unidos externamente y otras sustancias cuya presencia es bastante aleatoria y variable, tal como ácidos grasos dependientes de la dieta. Las mejores identificaciones pueden obtenerse evaluando solo las señales de masa en el intervalo de masa de aproximadamente 3.000 a 15.000 unidades de masa atómica. Los espectrómetros de masas ultrasensibles que se utilizan ahora para este propósito solo tienen una resolución de masa baja, lo que significa que los grupos de isótopos cuyas señales de masa difieren cada uno en una unidad de masa atómica ya no pueden resolverse en este intervalo de masas. Solo se miden las envolturas de los grupos de isótopos.

Este método de identificación de microbios requiere un cultivo puro de microbios, llamado "aislado", con el fin de obtener un espectro de masas en el que no se superpongan señales de otros microbios. Sin embargo, se ha encontrado que también se pueden evaluar los espectros de masas de mezclas de dos especies microbianas y que se identifican ambas especies de microbios (véase el documento DE 10 2009 007 266 A1, M. Kostrzewa et al., por ejemplo). La certeza de la identificación sólo sufre levemente. Si están implicadas más de dos especies de microbios en el espectro de masas, o si estas dos especies de microbios están presentes en concentraciones muy diferentes, la probabilidad de identificación y la certeza de la identificación disminuyen considerablemente.

A pesar del alto riesgo para la vida, la septicemia implica solo un pequeño número de microbios por volumen de líquido corporal; en adultos con septicemia de la sangre, por lo general ascienden a sólo 0,5 a 10 microbios capaces de reproducirse por mililitro de sangre. En los bebés, las densidades pueden ser significativamente más altas, ya que su resistencia inmunitaria aún no está completamente desarrollada. En los adultos, los microbios en la sangre son combatidos por varios mecanismos: por macrófagos después de haber sido identificados por anticuerpos, por ejemplo, pero también por antibióticos endógenos, tales como las defensinas. La septicemia ocurre cuando los mecanismos de defensa en la sangre no logran destruir estos microbios mucho más rápido de lo que son suministrados por los focos de infección; entonces pueden formarse focos secundarios muy rápidamente, en las válvulas cardíacas, por ejemplo, en cuyo caso suele ser necesaria una operación inmediata. En algunos líquidos corporales claros, tales como el líquido cefalorraquídeo, la cantidad de microbios por volumen puede ser mucho mayor que en la sangre, por lo que una separación directa sin propagación previa tiene muy buenas posibilidades de conducir a una identificación por espectrometría de masas.

Con patógenos en los líquidos corporales, el tiempo hasta su identificación es fundamental para que el tratamiento médico tenga éxito. El documento WPO 2009/065580 A1 (U. Weller 2007) describe un método para separar directamente los agentes infecciosos de los líquidos corporales mediante centrifugación e identificación por espectrometría de masas. Los microbios se pueden transferir del precipitado (sedimentos) directamente a la placa de soporte de la muestra de espectrometría de masas, por ejemplo. Sin embargo, este análisis de los microbios directamente separados solo es posible cuando hay altas concentraciones de microbios presentes en el líquido corporal, como es el caso de la orina de pacientes con enfermedad renal o inflamación en los genitales, por ejemplo. Si hay células humanas presentes en el líquido corporal, deben destruirse, por ejemplo, por ósmosis, antes de que los microbios puedan separarse; sin embargo, se conocen otros métodos de destrucción desde hace mucho tiempo.

Para una septicemia en la sangre, se conoce un método desde hace más de treinta años conocido como "lisiscentrifugación"; este método disuelve casi completamente las partículas de sangre con la ayuda de una saponina (un tensioactivo débil) inmediatamente después de la toma de muestra, separa los microbios mediante centrifugación cuidadosa y los cultiva en medios de cultivo adecuados en placas de Petri sin los efectos alteradores de la sangre. Varias empresas han producido y vendido comercialmente durante décadas tubos adecuadamente preparados ("Isolator™") con saponina y otros aditivos y las herramientas correspondientes, primero por DuPont (Wilmington, EE.UU.), luego por Wampole Laboratories, Cranbury, Nueva Jersey, EE.UU., y ahora también por Oxoid Limited, Basingstoke, Hampshire, Inglaterra. Isolator™ es una marca comercial de Carter-Wallace, Inc., Nueva York, N.Y.

10105 EE.UU.

La solicitud de patente US 20100120085 (J. Hyman et al.) reivindica una caracterización por espectrometría de masas e identificación de microbios en una muestra mediante barrido de espectrometría de masas, donde las células no microbianas son destruidas por el método conocido de disolución por tensioactivos; luego, los microbios se separan por centrifugación y se identifican por espectrometría de masas.

El método de análisis por espectrometría de masas directo de los microbios separados de los líquidos corporales solo tiene éxito si los microbios están presentes en altas concentraciones muy por encima de 104 microbios por mililitro. En la práctica, este es solo el caso de la orina, de los tejidos fuertemente inflamados, de los focos supurativos o, a veces, del líquido cefalorraquídeo o del líquido sinovial. En otros líquidos corporales como la sangre o la linfa, las cantidades de microbios son generalmente pequeñas, incluso con septicemia grave. Incluso en la septicemia aguda hay menos de diez microbios en un mililitro de sangre. Esta pequeña cantidad no es suficiente para una identificación por espectrometría de masas directa, por lo que se debe utilizar previamente una etapa de cultivo para multiplicar los microbios.

El documento US 2010/124763 A1 describe métodos para detectar e identificar microorganismos en frascos de hemocultivo utilizando técnicas espectroscópicas.

El documento Journal of Clinical Microbiology, vol. 48, no. 5, 17 de marzo de 2010, páginas 1584-1591, describe un método para identificar bacterias de hemocultivos positivos mediante el uso de espectrometría de masas de tiempo de vuelo MALDI en donde las bacterias de una muestra de sangre se cultivan en un hemocultivo, se recuperan de hemocultivos positivos y se identifican por la huella dactilar de MALDI-TOF.

El documento US 2010/129857 A1S emplea la lisis-centrifugación en combinación con la espectrometría de masas MALDI-TOF o espectroscopía Raman para la identificación de aislados microbiológicos de hemocultivos.

El llamado "hemocultivo" en frascos especiales de hemocultivo, que se venden comercialmente en grandes cantidades, se ha utilizado durante décadas para cultivar microbios en sangre. Esto implica añadir nutrientes y anticoagulantes adecuados a la sangre, así como inhibidores o adsorbentes de cualquier antibiótico que se haya administrado al paciente antes de tomar la muestra de sangre. Los frascos de hemocultivo de diferentes fabricantes difieren fundamentalmente en el tipo de adsorbentes para estos antibióticos. Se utilizan, por ejemplo, perlas de espuma plástica de poro abierto o de carbón vegetal. Sin embargo, ambos también impiden el crecimiento de los microbios. La práctica habitual es utilizar dos frascos de hemocultivo al mismo tiempo, uno para microbios aerobios y otro para anaerobios. Los frascos de hemocultivo modernos están provistos de sistemas de señalización que, si se utilizan en incubadoras debidamente equipadas, señalan automáticamente cuando han crecido suficientes microbios para una identificación microbiológica. Las señales se basan en la medición del aumento de contenido o la presión de CO², pero la densidad de los microbios en sangre ya es muy alta cuando se activa la señal. La identificación por espectrometría de masas suele ser posible horas o días antes de que se active la señal, por lo que se requiere al menos un mecanismo de activación mucho más sensible para una identificación por espectrometría de masas rápida.

