DE60116882T2

DE60116882T2 - Fourier-transformation-massenspektrometrie von komplizierten biologischen proben

Info

Publication number: DE60116882T2
Application number: DE60116882T
Authority: DE
Inventors: H. Jean-Louis Brighton DASSEUX; S. Roger Ann Arbor NEWTON; J. Thomas Pinckney REA; L. Charles Ann Arbor BISGAIER; E. Micael Ann Arbor PAPE
Original assignee: Esperion Therapeutics Inc
Current assignee: Esperion Therapeutics Inc
Priority date: 2000-07-10
Filing date: 2001-07-10
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2021-07-11
Also published as: DE60116882D1; ATE316656T1; US6974702B2; CA2415940A1; WO2002004957A3; US6680203B2; HK1051068A1; US20020019023A1; AU2001280517A1; ES2259668T3; US20050118650A1; WO2002004957A2; EP1299730A2; JP2004503749A; EP1299730B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Hochinformationsgehalts(„high information content", HIC)-Analyse bzw. -durchmusterung von komplexen biologischen Systemen unter Verwendung von Fourier-Transformations-Massenspektrometrie (FTMS). Die vorliegenden Verfahren sind nützlich zur Analyse komplexer biologischer Gemische, die sowohl Moleküle mit hohem Molekulargewicht (z.B. Polynukleotide, Proteine, Polysaccharide), als auch Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht (z.B. Oligonukleotide, Peptide, Lipide, Oligosaccharide, Steroidhormone, katabolische und metabolische Zwischenprodukte) enthalten, um die Bestimmung molekularer Unterschiede bzw. Differenzen zwischen komplexen biologischen Proben zu ermöglichen, und um die Identifizierung biologisch aktiver Moleküle (z.B. therapeutisch aktiver Arzneimittel, etc.) zu ermöglichen.
Hintergrund der Erfindung
Massenspektrometrie ist eine analytische Technik, die die Masse eines Atoms oder Moleküls misst (hierauf wird als atomare bzw. molekulare Masse Bezug genommen). Da die molekulare Masse die stöchiometrische Summe der Atommassen für jedes Element im Molekül ist, wird eine charakteristische Messung für jeden Analysten bereitgestellt, der eine unterschiedliche empirische Formel aufweist.
Das Instrument, das verwendet wird, um eine molekulare Masse zu messen, ist als Massenspektrometer bekannt. Typischerweise wird Massenspektrometrie durchgeführt, indem ein Analyt (in einer Gasphase) verdampft wird, ein Analyt dann ionisiert wird und Signale detektiert werden. Bei den meisten Typen von Massen spektrometern besteht der Detektor aus einer Art Elektronenvervielfacher. Ionen, die auf solch einen Detektor aufprallen, erzeugen Sekundärelektronen, die als irgendein messbarer Strom registriert werden. In dieser Hinsicht ist das FTMS-Instrument dahingehend einzigartig anders, dass es Ionen indirekt und ohne sie zu zerstören misst, indem ein Bildstrom („image current") gemessen wird. Die Daten, die in einem feinen, d.h. einem Massenspektrum erzeugt werden, weisen zwei Koordinaten auf: die Masse-Ladungs-Verhältnis-Skala (X-Achse) und die Intensitätsskala (Y-Achse).
Die molekularen Massen von Gasphasenionen, welche sich sowohl aus neutralen als auch geladenen Molekülen zusammensetzen, werden auf der Basis ihrer Masse-Ladungs-Verhältnisse (m/z) bestimmt. Wenn eine weitere Fragmentierung der Gasphasenionen erwünscht ist, kann diese erreicht werden, indem man sie mit Gasmolekülen kollidieren lässt, so genannte „Kollisions-induzierte Zerlegung" („collision-induced dissociation", CID). Die Teilfragmente, die erzeugt werden, werden dann ebenfalls aufgrund ihrer Masse aufgetrennt.
In den letzten Jahren wurde die Massenspektrometrie in einer Vielzahl biologischer Zusammenhänge ausgenutzt, einschließlich der Nukleinsäuresequenzierung, der Peptidsequenzierung und -identifizierung (Keen und Findlay, „Protein Sequencing Techniques", in Molecular Biology and Biotechnology, Robert A. Meyers, Herausgeber, VCH Publishers, Inc. 1995, Seite 771; Carr und Annan, „Overview of Peptide and Protein Analysis by Mass Spectrometry", in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Herausgeber, John Wiley & Sons, Inc., 1997, 10.21); der Detektion von posttranslationalen Modifikationen und der Expression in vitro und in vivo (Rowley et al., 2000, Methods 20:383–397); der Untersuchung der Proteintertiärstruktur (Last und Robinson, 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:564–570); der Untersuchung labiler nicht-kovalent-gebundener Biomoleküle (Budnik et al., 2000, Rapid Commun. Mass Spectrom. 14:578–584); der Diagnose von Erkrankungen (Bartlett und Pourfarzam, 1999, J. Inherit. Metab. Dis. 22:568–571); der Überwachung der Umweltkontamination (Scribner et al., 2000, Sci. Total Environ. 248: 157–167); landwirtschaftlichen Screenings (Hau et al., 2000, J. Chromatogr. 878:77–86); und forensischer Anwendungen (Hollenbeck et al., 1999, J. Forensic Sci. 44:783–788; Gaillard und Pepin, 1999, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 733:181–229).
Massenspektrometrie, welche eine femtomolare Sensitivität und eine höhere Genauigkeit als 0,01 % ermöglicht, hat sich zu einer attraktiven Alternative gegenüber chemischen Verfahren zur Peptidsequenzierung und -identifizierung entwickelt. Die Sensitivität der Massenspektrometrie has sich verbessert, indem isotopenmarkierte Peptide verwendet wurden und eine Nanoelektrosprayionenquelle mit einem Quadrupol-Flugzeit-Tandemmassenspektrometer kombiniert wurde. Dieser Ansatz nutzt eine intrinsische Eigenschaft des Quadrupol-Flugzeit-Gerätes aus, welche zu höherer Sensitivität und Auflösung als bei anderen Arten von Massenspektrometern führt (Shevchenko et al., 1997, Rapid Comm. Mass Spectrom. 11:1015–1024). Die Isotopenmarkierung von C-terminalen Peptidfragmenten, z.B. durch enzymatischen Verdau eines Proteins in 1:1 ¹⁶O/¹⁸O-Wasser, ermöglicht eine charakteristische Isotopenverteilung bei diesen Fragmenten, die einfach identifiziert werden kann (Schnolzer et al., 1996, Electrophoresis, 17:945–953); dabei wird die Aminosäuresequenz aufgedeckt.
Massenspektrometrie kann auch verwendet werden, um eine Struktur eines Proteins zu untersuchen. Diese Technologie kann akkurate Molekülmassen für geringste Mengen an interessierendem Protein mit Massen bis zu 500.000 Dalton („Da") bereitstellen. Die daraus hervorgehenden Massenspektren können auch dabei helfen, die Proteinfaltung, die Proteinselbstassoziierung und andere Konformationsveränderungen und die Tertiärstruktur zu bestimmen (Nguyen et al., 1995, J Chromatogr A 705:21–45). Zusätzlich können ko- und post-translationale Modifikationen von Proteinen identifiziert und kartiert werden. Dieses Verfahren ist gegenüber der Verwendung chemischer Verfahren wie C-terminaler Sequenzierung zu bevorzugen, welche relativ unsanfte Probenbehandlung erfordern, welche solche Proteinmodifikationen verändern oder zerstören können. Post translationale Modifikationen, die unter Verwendung von Massenspektrometrie identifiziert werden können, umfassen Phosphorylierung, Glycosylierung, Deamidierung, Alkylierung, Isoaspartylbildung und Disulfidbrückenbildung.
Die Massenspektrometrie hat auch wichtige Anwendungen bei der Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen gefunden. Zielproteinen kann in vivo gefolgt werden, um deren Konformationsveränderungen, die Verwendung von aktiven Stellen, die Ligandenerkennung, die Assemblierung zu multimeren Komplexen (z.B. Holoenzymen), und den Transportverkehr zwischen Organellen zu dokumentieren.
Fourier-Transformations-Massenspektrometrie (FTMS) ist auch als Fourier-Transformation-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometrie (FTICR) bekannt. Das Prinzip der Bestimmung von molekularen Massen, das bei FTMS verwendet wird, basiert auf einem linearen Verhältnis zwischen Ionenmasse und seiner Zyklotronfrequenz. In einem homogenen bzw. gleichförmigen Magnetfeld wird sich ein Ion in einer periodischen kreisförmigen Bewegung, die als Zyklotronbewegung bekannt ist, um das Zentrum des Magnetfeldes bewegen. Eine Ansammlung von Ionen, die ein bestimmtes Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) aufweist, kann dazu gebracht werden, in eine gleichphasige Zyklotronbewegung zu fallen, und dabei einen Bildstrom zu produzieren. Der Bildstrom wird zwischen einem Paar aus Empfängerelektroden detektiert, wobei ein Sinuskurvensignal erzeugt wird. Die Fourier-Transformation ist ein mathematisches Zerlegungs- bzw. Dekonvolutionsverfahren, das verwendet wird, um die Signale vieler unterschiedlicher m/z-Ansammlungen in eine Frequenz zu zerlegen, welche auch als Massenspektrum bekannt ist. Im Unterschied zu anderen Formen der Massenspektrometrie ist die FTMS nicht-zerstörerisch. Für einen allgemeinen Übersichtsartikel der FTMS siehe Hendrickson und Emmet, 1999, Ann. Rev. Phys. Chem. 50:517–536. Die Anwendung der FTMS auf die biologischen Wissenschaften ist allgemein ähnlich zu anderen massenspektrometrischen Anwendungen. Siehe z.B. Smith et al., 1996, „The Role of Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spec trometry in Biological Research – New Developments and Applications" in Mass Spectrometry in the Biological Sciences, Herausgeber A.L. Burlingame und S.A. Carr, Humana Press, Totowa, New Jersey; McLafferty, 1994, Acc. Chem. Res. 27:379–386).
