CN103140589A - 无血培养的脓毒血症质谱诊断 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于快速检测和快速质谱鉴定血液(脓毒血症)或其它体液中感染性微生物的方法和装置。本发明认识到血液并不是微生物培养的一种良好环境，并提供一种方法，其(a)很大程度上(如可能在采样后立即)破坏和溶解体液中的人体细胞，例如血液中的红细胞和白细胞，同时必须保持微生物能够繁殖，然后(b)通过例如离心或过滤从液体中分离病原微生物，(c)在一种不含有任何体液抗微生物成分的培养基中进行培养，(d)从培养基中再次分离，并(e)分析微生物蛋白质质谱图与参比图谱的类似性来进行鉴定。溶解人体细胞还可释放出寄居于巨噬细胞中的微生物。与所有其它培养方法相比，在含有合适组分的光学透亮的培养基中培养不仅可加速微生物扩增，还可持续测量自低微生物密度开始的定量生长。首先，这实现了在最早的时间实施质谱鉴定；其次，其在鉴定之前提供了对微生物的阳性检测，这可挽救患者生命；第三，其可尽早开始确定耐药性。

Description

无血培养的脓毒血症质谱诊断

技术领域

本发明涉及一种用于快速检测和快速质谱鉴定血液(脓毒血症)或其它体液中感染性微生物的方法和装置。

早先的技术

微生物“鉴定”指的是采用分类体系进行分类：域(真核生物、原核生物和古细菌)、界(植物、动物、真菌)、门、纲、目、科、属、种和亚种。鉴定一份微生物样本指的是，至少确定到属，一般确定到种，如有可能的话，也可以确定到亚种，例如当不同亚种具有不同病原性时，这一点很重要。在更为普遍的意义上，鉴定也意味着确定微生物的其他更多的个体特性，如微生物对抗生素的抵抗性。

许多种属的微生物，特别是细菌、原生动物、微藻和未分化的真菌细胞，如酵母，均可采用质谱方法进行鉴定，确定度很高，可通过将通常方式下在营养培养基上生长的克隆中的少量微生物转移至质谱样品支撑盘上，通过样本制备崩解微生物。从这一样本中获得的质谱图尤其能够显示不同的可溶性蛋白质的质量和丰度；这些蛋白质以足够高的浓度存在于微生物中。通过与参比图库中的参比图谱进行类似度分析，基于该质谱图能够鉴定该微生物。

微生物鉴定对于感染性疾病而言尤为重要，特别是脓毒血症。在脓毒血症中，微生物从一个(通常隐蔽的)来源中持续或间断性地释放入体液中，大多数进入血液循环，以及椎管中。在脓毒血症的情形下，特别重要的是，能够快速检测并鉴定病原类型从而立即给予适当的治疗。目前情况值得警惕：在德国每年有超过60,000人死于脓毒血症；其已成为第三大常见死因。在美国，根据疾病预防控制中心(CDC)的估算，每年约有230,000人死于脓毒血症。近年来，脓毒血症病例数持续增长，每年增长约1.5％。死亡率超过40％。快速鉴定可增加生存率。

在当今全球使用的传统质谱鉴定方法中，首先要培养微生物长成菌落。通常皮氏培养皿中用于培养的营养培养基为琼脂，其可获得“单菌落”，培养时间以小时、天或周计算，这取决于微生物的活力。如果添加或混合菌落，则可通过第二次培养获得单菌落。用小棉棒将所选菌落转移到质谱仪样品支撑盘上，并用基质(通常为α-氰基-4-羟基肉桂酸[HCCA]或2，5-二羟基苯甲酸[DHB])的强酸溶液喷洒，以便借由基质辅助激光解吸(MALDI)将其电离，从而使得微生物崩解。酸(通常为甲酸或三氟乙酸)可以攻击细胞壁，并且基质溶液的有机溶剂(通常为乙腈)能够渗入微生物的细胞内并使变弱的细胞壁破裂。接下来通过蒸发溶剂干燥样品，同时会引起溶解的基质结晶。微生物中的可溶性蛋白以及细胞内的一些其它物质会在这一过程中掺入基质结晶中。

掺入分析物分子的基质结晶可在质谱仪中用聚焦紫外激光脉冲轰击，生成蒸汽等离子体形式的分析物分子的离子，而这些离子可在质谱仪中根据离子质量分离进行测量。基于这一目的，通常采用飞行时间质谱。该质谱记录这些分析物离子，其主要为蛋白质离子。对于鉴定具有最有价值信息的离子的质量约为3,000至15,000原子质量单位。在本方法中，蛋白离子绝大部分是单电荷(电荷数z＝1)，因此只需要提及离子的质量m，而不需总是使用“质量电荷比”m/z(而在使用其他类型的质谱仪时这是必须且约定俗成的)。

可溶性蛋白质离子图谱，例如质谱，非常能反映所关心的微生物种属的特性，这是因为每一种微生物可产生自身的基因决定的蛋白质混合物，每种蛋白质具有特定质量。较高浓度的可溶性蛋白质的丰度可通过质谱技术检测，同样很大程度上由基因决定，仅少部分取决于营养状况或菌落成熟度。蛋白质图谱可用于微生物种属的定性，正如人类的指纹鉴定一样。目前许多公共和私人研究所正在采集可靠的参比质谱图供参比图库使用，这样就可用于医学诊断目的。不过所有的诊断方法需要根据相应国家法律由官方机构批准。在经验证的仪器上的使用经验证的图库的质谱鉴定方法已在数个州市获批。