Una vez que ha crecido una cantidad suficientemente grande de microbios en el hemocultivo, los microbios deben separarse por centrifugación o filtración para una identificación por espectrometría de masas. Todas las trazas de proteínas humanas y proteínas del medio nutritivo deben eliminarse para no interferir con la identificación por espectrometría de masas.

Cuando se hayan separado suficientes microbios, por ejemplo por centrifugación después de que se hayan disuelto todas las células humanas, la mejor manera de descomponer los microbios es añadiendo unos pocos microlitros de un ácido fuerte (ácido fórmico o ácido trifluoroacético) y aproximadamente la misma cantidad de acetonitrilo; la solución con las proteínas liberadas después se puede transferir a la placa de soporte de la muestra. Esta disociación de los microbios es posible incluso si la centrifugación no ha producido ningún precipitado visible. El límite de visibilidad de un precipitado es de aproximadamente 106 microbios; el límite de detección, por el contrario, es actualmente de aproximadamente 104 microbios, pero probablemente se puedan mejorar en el futuro. 104 microbios generalmente contienen más de 100 femtogramos de proteínas solubles, pero el límite de detección por espectrometría de masas para un método desarrollado de manera óptima está muy por debajo de este.

La identificación de los microbios en los líquidos corporales por espectrometría de masas es exitosa porque en la gran mayoría de los casos (mucho más de 70 por ciento) las infecciones microbianas agudas son causadas por una sola especie de microbio. Solo un pequeño porcentaje de casos, alrededor de 15 por ciento, implican dos especies de microbios, de modo que ambos pueden detectarse en los espectros de masas. Esta pureza de especie de los patógenos de las infecciones agudas contrasta radicalmente con la forma en que los microbios se encuentran en el cuerpo humano o sobre él; las aprox. 1014 bacterias de la flora intestinal en el intestino humano, por ejemplo, se distribuyen en al menos 400 especies bacterianas que viven en equilibrio unas con otras. La sangre y otros líquidos corporales son generalmente estériles, es decir, en el estado normal no contienen microbios en absoluto. Los microbios en los líquidos corporales normalmente son atacados, destruidos y eliminados inmediatamente por varios mecanismos de defensa que operan simultáneamente.

Objetivo de la invención

El objetivo de la invención es proporcionar métodos con los que se puedan detectar e identificar microbios infecciosos en la sangre (septicemia) u otros líquidos corporales más rápido que hasta ahora, de horas a días.

Sumario de la invención

El hemocultivo descrito anteriormente no es en modo alguno un medio nutritivo ideal para microbios; varias especies de microbios apenas crecen en hemocultivos. La sangre es fundamentalmente hostil a los microbios: además de los macrófagos que se alimentan de microbios, contiene una serie de sustancias antibióticas, tales como las defensinas y las enzimas antibacterianas. Además, la sangre de los pacientes con septicemia también suele contener antibióticos de amplio espectro, que se han administrado como tratamiento médico inicial antes de tomar muestras de sangre para realizar un diagnóstico.

La invención reconoce esta situación y proporciona un método según la reivindicación 1 y la reivindicación 17 que (a) destruye y disuelve en gran medida las partículas humanas en los líquidos corporales, tales como eritrocitos y leucocitos en sangre, inmediatamente después de la toma de muestras si es posible, mientras que los microbios deben mantenerse todavía capaces reproducirse, luego (b) separa los patógenos microbianos del líquido por centrifugación o filtración, por ejemplo, (c) los cultiva en un caldo nutritivo que no contiene ninguno de los componentes antimicrobianos de los líquidos corporales, (d) los separa de nuevo del caldo nutritivo, y (e) los identifica analizando la similitud entre un espectro de masas de sus perfiles de proteínas y los espectros de referencia.

Este método fundamental para la identificación por espectrometría de masas de los microbios puede ir acompañado de métodos que controlan el crecimiento cuantitativo de los microbios durante el cultivo en la etapa (c), particularmente métodos ópticos. Estos métodos ofrecen una detección temprana de la presencia de microbios, pero también una clasificación aproximada de los microbios. El control óptico solo es posible mediante el uso de un caldo nutritivo ópticamente transparente, a veces con una formulación especial que ayuda al procedimiento de medición. Por ejemplo, se pueden realizar medidas espectrométricas tales como análisis por dispersión de luz, medidas de extinción, medidas de fluorescencia en diferentes regiones del espectro electromagnético. Además, se pueden aplicar métodos de control acústicos o electrométricos. El cultivo se puede llevar a cabo preferiblemente en un recipiente de microcultivo con solamente muy poco caldo nutritivo con el fin de aumentar la densidad microbiana y, por lo tanto, la sensibilidad del método de control asociado. Los resultados intermedios tempranos de estos controles del crecimiento pueden salvar la vida del paciente, pero también pueden permitir que se termine el método si no se pueden detectar microbios en crecimiento. En particular, los métodos asociados pueden determinar el momento más temprano posible para llevar a cabo la identificación por espectrometría de masas. La identificación en sí lleva poco tiempo y, por lo tanto, permite que una terapia dirigida comience en una etapa temprana.

Un aspecto importante de la invención es también la liberación de especies bacterianas que anidan en macrófagos, tales como micobacterias o listerias.

Una vez que los microbios se han separado en la etapa (b), también es posible interponer un método de detección, tal como nano-RMN o micro-Raman, con el fin de detectar si hay algún microbio presente. El desarrollo actual de métodos espectrométricos o electrométricos modernos promete sensibilidades futuras que sean tan altas que se pueda detectar incluso la presencia de microbios individuales.

Este método proporciona suficientes patógenos en una forma suficientemente pura para la identificación por espectrometría de masas y es más rápido que cualquier método previamente conocido. Cuando el médico que trata al paciente conoce la especie de microbio, puede comenzar inmediatamente con un tratamiento dirigido porque para la mayoría de los microbios se sabe a qué antibióticos responderán. A menudo ocurre que la situación de resistencia, que puede ser diferente de una región a otra o de un hospital a otro, es conocida para esta especie de microbio. Pero también es posible utilizar una parte de los microbios cultivados para determinar su resistencia a los antibióticos. El inicio temprano de un tratamiento dirigido y prometedor de un paciente que se encuentra en una unidad de cuidados intensivos con septicemia, septicemia grave o choque séptico, no solo puede salvar la vida del paciente con más frecuencia que en el caso actual, sino que la recuperación temprana también reduce considerablemente los costes del tratamiento médico porque el paciente tiene una estancia más corta en cuidados intensivos.

Breve descripción de las ilustraciones

La figura 1 representa un recipiente de cultivo para métodos de acuerdo con esta invención en forma de un tubo de centrífuga (1), cuya tapa (2) contiene un septum (3) y un sistema de medición de presión diferencial (4). El recipiente de cultivo previamente evacuado (1) tiene un panel de escritura (5) con un código de barras adicional (6), un revestimiento interior (7) que cambia de color para indicar un aumento de CO², y contiene una solución (8) que disuelve partículas humanas.