Eine ganze Reihe von Forschern hat begonnen, die Verwendung von FTMS bei der Analyse von biologischen Proben zu schätzen; siehe Jensen et al., Electrophoresis 2000 21:1372–1380; Jensen et al., Anal. Chem. 1999 71: 2076–2084; Palblad et al., Rapid Comm. Mass Spec 2000, 14: 1029–1034; WO 95/25281; WO 00/29987 ; WO 00/03240 ; WO 99/58727; WO 99/57318; WO 99/46047; Li et al., Anal. Chem. 1999 71: 4397–4402; Penn et al., Anal. Chem. 1997; 669:2471–2477; und U.S.-Patente Nummern 6,017,093 und 4,224,031.
Analytische Verfahren, die bei der Entdeckung von Arzneimitteln („drug discovery") nützlich sind, basieren primär auf individuellen Endpunktbeobachtungen. Die Ausrichtung spezifischer biologischer Interaktionen (z.B. Rezeptor-Ligand, Substrat-Enzym) im Hinblick auf einen xenobiotischen Eingriff war ein allgemeines Paradigma für die Untersuchung chemischer Bibliotheken. Der traditionelle Ansatz der Wahl für das Drug Discovery pharmazeutischer, biotechnologischer und genomischer Unternehmen ist ein klassisches Hochdurchsatzscreening („high throughput screening", HTS), welches ein paralleles Screening großer chemischer Bibliotheken im Hinblick auf einzelne Zielverbindungen mit sich bringt, wobei im Allgemeinen Zell-freie Assays verwendet werden. Chemische Bibliotheken, die bei HTS verwendet werden, wurden am häufigsten unter Verwendung von kombinatorischer Chemie erzeugt. Sammlungen von Chemikalien, die aus natürlichen Quellen erhalten wurden, oder unter Verwendung von „konventioneller" Chemie erzeugt wurden, werden zu einem geringeren Ausmaß in HTS verwendet.
Der HTS-Ansatz basiert auf der Prämisse validierter Zielverbindungen (Targets), für gewöhnlich Proteinen (z.B. Enzymen, Rezeptoren, Transferproteinen) oder Nukleinsäuren (Genen, mRNAs). Daher ist das Ziel- bzw. Target-Protein oder die Target-Nukleinsäure, die beim Screenen mittels HTS verwendet wird, im Allgemeinen bekannt, und man glaubt, dass sie eine Rolle im Erkrankungszustand spielt. Nur dann werden Modulatoren für das Zielprotein als Leitverbindungen zur Arzneimittelentwicklung gesucht. Bearbeiter haben HTS bei Targets durchgeführt, nur um später herauszufinden, dass das Target-Protein für die Erkrankung irrelevant war. Zum Beispiel aufgrund der Tatsache, dass Rezeptoren in Form unterschiedlicher Subtypen existieren können, von denen nur einer kritisch essentiell sein kann, könnte eine Knockout-Maus, die auf den falschen Rezeptorsubtyp abzielt, wahrscheinlich keinen relevanten Phänotyp aufzeigen. Es wird klar, dass viele biologische Funktionen von redundanten biochemischen Stoffwechselwegen unterstützt werden. Wenn ein Stoffwechselweg fehlt, übernimmt ein redundanter Mechanismus. Viele Arzneimittel, die auf der Basis eines definierten Targets entwickelt wurden, zeigen keine oder wenig therapeutische Aktivität in vivo, weil redundante biochemische Stoffwechselwege den Stoffwechselweg umgehen, in den das Target involviert ist.
Damit HTS erfolgreich ist, erfordern die Targets für gewöhnlich eine geeignete zelluläre Umgebung oder einen geeigneten biologischen Kontext. Zum Beispiel sollte ein Membranrezeptor in einer Membran vorliegen, ähnlich zu der, in welcher sich der Rezeptor normalerweise befindet; ansonsten können die Eigenschaften des Rezeptors artifiziell beeinflusst sein. Eine geeignete Membranumgebung kann das Rekonstituieren der Membran mit geeigneten Lipiden erfordern. Die Rekonstitution der geeigneten Membranumgebung ist die anspruchsvollste Aufgabe in solchen Situationen, und zwar aufgrund eines Mangels an ausreichend detailliertem Wissen über die Verbindungen solch einer Umgebung, oder aufgrund der Komplexität der natürlichen Membranumgebung.
Zusätzlich erfordert eine erfolgreiche klassische HTS Wissen über den Mechanismus der interessierenden Erkrankung oder den interessierenden Zustand, welches die Auswahl eines geeigneten Targets zur Validierung erlaubt und schließ lich das Screening ermöglicht. In Abwesenheit von solch detailliertem Wissen kann klassisches HTS nicht durchgeführt werden.
Eine andere Einschränkung der Technik ist die, dass HTS, welches auf einem validierten Target basiert, nur Modulatoren von diesem Target aufdeckt. Schließlich kann das kosten- und arbeitsintensive Screeningverfahren bestenfalls einen kleinen Satz möglicher Testverbindungen bereitstellen.
Daher würde ein Verfahren, welches ein unvoreingenommenes simultanes Screening im Hinblick auf Modulatoren multipler unvalidierter Targets in ihrer natürlichen Umgebung erlaubt, die Geschwindigkeit der Drug Discovery stark verbessern, während die Kosten reduziert werden. Insbesondere die Identifizierung kleiner Moleküle, welche in anormalen Mengen in spezifischen Stadien (Erkrankungsstadien, Entwicklungsstadien, Differenzierungsstadien, etc.) vorhanden sind, sollte die Gestaltung von Analoga, Agonisten oder Antagonisten dieser Moleküle erleichtern, was zur schnellen Identifizierung hochspezifischer Drogen führt, einschließlich pharmazeutischer Drogen bzw. Arzneimittel, Drogen bzw. Arzneimittel für Veterinäranwendungen, Drogen für landwirtschaftliche Anwendungen (Unkrautvernichter, Parasiten/Insekten-Vernichter, Phytohormonagonisten, etc.) und Drogen für Umweltanwendungen (Bakterienvernichter, bakterielle Proliferatoren für die Ölverschmutzungsbeseitigung, Muschelproliferationskontrollmittel, Algenproliferationskontrollmittel, etc.); jedoch nicht auf diese beschränkt.
„Bioinformatik" bezieht sich im Allgemeinen auf die Handhabung biologischer Daten unter Verwendung von rechnergestützten Mitteln, einschließlich Datenspeicherung (Registrierung von Daten auf einem effektiven Weg, um einfach Informationen zu erhalten) und Datenanalyse unter Verwendung computerintensiver mathematischer Berechnungen (statistische Analyse, nicht-lineare Analyse, etc.). Bioinformatik wird intensiv verwendet, um Struktur-Aktivität-Zusammenhänge zu bestimmen, und zwar unter Verwendung der großen Datenmenge, die mittels High Throughput Screening und kombinatorischer Chemie erzeugt wird, um ef fektivere biologisch-aktive Moleküle zu gestalten. Der Zustand der Bioinformatik hat sich aus dem Bedarf entwickelt, die Fülle von Gensequenzinformation, die in den letzten zwei Jahrzehnten verfügbar geworden ist, zu organisieren und zugänglich zu machen. Während sie anfänglich verwendet wurde, um normale Gensequenzen zu katalogisieren, dehnt sich die Bioinformatik dahin aus, auch die Identifizierung von Proteinstrukturen, basierend auf Mustererkennung in primären Sequenzen und Genexpressionsdaten, die aus Microarrays erhalten wurden, zu umfassen (siehe z.B. http://www.ebi.ac.uk).
Verfahren zur Genexpressionsprofil-Analyse, welche nützlich sind, um Genprodukte zu identifizieren, die in unterschiedlichen Zelltypen unterschiedlich exprimiert oder reguliert sind (z.B. als Mittel, um ihre Funktion zu identifizieren), umfassen die „differential display"- Technik, serielle Analyse der Genexpression (SAGE), Nukleinsäurearraytechnologie, subtraktive Hybridisierung, Proteom-Analyse, und Massenspektrometrie zweidimensionaler Proteingele. Verfahren zur Genexpressionsprofil-Analyse sind beispielhaft in den folgenden Literaturstellen enthalten, welche die „differential display"-Technik (Liang und Pardee, 1992, Science 257:967–971), Proteom-Analyse (Humphery-Smith et al., 1997, Electrophoresis 18:1217–1242; Dainese et al., 1997, Electrophoresis 18:432–442), SAGE (Velculescu et al., 1995, Science 270:484–487), subtraktive Hybridisierung (Wang und Brown, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:11505–11509), und Hybridisierungs-basierte Verfahren unter Anwendung von Nukleinsäurearrays (Heller et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:2150–2155; Lashkari et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 13057–13062; Wodicka et al, 1997, Nature Biotechnol. 15:1259–1267) beschreiben.
Genomsequenzprojekte, wie das Humangenomprojekt, haben große Datenbanken von Gensequenzen erzeugt. Eine biologische Funktion kann jedoch nicht allein aus Nukleotidsequenzdaten bestimmt werden, sondern muss letztlich durch Untersuchen der Genprodukte auf der Ebene des Proteins bestimmt werden. Nur indem das Protein selbst untersucht wird, kann sein Expressionsmuster, seine Assoziie rung mit anderen Molekülen in vivo, und seine Rolle bei normalen und erkrankten Geweben erkannt werden. In Erkenntnis dieser Schwächen der Genomwissenschaften bzw. Genomics haben Wissenschaftler den „Proteomics"-Ansatz verfolgt. Das Gebiet der Proteomics hat sich weiterentwickelt durch Verwendung von zweidimensionaler Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE), welche in der Lage ist, Tausende von Proteinen entsprechend ihrer Ladung und Masse aufzutrennen. Die daraus hervorgehenden Proteinmuster werden dann verglichen, und es werden Versuche unternommen, einzigartige Muster bestimmten Zelltypen oder Krankheitsstadien zuzuordnen. 2D-PAGE schlägt jedoch bei der Auflösung der großen Anzahl von Proteinen, die in komplexen Proben vorliegen, fehl, und die Technik ist zeitaufwendig, arbeitsintensiv und teuer. Zusätzlich kann 2D-PAGE auch signifikant bei der Detektion von in geringen Mengen vorhandenen Proteinen fehlschlagen. 2D-PAGE weist einen relativ geringen dynamischen Bereich auf, insbesondere verglichen mit FTMS.