这一质谱鉴定法已被证明非常成功。其准确鉴定的可靠性远高于目前为止所用的微生物鉴定法。目前已证实，对于上百种不同种属的微生物，鉴定确定度可超过95％。存在疑虑的情况下，如果与目前微生物鉴定方法存在偏倚，则在大多数情况下基因测序可确证质谱鉴定是正确的。由于微生物种属间的关系也可通过质谱图的相似度进行鉴定，所以甚至可能在简单的质谱鉴定的帮助下校正分类体系中微生物种属的分类，最终需要通过更为复杂的DNA测序证实。

为鉴定微生物，质谱将测量约2,000原子量单位至20,000原子量单位，不过在低于约3,000原子量单位的较低质量范围内的质量信号的价值较小，这是因为其可以来源于外部吸附的包被多肽以及罕见和多变的其它物质，例如膳食依赖性脂肪酸。通过仅评估约3,000-15,000原子量范围内的质量信号可获得最佳的鉴定结果。目前基于这一目的使用的超敏感质谱仅具有低质量解析，这意味着仅相差一个原子量单位的同位素基团将无法在该质量范围内被解析。仅测量同位素基团的离子包。

这种鉴定微生物的方法需要纯微生物培养物，即所谓的“分离物”，以便取得没有与其他微生物类型信号重叠的质谱。不过目前已发现，也可评估两种微生物混合物的质谱图，这样可鉴定两种微生物种属(例如，参见DE 10 2009 007 266 A1，

M.Kostrzewa et al.)。鉴定可靠性仅受到轻微影响。如果该质谱图中超过2种微生物种属，或者这2个微生物种属的浓度相差很大，则会大大降低鉴定可能性和确定度。

尽管脓毒血症对生命产生很高风险，但是其在血液中仅有少量微生物；在脓毒血症的成人患者中，每毫升血液仅有0.5-10个微生物能够繁殖。在婴儿中，这一密度会高得多，因为婴儿的免疫系统尚未完全发育。在成人中，血液中的微生物可被多种机制打败：例如被抗体识别后经由巨噬细胞，以及经由内源性抗生素，例如防御素。当血液中的防御机制未能以比感染位点释放微生物的速度快许多的速度摧毁这些微生物，则会出现脓毒血症；这样会快速形成次级位点，例如在心脏瓣膜上，这通常需要立即手术。在一些清洁的体液中，例如脑脊液，一定体积内的微生物数量要比血液中高出许多，这样无需预先扩增、直接分离为质谱鉴定提供很好的机会。

如想获得成功的医学治疗，则体液中存在病原至病原鉴定的时间是至关重要的。文件WPO 2009/065580 A1(U.Weller 2007)描述了一种通过离心和质谱鉴定直接从体液中分离感染性物质的方法。例如，可从沉淀(团块)直接转移微生物至质谱样品支撑盘上。不过，这种直接分离微生物的分析方法仅在体液中存在高浓度微生物的情况下可行，例如就像在肾病患者或生殖器感染患者的尿液中。如果在体液中存在人体细胞，则必须在分离微生物之前将其裂解，例如通过渗透作用；不过目前已有其它裂解方法。

对于脓毒血症，一种名为“裂解离心”的方法已有30年的历史；在采样后立即加入皂甙(一种弱表面活性剂)的帮助下，该方法几乎可完全溶解血液颗粒，通过小心离心可分离得到微生物，在皮氏培养皿中用适当的培养基上进行培养(血液不会产生干扰影响)。数家公司已于十年前生产和销售添加皂苷及其它添加剂的适当制备管(″Isolator^TM″)以及相应工具，首家公司是DuPont(Wilmington，USA)，随后是Wampole Laboratories，Cranbury，NJ，USA，目前OxoidLimited，Basingstoke，Hampshire，England也具备。Isolator^TM是Carter-Wallace，Inc.的商标(公司位于美国纽约州的纽约市，邮编：10105)。

专利申请US 20100120085(J.Hyman et al.)要求保护一种通过质谱扫描对样品中微生物进行质谱表征和鉴定的方法，其中采用已知表面活性剂溶解的方法破坏非微生物细胞；然后通过离心分离得到微生物，并通过质谱进行鉴定。本文件还隶属于最接近的现有技术。

从体液中直接分离微生物进行质谱分析的方法仅在每毫升具有超过10⁴个微生物的高浓度情况下是成功的。实际上，其仅适合于尿液、重度感染组织、化脓性部位，或者有时为脑脊液或滑液。在其它体液中，例如血液或淋巴液，微生物的数量通常很少，甚至是重度脓毒血症。甚至在急性脓毒血症中，每毫升血液中仅不到10个微生物。这么少的数量不足以直接进行质谱鉴定，因此必须在此之前进行培养以扩增微生物。

数十年以来，使用在目前有大量市售的特殊血液培养瓶中的所谓的“血液培养”来培养血液中的微生物。这涉及向血液中添加适当的营养物质和抗凝剂，以及患者在血样采集前向患者施用的任何抗生素的抑制剂或吸附剂。不同厂商生产的血液培养瓶采用的抗生素吸附剂类型大不相同。例如，采用试验活性炭或开孔式塑料泡沫珠。不过，两者均会阻碍微生物生长。在通常实践中，同时试使用2种血液培养瓶，其中一个供好氧微生物使用，另一个供厌氧微生物使用。现代血液培养瓶都带有信号系统，如在适当装配的孵育器中使用，当生长的微生物数量足够用于微生物鉴定，则会自动发出信号。该信号是基于对CO₂含量或压力增加的测定，不过触发信号时，血液中微生物的密度已经很高了。通常质谱鉴定会早于信号触发数小时或数天，因此对于快速质谱鉴定至少需要更为灵敏的触发机制。