La Figura 2 ilustra un ejemplo de un recipiente de microcultivo (12) con capilares de entrada (11) y (13), que están cerrados con los septum (10) y (14). Del recipiente de microcultivo con un volumen de solo aproximadamente 100 microlitros se puede extraer el aire previamente para estar listo para usar, de modo que los microbios en un caldo nutritivo se puedan introducir fácilmente con una jeringa a través de uno de los septum. El crecimiento de microbios en el volumen de microcultivo (12) se puede controlar con dispositivos de medición externos (17) o (19. Es posible medir la extinción del haz de luz (16) de un diodo láser externo (15) en un detector (17), por ejemplo, y producir una señal si han crecido suficientes microbios. También se puede controlar la luz dispersada (18) del haz de luz (16) en un detector (19). Si se pueden excitar sustancias fluorescentes en proporción a los microbios con el haz de luz (16), se puede controlar la luz fluorescente (18) mediante el detector (19). La extinción, luz dispersada o las curvas de luz fluorescente proporcionan información temprana sobre la presencia de microbios. Otros tipos de espectrometrías se pueden utilizar de forma similar. El tapón de rosca (20) se utiliza para abrir el recipiente de microcultivo una vez que los microbios se han separado por centrifugación una vez finalizado el cultivo. Los microbios se pueden descomponer en el recipiente de microcultivo después de retirar el caldo nutritivo, y el líquido de extracción se puede separar junto con las proteínas microbianas disueltas.

La Figura 3 muestra un recipiente de microcultivo muy simple (30) con septum (31), lleno con aproximadamente 100­ 200 microlitros de caldo (32), dentro de una disposición de control que consiste en una fuente de luz larga (34) y un detector de extinción (35). Las vistas del corte transversal en la parte inferior de la figura ilustran la disposición del detector de extinción (35), o detectores para luz dispersada (36) que se desvía con la mayor densidad en dirección hacia adelante, o detectores para luz fluorescente (37) que irradia en todas las direcciones con aproximadamente la misma densidad. El pequeño recipiente es ideal para centrifugar después del cultivo, para lavar y para la desintegración de los microbios granulados en una solución de matriz ácida.

La figura 4 presenta un diagrama de las etapas del procedimiento básico según esta invención.

La Figura 5 presenta un diagrama más detallado de un procedimiento preferido con etapas insertadas.

Realizaciones favorables

Como se presenta en la figura 4, la invención proporciona un método que incluye las siguientes etapas básicas:

a) disolver las partículas humanas en el líquido corporal, preferiblemente mediante tensioactivos débiles,

b) separar los microbios del líquido, por centrifugación o filtración, por ejemplo,

c) cultivar los microbios en un caldo nutritivo que no contenga los componentes antimicrobianos de los líquidos corporales,

d) separar los microbios del caldo nutritivo, por centrifugación o filtración, por ejemplo,

e) identificar los microbios comparando un espectro de masas de las proteínas microbianas con espectros de referencia.

Las realizaciones preferidas del método, más detalladas y especificadas, con las etapas b1), b2), c1), c2) y d1) insertadas, se muestran en la figura 5. Las etapas adicionales no deben realizarse todas dentro de la misma realización.

La expresión "líquidos corporales" se usa en un sentido amplio para significar todos los líquidos internos o excretados del cuerpo que pueden infectarse con microbios. Además de la sangre, también se incluyen particularmente la linfa, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, orina, líquido lagrimal, tejido homogeneizado hasta los líquidos de abscesos supurantes o moco nasal inflamado. En algunos de estos líquidos, las concentraciones de microbios son tan altas que la identificación inmediata es exitosa, después de que los microbios se hayan separado limpiamente, incluso sin cultivo adicional. Esta invención no se refiere a estos líquidos; los microbios en estos líquidos se pueden separar e identificar directamente con la ayuda de uno de los métodos en el documento WPO 2009/065580 A1 (U. Weller 2007), ya citado anteriormente. En muchos de estos líquidos corporales, sin embargo, las concentraciones de microbios son tan bajas que los microbios deben multiplicarse mucho por cultivo antes de que pueda tener lugar una identificación. Aquí es donde entra en juego esta invención.

El método que se describe con más detalle a continuación utiliza sangre como líquido corporal; sin embargo, también se puede utilizar para otros líquidos corporales, pero las cantidades de tensioactivos y otras sustancias añadidas deben adaptarse en consecuencia. La descripción aquí se limita a la centrifugación como medio para separar los microbios del líquido, pero sin desear excluir la filtración u otros métodos de separación, tales como la unión a perlas magnéticas.

En principio, los glóbulos sanguíneos se pueden destruir en la etapa (a) con agua destilada después de una centrifugación previa, lo que hace que la mayoría de los glóbulos sanguíneos revienten debido a la ósmosis. La repetición de la centrifugación y la adición de agua destilada destruyen casi todos los glóbulos sanguíneos. Los fragmentos restantes de membranas celulares, que se separan por centrifugación junto con los microbios, apenas perturban el cultivo posterior en el caldo nutritivo.

Sin embargo, el método preferido usa tensioactivos débiles para la desintegración y disolución de las partículas de sangre en la etapa (a). Es particularmente importante que la disolución de los glóbulos sanguíneos se lleve a cabo mediante una cantidad medida con precisión de tensioactivos débiles no tóxicos con el fin de que incluso los microbios sensibles sigan siendo completamente capaces de reproducirse. Una disolución con saponina no tóxica diluida es favorable, por ejemplo. La delicada membrana celular de los glóbulos sanguíneos consiste predominantemente en fosfolípidos, que se unen entre sí en un enlace no covalente para formar la membrana. Los tensioactivos disuelven los enlaces no covalentes de proteínas y lípidos. Los fosfolípidos de las membranas celulares son en sí mismos anfifílicos, es decir, tienen las propiedades de los tensioactivos y pueden ser disueltos de forma nano-coloidal por otros tensioactivos formando micelas, de modo que los tensioactivos añadidos se unen en un grado tal que apenas pueden dañar más a los microbios.

Un aspecto importante de la invención es también liberar las especies bacterianas que anidan en macrófagos u otras células humanas de la sangre, tales como micobacterias o listerias, disolviendo los glóbulos sanguíneos.

La disolución de los glóbulos sanguíneos y la posterior separación de los microbios de la sangre deben realizarse preferiblemente inmediatamente después de que se haya tomado la muestra de sangre, ya que dejar microbios sensibles en la sangre durante un período prolongado podría hacer que no fueran capaces de reproducirse. Para los microbios sensibles, la semivida para la supervivencia de los microbios viables en la sangre es de solo unas pocas horas, mientras que los microbios fuertes pueden incluso multiplicarse en la sangre. Pero incluso en sangre disuelta en saponina, la semivida de los microbios sensibles no es mucho mayor; por lo tanto, se recomienda que los microbios se separen del líquido por centrifugación o filtración dos horas después de que los glóbulos sanguíneos se hayan disuelto, como muy tarde.