Zusammenfassung der Erfindung
Entsprechend der oben dargestellten Aufgaben stellt die vorliegende Erfindung, wie sie in den Ansprüchen beschrieben ist, Verfahren bereit, die das Vergleichen eines FTMS-Peakprofils einer ersten biologischen Probe, die sich von Zellen ableitet, welche nicht einem bioaktiven Kandidaten-Mittel ausgesetzt wurden, mit einem FTMS-Peakprofil einer zweiten biologischen Probe, welche sich von einer Zelle ableitet, die dem bioaktiven Kandidaten-Mittel ausgesetzt wurde, umfassen.
Gemäß eines weiteren Aspekts stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, welche es umfassen, eine erste Population von Zellen mit einem ersten bioaktiven Kandidaten-Mittel in Kontakt zu bringen und die erste Population von Zellen einer FTMS-Analyse zu unterwerfen, um ein erstes Peakprofil zu erhalten. Das erste Profil wird mit einem Referenzprofil der ersten Population von Zellen in Abwesenheit des ersten Mittels verglichen.
Gemäß eines zusätzlichen Aspekts stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, die es umfassen, eine erste Population von Zellen einer FTMS-Analyse zu unterwerfen, um ein erstes Peakprofil zu erhalten, welches eine Vielzahl von Peaks umfasst, wobei mindestens zwei Peaks zwei unterschiedlichen Arten von Biomolekülen entsprechen.
Gemäß eines weiteren Aspekts stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, welche eine Population von Zellen umfassen, die mindestens eine erste und eine zweite Subpopulation von Zellen umfassen, und welche es umfassen, die erste Subpopulation von Zellen mit einem ersten bioaktiven Kandidatenmittel in Kontakt zu bringen. Die zweite Subpopulation von Zellen wird mit einem zweiten bioaktiven Kandidatenmittel in Kontakt gebracht und die erste und zweite Subpopulation von Zellen werden einer FTMS-Analyse unterworfen, um ein erstes und ein zweites Peakprofil zu erhalten. Die ersten und die besagten zweiten Peakprofile werden mit einem Referenzprofil der Population von Zellen in Abwesenheit der Mittel verglichen.
Gemäß eines zusätzlichen Aspekts stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, die es umfassen, eine erste Population von Zellen mit einer Droge bzw. einem Arzneimittel in Kontakt zu bringen und die Population von Zellen einer FTMS-Analyse zu unterwerfen, um ein Peakprofil zu erhalten. Das Profil wird mit einem Referenzprofil von der besagten Population von Zellen in Abwesenheit der Droge bzw. des Arzneimittels verglichen.
Gemäß eines weiteren Aspekts stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, die es umfassen, eine Population von Zellen bereitzustellen, welche mindestens eine erste und eine zweite Subpopulation umfasst, und welche es umfassen, die erste Subpopulation von Zellen mit einer Droge bzw. einem Arzneimittel mit einer ersten Konzentration in Kontakt zu bringen und die zweite Subpopulation von Zellen mit einer Droge bzw. einem Arzneimittel mit einer zweiten Konzentration in Kontakt zu bringen. Die ersten und zweiten Subpopulationen von Zellen wer den einer FTMS-Analyse unterworfen, um ein erstes bzw. ein zweites Peakprofil zu erhalten. Die ersten und zweiten Peakprofile werden miteinander verglichen, um mindestens einen Peak zu identifizieren, der sich im Hinblick auf seine Intensität unterscheidet, wobei der Peak nicht dem Arzneimittel entspricht.
Gemäß eines zusätzlichen Aspekts stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, welche es umfassen, eine erste Population von Zellen einer FTMS-Analyse zu unterwerfen, um ein erstes Peakprofil zu erhalten, und eine zweite Population von Zellen einer FTMS-Analyse zu unterwerfen, um ein zweites Peakprofil zu erhalten, wobei die besagten ersten und zweiten Populationen von unterschiedlichem Zelltyp sind. Die ersten und zweiten Peakprofile werden verglichen, um mindestens einen Peak zu identifizieren, der im Hinblick auf seine Intensität einen Unterschied aufweist.
Gemäß eines weiteren Aspekts stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, SAR („software activity relationship")-Software in Kombination mit FTMS-Analyse zu verwenden, um eine chemische Hypothese zu erzeugen und neue biologisch aktive Moleküle zu entwerfen.
Gemäß eines zusätzlichen Aspekts stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Bestimmung der Komponenten und Stoffwechselwege von Erkrankungsstadien bzw. -zuständen bereit. Die Verfahren umfassen es, eine Population von Zellen von einem Organismus mit einem Erkrankungszustand einer FTMS-Analyse zu unterwerfen, um ein erstes Peakprofil zu erhalten. Das Peakprofil wird dann mit einem Referenzprofil von Zellen eines Organismus verglichen ohne diesen Krankheitszustand, oder mit Zellen desselben Organismus von einem nicht erkrankten Gewebe. Der Vergleich führt zur Identifizierung von mindestens einem Peak, der entweder im Hinblick auf die Intensität einen Unterschied aufweist, oder der in einem Profil vorliegt, aber nicht in dem anderen. Die zelluläre Komponente, welche zu diesem Peak führt, wird dann identifiziert. Diese Information kann auf eine Vielzahl von Wegen verwendet werden. Datenbanken können im Hinblick auf Bindungspartner der zellulären Komponente durchsucht werden, um die zellulären Stoffwechselwege des Krankheitszustandes zu untersuchen. Die zelluläre Komponente oder ihre Bindungspartner können in Screens im Hinblick auf Drogen- bzw. Arzneimittelkandidaten verwendet werden.
Gemäß eines weiteren Aspekts stellt die Erfindung Screeningverfahren für die Entdeckung neuer Arzneimittel bzw. Drogen bereit. Die Verfahren umfassen die Verwendung von einer beliebigen Anzahl von Vorscreeningverfahren, welche die Zugabe von Kandidatenmitteln zu Zellen und das Screenen im Hinblick auf geänderte Phänotypen umfassen. Zellen, die veränderte Phänotypen aufweisen, werden dann einer FTMS-Analyse unterworfen, und relevante Peaks werden identifiziert. Alternativ dazu können, sobald Peakprofile für wünschenswerte Wirkungen erzeugt worden sind, Kandidatendrogen gescreent werden, wie beispielsweise jene die in Struktur-Aktivitäts-Beziehungs (SAR)-Studien erzeugt wurden, welche diese wünschenswerten Peakprofile nachahmen.
Gemäß eines zusätzlichen Aspekts stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für das de novo Drogen- bzw. Arzneimitteldesign bereit. Die Verfahren umfassen das Erzeugen einer Vielzahl von FTMS-Analysen bei einem beschränkten Satz oder einer beschränkten Bibliothek von Kandidatenverbindungen. Die daraus hervorgehenden Peakprofile werden dann mit wünschenswerten Peakprofilen verglichen (z.B. jenen, die unter Verwendung von bekannten Drogen oder krankheitsfreien Zellen erzeugt wurden), um „Shapes", „Pharmacophoren" oder „aktive Stellen", welche relevant sind, zu identifizieren. Die Ergebnisse können dann gegen virtuelle chemische Bibliotheken durchgescreent werden, um zusätzliche Verbindung zum Testen in traditionellen und FTMS-Screenings zu identifizieren.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 stellt Schritte eines bevorzugten Prozesses zur Auswahl von Peaks dar.
2 stellt Schritte eines bevorzugten Prozesses zur Analyse von HICS-FTMS-Ergebnissen für eine biologische Probe dar.
3 stellt Schritte eines bevorzugten Prozesses zur Identifizierung von Peaks dar, die Massenspektren gemein sind.
4 stellt veranschaulichende Spektren von Proben dar, die aus unbehandelten Hepatozyten (Spektren A-C) erhalten wurden, gegenüber Spektren von Proben, die mit Lovastatin behandelt wurden (Spektren D-H).
5 HICS-FTMS-Datenanalyse-Software wurde verwendet, um 82 niedermolekulare Massenpeaks der HICS-FTMS-Spektren zu analysieren, die aus Extrakten von Rattenhepatozyten erzeugt wurden, nachdem diese mit verschiedenen Konzentrationen von Lovastatin behandelt wurden. Auf die y-Achsen sind die relativen Intensitäten für jeden Peak (normalisiert gegen die Intensitäten der Peaks von unbehandelten Hepatozyten) gegen die Konzentration von Lovastatin in μM auf den x-Achsen aufgetragen. Die Zahl oben auf jedem Diagramm ist die molekulare Masse des entsprechenden Moleküls. LOWESS wurde verwendet, um lineare und nicht-lineare Kurvenanpassung durchzuführen. Eine logistische Regression wurde verwendet, um die Kurvenanpassung zu verfeinern und akkurate statistische Messungen bereitzustellen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Anmelder haben entdeckt, dass FTMS-Spektren komplexer biologischer Proben die erforderliche Auflösung und Sensitivität aufweisen, um die Analyse individueller Moleküle, die in der Probe vorhanden sind, zu ermöglichen, wobei jedes der Moleküle einen oder mehrere einzigartige FTMS-Peaks unter den Peaks im Peakprofil der Probe verursachen kann. Die Möglichkeit, spezifische Peaks herauszugreifen, erlaubt die Messung der Intensität des Peaks, und daher der relati ven Konzentration des Moleküls, zu welchem der Peak gehört, in der komplexen biologischen Probe. Diese Eigenschaft ist besonders nützlich bei Vergleichsstudien und ermöglicht die Untersuchung eines bestimmten Moleküls in einer Vielzahl biologischer Zustände, und die Charakterisierung von jedem spezifischen biologischen Zustand, was Hochinformationsgehalts-Screening (HICS) oder Hochinformationsgehalt-Analyse (HICA) erleichtert. Hochinformationsgehalts-Screening und -Analyse mittels FTMS wird im Folgenden als HICS-FTMS bzw. HICA-FTMS bezeichnet. Daher besitzen, im Gegensatz zu traditionellen Ansätzen, welche jeweils höchstens eine Hand voll Moleküle untersuchen, HICS-FTMS und HICA-FTMS allgemeinere Anwendbarkeit, welche für die meisten biologischen Probleme nützlich ist, im Gegensatz zu derzeit verfügbaren Verfahren. Dies umfasst die Verwendung von HICS-FTMS und HICA-FTMS, um biologische Zustände an verschiedenen Zeitpunkten in komplexen Systemen zu charakterisieren und zu unterscheiden. Insbesondere weist diese leistungsstarke Technik klinische Anwendbarkeit auf, wenn sie verwendet wird, um normale und krankhafte Zustände zu vergleichen, charakteristische Marker während des Fortschreitens einer Erkrankung zu identifizieren, und Arzneimitteltherapien zu überwachen. Darüber hinaus umfasst die Erfindung die Entwicklung von Arzneimitteln bzw. Drogen mit Hilfe von HICS-FTMS durch Ermitteln von Protein-Protein-Wechselwirkungen, Definieren von Inhaltsstoffen von Organellen und Zytopiasma, und Charakterisieren multimerer Proteinkomplexe.