一旦在血液培养基中生长了足够数量的微生物，则必须通过离心或过滤分离微生物用于质谱鉴定。必须去除所有痕量人体蛋白质以及来自营养培养基的痕量蛋白质以免干扰质谱鉴定。

例如，溶解所有人体细胞后通过离心分离得到足够数量的微生物时，可添加数微升的强酸(甲酸或三氟乙酸)以及大约等量的乙腈裂解微生物；然后可以将含有释放出的蛋白质的溶液转移至样品支撑盘上。如果离心后看不到沉淀的话，在可能分离微生物解离。沉淀物的能见度极限约为10⁶个微生物；相比之下，检测限约为10⁴个微生物，但是未来仍有提高的可能。10⁴个微生物一般含有100飞克以上的可溶性蛋白质，但开发出的最佳方法的质谱检测限远低于此。

因为在绝大多数情况下(超过70％)，仅由单一种的微生物造成急性微生物感染，所以可成功通过质谱鉴定体液中的微生物。仅在少数情况下(约15％)涉及2种微生物种，则其均可在质谱中检测到。急性感染病原体的纯度与其他人体内或人体表面出现的微生物形成鲜明对比。如人体肠道菌丛大约有10¹⁴个细菌，至少由400个细菌种组成，这些细菌互相均衡地生活。通常血液和其它体液是无菌的，例如在正常状态下，不包含任何微生物。体液中的微生物通常同时被数种防御机制立即攻击、杀死和清除。

发明目的

本发明旨在提供一些可检测和鉴定血液中(脓毒血症)或其它体液中的感染性微生物的方法和装置，其检测和鉴定速度比目前的方法和装置快数小时或数天。

发明摘要

上述血液培养基并不是微生物的理想培养基；数种微生物很难在血液培养基中生长。血液基本不适合微生物生长：除了吞噬微生物的巨噬细胞外，其还包含抗菌物质，例如防御素和抗菌酶。此外，脓毒血症患者的血液通常还包含广谱抗生素，在采集血样进行诊断前该患者已服用抗生素作为最初的治疗。

本发明认识到这一情况，并提供一种方法，其(a)很大程度上(如可能在采样后立即)破坏和溶解体液中的人体细胞，例如血液中的红细胞和白细胞，同时必须保持微生物能够繁殖，然后(b)通过例如离心或过滤从液体中分离病原微生物，(c)在一种不含有任何体液抗微生物成分的营养肉汤中培养微生物，(d)从营养肉汤中再次分离，并(e)通过分析微生物蛋白质质谱图与参比图谱的类似性来进行鉴定微生物。

质谱鉴定微生物的基本方法还可以在步骤(c)中包括用于监测培养过程中微生物生长情况的定量方法，特别是光学方法。这些方法可早期监测微生物的存在，同时对微生物进行粗略分类。仅在使用光学透明的营养肉汤的情况下方可进行光学监测，有时一些特殊配方可辅助测量程序。例如，可以进行光谱测量，例如在不同电磁谱区进行光散射分析、消光测量、荧光测量。而且，可以应用声学或电测监测方法。优选在仅含有很少量营养肉汤的微培养瓶中进行培养以增加微生物密度，从而提高附带的监测方法的灵敏度。这些生长监测的早期中间结果对于患者来说是救命的，不过如果检测不到生长的微生物，也可以停止该方法。特别的，附带方法可确定进行质谱鉴定的最早时间点。鉴定本身费时很短，这样可在早期阶段开始靶向治疗。

本发明的一个重要方面是将巨噬细胞中的细菌种属释放出来，例如分枝杆菌或李斯特氏菌。

经步骤(b)分离得到微生物后，也可以加入检测方法，例如nano-NMR或微拉曼广谱法(micro-Raman)，以检测是否存在任何微生物。目前现代光谱学或电磁方法的发展大大提高了灵敏度，甚至可检测到仅存在数个微生物的存在。

这种方法为质谱鉴定提供了足够的充分纯化的病原体，并比任何已知方法更为快速。当治疗患者的医生知道微生物种属时，其可立即开始针对性治疗，因为目前已知大多数微生物应答的抗生素。通常已知该微生物种属的耐药情况，这在地区之间或医院之间可能会不同。不过也可以使用培养的部分微生物来确定其对抗生素的耐药性。对于因脓毒血症、重度脓毒血症或感染性休克进入重症监护室进行治疗的患者，尽早开始针对性的和有希望的治疗不仅可以比现在更能拯救患者生命，同时早期康复也会大大降低治疗费用，因为患者在重症监护室的住院时间缩短。

附图简介

图1示出了根据本发明方法所用的一种培养瓶，其是离心管(1)的形式，其管帽(2)具有一个隔片(3)和一个分压测量系统(4)。预真空培养瓶(1)具有一个书写平板(5)，上面有一个额外的条码(6)、一个内部涂层(7)，后者可随着CO₂增多而改变颜色以及一种可溶解人体颗粒的溶液(8)。

图2阐释了一个带有入口毛细管(11)和(13)的微培养瓶(12)，其用隔片(10)和(14)封闭。微培养瓶的体积仅约为100μl，其经过预真空化，可直接使用，这样可以很容易地用注射器将营养肉汤中的微生物穿过其中一个隔片。微生物在微培养容积(12)内生长，可通过外部测量装置(17)或(19)进行监测。例如，也可以在检测器中(17)测量从外部激光二极管(15)的光束消光(16)，如果已生长了足够数量的微生物则可发出信号。也可以在检测器中(19)监测光束(16)的散射光(18)。如果光束(16)可激发出与微生物成正比的荧光物质，则可用检测器(19)监测荧光(18)。消光、散射光或荧光曲线可提供微生物存在的早期信息。类似地也可使用其它类型的光度计。完成培养后，一旦离心分离微生物后，可使用螺帽(20)打开微培养瓶。将营养肉汤移除后，微生物可在微培养瓶中裂解，提取液可与溶解的微生物蛋白一同被取出。