En ambos casos, destrucción con agua destilada o disolución con una cantidad exacta de tensioactivos, pueden permanecer en el líquido diferentes cantidades de residuos, tales como paredes celulares disueltas de manera incompleta y otros componentes no solubles de los glóbulos sanguíneos, pero no interfieren significativamente con el resto del método. Estos componentes se pueden eliminar más tarde lavando los microbios separados en la etapa (d) en una etapa de lavado especial (d1) con disolución de todas las proteínas no microbianas mediante tensioactivos fuertes. En la etapa (a) es importante destruir los glóbulos sanguíneos de tal manera que se liberen todos los microbios insertados en las células. Cuando los microbios se separan del líquido en la etapa (b), se eliminan todas las proteínas humanas solubles, incluidas las proteínas solubles de los glóbulos sanguíneos, junto con todos los anticuerpos endógenos que son dañinos para la reproducción de los microbios, tales como las defensinas y las enzimas antimicrobianas. Las defensinas forman hasta 30 por ciento de la sustancia granular de los granulocitos neutrófilos, que constituyen aproximadamente 60 por ciento de los leucocitos. Si es necesario, se pueden insertar etapas de lavado (b1).

También es particularmente importante eliminar todos los antibióticos de amplio espectro ya administrados como parte del tratamiento de los pacientes con septicemia, lo cual se hace aquí automáticamente en las etapas (b) y (b1). Los frascos de hemocultivo disponibles comercialmente contienen diferentes tipos de partículas para hacer que estos antibióticos sean inofensivos, desde fragmentos de carbón hasta perlas de espuma plástica de poros abiertos y duras. Los fabricantes libran guerras de palabras sobre estas adiciones, pero todas dañan el crecimiento sin obstáculos de los microbios en los hemocultivos, en parte porque adsorben firmemente los microbios y en parte porque literalmente muelen los microbios cuando los frascos de hemocultivo se mueven hacia delante y hacia atrás en la cámara de incubación.

La etapa de lavado intermedio (d1) mencionada anteriormente para limpiar los microbios depositados después de un cultivo suficiente en la etapa (c) sirve para eliminar todos los rastros de proteínas extrañas residuales que no pertenecen a los microbios, es decir, todas las proteínas humanas, y también todas las proteínas que se originan del caldo nutritivo y podrían unirse a los microbios. Las proteínas solubles podrían incluso haber sido producidas por microbios vivos de las paredes celulares no disueltas de los glóbulos sanguíneos. Si se superponen señales de proteínas extrañas a las señales de las proteínas microbianas en el espectro de masas, la identificación se hace mucho más difícil, si no imposible. Esta limpieza en la etapa (d1) se puede hacer con tensioactivos fuertes tales como SDS (dodecilsulfato de sodio) porque para la identificación por espectrometría de masas, los microbios no tienen que conservar su capacidad de reproducción.

Finalmente, los microbios deben descomponerse y liberar las proteínas solubles con el fin de adquirir el espectro de masas de las proteínas microbianas para la identificación por espectrometría de masas en la etapa (e). Como ya se ha descrito en la introducción, esta desintegración de los microbios se puede hacer preferiblemente mientras aún están en el tubo de centrífuga con unos microlitros de un ácido orgánico agresivo tal como ácido fórmico o ácido trifluoroacético y unos microlitros de acetonitrilo; pero los microbios también pueden descomponerse, como suele ser el caso en la actualidad, después de esparcir algunos microbios sobre una placa de soporte de muestra de espectrometría de masas. Se utilizan métodos convencionales para adquirir el espectro de masas de las proteínas microbianas e identificarlas por análisis de similitud con los espectros de referencia en la etapa (e).

Si se usa la centrifugación, todo el método desde la etapa (a) a la etapa (d) y hasta la desintegración de los microbios para obtener una disolución de las proteínas microbianas para adquirir los espectros de masas se puede realizar en el mismo tubo de centrífuga, por ejemplo. Aquí se puede utilizar, por ejemplo, un tubo de centrífuga estándar de 1,5 mililitros. Pero con el fin de detectar la septicemia con solo 0,5 microbios viables por mililitro con suficiente certeza estadística, es más ventajoso utilizar recipientes de cultivo especiales con un volumen de aproximadamente 15 mililitros, en los que se pueden utilizar de ocho a diez mililitros de sangre. Su volumen es similar al de los frascos de hemocultivo utilizados hasta ahora, pero deberían permitir la centrifugación, lo que no es posible con los frascos de hemocultivo. Los tubos de centrífuga estándar de 1,5 mililitros se pueden utilizar en el análisis de la sangre de bebés, por ejemplo, porque en este caso solo se dispone de pequeñas cantidades de sangre y, por lo general, hay concentraciones más altas de microbios en la sangre en caso de septicemia. El método se describe aquí para los recipientes de centrífuga más grandes.

Cuando se utiliza para este método un tubo de centrífuga de 15 ml preparado previamente y listo para usar, se añaden aproximadamente ocho mililitros de sangre. Preferiblemente, el tubo de centrífuga se sella con un septum y se extrae el aire previamente; está prefabricado y contiene de dos a cuatro mililitros de una disolución estéril que contiene aproximadamente 240 microgramos de saponina no tóxica, una pequeña cantidad de inhibidor de espuma y al menos un anticoagulante. Se conocen reglas precisas para el llenado estéril de la sangre a partir de métodos para el tratamiento de hemocultivos. Los líquidos en el tubo de centrífuga se mezclan inmediatamente con movimientos circulares cuidadosamente cinco veces y después de aprox. 30 segundos se centrifugan durante 10 minutos a 3000 g, de modo que los microbios precipitan como un sedimento suelto. El líquido sobrenadante se retira cuidadosamente con una jeringa estéril y se desecha; se puede insertar una aguja capilar estéril con microfiltro para permitir que el aire aséptico fluya posteriormente. Ahora se añaden diez mililitros de un caldo nutritivo a los microbios, nuevamente con una jeringa estéril. Los microbios se dispersan en el caldo mediante agitación; el tubo de centrífuga se incuba durante un tiempo especificado a una temperatura determinada. Es particularmente ventajosa la incubación con ligera agitación con el fin de evitar que los microbios precipiten.

Los frascos de hemocultivo disponibles comercialmente suelen estar provistos de dispositivos de señalización que, en cámaras de incubación adecuadamente equipadas, pueden indicar cuándo han crecido suficientes microbios. Estos dispositivos de señalización a veces se basan en revestimientos de paredes que cambian de color cuando el cambia el contenido de CO² y, a veces, en diferentes tipos de medición del aumento de CO² o simplemente en la indicación de un aumento de presión. Cuando se mide el contenido de CO², se deben utilizar siempre dos frascos de hemocultivo: uno para microbios aerobios y otro para microbios anaerobios.

Aunque estos dispositivos de señalización no han sido hasta ahora ideales para identificaciones por espectrometría de masas porque su sensibilidad es demasiado baja, también se pueden aplicar en recipientes de cultivo para los métodos de acuerdo con esta invención. Incluso funcionan mejor aquí porque los glóbulos sanguíneos no liberan CO². La figura 1 representa dicho recipiente de cultivo en forma de un tubo de centrífuga (1), cuya tapa (2) contiene un septum perforable (3) y un microsistema de medición de presión diferencial (4). El recipiente de cultivo (1) tiene un panel de escritura (5) con un código de barras adicional (6); se ha extraído el aire previamente para su llenado. Como alternativa al sistema de medición de presión diferencial (4), el tubo puede tener un revestimiento interior (7) que cambia de color para indicar un aumento de CO². El tubo de centrífuga contiene una cantidad medida con precisión de una solución (8) que disuelve partículas humanas y consiste en saponina, anticoagulantes e inhibidores de espuma en agua estéril, por ejemplo. Como se indicó anteriormente, se utilizan jeringas y agujas estériles con microfiltros para llenar el tubo y para intercambiar líquidos. Se debe evitar cuidadosamente cualquier contaminación con microbios del entorno hasta después de la incubación. Se pueden utilizar dos recipientes de cultivo idénticos con diferentes tipos de caldo nutritivo para el cultivo de microbios aeróbicos y anaeróbicos.