FTMS bietet eine Reihe an deutlichen Vorteilen und Überlegenheiten gegenüber traditioneller Massenspektroskopie (MS). Die Auflösung, Genauigkeit und Sensitivität von FTMS macht es für die Analyse komplexer biologischer Proben wie geschaffen. Diese Proben können hochmolekulare Massenkomponenten wie Nukleinsäuren, Proteine, Lipide und Oligosaccharide umfassen, einschließlich Lipoproteinen, Proteoglukanen und chemisch modifizierten Molekülen (z.B. phosphorylierten Proteinen), aber nicht darauf beschränkt, und niedermolekulare Massenkomponenten, wie Peptide, metabolische Intermediate, Arzneimittelmetaboliten und -kataboliten. Die Entschlüsselung der chemischen Komplexität solch eines zellulären Systems erfordert eine extrem hohe Auflösungsfähigkeit und Massegenauigkeit. Von allen massenspektrometrischen Techniken ist FTMS am besten in der Lage, die höchste Leistung in Form von Auflösungsfähigkeit und Massegenauigkeit zu erreichen.
Zusätzlich erlaubt die nicht destruktive Natur von FTMS die Analyse und wiederholte Analyse kleiner Probenmengen, und die Auflösung ermöglicht die spezifische Charakterisierung und Identifizierung unterschiedlicher zellulärer Komponenten. Daher ist ein Vorteil der, dass eine sequenzielle Analyse es ermöglicht, den dynamischen Massebereich, der bei diesen Techniken während eines bestimmten Durchlaufs im Bereich von 10³ bis 10⁴ liegen kann, zu erweitern. FTMS kann das Erfordernis einer Vorbehandlungsauftrennung (2D-PAGE, HPLC, GC, etc.) wie sie bei der Verwendung klassischer Massenspektrometrie erforderlich ist, ausschalten; FTMS weist einen größeren dynamischen Bereich als 2D-PAGE auf. Zusätzlich wird sich der dynamische Bereich und die Auflösungsfähigkeit erhöhen, gleichlaufend mit dem Anstieg der Magnetstärke von FTMS mit dem Fortschreiten der Technologie. Zusätzlich kann die nicht destruktive Qualität von FTMS die Analyse unterschiedlicher Typen von Biomolekülen (z.B. Proteinen, Lipiden, Kohlenwasserstoffen, Metaboliten, etc.) gleichzeitig oder in sequenziellen Durchläufen derselben Proben oder ähnlicher Proben ermöglichen. Das heißt, die nicht destruktive Natur von FTMS ermöglicht die Erzeugung stabiler Informationen, indem anfängliche experimentelle Bedingungen verändert werden, indem die präparativen Schritte verändert werden und indem Lösungsmittel und Durchlaufliedingungen (einschließlich Massegrenzen) verändert werden.
Daher stellt die vorliegende Erfindung, wie sie in den Ansprüchen beschrieben ist, eine Vielzahl unterschiedlicher Assays und Analysen bereit, um die Untersuchung einer Vielfalt zellulärer Komponenten, Mechanismen und Stoffwechselwege zu ermöglichen. Es gibt drei Kernanwendungen für die vorliegende Erfindung. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung verwendet, um Komponenten und Stoffwechselwege von Krankheitszuständen zu untersu chen und zu entdecken. Zum Beispiel ermöglicht der Vergleich von Krankheitsgewebe (oder, wie unten ausgeführt, Geweben oder Zellen, die unterschiedlichen Behandlungen ausgesetzt wurden, wie Hitze, Stress, etc.) mit „normalem" Gewebe die Untersuchung wichtiger Moleküle, die in die Krankheit involviert sind. Stoffwechselwege von Krankheiten können ebenfalls untersucht werden.
Zweitens ermöglicht die vorliegende Erfindung auch die Entdeckung/das Screening neuer Drogen- bzw. Arzneimittelkandidaten, die verwendet werden können, um eine Krankheit zu behandeln. Nachdem zum Beispiel relevante Effekte bzw. Wirkungen (z.B. das Vorhandensein oder die Abwesenheit bestimmter Moleküle; Peaks in einem Krankheitsspektrum oder einem Spektrum einer Droge bzw. eines Arzneimittels, mit wünschenswerten oder unerwünschten Wirkungen) identifiziert wurden, können chemische Bibliotheken von Drogen-Kandidaten im Hinblick auf eine Verdopplung oder eine Vermeidung eines relevanten Effekts hin durchgescreent werden. Daher können zum Beispiel neue chemische Bibliotheken im Hinblick auf anfängliche Treffer bzw. „Hits" durchgescreent werden, oder Struktur-Aktivität-Beziehungen (SAR) können durchgeführt werden, sobald ein relevantes Gerüst bzw. Muster identifiziert wurde.
Schließlich ermöglicht die vorliegende Erfindung auch ein de novo Arzneimitteldesign, und zwar wie folgt. Anfängliches FTMS-Screening beschränkter Bibliotheken von Kandidatenverbindungen kann durchgeführt werden, um relevante Verbindungen zu identifizieren. Dem kann ein Screening virtueller und/oder realer Bibliotheken von Pharmacophoren folgen, um Strukturen zu identifizieren, die ähnliche Aktivitäten aufweisen könnten. Diese virtuellen Moleküle können dann synthetisiert und im Hinblick auf ihre Aktivität hin getestet werden.
Indem FTMS-Peakprofile unterschiedlicher Proben verglichen werden, können komplexe und intensive Daten untersucht bzw. aufgehellt werden; die Verfahren ermöglichen die Identifizierung von Biomolekülen, die in unterschiedlichen Proben unterschiedlich vorhanden sind; dies umfasst sowohl Veränderungen im Vor handensein oder der Abwesenheit von Peaks sowie Veränderungen der Peak-Intensität. Zum Beispiel können FTMS-Peakprofile von Zellen erhalten werden, die einem oder mehreren Kandidatenmitteln oder -drogen ausgesetzt wurden, und sie können mit Profilen von unbehandelten Zellen verglichen werden, um zelluläre Veränderungen zu identifizieren, die mit der Droge oder der Verbindung in Verbindung stehen; es können zum Beispiel Toxizitätsprofile erhalten werden oder Bibliotheken von Drogen- bzw. Arzneimittel-Kandidaten können im Hinblick auf wünschenswerte oder unerwünschte Wirkungen hin durchgescreent werden. Ganz ähnlich können Zellen unterschiedlicher Krankheitszustände, wie beispielsweise kardiovaskulärer Krankheiten, Krebs, Diabetes, Fettsucht, entzündlichen Erkrankungen, Alzheimer-Erkrankungen, Autoimmun-Erkrankungen, Infektionen mit Pathogenen, etc., mit normalen Gewebeprofilen verglichen werden, um die Stoffwechselwege und die zellulären Komponenten zu identifizieren, die durch die Erkrankung beeinflusst werden. Noch ein weiteres Beispiel umfasst den Vergleich von Profilen von unterschiedlichen Geweben oder Zelltypen, um Zellspezifische Komponenten zu identifizieren, um eine Datenbank für Vergleiche mit neuen Geweben, Krankheitszuständen oder von unterschiedlichen Individuen aufzubauen.
Die hierin beschriebenen Verfahren erlauben weiterhin die Detektion und/oder Identifikation chemischer Modifikationen natürlicher Moleküle, die Identifizierung von pathologisch induzierten Modifikationen von metabolischen Stoffwechselwegen, (nämlich Veränderungen im Durchsatz bzw. Durchfluss, Akkumulation von Metaboliten, Abreicherung bzw. Depletion von Metaboliten, Modifikation von Metaboliten), Identifizierung iatrogener Wirkungen, Identifizierung einer biochemischen Reaktion und biochemischer Stoffwechselwege, Identifizierung von katabolischen und metabolischen Zwischenprodukten, Identifizierung von redundanten biochemischen/metabolischen Stoffwechselwegen, Identifizierung von biochemischen/metabolischen SOS-Wegen, und die Identifizierung von Apoptose-Wegen. Metabolische Zwischenprodukte und Metabolite von Interesse umfassen natürliche Metabolite, in vivo synthetisierte oder abgebaute Moleküle, während Oxidations- oder Reduktions-Reaktionen modifizierte Moleküle, in Zellen und in biologischen Flüssigkeiten, sowie verschiedene kleine und große Moleküle, die in Nahrungsmitteln vorhanden sind (z.B. Vitamine, Fremdsubstanzen) oder die durch enzymatischen Abbau von Nahrungsmitteln (z.B. Aminosäuren, insbesondere essentielle Aminosäuren, Fettsäuren) erzeugt werden, sowie Kataboliten und Xenobiotika.
Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um eine Vielzahl von Datenbanken zur Verwendung bei der Analyse von Proben zu erzeugen. Zum Beispiel können die Verfahren verwendet werden, um eine Datenbank metabolischer Transformationen, die in vivo auftreten, zu erzeugen. Das heißt, Referenzmoleküle (z.B. Gerüstmoleküle), die chemische Substrukturen von Interesse enthalten, werden verabreicht, und neue oder veränderte Metaboliten werden mittels FTMS identifiziert. Zum Beispiel können metabolische Transformationen von sekundären Aminen oder sekundären Alkoholen identifiziert werden, registriert werden und in eine erfindungsgemäße Datenbank eingestellt werden. Jede neue Verbindung mit einem sekundären Amin wird unter Verwendung der metabolischen Transformationsdatenbank untersucht. Ganz ähnlich kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um höchst genaue Datenbanken kleiner Moleküle zu erzeugen.