图3示一个带有隔片(31)的非常简单的微培养瓶(30)，其可填充约100-200μl营养肉汤(32)，在监测范围内包含一个长光源(34)和一个消光检测器(35)。本图底部横断面图示消光检测器(35)或散射光检测器(36)的布局，散射光在最高密度处向前弯曲，或荧光检测器(37)，其以约等密度向各个方向辐射。小瓶很适合于培养后离心、洗涤以及将沉淀微生物在酸性基质溶液中崩解。

图4示根据本发明的基本程序步骤图。

图5示一个带有插入步骤的优选程序的更为详细的示意图。

优选实施例

如图4所示，本发明提供一种方法，其包含以下基本步骤：

a)溶解体液中的人体细胞，优选采用弱表面活性剂；

b)从体液中分离微生物，例如通过离心或过滤；

c)在营养肉汤中培养微生物，其中营养肉汤中不含有体液中抗微生物的成分；

d)从培养基中分离微生物，例如通过离心或过滤；

e)通过对微生物蛋白质谱与参比谱图的类似性分析来鉴定微生物。

图5更为详细地显示了本方法的优选实施例，其包含插入步骤b1)，b2)，c1)，c2)和d1)。在同一实施例中并不需要进行所有其它步骤。

术语“体液”广义上指的是可被微生物感染的机体内所有内部或分泌的液体。除了血液外，其还包含淋巴液、滑液、脑脊液、尿液、泪液、组织匀浆液以及来自化脓性脓肿或发炎的鼻粘膜的液体。在其中一些液体中，微生物浓度很高，在干净分离微生物后，甚至无需进一步培养，即可成功进行即时鉴定。本发明不关注这些液体；在这些液体中的微生物可采用上述WPO 2009/065580 A1(U.Weller 2007)中的一种方法进行直接分离和鉴定。但是，在大多数体液中，微生物的含量很低，必须在鉴定前对微生物进行培养以高度扩增。这也就是本发明的目的所在。

下面详述的方法采用血液作为体液；不过，也可使用其它体液，但是必须相应地添加一定量的表面活性剂和其它物质。这里的描述将离心作为将微生物从液体中分离的方法，但并不排除过滤或其它分离方法，例如磁珠吸附。

基本上，在步骤(a)中在离心前用蒸馏水就可以破坏血球，这会导致大多数血球因为渗透作用而破裂。重复离心和加入蒸馏水可几乎破坏所有血球。与微生物一同离心分离出来残余的细胞膜碎片几乎不干扰后续的培养基培养。

不过，优选的方法在步骤(a)中采用弱表面活性剂以崩解和溶解血液颗粒。尤为重要的是，使用精确称量的无毒弱表面活性剂进行血球溶解，这样甚至敏感的微生物也完全能保留繁殖能力。例如，优选经过稀释的、无毒皂苷溶液。血球精细的细胞膜主要由磷脂组成，其以非共价键结合形成细胞膜。表面活性剂可溶解蛋白质和脂质的非共价键。细胞膜的磷脂本身是两性的，即它们具有表面活性剂的特点，可通过形成微球而被其它表面活性剂溶解为纳米胶质，这样添加的表面活性剂可键合至其很难再破坏微生物的程度，。

本发明的另一个重要方面是通过溶解血球，从巨噬细胞或其它人体血细胞中释放寄居的细菌，例如分支杆菌或李斯特氏菌。

在采集血样后优选立即溶解血球，并从血液中分离微生物，这是因为将敏感的微生物长时间留在血液中，则其可能会丧失增殖能力。对于敏感微生物，在血液中活微生物的生存半衰期仅为数小时，而健壮的微生物甚至可在血液中繁殖。但是即使在皂苷溶解的血液中，敏感微生物的半衰期也不会太长；因此推荐在溶解血球后最迟2小时内通过离心或过滤将微生物从液体中分离出来。

使用蒸馏水裂解或用精确量的表面活性剂溶解，在这两种情况下，液体中的残渣量会不同，例如未完全溶解的细胞壁和血球的其它不可溶性成分，但是不会显著影响本方法的残渣。这些成分可通过稍后步骤(d)中洗涤分离得到的微生物中去除，该步骤有一个特别的洗涤步骤(d1)，用强表面活性剂溶解所有非微生物蛋白。在步骤(a)中，很重要的一点是，破坏血球要保证将所有隐藏在细胞中的微生物释放出来。在步骤(b)中从液体分离微生物后，去除所有可溶性人体蛋白，包括来自血球的可溶性蛋白，以及对微生物繁殖有害的所有内源性抗体，例如防御素和抗微生物酶。防御素在中性粒细胞中组成高达30％的颗粒物质，在白细胞中组成高达60％。如需要，插入洗涤步骤(b1)。

同时特别重要的一点是，去除所有已作为脓毒血症患者治疗的一部分的广谱抗生素，这要在步骤(b)和(b1)中自动进行。市售的血液培养瓶包含不同类型的颗粒物质，可使这项抗生素无害，包括活性炭以及硬质开孔塑料泡沫珠。制造商对这些添加剂多有争论，不过它们均会有损于血液培养基中的微生物生长，这部分因为其可牢固吸附微生物，也可能是因为当血液培养瓶在孵箱中来回移动实际上会碾压微生物。

之前提到可清洁在步骤(c)中充分培养后沉淀的微生物的中间洗涤步骤(d1)，其可去除不属于微生物的所有痕量残留的外源蛋白，即所有人体蛋白以及所有来自于培养基并可吸附质微生物的蛋白。甚至活微生物从血球未溶解的细胞壁上产生的可溶性蛋白。如果在质谱中来自外源蛋白的信号叠加在微生物蛋白的信号上，则鉴定会变得困难得多。步骤(d1)中的清洁可采用强表面活性剂完成，例如SDS(十二烷基硫酸钠)，因为对于质谱鉴定而言，微生物不需要保持其繁殖能力。