Después de una incubación suficientemente larga (etapa c), los microbios se vuelven a separar por centrifugación (etapa d), siendo ahora suficiente tres minutos a 10.000 g si los recipientes de cultivo están diseñados para ello. Se elimina el líquido sobrenadante y los microbios se recogen agitando con una disolución de SDS al 0,5 por ciento en agua con el fin de eliminar todos los restos de proteínas del caldo nutritivo o humanas (etapa d1). Después de una nueva centrifugación y la eliminación del líquido sobrenadante, los microbios se lavan con agua destilada y se centrifugan nuevamente. Es importante que se eliminen todos los rastros de SDS porque el SDS (y otros tensioactivos fuertes) impiden en gran medida la ionización de las proteínas en la fuente de iones del espectrómetro de masas.

La desintegración de los microbios para liberar las proteínas solubles, la adquisición de espectros de masas y la identificación de los microbios por sus espectros de masas (etapa e) utilizan métodos convencionales y no se describen con más detalle aquí.

En lugar de separar los microbios por centrifugación en las etapas (b) y (d), también se pueden separar por microfiltración y lavar. También se suelen utilizar centrífugas para la microfiltración. Dado que la adición de tensioactivos disuelve casi por completo las membranas celulares de las partículas sanguíneas y sus estructuras internas, la microfiltración también produce un aislado puro de los microbios.

La experiencia muestra que solo alrededor de 15 por ciento de los hemocultivos muestran un resultado positivo. Dado que es extremadamente ventajoso para la supervivencia de un paciente con sospecha de septicemia que se detecte lo antes posible la existencia de septicemia, se puede insertar un método de detección espectrométrica para microbios precipitados, tal como nano-RMN o micro Raman, después de la primera separación de los microbios en la etapa (b), por ejemplo. Actualmente se están desarrollando métodos microespectrométricos y electrométricos ultrasensibles cuyo objetivo es detectar la presencia de microbios individuales en el sedimento de la centrífuga. El conocimiento temprano de la ausencia definitiva de microbios no solo ahorra el coste del método adicional, también es importante para el médico encargado, quien puede ajustar su tratamiento temprano en función de esto. Estas detecciones aún no han tenido éxito, pero podrían ser muy importantes en el futuro.

Sin embargo, más prometedoras son las realizaciones del método que controlan el crecimiento multiplicativo de los microbios en la etapa (c1), mientras se cultivan en la etapa (c), con una sensibilidad muy alta midiendo la densidad microbiana. En la etapa (c1), la presencia de microbios que son capaces de reproducirse se puede determinar en una etapa temprana detectando un aumento en la densidad microbiana y, lo que es más importante, el control en la etapa (c1) también puede determinar el momento más temprano en el que se puede iniciar una identificación por espectrometría de masas. A continuación, se puede detener el cultivo (etapa c2). Este control solo es posible mediante la invención: sustituyendo el hemocultivo por cultivo en un caldo nutritivo transparente con características ópticas definidas. El término "transparente" no debe significar transparencia completa en todo el intervalo espectral; es suficiente cuando se pueden aplicar ciertos tipos de espectrometría sin perturbaciones. En dicho caldo nutritivo transparente con una composición personalizada, se pueden usar diferentes tipos de espectrometría en amplios intervalos del espectro electromagnético, por ejemplo, espectrometría infrarroja, espectroscopía Raman, espectrometría de absorción y luz dispersada, y muchos más. La espectrometría de fluorescencia tiene una sensibilidad de detección particularmente buena, por ejemplo. Esta se puede activar o ayudar añadiendo sustancias al caldo nutritivo cuyo metabolismo en microbios conduce a productos de descomposición fluorescentes, o cuya unión a las paredes celulares de los microbios produce una fluorescencia medible. Hay sustancias fluorescentes que cambian su longitud de onda fluorescente por unión a las paredes celulares. Dado que los microbios también crecen a menudo en las paredes del recipiente de cultivo, también se pueden utilizar métodos de medición de superficie, tales como la espectrometría de resonancia de plasmón (PRS) o la espectrometría Raman de superficie mejorada (SERS). También es posible utilizar diferentes tipos de espectrometría acústica y vibracional. Además, se pueden utilizar métodos de control eléctrico: medición de la constante dieléctrica en recipientes de forma adecuada, por ejemplo. A menudo, los diferentes métodos de medición no solo pueden seguir el crecimiento, sino también comunicar una clasificación aproximada de los microbios. Incluso la velocidad de crecimiento es una indicación para una clasificación inicial, una clasificación que es médicamente muy relevante.

Cuando se utilizan estos métodos de medición con el control del crecimiento de los microbios, es particularmente ventajoso que los microbios separados en la etapa (b) se cultiven en un caldo nutritivo cuyo volumen sea mucho menor que el de la sangre. En un buen caldo nutritivo, los microbios experimentan un crecimiento exponencial en gran medida sin obstáculos hasta una densidad de 107 a 108 microbios por mililitro, mientras que solo se requieren aproximadamente 104 microbios para la identificación por espectrometría de masas. Por lo tanto, el cultivo puede tener lugar en microcantidades por debajo de un mililitro: solo 100 microlitros de caldo nutritivo, por ejemplo, son suficientes para cultivar suficientes microbios para una identificación por espectrometría de masas. Esto permite transferir los microbios, en una etapa (b2), a una cámara de microcultivo de forma especial con un volumen de solo aproximadamente 100 a 200 microlitros después de una breve fase inicial de aproximadamente una a dos horas de cultivo en el recipiente de centrifugación original, en solo 100 microlitros de caldo nutritivo, por ejemplo. En este pequeño volumen de caldo nutritivo, la densidad de inoculación, y por tanto también la densidad microbiana subsiguiente, es aproximadamente 100 veces mayor en cada etapa del cultivo que en un volumen que corresponde a la cantidad de sangre. En las Figuras 2 y 3 se muestran ejemplos de dichas cámaras de microcultivo. Estas cámaras de microcultivo son particularmente adecuadas para los diferentes tipos de espectrometría porque la densidad microbiana es 100 veces mayor.

Con una tasa de reproducción media de solo una generación de microbios por hora, un cultivo de 12 horas genera los 104 microbios requeridos a partir de un solo microbio. Los tipos agresivos de microbios, tales como por ejemplo E. coli, se reproducen mucho más rápido.