Daher stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die mit Fourier-Transformation-Massenspektroskopie (FTMS)-Analyse in Verbindung stehen. FTMS kann mit jeder Anzahl von Proben durchgeführt werden. Wie vom Fachmann gewürdigt werden wird, kann die Probe eine beliebige Anzahl an Dingen umfassen, einschließlich Zellen (einschließlich sowohl primärer Zellen als auch kultivierter Zell-Linien), Gewebe und Körperflüssigkeiten (einschließlich Blut, Urin, Serum, Lymphflüssigkeit, Harnflüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit, interstitielle Flüssigkeit, Kammerwasser und Glaskörperflüssigkeit, Kolostrum, Sputum, Amnionflüssigkeit, Speichel, Anal- und Vaginal-Absonderungen, Schweiß und Samen, ein Transsudat, ein Exsudat (z.B. Flüssig keit erhalten von einem Abszess oder irgendeiner anderen Stelle einer Infektion oder Entzündung) oder Flüssigkeit erhalten aus einem Gelenk (z.B. einem normalen Gelenk oder einem Gelenk, das durch eine Erkrankung beeinflusst ist, beispielsweise rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Gicht oder septischer Arthritis), aber nicht darauf beschränkt, und zwar von geradezu jedem Organismus, wobei Säugerproben bevorzugt sind und humane Proben besonders bevorzugt sind; Umweltproben (einschließlich Luft-, Landwirtschafls-, Wasser- und Boden-Proben, jedoch nicht darauf beschränkt); Proben von Mitteln biologischer Kriegsführung; Forschungsproben einschließlich extrazellulärer Flüssigkeiten, extrazellulärer Überstände von Zellkulturen, Inclusion Bodies in Bakterien, zellulärer Kompartimente, zellulärem Periplasma, Mitochondrienkompartimenten, etc., gereinigter Proben, extraterrestrischer Proben wie von Meteoriten, etc., jedoch nicht darauf beschränkt. Wie vom Fachmann gewürdigt werden wird und wie unten ausgeführt, können die Proben entweder „nativ" sein, z.B. ohne weitere Manipulation oder Behandlung, oder sie können „behandelt" sein, was eine beliebige Vielzahl von Behandlungen umfassen kann, einschließlich Aussetzen gegenüber Kandidatenmitteln einschließlich Drogen bzw. Arzneimitteln, genetischer Veränderung (z.B. Hinzufügen oder Deletion eines Gens), etc. Dies ist von der Behandlung oder Präparation der Proben für die FTMS-Analyse zu unterscheiden, wie unten weiter beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird FTMS an Proben durchgeführt, die Zellen umfassen, Wie vom Fachmann gewürdigt werden wird, gibt es eine breite Vielfalt von Zelltypen, die in der vorliegenden Erfindung eine Anwendung finden, einschließlich sowohl eukaryotischer als auch prokaryotischer Zellen, wobei die ersteren bevorzugt sind. Geeignete prokaryotische Zellen umfassen Bakterien wie E. coli, Bacillus species, extremophile Bakterien wie thermophile, etc., und jedes der unten aufgelisteten Bakterien und jeden der unten aufgelisteten Organismen oder alle, einschließlich Mykoplasma, Rickettsia, einzellige Planktonorganismen, Paramecium, Pseudomonas, Nitrosomonas, Nitrobacter etc. Prionen und die Teile, die Kreutzfeld-Jacob-Erkrankung hervorrufen, sind von dieser Definition umfasst.
Geeignete eukaryotische Zellen umfassen Insektenzellen; Pilze wie Hefen und filamentöse Pilze, einschließlich Arten von Aspergillus, Trichoderma, Pichia und Neurospora, Mycoplasmen, etc. und einschließlich blühender Strukturen und Sporen sowie Flechten; Pflanzenzellen, einschließlich jene von Algen, Mais, Hirse, Tabak, Raps, Sojabohne, Baumwolle, Tomate, Kartoffel, Luzerne, Sonnenblume, etc., und einschließlich Blüten-, Stengel-, Pflanzensaft-, Blatt- und Pollen-Zellen, etc.; und Tierzellen, einschließlich von Fischen, Vögeln und Säugetieren. Geeignete Fischzellen umfassen jene von Arten von Lachs, Forelle, Barsch, Thunfisch, Karpfen, Flunder, Heilbutt, Schwertfisch, Dorsch und Zebrafisch, jedoch nicht darauf beschränkt. Geeignete Vogelzellen umfassen jede von Hühnern, Enten, Wachteln, Fasanen und Truthähnen, und anderen Dschungelvögeln oder Wildvögeln, sind aber nicht darauf beschränkt. Geeignete Säugerzellen umfassen Zellen von Pferden, Kühen, Büffeln, Hirschen, Schafen, Kaninchen, Nagern wie Mäusen, Ratten, Hamstern und Meerschweinchen, Ziegen, Schweinen, Primaten und Menschen, Meeressäugern einschließlich Delphinen und Walen, primären Zellen sowie Zell-Linien wie beispielsweise humanen Zell-Linien von jedem Gewebe oder Stammzelltypen, und Stammzellen einschließlich pluripotente und nicht-pluripotente Stammzellen; sie sind aber nicht darauf beschränkt. Zusätzlich können die Zellen Tumorzellen sein, wie unten ausgeführt, Kardiomyozyten, Endothelzellen, Epithelzellen, Lymphozyten (T-Zellen und B-Zellen), Mastzellen, Eosinophile, vaskuläre Intimalzellen, Hepatozyten, Leukozyten einschließlich mononukleärer Leukozyten, Stammzellen wie hämatopoetische , neurale, Haut-, Lungen-, Nieren-, Leber- und Myozyten-Stammzellen, Osteoblasten, Chondrozyten und Zellen von anderen Bindegeweben, Keratinozyten, Melanozyten, Leberzellen, Nierenzellen und Adipozyten. Geeignete Zellen umfassen auch bekannte Forschungszellen, einschließlich Jurkat T-Zellen, NIH 373-Zellen, CHO, Cos, etc. Siehe ATTC- Zelllinien- Katalog. Wie vom Fachmann gewürdigt werden wird, können die Zellen eine Vielzahl von Formaten einnehmen, einschließlich der Verwendung gefrorener Proben (Zellen und Gewebe), dehydrierter, gefriergetrockneter oder einbalsamierter Gewebe, mumifizierter Zellen und Gewebe, toter Zellen und Gewebe (forensische Analyse sowie Ethnologie), sporulierter Bakterien, etc. Ganz ähnlich können die Zelle diploide oder haploide Zellen, mono- oder multinukleäre Zellen, Blutblättchen, anukleäre Zellen wie Erythrozyten, Makrophagen und aktivierte Makrophagen, pluripotente Zellen, differenzierte und nicht-differenzierte Zellen, Stammzellen und Zellen mit Extrachromosomen oder Nukleinsäurematerial sein. Es sollte auch erwähnt werden, dass Populationen von Zellen die tatsächlichen Tiere umfasst; das heißt, ein Tier kann als Population von Zellen angesehen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform und wie unten weiter ausgeführt sind die in der FTMS-Analyse verwendeten Zellen von unterschiedlichen Geweben, insbesondere humanen Geweben. Daher können zum Beispiel die Peakprofile von Zellen von unterschiedlichen Geweben verglichen werden, um die Untersuchung bzw. Aufdeckung von Zell-spezifischen Markern sowie nicht-spezifischen Komponenten oder Komponenten mit Grundumsatz- bzw. „housekeeping"-Funktion zu ermöglichen. In dieser Ausführungsform können die Zellen entweder primäre Zellen oder Zell-Linien vom Gehirn, der Haut, der Lunge, endotheliale, epitheliale, Adipozyten, Muskel, Knochen, Magen, Darm, Milz, Pankreas, Niere, Blase, Herz, lymphatischem System, Blut, Leber, etc. sein. In dieser Ausführungsform können FTMS-Profile von unterschiedlichen Geweben verglichen werden und verwendet werden, um eine Datenbank aufzubauen, wie unten weiter ausgeführt. Ganz ähnlich können die Zellen von demselben Gewebe sein, aber von unterschiedlichen Individuen, um eine Datenbank aufzubauen, um Zell-spezifische Marker zu normalisieren und zu evaluieren. Die Zellen können von demselben bzw. derselben oder unterschiedlichen Individuen, Spezies, Subspezies, Untergruppen in unterschiedlichen Biotypen stammen, etc.
In einigen Ausführungsform werden primäre Zellen mit Zell-Linien desselben Gewebes verglichen, um zwischen diesen zweien Unterschiede zu identifizieren. Wie im Stand der Technik bekannt zeigen einige Zell-Linien nicht dieselben Profile und die Empfänglichkeit gegenüber Drogen bzw. Arzneimitteln wie primäre Zellen. Daher kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um zelluläre Unterschiede zwischen diesen zweien zu ermitteln.