最后，必须裂解微生物，释放出可溶性蛋白，从而获取微生物蛋白的质谱图用于步骤(e)中的质谱鉴定。正如简介中所述，优选当微生物仍在离心管中的时候，加入数微升的强有机酸，例如甲酸或三氟乙酸，以及数微升的乙腈进行微生物裂解；不过目前通常在将微生物铺在质谱样品支撑盘上后也可裂解微生物。使用传统方法获取微生物蛋白的质谱图，并在步骤(e)中通过与参比图谱进行类似性分析完成鉴定。

如果采用离心，则可在同一离心管中进行步骤(a)至(d)以及裂解微生物以获得微生物蛋白溶液供质谱采集。例如，这里使用的是一个1.5ml标准离心管。不过，为了足够确定地检测每毫升仅有0.5个活菌的脓毒血症，使用特殊的培养皿(约15ml)则更有优势，其可使用8-10ml血液。目前其体积与所用的血液培养瓶体积类似，不过其可进行离心，而血液培养瓶则不行。例如，分析婴儿的血液时可使用1.5ml标准离心管，因为在这种情况下仅可获得少量血液，而在脓毒血症情况下婴儿血液中的微生物含量通常较高。此处所述方法适用于较大的离心管。

当使用一个预制的即用型15ml离心管时，可加入约8ml血液。优选用隔片密封离心管并进行预真空化；其经过预制，含有2-4ml无菌溶液，其中包含约240μg无毒皂苷、少量泡沫抑制剂和至少一种抗凝剂。血液培养物处理方法中得知无菌灌入血液的精准原则。小心颠倒离心管5次，立即混合其中的液体，30秒后在3000g下离心10分钟，然后微生物形成一个松散的沉淀块。用无菌注射器小心去除上清；插入一个带有微滤器的无菌毛细管针，这样无菌空气可流入。现在再用无菌注射器向微生物中添加10ml培养基。振荡培养基使微生物分散开；将离心管在特定温度下服用特定时间。孵育过程中轻微振荡，效果更佳，这样可防止微生物沉淀。

市售的血液培养瓶通常带有信号装置，其可安装在孵箱上，当微生物生长至足够数量时可提示。有时这些信号装置是基于孵箱壁涂层颜色随CO₂含量改变而改变，有时是基于对CO₂增加的不同类型的测量或仅基于气压增加。测量CO₂含量时，一般必须使用2个血液培养瓶：一个供好氧微生物，一个供厌氧微生物。

虽然由于灵敏度较低，这些信号装置距离理想的质谱鉴定仍有距离，但其还可应用于根据本发明方法的培养皿中。由于血球并不释放CO₂，所以效果会更好。图1示一种培养皿，其包含一个离心管(1)，管帽(2)具有一个隔片(3)和一个微分压测量系统(4)。培养皿(1)具有一个带有额外条码(6)的书写平板(5)；其经预真空化，可供填充。作为分压测量系统(4)的替代方法，离心管可具有一个内部涂层(7)，后者可变换颜色来提示CO₂增加。离心管含有精确称量的一种溶液(8)，其可溶解人体细胞，例如该溶液的组成包含溶解在无菌水中的皂苷、抗凝剂和泡沫抑制剂。如上所述，带有微滤器的无菌注射器和针头用于填充离心管和更换液体。必须小心避免从环境中带入任何污染微生物直至完成孵育。可使用2种装有不同类型培养基的相同培养皿类培养好氧和厌氧微生物。

在足够长时间的孵育(步骤c)后，再次通过离心(步骤d)分离微生物，如果培养皿可以离心的话，则10,000g下3分钟就足够了。弃上清，用溶于水的0.5％SDS溶液振摇微生物，却出所有残留的人体或培养基蛋白(步骤d1)。再次离心和弃上清后，用蒸馏水洗涤微生物并再次离心。重要的一点是，必须去除所有痕量SDS，因为SDS(和其它强表面活性剂)会大大降低质谱仪离子源中蛋白的电离。

采用传统方法裂解微生物以释放可溶性蛋白、采集质谱图并对质谱图进行微生物鉴定(步骤e)，在此不再详述。

除了在步骤(b)和(d)中通过离心分离微生物外，还可通过微过滤分离和洗涤。通常使用离心进行微过滤。由于添加表面活性剂可完全溶解血细胞的细胞膜及其内部结构，微过滤也可获得微生物的纯分离物。

经验显示约15％的血液培养物表现为阳性结果。由于尽早检测出疑似脓毒血症中是否存在脓毒血症对于一名患者的生存极为有利，可在步骤(b)中首次分离微生物后插入质谱检测沉淀的微生物，例如nano-NMR或微拉曼广谱。目前正在研发用于检测离心沉淀中是否存在单个微生物的超敏微谱和电磁方法。尽早确定是否存在微生物不仅可节省后续方法费用，同时对于主治医生而言也非常重要，医生可据此尽早调整治疗。尽管目前这些检测尚未成功，但在今后可能会非常重要。