La cámara de microcultivo (12) que se muestra en la Figura 2 se puede escanear de manera muy simple con un dispositivo (17) para medir la extinción de la luz: este dispositivo controla la atenuación causada por la dispersión o absorción de la luz cuando se envía un haz de luz (16) a través de la cámara. La fuente de luz (15) y la unidad de medida de extinción (17) no necesitan estar conectadas a la cámara de microcultivo, sino que pueden instalarse en una cámara para la incubación y así escanear cíclicamente varias cámaras de microcultivo. No solo es posible medir la extinción; un dispositivo de medición similar (19) puede medir la luz dispersada (18) o la luz fluorescente (18) que se origina en los microbios en crecimiento cuando se irradian con un haz de luz (16). La fuente de luz (15) y la unidad de medida de extinción (17) no necesitan estar conectadas a la cámara de microcultivo, sino que pueden instalarse en una cámara para la incubación y así escanear cíclicamente varias cámaras de microcultivo. No solo es posible medir la extinción; un dispositivo de medición similar (19) puede medir la luz dispersada (18) o la luz fluorescente (18) que se origina en los microbios en crecimiento cuando se irradian con un haz de luz (16).

En la cámara de microcultivo aún más simple (12) que se muestra en la Figura 4, el crecimiento de microbios se puede controlar de manera muy simple mediante luz de un sistema de diodos largo (34) que cruza el tubo y se detecta con un dispositivo (34) para medir la extinción. Los detectores (35) y (36) pueden detectar fácilmente luz dispersada (densidad más alta en la dirección hacia delante) o luz fluorescente (densidad igual en todas las direcciones).

Si las cámaras de microcultivo tienen una forma favorable, estos dispositivos de control pueden, sobre todo, dar una indicación precisa de cuando han crecido aprox. 104 microbios para la identificación por espectrometría de masas. Con ello se consigue un ahorro de tiempo de muchas horas o incluso días en comparación con los dispositivos de señalización que se utilizan habitualmente en los hemocultivos en la actualidad, lo que a menudo es crucial para la supervivencia del paciente. Como ya se mencionó, dicho sistema de medición también puede proporcionar una indicación temprana confiable de la presencia de microbios, e incluso una clasificación aproximada, que también es de importancia crucial para el tratamiento temprano del paciente. Esta posibilidad de cultivar en cámaras de microcultivo también solo es posible por el principio fundamental de esta invención: el cultivo de los microbios en un caldo nutritivo especial.

Una cámara de microcultivo similar a las mostradas en las Figuras 2 y 3 es adecuada para muchos de los tipos de espectrometría mencionados anteriormente, aunque la forma y el material de las paredes y ventanas posiblemente tengan que adaptarse al tipo de espectrometría. También se puede conformar de tal manera que sea directamente adecuado para separar los microbios del líquido por centrifugación, como en la Figura 3, y para finalmente desintegrar los microbios, por ejemplo. También es posible utilizar cámaras de microcultivo en chips de silicio, y pueden estar presentes en el chip circuitos eléctricos para medir el crecimiento de microbios ("laboratorio en el chip").

Cuando se utilizan espectrometrías particularmente sensibles para este control, tales como la espectrometría de fluorescencia antes mencionada con el uso de sustancias especiales, el crecimiento de los microbios se puede detectar muy temprano. En este caso, solo se analizan los microbios capaces de crecer, es decir, los realmente peligrosos; esto contrasta con los análisis del sedimento después de la etapa (b), donde también se podrían medir los microbios que están muertos o que no pueden reproducirse. No se puede enfatizar lo suficiente que la detección temprana de una septicemia real es de crucial importancia para las posibilidades de recuperación del paciente, o incluso para sus posibilidades de supervivencia.

La invención se basa en particular en el cultivo de microbios no en los líquidos corporales antimicrobianos, sino en un caldo nutritivo particularmente favorable. Como se explicó, es el caldo nutritivo especial el que permite realizar también mediciones complementarias del crecimiento microbiano. En primer lugar, sin embargo, los microbios deben separarse limpiamente del líquido corporal. Esto se hace usando un método que es similar al desarrollado hace más de treinta años para los tubos Isolator™ para la separación limpia de microbios de la sangre, y que mientras tanto ha sido probado y examinado millones de veces. Implica disolver rápidamente los diferentes tipos de glóbulos sanguíneos en una cantidad medida con precisión de un tensioactivo débil sin destruir los microbios o hacerlos incapaces de reproducirse. Se ha demostrado que una saponina purificada no tóxica es un buen tensioactivo débil, pero se pueden utilizar muchos otros tipos de tensioactivos. La delicada membrana celular de los glóbulos sanguíneos consiste predominantemente en fosfolípidos, que se unen entre sí con un enlace no covalente para formar la membrana. Los tensioactivos disuelven los enlaces no covalentes de proteínas y lípidos, pero también destruyen la estructura cuaternaria y terciaria de las proteínas macromoleculares en el interior de las células por uniones iónicas. Los fosfolípidos de las membranas celulares son en sí mismos anfifílicos, es decir, tienen características tensioactivas y pueden ser disueltos por otros tensioactivos formando micelas nano-coloidales. Como resultado, las membranas celulares se disuelven en gran medida, pero esto también une los tensioactivos añadidos a la sangre en gran medida, después de lo cual ya no pueden dañar a los microbios. Las estructuras internas de los glóbulos sanguíneos también son destruidas por los tensioactivos y se disuelven en gran medida, incluida la membrana del núcleo celular y el ADN de los leucocitos. Todos los componentes disueltos se eliminan con el líquido sobrenadante después de la centrifugación. Los macrófagos también se disuelven, liberando así cualquier microbio que pueda estar anidando en su interior.

Las paredes celulares de las bacterias, por otro lado, son muy fuertes; consisten principalmente en mureínas polimerizadas reticuladas. En el caso de las bacterias Gram positivas hay una reticulación adicional con los ácidos teicoicos, que también están polimerizados. Estas redes unidas covalentemente resisten el efecto de disolución de los tensioactivos al menos durante el breve período de varios minutos. Los tensioactivos también pueden penetrar en los microbios y destruir las estructuras de plegamiento de las proteínas, lo que daña su capacidad de reproducción; por lo tanto, es importante usar una cantidad medida con precisión de un tensioactivo débil, preferiblemente una saponina no tóxica, para la primera disolución de las partículas humanas en la etapa (a), y dejar que el tensioactivo actúe únicamente durante un breve período de tiempo.

La semivida para la supervivencia de microbios sensibles en una solución de saponina-sangre es de solo unas pocas horas. Por lo tanto, los microbios deben separarse del líquido en el menor tiempo posible. Se recomienda que los microbios no se mantengan en el líquido durante más de dos horas. Por lo tanto, los recipientes de cultivo llenos de sangre deben transportarse rápidamente por mensajería o sistemas de transporte especiales al laboratorio, donde se puede llevar a cabo el método adicional. También es posible enviar la sangre al laboratorio en recipientes de sangre normales con anticoagulantes, aunque también aquí, el retraso más breve posible es fundamental.

Para la identificación por espectrometría de masas de los microbios cultivados por incubación, no es importante si los microbios están muertos o son viables, siempre que las proteínas del interior no se liberen o cambien en su estructura primaria. Por tanto, es posible utilizar un tensioactivo mucho más fuerte, SDS (dodecilsulfato de sodio), por ejemplo, para limpiar estos microbios de todos los residuos de proteínas extrañas en la etapa (d1). Sin embargo, el tensioactivo fuerte debe volver a lavarse a fondo posteriormente, porque incluso en trazas obstaculizará la ionización de las proteínas para la adquisición de los espectros de masas.