In einer bevorzugten Ausführungsform können Vergleiche zwischen unterschiedlichen Zellstadien oder Zellen, die unterschiedlichen Behandlungen unterworfen werden, unter Verwendung der erfindungsgemäßen Techniken untersucht werden. Zum Beispiel umfassen geeignete unterschiedliche Behandlungen physikalische Behandlung (Stress, Hitze, Kälte, Druck, Bestrahlung etc.), Behandlungen mit Wachstumshormonen oder Metamorphosehormonen (z.B. bei Raupen, Amphibien), Behandlungen mit chemischen Stimulationsmitteln (Kaffee, Drogen, anregenden bzw. stimulierenden Aminosäuren, etc.) und Behandlungen mit elektrischer Stimulation (z.B. in Nerven, Muskelzellen); sie sind aber nicht darauf beschränkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die Zellen von einem Tier mit einem Krankheitszustand. „Krankheitszustand" umfasst in diesem Zusammenhang jedes Leiden, für das entweder Information, Diagnose oder Behandlung erwünscht ist. Der Krankheitszustand kann das Ergebnis einer genetischen Erkrankung (einschließlich genetischer Erkrankungen, die auf Proteinveränderungen basieren, wie zystischer Fibrose oder Sichelzellanämie, oder dem Vorhandensein bestimmter einzelner Nukleotidpolymorphismen, Mutationen in Tumorsuppressorgenen, etc.), somatischer Zellveränderungen etc. sein. Dementsprechend sind geeignete Zellen im Krankheitszustand jene von Krebs, kardiovaskulären Erkrankungen, viralen oder bakteriellen Infektionen, Fettsucht, Diabetes, entzündlichen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, etc. Ganz ähnlich können die Zellen von Individuen mit chromosomalen Abnormitäten (z.B. Trisomie, etc.), vor und nach Gentherapie, etc., stammen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Krebszellen oder -gewebe in der vorliegenden Erfindung verwendet. In dieser Ausführungsform umfassen geeignete Tumorzellen jene von Hautkrebs einschließlich Melanom, myeloider Leukä mie, Karzinomen der Lunge, der Brust, der Eierstöcke, des Darms, der Niere, der Prostata, des Pankreas, des Magens, des Gehirns, des lymphatischen Systems, des Thymus, der Schilddrüse, der Nebennieren, der Hoden, etc., sind aber nicht darauf beschränkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen von Individuen mit kardiovaskulären Erkrankungen erhalten. Daher umfassen geeignete Zellen im Krankheitszustand in dieser Ausführungsform Kardiomyozyten, Endothelialzellen des zirkulatorischen Systems, Makrophagen, Leberzellen (Hepatozyten), Adipozyten, Zellen der glatten Muskulatur, Darmzellen, etc.; jedoch nicht darauf beschränkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen von Individuen mit Diabetes erhalten. Daher umfassen in dieser Ausführungsform geeignete Zellen im Krankheitszustand Kardiomyozyten, Endothelialzellen des Kreislaufsystems, Makrophagen, Pankreaszellen, Leberzellen (Hepatozyten), Adipozyten, Zellen der glatten Muskulatur, Darmzellen, etc., jedoch nicht darauf beschränkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen von Individuen mit Fettsucht erhalten. Daher umfassen in dieser Ausführungsform geeignete Zellen im Krankheitszustand in dieser Ausführungsform Kardiomyozyten, Endothelialzellen des Kreislaufsystems, Makrophagen, Leberzellen (Hepatozyten), Adipozyten, Zellen der glatten Muskulatur, Darmzellen, etc., jedoch nicht darauf beschränkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen im Krankheitszustand als solche klassifiziert aufgrund einer Infektion mit Viren oder Bakterien. Geeignete Viren umfassen Orthomyxoviren (z.B. Influenza-Virus), Paramyxoviren (z.B. respiratorische Synzytien-Viren, Mumpsvirus, Masernvirus), Adenoviren, Rhinoviren, Coronaviren, Reoviren, Togaviren (z.B. Rubella-Virus), Parvoviren, Poxviren (z.B. Variolavirus, Vacciniavirus), Enteroviren (z.B. Poliovirus, Coxsackievi rus), Hepatitisviren (einschließlich A, B und C), Herpesviren (z.B. Herpes simples Virus, Varicella-Zoster-Virus, Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus), Rotaviren, Norwalk-Viren, Hantavirus, Arenavirus, Rhabdovirus (z.B. Rabies-Virus), Retroviren (einschließlich HIV, HTLV-I und -II), Papovaviren (z.B. Papillomavirus), Polyomaviren, und Picornaviren, jedoch nicht darauf beschränkt. Geeignete Bakterien umfassen eine breite Vielfalt von pathogenen und nicht-pathogenen Prokaryonten von Interesse einschließlich Bacillus, Vibrio, z.B. V. cholerae; Escherichia, z.B. enterotoxigene E. coli, Shigella, z.B. S. dysenteriae; Salmonella, z.B. S. typhi; Mycobacterium, z.B. M. tuberculosis, M. leprae; Clostridium, z.B. C. botulinum, C. tetani, C. difficile, C. perfringens; Cornyebacterium, z.B. C. diphtheriae; Streptococcus, S. pyogenes, S. pneumoniae; Staphylococcus, z.B. S. aureus; Haemophilus, z.B. H. influenzae; Neisseria, z.B. N. meningitidis, N. gonorrhoe; Yersinia, z.B. G. lamblia, Y. pestis, Mycoplasmen, Rikettien, Pseudomonas, z.B. P. aeruginosa, P. putida; Leischmania, Chlamydia, z.B. C. trachomatis; Bordetella, z.B. B. pertussis; und Treponema, z.B. T. pallidum; jedoch nicht darauf beschränkt. In einigen Ausführungsformen umfasst der Krankheitszustand jedoch nicht eine bakterielle oder viruelle Infektion.
In einer Ausführungsform können die Zellen genetisch verändert bzw. genmanipuliert sein, das heißt sie können exogene Nukleinsäuren enthalten (z.B. „knock-in"-Zellen oder transgenische Tiere) oder bei ihnen können Nukleinsäuren (einschließlich Genen) deletiert oder verändert sein (z.B. „knock-out"-Zellen oder transgenische Tiere).
In einer bevorzugten Ausführungsform, wie in größerem Umfang unten ausgeführt, können Zellen im Krankheitszustand mit Zellen von entsprechendem Gewebe, die die Erkrankung nicht aufweisen, d.h. normalem Gewebe, verglichen werden, um die Unterschiede herauszufinden. Die normale Probe kann von demselben Tier oder einem zweiten Individuum stammen, einschließlich Familienmitgliedern, Zwillingen, etc. Zusätzlich kann die normale Probe von nach der Be handlung stammen, z.B. nach Erhalt von Knochenmarkstransplantationen, Chemotherapie, etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen einem oder mehreren bioaktiven Kandidaten-Mitteln (auf welche hierin auch als „Drogen" bzw. „Arzneimittel" oder „Biomodulatoren" Bezug genommen wird) vor der FTMS-Analyse ausgesetzt. Der Begriff „bioaktives Kandidaten-Mittel" oder „Biomodulator", wie er hierin verwendet wird, beschreibt irgendein natürliches oder synthetisches Molekül, z.B. ein Protein, ein kleines organisches Molekül, Kohlenwasserstoffe (einschließlich Polysaccharide), ein Polynukleotid, Lipide, etc., welches in den erfindungsgemäßen Systemen zu testen ist, und insbesondere im Hinblick auf die Fähigkeit zu testen ist, eine Reaktion oder Störung in einem zellulären System hervorzurufen. Beispiele umfassen Drogen bzw. Arzneimittel, Antisense- oder Triple Helix Nukleinsäuren, Ribozyme, Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Liganden, Antikörper, Pheromone, Agonisten, Antagonisten, Analoga, Kanalblockierungsmittel, Toxine, Unkrautvernichter, Geruchsstoffe oder jedwede andere chemische Moleküle.
Kandidaten-Mittel umfassen zahlreiche chemische Klassen, obwohl es sich typischerweise um organische Moleküle handelt, bevorzugt kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 und weniger als ungefähr 2500 Dalton, wobei Moleküle bevorzugt in einem Bereich von ungefähr 100 bis ungefähr 1000 bis 1500 bevorzugt sind. Kandidaten-Mittel umfassen funktionelle Gruppen, die zur strukturellen Wechselwirkung mit Proteinen notwendig sind, insbesondere Wasserstoffbrückenbildung, und typischerweise umfassen sie mindestens eine Amin-, Carbonyl-, eine Hydroxyl- oder Carboxyl-Gruppe, bevorzugt mindestens zwei der funktionellen chemischen Gruppen. Die Kandidaten-Mittel umfassen oft zyklische Kohlenstoff- oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehreren der oben genannten funktionellen Gruppen substituiert sind. Kandidaten-Mittel findet man auch unter Biomolekülen einschließlich Peptiden, Sacchariden, Lipiden, Fettsäuren, Steroiden, Purinen, Pyrimidinen, Derivaten, strukturellen Analoga oder Kombinationen daraus. Besonders bevorzugt sind kleine Moleküle, Peptide, Peptidanaloga, Lipidanaloga und Kohlenwasserstoff-Analoga.
Kandidaten-Mittel erhält man aus einer breiten Vielfalt an Quellen, einschließlich Bibliotheken aus synthetischen oder natürlichen Verbindungen. Zum Beispiel sind zahlreiche Mittel zur zufälligen oder gerichteten Synthese einer breiten Vielfalt organischer Verbindungen und Biomoleküle verfügbar, einschließlich der Expression randomisierter Oligonukleotide. Alternativ dazu sind Bibliotheken aus natürlichen Verbindungen in Form von bakteriellen, pilzlichen, Pflanzen- und Tier-Extrakten verfügbar oder einfach herstellbar. Zusätzlich können neue Bibliotheken oder Spezies von Kandidaten-Mitteln hergestellt werden, indem Vorläufermoleküle (z.B. chemische Gerüststoffe) Mikroorganismen (einschließlich Bakterien, Hefen, etc.) oder anderen Organismen (Pflanzen, Actinomyceten, Pilze, etc.) zugeführt werden, um neue Chemikalien oder künstlich schwierig zu synthetisierende Chemikalien/Moleküle zu erzeugen.
Zusätzlich werden natürlich oder synthetisch hervorgebrachte Bibliotheken und Verbindungen einfach über konventionelle chemischen, physikalische und biochemische Mittel modifiziert. Bekannte pharmakologische Mittel können gerichteter oder zufälliger chemischer Modifikation unterworfen werden, wie Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidifizierung, um strukturelle Analoga herzustellen. Verbindungen können razemische Gemische oder Isomere sein.