更令人期待的是本方法步骤(c1)中监测微生物扩增生长的方法，步骤(c)中培养期间，对测量微生物密度具有非常高的灵敏度。在步骤(c1)中，可通过检测微生物密度的增加来在早期确定是否存在能够繁殖的微生物，而且更重要的是，步骤(c1)中的监测还可确定能够开始质谱鉴定的最早时间。然后可停止培养(步骤c2)。本监测仅在本发明中可以实现：将血液培养基替换为清澈的具有设定光学特性的培养基。术语“清澈”不意味着在全广谱范围内完全透明；指的是足以应用某种光度计而不产生干扰。在这样一种自定义组分的培养基中，可使用电磁广谱范围内的各种光谱法，例如红外光谱法、拉曼光谱法、散射光和吸收光谱法及其它。例如，荧光光谱法具有很好的检测灵敏度。其可通过向培养基中添加物质来激发或辅助，微生物的代谢可产生荧光分解产物，或者其吸附在微生物细胞壁上产生可测量的荧光。荧光物质吸附在细胞壁上改变其荧光波长。由于微生物还通常生长在培养皿壁上，还可采用表面测量方法，例如等离子体共振光谱法(PRS)或表面增强拉曼光谱法(SERS)。也可以采用不同类型的声学和震动谱。而且，可采用的电子监测方法：例如测量合适形状容器中电介质常数。通常不同的测量方法可不仅追踪生长，还可粗略对微生物进行分类。甚至生长速度也可提示最初的分类，该分类可能是医学相关的。

当使用这些测量方法监测微生物生长时，如果在步骤(b)中分离的微生物在容积比血液少许多的培养基中生长时，其优势更为突出。在良好的培养基中，微生物会呈现指数生长至高达每毫升10⁷-10⁸个微生物的密度，而质朴鉴定仅需约10⁴个微生物。因此进行低于1ml的微量培养：例如100μl培养基就足够供用于质谱鉴定的微生物生长。例如，最初在原始离心管中的100μl培养基中短暂培养1-2个小时后，可以将步骤(b2)中的微生物转移至一个特殊形状的体积仅为100-200μl的微培养室中。在该少量培养基中，接种密度以及后续微生物密度约比在等量血液中培养的100倍。图2和3示此种微培养室。这种微培养室尤其适合不同类型的光谱法，因为微生物密度要高100倍。

微生物以每小时仅繁殖1代的中等繁殖速度，从单个微生物培养12小时可获得所需10⁴个微生物。侵袭性微生物繁殖速度更快，例如大肠杆菌。

图2中所示的微培养室(12)可简单地用一种消光测量装置(17)扫描：当光束

(16)穿过培养室时，这种装置可监测因光散射或吸收导致的延迟。无需将光源(15)和消光测量单元(17)与微培养室连接，其可安装在孵育室中，这样可循环扫描数个微培养室。不仅可测量消光；一种类似的测量装置(19)还可测量当用光束(16)照射生长中的微生物时所产生的散射光(18)或荧光(18)。无需将光源(15)和消光测量单元(17)与微培养室连接，其可安装在孵育室中，这样可循环扫描数个微培养室。不仅可测量消光；一种类似的测量装置(19)还可测量当用光束(16)照射生长中的微生物时所产生的散射光(18)或荧光(18)。

在如图4所示的更为简单的微培养室(12)中，可非常简单地通过横跨培养管的长二极管系统(34)的光线和使用消光测量装置检测(34)微生物的生长。检测器(35)和(36)能很容易地检测散射光(正向光密度最高)或荧光(各方向光密度相同)。

如果微培养室具有有利形状，则当已生长了质谱鉴定所需的约10⁴个微生物时，这些监测装置可以给出准确提示。与目前血液培养通常使用的信号装置相比，这样可节省数小时至数天的时间，这通常对患者生存是至关重要的。如上所述，这类测量系统还可在早期可靠提示是否存在微生物，甚至进行粗略分类，这也对于患者早期治疗至关重要。本发明的基本条件——在特殊培养基中培养微生物——方可实现在微培养室中的培养。

与图2和3所示类似的微培养室适合于上述许多类型的光谱法，虽然培养室壁窗的形状和材料需要适合光谱法类型。例如，如图3所示，其形状也可以直接适合于通过离心从液体中分离微生物，以及适合于最终崩解微生物。也可以在硅片上使用微培养室和电路来测量硅片上微生物生长情况(“芯片实验”)。

使用特别灵敏的光谱法进行监测时，例如上述的使用特殊物质的荧光光谱法，可更早地监测都微生物的生长。在这种情况下，仅分析能够生长的微生物，例如确实有害的微生物；这与步骤(b)后分析沉淀物不同，其也可测量死亡或无法繁殖的微生物。我们一直强调，尽早检测真正的脓毒血症对患者康复，甚至是生存具有重大意义。

本发明基于在特别有利的培养基中培养基微生物，而不是抗微生物的体液中。正如所释，正是特殊的培养基实现了对微生物生长情况的同时测量。不过，首先必须将微生物从体液中干净地分离出来。所采用的方法与30多年前开发的一种方法类似，其适用于Isolator^TM管，可将微生物从血液中干净地分离出来，该方法已经过无数次的尝试和建议。其涉及采用一种精确称量的不含破坏微生物或使之无法繁殖的弱表面活性剂快速溶解不同类型的血球。已证明一种纯化的无毒皂苷是很好的弱表面活性剂，不过还可使用许多其它类型的表面活性剂。血球精细的细胞膜主要由磷脂组成，其以非共价键结合形成细胞膜。表面活性剂可溶解蛋白质和脂质的非共价键，同时通过离子吸附破坏细胞内大分子蛋白质的四级和三级结构。细胞膜的磷脂是亲水性的，也就是具有表面活性剂的特性，能够形成胶束而以纳米胶体的形式被其它表面活性剂溶解。这样，大部分细胞膜溶解，但是其可大多可与添加至血液中的表面活性剂结合，这样就不会再破坏微生物。血球的大部分内部结构也被表面活性剂破坏和溶解，包括细胞核的核膜以及白血球的DNA。离心之后，随着去除上清液这些溶解成分也会被去除。巨噬细胞也会被溶解，从而释放出寄居的任何微生物。