En una realización adicional del método según la invención, la sangre de los tubos de centrífuga se puede centrifugar primero. A continuación, se extrae el plasma sanguíneo claro sobrenadante y el depósito de color rojo oscuro se recoge con una solución de tensioactivo débil: una solución de saponina al 1 por ciento, por ejemplo. El precipitado de color rojo oscuro, que contiene no solo los microbios sino también, en particular, los 5 millones de eritrocitos, 7 mil leucocitos y 50 mil trombocitos de cada mililitro de sangre, se mezcla con la solución de tensioactivo añadida en un agitador, un proceso que destruye las membranas celulares de los glóbulos sanguíneos y libera las proteínas solubles. La solución de color rojo oscuro se vuelve a centrifugar ahora, el líquido sobrenadante permanece rojo intenso esta vez y el precipitado, si es visible, aparece de color blanco puro. El caldo nutritivo ahora se puede añadir al precipitado e incubar.

En una modificación de esta realización, el precipitado de color rojo oscuro de los glóbulos sanguíneos también puede recogerse simplemente con agua destilada. Esto en sí mismo destruye la mayoría de los glóbulos sanguíneos. Repetir la centrifugación y recoger el depósito con agua destilada produce suficientes microbios limpios para el cultivo en el caldo nutritivo.

Antes de la adquisición del espectro en la etapa (e), los microbios se desintegran y se extraen las proteínas microbianas solubles. Con este fin, se añaden varios microlitros de ácido fórmico al 70 por ciento a los microbios precipitados. El ácido ataca agresivamente los peptidoglicanos (mureínas) de las paredes celulares de los microbios y destruye la estructura celular. Luego se añade la misma cantidad de acetonitrilo con el fin de disolver tantas proteínas como sea posible. La solución se centrifuga nuevamente con el fin de precipitar los componentes sólidos, tales como los restos de las paredes celulares de los microbios.

Ahora debe adquirirse un espectro de masas de las proteínas disueltas de los microbios en el líquido sobrenadante. Esto se puede hacer de diversas formas con varios métodos de ionización conocidos en varios tipos de espectrómetros de masas, pero hasta ahora se han utilizado exclusivamente espectrómetros de masas de tiempo de vuelo MALDI especiales.

Para la adquisición convencional del espectro de masas en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo MALDI, ahora se aplica aproximadamente un microlitro y medio del líquido sobrenadante a cada punto de muestra de medición de un soporte de muestra MALDI y se seca. Luego se añade aproximadamente un microlitro y medio de una solución de sustancia matriz, preferiblemente HCCA disuelto en 50% de acetona en agua con la adición de un poco (aproximadamente 3%) de ácido trifluoroetanoico (TFA). Para ello, se utilizan soportes de muestra que contienen anclajes hidrófilos de dos milímetros de diámetro en un entorno hidrófobo, por ejemplo. Pero también es posible utilizar soportes de muestra desechables, en los que círculos grabados impiden que la solución se extienda. La solución forma gotitas semiesféricas de dos milímetros de diámetro. Después de secar todas las muestras de medición, el soporte de muestra está listo para la adquisición de los espectros de masas.

Este método de preparación más simple para las muestras de medición se puede modificar de una amplia variedad de formas. Una opción es utilizar placas de soporte de muestras que ya lleven una capa delgada de la sustancia de la matriz: HCCA, por ejemplo. El líquido sobrenadante de ácido fórmico y acetonitrilo se pipetea directamente sobre esta capa fina. La capa fina tiene la propiedad de poder unir inmediatamente todas las proteínas en la superficie, por lo que después de aproximadamente un minuto se puede eliminar el líquido restante. Esto también elimina las impurezas. La posterior adición opcional de una gota de acetona puede incrustar las proteínas en los pequeños cristales de la capa delgada mediante procesos de recristalización.

Una vez finalizado el cultivo, el procedimiento de preparación de la muestra de medición para la adquisición de un espectro de masas en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo MALDI tarda solo aproximadamente de 10 a 15 minutos en total. El soporte de muestra con las preparaciones de muestras se introduce ahora en la fuente de iones de un espectrómetro de masas disponible comercialmente de la forma habitual a través de un cierre de vacío. El espectrómetro de masas está listo para funcionar en aproximadamente cinco minutos. En un espectrómetro de masas MALDI cuyo láser de pulsos UV funciona a 200 hercios, solo se tarda unos pocos segundos en adquirir un número suficiente de espectros individuales de una muestra de medición con el fin de obtener un espectro de suma muy útil. Por tanto, la adquisición de los espectros de masas se puede completar en unos pocos minutos.

Están disponibles comercialmente programas informáticos para la posterior identificación de los microbios mediante sus espectros de masas. El tiempo necesario para identificar los microbios a partir de buenos espectros de masas depende de la potencia del ordenador, el tamaño de la biblioteca de espectros de referencia y el algoritmo para el análisis de similitud. Con los ordenadores disponibles comercialmente en espectrómetros de masas, la identificación de los espectros de masas de las muestras, incluidas las muestras de confirmación, tarda solo unos minutos; por tanto, la especie microbiana se identifica media hora después de que finalice el cultivo de los microbios, como muy tarde.

En una realización diferente, si el precipitado es visible después de una etapa de lavado final, una pequeña cantidad de los microbios así aislados se puede transferir a la placa de soporte de la muestra de la manera habitual mediante un hisopo y se puede preparar allí como de costumbre. Los espectros de masas de esta técnica de hisopo convencional son muy similares a los espectros de masas de la técnica de digestión que usa ácido en el tubo de centrífuga. Si hay alguna diferencia apreciable, los espectros de masas de ambos tipos de preparación de muestras se pueden introducir en la biblioteca como espectros de referencia.

La invención proporciona principalmente un método para la identificación definitiva de patógenos microbianos en sangre que es significativamente más rápido que los métodos actuales, que funcionan casi exclusivamente con el cultivo de los microbios en recipientes de hemocultivo y el subsiguiente cultivo en placas de Petri. La invención cultiva los microbios no en la sangre antimicrobiana, sino en un caldo nutritivo favorable para el crecimiento microbiano, del cual se separan, lavan y se identifican inmediatamente por espectrometría de masas. El caldo nutritivo también permite el uso de métodos para un control sensible del crecimiento de microbios para que el cultivo pueda detenerse cuando han crecido los 104 microbios necesarios para la identificación por espectrometría de masas. El método por espectrometría de masas se puede utilizar para realizar una identificación sin ningún conocimiento previo de los microbios y conduce directamente a una identificación a nivel de la especie o subespecie microbiana. Ningún otro método de identificación es tan rápido y fiable.

La última etapa (e) en la identificación de los microbios aislados así obtenidos sigue métodos convencionales, que por lo demás se basan normalmente en aislar un tipo de microbio cultivando una colonia. El aislamiento aquí se produce automáticamente porque en las infecciones agudas sólo se encuentran como patógenos una o como máximo dos especies de microbios. Esto significa que se obtienen suficientes cultivos de microbios puros (aislados). Incluso cuando hay presentes dos especies de microbios, el método sigue funcionando satisfactoriamente.