Zusätzlich kann eine Bibliothek oder mehrere Bibliotheken simultan oder nacheinander durchgescreent werden; die Bibliotheken können verwandt sein (z.B. orthogonale Bibliotheken, synthetische Bibliotheken verwandter Gerüststoffe, natürliche Bibliotheken von Pflanzenextrakten) oder nicht verwandt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidaten-Mittel Proteine. Mit „Protein" sind hierin mindestens zwei kovalent verbundene Ami nosäuren gemeint, was Proteine, Polypeptide, Oligopeptide und Peptide umfasst. Das Protein kann sich aus natürlich auftretenden Aminosäuren und Peptidbindungen, oder synthetischen peptidomimetischen Strukturen wie Peptoiden zusammensetzen. Somit meint „Aminosäure" oder „Peptidrest", wie hier verwendet, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische Aminosäuren. Zum Beispiel werden Homophenylalanin, Citrulin und Norleucin für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als Aminosäuren angesehen.
„Aminosäure" umfasst auch Iminosäurereste wie Prolin und Hydroxyprolin. Die Seitenketten können entweder in der (R)- oder der (S)-Konfiguration vorliegen. In der bevorzugten Ausführungsform liegen die Aminosäuren in der (S)- oder L-Konfiguration vor. Wenn nicht-natürlich vorkommende Seitenketten verwendet werden, können Nicht-Aminosäure-Substituenten verwendet werden, um beispielsweise den Abbau in vivo zu verhindern oder zu verzögern. Chemische Blockierungsgruppen oder andere chemische Substituenten können ebenfalls hinzugefügt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidaten-Mittel natürlich vorkommende Proteine oder Fragmente von natürlich vorkommenden Proteinen. Daher können zum Beispiel zelluläre Extrakte, die Proteine enthalten, oder zufällige oder gerichtete Verdaue von proteinösen zellulären Extrakten verwendet werden. Auf diese Weise können Bibliotheken von prokaryotischen und eukaryotischen Proteinen für das Screening in dem hierin beschriebenen System hergestellt werden. Insbesondere bevorzugt in dieser Ausführungsform sind Bibliotheken von bakteriellen, pilzlichen, viralen und Säuger-Proteinen, wobei letztere bevorzugt sind, und humane Proteine insbesondere bevorzugt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidaten-Mittel Peptide aus ungefähr 5 bis ungefähr 30 Aminosäuren, wobei von ungefähr 5 bis ungefähr 20 Aminosäuren bevorzugt sind, und von ungefähr 7 bis ungefähr 15 insbesondere bevorzugt sind. Die Peptide können Verdauprodukte von natürlich vorkommenden Proteinen sein, wie oben ausgeführt, Zufallspeptide, oder „verzerrte" („biased") Zufallspeptide. Mit „randomisiert" („Zufalls-") oder grammatikalischen Äquivalenten ist hierin gemeint, dass jede Nukleinsäure und jedes Peptid im Wesentlichen aus Zufallsnukleotiden bzw. -aminosäuren besteht. Da diese Zufallspeptide (oder Nukleinsäuren wie unten diskutiert) im Allgemeinen chemisch synthetisiert werden, können sie jedes Nukleotid oder jede Aminosäure an jeder Position einbauen. Das synthetische Verfahren kann so gestaltet werden, dass randomisierte Proteine oder Nukleinsäuren erzeugt werden, so dass die Bildung von allen oder den meisten der möglichen Kombinationen über die Länge der Sequenz ermöglicht wird, und dadurch eine Bibliothek aus randomisierten bioaktiven proteinösen Kandidaten-Mitteln gebildet wird. Daher können zum Beispiel Bibliotheken aus helikalen amphipathischen Peptiden, Beta-Faltblatt-Peptiden, amphipathischen Beta-Faltblatt-Peptiden, etc. hergestellt werden.
In einer Ausführungsform ist die Bibliothek vollständig randomisiert, ohne Sequenzpräferenzen oder Konstanten an irgendeiner Position. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bibliothek "unausgewogen" bzw. „verzerrt" („biased"). Das heißt, einige Positionen innerhalb der Sequenz werden entweder konstant gehalten oder sie werden aus einer begrenzten Anzahl von Möglichkeiten ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleotide oder Aminosäurereste innerhalb einer definierten Klasse randomisiert, zum Beispiel aus hydrophoben Aminosäuren, hydrophilen Resten, sterisch unausgewogenen bzw. verzerrten Resten (entweder kleinen oder großen), zur Bildung von Cysteinen hin zum Quervernetzen, von Prolinen für SH-3-Domänen, Serinen, Threoninen, Tyrosinen oder Histidinen für Phosphorylierungsstellen, etc., oder zu Purinen hin, etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidaten-Mittel Nukleinsäuren. Mit „Nukleinsäure" oder „Oligonukleotid" oder grammatikalischen Äquivalenten sind hierin mindestens zwei Nukleotide, die kovalent miteinander verknüpft sind, gemeint. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure wird im Allgemeinen Phosphodiesterbindungen enthalten, obwohl in einigen Fällen, wie un ten ausgeführt, Nukleinsäureanaloga umfasst sind, die wechselnde Rückgrate aufweisen können, indem sie zum Beispiel Phosphoamid (Beaucage et al., Tetrahedron, 49(10):1925 (1993) und darin enthaltene Literaturstellen; Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800 pyrimidinyl1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem., 81:579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res., 14:3487 (1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); und Pauwels et al., Chemica Scripta, 26:141 (1986), Phosphorthioat (Mag et al., Nucleic Acids Res., 19:1437 (1991); und U.S. Patent Nr. 5,644,048), Phosphordithioat (Briu et al, J. Am.Chem. Soc., 111:2321 (1989)), O-Methylphosphoramidid-Verbindungen (siehe Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), und Peptid-Nukleinsäure-Rückgrate und -Verbindungen (siehe Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114:1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson et al., Nature, 380:207 (1996)) umfassen. Andere analoge Nukleinsäuren umfassen jene mit positiven Rückgraten (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097 (1995)); nicht-ionischen Rückgraten (US-Patente 5,386,023; 5,637,684; 5,602,240, 5,216,141; und 4,469,863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30:423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide, 13:1597 (1994); Kapitel 2 und 3, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Herausgeber Y.S. Sanghzui und P. Dan Cook, Mesmaeker et al., Bioorganic out-put interface Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994); Tetrahedron Lett., 37:743 (1996)) und Nicht-Ribose-Rückgrate, einschließlich jener, die in US-Patenten 5,235,033 und 5,034,506 beschrieben sind und in Kapiteln 6 und 7, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Herausgeber Y.S. Sanghui und P. Dan Cook. Nukleinsäuren, die ein oder mehrere zyklische Zucker enthalten, sind ebenfalls von der Definition von Nukleinsäuren umfasst (siehe Jenkins et al., Chem. Soc. Rev., (1995) Seiten 169–176). Mehrere Nukleinsäureanaloga sind in Rawls, C & E News, 2. Juni, 1995, Seite 35 beschrieben. Diese Modifikationen des Ribose-Phosphat-Rückgrats können vorgenommen werden, um das Anhängen zusätzlicher Gruppierungen wie Markierungen zu erleichtern, oder um die Stabilität und die Halbwertszeit solcher Moleküle in physiologischen Umgebungen zu erhöhen. Zusätzlich können Gemische natürlich vorkommender Nukleinsäuren und Analoga hergestellt werden. Analog dazu können Gemische unterschiedlicher Nukleinsäureanaloga, und Gemische natürlich vorkommender Nukleinsäuren und Analoga hergestellt werden. Die Nukleinsäuren können einzelsträngig oder doppelsträngig sein, wie angegeben, oder sie können sowohl Teile doppelsträngiger als auch einzelsträngiger Sequenz enthalten. Die Nukleinsäure kann DNA sein, sowohl genomische als auch c-DNA, RNA, oder ein Hybrid, wobei die Nukleinsäure eine Kombination aus Desoxyribo- und Ribo-Nukleotiden enthält, und jedwede Kombination aus Basen, einschließlich Uracil, Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Inosin, Xanthin, Hypoxanthin, Isocytosin, Isoguanin, etc.
Wie oben allgemein für Proteine beschrieben, können bioaktive Nukleinsäure-Kandidaten-Mittel natürlich vorkommende Nukleinsäuren, Zufallsnukleinsäuren, oder „verzerrte" („biased") Zufalls-Nukleinsäuren sein. Es können zum Beispiel Verdauprodukte von prokaryotischen oder eukaryotischen Genomen verwendet werden, wie oben für Proteine ausgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidaten-Mittel chemische Gebilde, von denen eine breite Vielfalt in der Literatur verfügbar ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Bibliothek unterschiedlicher bioaktiver Kandidaten-Mittel verwendet. Bevorzugt sollte die Bibliothek eine ausreichend strukturell-diverse Population randomisierter Mittel bereitstellen, um einen der Wahrscheinlichkeit nach ausreichend großen Bereich an Diversität zu erreichen, um eine Bindung an ein bestimmtes Ziel zu erlauben. Dementsprechend sollte eine Wechselwirkungsbibliothek groß genug sein, so dass mindestens eines ihrer Mitglieder eine Struktur haben wird, die ihm eine Affinität an das Ziel verleiht. Obwohl es schwierig ist, die erforderliche absolute Größe einer Wechselwirkungsbibliothek zu schätzen, stellt die Natur mit der Immunreaktion einen Hinweis bereit: eine Diversität von 10⁷ bis 10⁸ unterschiedlichen Antikörpern stellt mindestens eine Kombination mit ausreichender Affinität bereit, um mit den meisten potentiellen Antigenen, mit denen ein Organismus konfrontiert ist, zu interagieren. Publizierte in vitro-Selektionstechniken haben auch gezeigt, dass eine Bibliothekengröße von 10⁷ bis 10⁸ ausreichen ist, um Strukturen mit einer Affinität für das Ziel zu finden. Eine Bibliothek aus allen Kombinationen eines Peptids von 7 bis 20 Aminosäuren Länge, wie sie allgemein hierin vorgeschlagen wird, besitzt das Potential, für 20⁷ (10⁹) bis 20²⁰ zu kodieren. Daher ermöglichen die vorliegenden Verfahren mit Bibliotheken aus 10⁷ bis 10⁸ unterschiedlichen Molekülen einen „Arbeits"-Satz einer theoretisch vollständigen Interaktions- bzw. Wechselwirkungsbibliothek für 7 Aminosäuren, und einen Satz aus Formen bzw. Shapes für die 20²⁰-Bibliothek. Daher werden in einer bevorzugten Ausführungsform mindestens 10³ unterschiedliche Kandidaten-Mittel durchgescreent, wobei mindestens 10⁴ bevorzugt ist, mindestens 10⁵ bis 10⁶ besonders bevorzugt ist, und in einigen Fällen, abhängig von den Screening-Techniken, 10⁷, 10⁸ oder 10⁹ unterschiedliche Kandidaten-Mittel, die simultan in den vorliegenden Verfahren analysiert werden. Bevorzugte Verfahren maximieren Bibliothekengröße und -diversität.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Kandidaten-Mittel eine bekannte Droge bzw. ein bekanntes Arzneimittel, z.B. ein bioaktives Mittel, von dem bekannt ist, dass es mindestens eine wünschenswerte Wirkung aufweist. Wie jedoch ausführlicher unten ausgeführt, weisen viele Arzneimittel Nebenwirkungen oder Toxizitätsprobleme auf, und die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um die Mechanismen der Toxizität aufzuhellen und um nach einer zweiten Generation von Arzneimittel-Analoga zu screenen, die nicht so viele oder keine Nebenwirkungen aufweisen. Zum Beispiel können die Peaks eines Spektrums mit Toxizität in Verbindung stehen, was durch die Verwendung von klassischen Markern oder Farbstoffen identifiziert wird, beispielsweise Lebensfähigkeitsfarbstoffen, oder Massentags, wie im Stand der Technik bekannt. Zusätzlich werden in einigen Ausführungsformen zwei oder mehr Drogen bzw. Arzneimittel zu der Probe simultan oder nacheinander hinzu gegeben, um die Untersuchung von Arzneimittelwechselwirkungsmechanismen und Komplikationen zu ermöglichen oder um einen biologischen/metabolischen Stoffwechselweg oder ein Enzym zu blockieren.