另一方面，细菌的细胞壁非常稳定；它们主要是由交联的聚合胞壁质组成。对于革兰氏阳性菌，还有与聚合的磷壁酸的交叉链接。这些共价键网面能够短暂承受表面活性剂的溶解作用至少数分钟。表面活性剂还可渗入微生物中，破坏蛋白质折叠结构，这会破坏其繁殖能力；因此很重要的一点是，在步骤(a)中首次溶解人体细胞时使用精密称量的弱表面活性剂，优选无毒皂苷，并仅让表面活性剂作用一小段时间。

敏感微生物在皂苷血液溶液中的生存半衰期仅为数小时。因此必须尽快从液体中分离出微生物。推荐微生物在液体中保留不超过2小时。因此必须通过信使或特殊传送系统将装有血液的培养皿快速送至实验室，在那里实施后续方法。不过也可以用含有抗凝剂的正常血液容器将血液送至实验室，延迟时间最短是最重要的。

对于孵育生长的微生物进行质谱鉴定而言，微生物是死是活并不重要，只要其内部的蛋白未释放出来或其原始结构未改变。因此可以在步骤(d1)中使用更强的表面活性剂，例如SDS(十二烷基硫酸钠)来清洁微生物以除去所有残留的外源蛋白。不过必须再次彻底清洗强表面活性剂，因为即使是痕量残留，也会阻碍蛋白电离，从而阻碍获取质谱图。

在根据本发明方法的另一实施例中，首先将离心管中的血液离心。然后去除上清血浆，用弱表面活性剂溶液振摇深红色的沉淀：例如1％皂苷溶液。1毫升血液中的深红色沉淀物不但含有微生物，通常还含有5百万个红血球、7千个白血球，还有5万个血小板，将其放入烧瓶与添加的表面活性剂一起混合，从而破坏血球的细胞膜并释放出可溶性蛋白质。再度离心该深红色溶液，这时上清液依然为深红色，而沉淀物若肉眼可见则是纯白色。现在可加入培养基至沉淀中，并进行孵育。

在本实施例的修改方案中，还可以仅用蒸馏水振摇深红色的血球沉淀物。其本身可破坏大多数的血球。重复离心和用蒸馏水重悬沉淀可获得足够纯净的微生物用于在培养基中培养。

在进行步骤(e)中的质谱采集前，裂解微生物并提取可溶性微生物蛋白。最后，将数微升70％甲酸加入至沉淀的微生物中。甲酸可攻击微生物细胞壁上的肽聚糖，破坏细胞结构。接着为了尽量溶解更多蛋白质而添加等量的乙腈。再次离心溶液从而使固体组分沉淀，例如微生物细胞壁残留物。

现在必须从上清中溶解的微生物蛋白中获取质谱图。可在数种质谱仪中使用已知的数种电离方法完成，不过目前仅使用特殊的MALDI飞行时间质谱仪。

对于在MALDI飞行时间质谱仪中传统采集质谱，目前每测量一个MALDI样品点要加入约1.5μl上清，并进行干燥。然后加入约1.5μl基质物质溶液，优选溶于50％丙酮水溶液的HCCA，并加入一些(约3％)三氟乙酸(TFA)。基于这一目的，例如，使用的样品支撑盘在疏水环境中亲水锚直径为2毫米。不过也可以使用一次性样品支撑盘，上面可以刻圈以防止溶液扩散。液体形成一个半球形的液滴，直径为2毫米。样品支撑盘上的样品制剂干燥后，就可以开始取得质谱了。

可以用很多种方式修改测量样品的最简单预制方法。其中一个选项是利用已经涂好一层基质溶液薄膜的样品支撑盘：例如，HCCA。可以把含有甲酸和乙腈的上清液用移液管直接移到该薄层。该薄膜具有立即结合表面所有蛋白的性能，这样约1分钟后可去除残留液体。这也可以去除杂质。接下来可以选择性地添加一滴丙酮，通过重结晶把蛋白质牢牢地嵌入薄膜的小结晶体内。

完成培养后，制备用于在MALDI飞行质谱仪中获取质谱图的测量样品共费时约

10-15分钟。现在通过真空锁将带有制备好的样品的样品支撑盘放入市售质谱仪的离子源中。质谱仪运转约5分钟。在紫外线脉冲激光以200赫兹运转的质谱仪中，只需要几秒即可从测量的样品获得足够数量的个别质谱，从而得到非常有用的总质谱。因此，数分钟后就可以获得质谱。

目前有市售的计算机软件可通过质谱鉴定微生物。从良好的质谱鉴定微生物所需要的时间视计算机的性能、参考质谱库的大小、类似性分析的运算法则而定。使用市售的质谱仪电脑，从样品中鉴定质谱图，包括确认样品，仅费时数分钟；因此在完成微生物培养后，最晚在半小时内鉴定出微生物种属。

在另一实施例中，如果在最后的洗涤步骤后可看到沉淀物，则可用棉棒将分离得到的少量微生物转移至样品支撑盘上，并按平常制备方法操作。传统棉棒技术的质谱在很大程度上与离心管内加入酸的分解技术的质谱类似。如果证实质谱有差异，该两种样品预制方式的质谱可以输入到质谱库作为参考质谱使用。

本方法主要提供一种比现行方法快得多的微生物病原鉴定方法，其主要在血液培养皿以及皮氏培养皿中培养微生物。本发明在对微生物生长有利的培养基中培养微生物，而不是在抗微生物的血液中培养，并分离、洗涤和立即通过质谱方法鉴定。培养基可允许使用一种灵敏的微生物生长监测方法，这样当已生长了质谱鉴定所需的10⁴个微生物后即可停止培养。可采用质谱方法进行鉴定，而无需对该微生物有任何了解，这样可直接鉴定至微生物所属的种或亚种。目前没有任何其它鉴定方法如此快速可靠。