Como se ha destacado varias veces, la identificación rápida de los microbios de septicemia es extremadamente importante. Si la especie ocurre con frecuencia, generalmente se conoce la situación de resistencia, por lo que no hay urgencia para determinar la resistencia. Para los microbios que ocurren con menos frecuencia, pero también para algunas de las especies de microbios frecuentes que ocurren en situaciones de resistencia muy variables, el conocimiento de su resistencia a diferentes antibióticos y también, lo más importante, el conocimiento de la fuerza de esta resistencia puede ser necesario. En este caso, también se pueden usar pequeñas porciones de los precipitados microbianos aislados en la etapa (d) para determinar la resistencia de los microbios con los métodos funcionales habituales de cultivo intentados en presencia de concentraciones progresivas de antibióticos. Si se sospecha de microbios inusuales en una etapa temprana, se pueden cultivar primero en el caldo nutritivo antes de dividir el caldo nutritivo entre los frascos de microcultivo individuales. En uno de estos frascos se cultivan los microbios para la identificación por espectrometría de masas, en otros para la caracterización de su resistencia a diferentes antibióticos.

El método de esta invención con separación rápida de los microbios de las células endógenas también se puede aplicar a abscesos u otros focos de inflamación, ya que también contienen células endógenas. Un ejemplo de esto es un foco supurativo, es decir, una acumulación de algunos microbios vivos, algunos parcialmente digeridos en una mezcla con ciertos tipos de leucocitos que los combaten. Aquí también, las células endógenas se pueden disolver con soluciones tensioactivas. Otro ejemplo es el moco nasal obtenido como frotis de la mucosa nasal, para lo cual la identificación de los microbios (particularmente MRSA) es de gran interés. Estas muestras también se pueden obtener de otras membranas mucosas. Aunque en la mayoría de los casos la separación directa aporta suficientes microbios para una identificación con estas muestras, también se puede llevar a cabo el cultivo en un caldo nutritivo adecuado si es necesario.

En los métodos descritos anteriormente, los espectros de masas de los microbios se adquirieron en espectrómetros de masas de tiempo de vuelo con ionización por desorción por láser asistida por matriz (MALDI). Esto es habitual, pero no obligatorio. Los líquidos de desintegración de microbios con proteínas solubles también pueden ionizarse mediante electropulverización, por ejemplo. Este tipo de ionización genera una fuerte superposición de iones de carga múltiple en el intervalo de masa de aproximadamente 600 a 1.600 unidades de masa atómica, que necesariamente requieren un espectrómetro de masas con alta resolución. Aquí es más ventajoso el método de ionización química a presión atmosférica (APCI), que proporciona de manera muy predominante iones cargados individualmente de las sustancias analíticas. Aquí se pueden usar espectrómetros de masas de tiempo de vuelo con inyección de iones ortogonal (OTOF-MS), al igual que espectrómetros de masas de resonancia ciclotrónica de iones (ICR-MS) u otros espectrómetros de masas de alta resolución.

Los diferentes tipos de recipientes de cultivo descritos anteriormente para el método de acuerdo con esta invención también se pueden producir y vender comercialmente. También se pueden juntar en un paquete de consumibles comercialmente vendible (kit) con, por ejemplo: jeringas estériles desechables para descarga; caldo nutritivo listo para usar, suministrado en jeringas, por ejemplo; agujas de punción con microfiltros para una ventilación estéril; soportes de muestra desechables y la sustancia de matriz.

Con el conocimiento de la invención, los expertos en la técnica pueden modificar los métodos aquí descritos en una amplia variedad de formas. Algunas de estas modificaciones ya se han descrito anteriormente, pero ciertamente existen otros métodos que, sobre la base fundamental del cultivo en un caldo nutritivo, pueden proporcionar no solo una identificación por espectrometría de masas temprana de los microbios, sino también generar más información sobre los microbios en una etapa temprana.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Método para la identificación de microbios en sangre que comprende las etapas:

(a) Disolver partículas de la sangre humana en la sangre con un tensioactivo,

(b) Separar los microbios de la sangre,

(c) Cultivar los microbios en un caldo nutritivo que no contenga compuestos antimicrobianos de la sangre, (d) Separar los microbios del caldo nutritivo,

(e) Identificar los microbios mediante análisis de similitud de un espectro de masas de las proteínas microbianas y espectros de referencia.

2. Método según la reivindicación 1, en donde en la etapa (a) se liberan microbios que anidan en macrófagos u otras células humanas de la sangre.

3. Método según la reivindicación 1, en donde las partículas humanas se disuelven en una solución acuosa de saponina con inhibidor de espuma añadido.

4. Método según la reivindicación 3, en donde las partículas humanas son eritrocitos y leucocitos.

5. Método según la reivindicación 4, en donde las partículas humanas se disuelven inmediatamente después de tomar la muestra de sangre.

6. Método según una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde después de la etapa b) se investiga si se han separado los microbios y las etapas c) a e) se llevan a cabo solo si se han detectado microbios.

7. Método según una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde en la etapa c) el cultivo de los microbios tiene lugar en menos de un mililitro de caldo nutritivo.

8. Método según una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde se controla el crecimiento cuantitativo de los microbios durante el cultivo de los microbios en la etapa c).

9. Método según la reivindicación 8, en donde el cultivo de los microbios en la etapa c) se lleva a cabo solo hasta que el control indica suficientes microbios para una identificación por espectrometría de masas.

10. Método según la reivindicación 8 o 9, en donde los microbios se cultivan en un caldo ópticamente transparente y el control del crecimiento cuantitativo de los microbios se lleva a cabo midiendo la extinción de la luz, la luz dispersada o la fluorescencia.

11. Método según la reivindicación 10, en donde para el control del crecimiento cuantitativo de los microbios por fluorescencia, se añade al caldo nutritivo una sustancia cuya descomposición por los microbios o la unión a los microbios produce una fluorescencia medible o un cambio medible de la longitud de onda de fluorescencia.

12. Método según una de las reivindicaciones 1 a 11, en donde los microbios separados del caldo nutritivo en la etapa d) se limpian de proteínas extrañas mediante una solución acuosa de SDS (dodecilsulfato de sodio).

13. Método según una de las reivindicaciones 1 a 12, en donde para la adquisición del espectro de masas en la etapa e) las proteínas microbianas se ionizan mediante desorción por láser asistida por matriz (MALDI).

14. Método según una de las reivindicaciones 1 a 13, en donde una porción de los microbios que crecen en el caldo nutritivo se usa para probar su resistencia a los antibióticos.

15. Método según una de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la sangre se centrifuga y el plasma sanguíneo sobrenadante se retira antes de la etapa (a) y en donde, en la etapa (b), el depósito que comprende las partículas humanas y los microbios se añade al tensioactivo.

16. Método según la reivindicación 12, en donde, después de una nueva centrifugación y eliminación del líquido sobrenadante, los microbios se lavan con agua destilada y se centrifugan de nuevo.

17. Método para la identificación de microbios en sangre que comprende las etapas:

(a) Destruir partículas de sangre humana en la sangre con agua destilada,

(b) Separar los microbios de la sangre,

(c) Cultivar los microbios en un caldo nutritivo que no contenga compuestos antimicrobianos de la sangre, (d) Separar los microbios del caldo nutritivo,

(e) identificar los microbios mediante análisis de similitud de un espectro de masas de las proteínas microbianas y espectros de referencia.

18. Método según la reivindicación 17, en donde la sangre se centrifuga y el plasma sanguíneo sobrenadante se elimina antes de la etapa (a) y en donde, en la etapa (b), el depósito que comprende las partículas humanas y los microbios se añade al agua destilada.