鉴定分离出的微生物的最后步骤(e)可按照传统方法，或者通常通过培养菌落而分离单一类型的微生物。这种隔离自然存在，因为对于急性感染只有一种或最多只有两种微生物是病原体。这意味着获得了足够纯的微生物培养物(分离物)。即使有两种微生物存在，这方法也仍然非常有效。

正如之前所强调的，快速鉴定脓毒血症中的微生物是极为重要的。如果该种属经常出现，则通常已了解其耐药情况，因此不着急确定耐药性。对于较少出现的微生物，以及经常出现但耐药情况差异很大的微生物种属，了解其对不同抗生素的耐药性以及，最重要的，了解其耐药强度是很必要的。在这种情况下，尝试在存在高浓度抗生素条件下培养的方法，在步骤(d)中少部分微生物沉淀物可用于鉴定该微生物的耐药情况。如果早期怀疑的微生物不太常见，则在多个微培养瓶中培养前先在培养基中进行培养。在其中一个培养瓶中，可培养微生物用于质谱鉴定，在其它培养瓶中，可培养微生物进行多种抗生素耐药性分析。

在本发明的方法中，首先从内源细胞中分离微生物，这同样适用于脓肿或其它炎症部位，因为它们同样包含内源性细胞。该方法的一个例子是化脓性病灶，也就是一些生物的积累物，其中有被部分消化的微生物以及消灭微生物的特定类型的白血球。这里同样地，内源性细胞可用表面活性剂溶液溶解。另一个例子是利用棉棒采集鼻粘膜，鉴定其中的微生物(特别是MRSA)是很多人感兴趣的。也可以从其它粘膜采集此类样品。虽然在大多数情况下，直接分离可提供用于鉴定的足够微生物，如需要同样可以在合适的培养基中进行培养。

在上述方法中，利用飞行时间质谱仪以基质辅助激光解吸(MALDI)电离获得微生物的质谱。一般是这样，但不是必须的。例如，也可以用静电喷雾电解来自微生物的可溶性蛋白质溶液。这种类型的电离产生质量范围大约为600到1,600道尔顿的重叠程度很高的多电荷离子，需要高分辨率的质谱仪。大气压下化学电离法(APCI)更具优势，其主要提供分析物的单电荷离子。正交发射离子的飞行时间质谱仪(OTOF-MS)可以作质谱仪使用，也可以使用离子回旋共振质谱仪(ICR-MS)或其他高分辨率的质谱仪。

也可生产和市售上述根据本发明方法的不同培养皿。例如，其也可一同放入市售试剂盒中：用于吸液的无菌一次性注射器；例如，注射器形式提供的即用型培养基；供无菌通气的带有微滤器的穿刺针；一次性样品支撑盘和基质物质。

了解本发明之后，技能熟练的人可以用各种各样的方式修改上述的方法。上面已描述了基于培养基中培养基的一些修改方案，但肯定还有方法，不仅可对微生物进行早期质谱鉴定，还可以早期生成微生物的其它信息。

Claims (18)

1.一种鉴定体液中微生物的方法，包含以下步骤：

a)溶解体液中的人体细胞；

b)从体液中分离微生物；

c)在培养基中培养微生物；

d)从培养基中分离微生物；

e)通过对微生物蛋白质谱与参比谱图的类似性分析来鉴定微生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中体液为血液。

3.根据权利要求1所述的方法，其中体液为淋巴液、滑液、脑脊液或匀浆组织。

4.根据权利要求1-3之一所述的方法，其中在步骤a)中采用一种表面活性剂溶解人体细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其中溶解人体细胞的方法包含一种皂苷溶液，其中添加有泡沫抑制剂。

6.根据权利要求1-5之一所述的方法，其中在步骤b)后研究是否分离微生物，仅当已检测到微生物时方可进行步骤c)。

7.根据权利要求1-6之一所述的方法，其中在步骤c)中微生物培养仅在不到1ml的培养基中进行。

8.根据权利要求1-7之一所述的方法，其中在步骤c)中微生物培养过程中监测微生物定量生长。

9.根据权利要求8所述的方法，其中仅当监测提示具有足够用于质谱鉴定数量的微生物时，方进行步骤c)中的微生物培养。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中监测微生物定量生长的方法包含测量消光、散射光或荧光的方法。

11.根据权利要求10所述的方法，其中监测培养皿中微生物定量生长的方法包含测量荧光的方法，其中培养基包含一种物质，其被微生物降解或吸附至微生物上可产生一种可测量的荧光或荧光波长发生可测量的改变。

12.根据权利要求1-11之一所述的方法，其中采用SDS(十二烷基硫酸钠)步骤d)中从培养基中分离得到的微生物上的外源蛋白。

13.根据权利要求1-12之一所述的方法，其中对于步骤e)中的质谱采集，通过基质辅助激光解吸(MALDI)方法电离微生物蛋白。

14.根据权利要求1-13之一所述的方法，其中一部分在培养基中生长的微生物用于测试其对抗生素的耐药性。

15.用于实施根据权利要求1-15之一所述的方法的培养皿，适合通过离心分离微生物。

16.根据权利要求15所述的一种装置，其允许通过外部测量装置监测培养期间微生物的生长情况。

17.步骤a)中根据权利要求13或16所述的培养皿经预真空化，可灌入体液，并含有一种表面活性剂、泡沫抑制剂和溶解人体颗粒的抗凝剂的溶液。

18.试剂盒包装，包含根据权利要求15-17之一所述的即用型培养皿和即用型培养基。

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