Wie vom Fachmann anerkannt werden wird, gibt es eine breite Vielfalt möglicher Drogen bzw. Arzneimittel, die in der vorliegenden Erfindung eine Anwendung finden können, abhängig von dem Assay und den gewünschten Eigenschaften. Zum Beispiel umfassen bei Krebsanwendungen geeignete Krebs-Arzneimittel antineoplastische Arzneimittel einschließlich alkylierender Mittel wie Alkylsulfonate (Busulfan, Improsulfan, Piposulfan); Aziridine (Benzodepa, Carbochon, Meturedepa, Uredepa); Ethylenimine und Methylmelamine (Altretamin, Triethylenmelamin, Triethylenphosphoramid, Triethylenthiophosphamid, Trimethylolmelamin); N-Lost-Verbindungen (Chloramucil, Chlornaphazin, Cyclophosphamid, Estramustin, Ifosfamid, Mechlorethamin, Mechlorethaminoxidhydrochlorid, Melphalan, Novembichin, Phenesterin, Prednimustin, Trofosfamid, Uracil-Lost); Nitrosoharnstoffe (Carmustin, Chlorzotocin, Fotenmustin, Lomustin, Nimustin, Ranimustin); Dacarbazin, Mannomustin, Mitobranitol, Mitolactol; Pipoproman; Doxorubicin und Cisplatin (einschließlich seiner Derivate), jedoch nicht darauf beschränkt.
Insbesondere im Hinblick auf kardiovaskuläre Erkrankungen gibt es eine Vielzahl geeigneter Drogen bzw. Arzneimittel, die zu Zellen gegeben werden können, um den Wirkmechanismus aufzuhellen, die Reaktion bei dem Biomolekül-Spiegel zu charakterisieren, oder relevante Biomoleküle im Stoffwechselweg einer Arzneimittelwirkung zu identifizieren. Diese umfassen Statine (Cholesterinherabsetzende Mittel, die Cholesterin-Synthese durch Inhibieren von HMGCoA-Reduktase blockieren, welche Atorvastatin, Pravastain, Lovastatin, Cerivastatin, Sinvastatin umfassen), Fibrate (Fenofibrat, Bezafibrat, Gemfibrozil), Niacin, Nicotinsäure, Östrogene, Gallensäure-bindende Harze (einschließlich Cholestyramin und Colestipolhydrochlorid), ACAT-Inhibitoren, Inhibitoren der intestinalen Cholesterin-Absorption, PPAR-Liganden, (alpha, gamma, etc.), und Liganden von Kernfaktor wie RXR, FXR, ROR, etc.; jedoch nicht darauf beschränkt.
Geeignete Diabetes-Arzneimittel umfassen Biguanide (einschließlich Metformin, Phenformin und Bufomin, jedoch nicht darauf beschränkt); Sulfonylharnstoffe (einschließlich Tolbutamid, Acetohexamid, Tolazomid, Chlorpropamid, Glipizid und Glyburid, jedoch nicht darauf beschränkt); Thazolidindion-Derivate (einschließlich Ciglitazon, Ploglitazon, Englitazon und Troglitazon, jedoch nicht darauf beschränkt); und andere, die in Cornicelli, Atherosclerosis 2(2):43 (1999) beschrieben sind, jedoch nicht darauf beschränkt.
Geeignete Arzneimittel bei Hypertonie umfassen Betablocker, ACE-Inhibitoren, Diuretika; Angiotensin-Inhibitoren wie Losartan, etc., jedoch nicht darauf beschränkt.
Die bioaktiven Kandidaten-Mittel werden mit einer Zelle oder einer Population von Zellen vereinigt oder zu diesen hinzu gegeben. Geeignete Zelltypen für unterschiedliche Ausführungsformen sind oben erläutert. Das bioaktive Kandidaten-Mittel und die Zellen werden vereinigt. Wie vom Fachmann anerkannt werden wird, kann dies auf eine Vielzahl von Wegen erreicht werden, einschließlich Zugabe der Kandidaten-Mittel auf die Oberfläche der Zellen, zum Medium, das die Zellen enthält, oder auf eine Oberfläche, auf welcher die Zellen wachsen oder mit der sie in Kontakt stehen; Zugabe der Mittel in die Zellen, zum Beispiel unter Verwendung von Vektoren, die die Mittel in die Zellen einbringen werden (d.h. wenn die Mittel Nukleinsäuren oder Proteine sind). Wie vom Fachmann anerkannt werden wird, gibt es eine breite Vielfalt von Verabreichungsverfahren, die verfügbar sind, einschließlich der Verwendung von Vesikeln und anderen Vehikeln wie Liposomen, organischen Lösungen, Dispersionen, Suspensionen, Elektroporation, etc.
Im Allgemeinen werden die Kandidaten-Mittel zu den Zellen gegeben (entweder extrazellulär oder intrazellulär, wie oben ausgeführt), und zwar unter Reaktionsbedingungen, die eine Mittel-Target-Wechselwirkung begünstigen. Im Allgemeinen wird es sich dabei um physiologische Bedingungen handeln. Inkubationen können bei jeder Temperatur durchgeführt werden, welche eine optimale Aktivität erleichtert, typischerweise zwischen 4 und 40°C. Inkubationszeiten werden im Hinblick auf eine optimale Aktivität ausgewählt, aber sie können auch optimiert werden, um ein schnelles Hochdurchsatzscreening zu erleichtern. Typischerweise werden zwischen 0,1 und 4 Stunden ausreichend sein, bevorzugt zwischen 0,1 und 1 Stunde. Überschüssiges Reagenz wird im Allgemeinen entfernt oder weggewaschen.
Eine Vielzahl anderer Reagenzien bzw. Mittel kann in die Reaktionen und Assays aufgenommen werden, wie unten ausgeführt. Diese umfassen Reagenzien wie Salze, neutrale Proteine, z.B. Albumin, Detergenzien, etc., welche verwendet werden können, um eine optimale Protein-Protein-Bindung zu erleichtern und/oder nicht-spezifische oder Hintergrunds-Wechselwirkungen zu vermindern. Auch Reagenzien, die auf andere Weise die Effizienz des Assays verbessern, wie Protease-Inhibitoren, Nuklease-Inhibitoren, antimikrobielle Mittel, etc., können verwendet werden. Das Gemisch aus Komponenten kann in jeder Reihenfolge hinzu gegeben werden, die für eine Analyse und ein Screening sorgt, wie eben notwendig. Das Waschen oder Spülen der Zellen wird, wie vom Fachmann anerkannt werden wird, zu unterschiedlichen Zeiten vorgenommen, und es kann die Verwendung einer Filtration und Zentrifugation umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden eher Störmittel- bzw. -faktoren, „Pertubatoren", verwendet, als eine Chemikalie oder eine biochemische Gruppierung als Kandidaten-Mittel zu verwenden. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Pertubator" auf einen physikalischen oder nicht-physikalischen Parameter oder einen Reiz bzw. Stimulus, der eine Reaktion oder eine Störung bzw. Pertubation in einem biologischen System auslöst (auf zellulärer, Gewebe- oder Organismus-Ebene). Physikalische Stimuli umfassen Umgebungs- bzw. Umwelt-Bedingungen (einschließlich Gas, Geruchsstoffe, Stromschlag, Bestrahlung und andere physikalische Einflüsse, jedoch nicht darauf beschränkt), lebende Organismen (einschließlich Bakterien-, Virus-, Hefen-, Pflanzen- oder Tier-Parasiten, jedoch nicht darauf beschränkt) und fremde Substanzen (z.B. ein Transplantiertes oder aufgepfropftes Organ oder Gewebe, ein Implantat), jedoch nicht darauf beschränkt. Nicht-physikalische Stimuli umfassen Umgebungsbedingungen (einschließlich kalter oder heißer Temperaturen, Druck, jedoch nicht darauf beschränkt), oder emotionale Zustände (einschließlich Angst, Stress, mentale Herausforderung, emotionale Störung, sexuelle Anziehung und Vergnügen, jedoch nicht darauf beschränkt); sie sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Sobald die Zellen dem Kandidaten-Mittel bzw. den Kandidaten-Mitteln ausgesetzt wurden und es ihnen ermöglicht wurde, für eine gewisse Zeitspanne zu inkubieren, können mehrere Schritte durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Zellen, wenn zum Beispiel Bibliotheken von Kandidaten-Mitteln zu den Zellen hinzu gegeben wurden, im Hinblick auf einen veränderten Phänotyp durchgescreent werden, um Zellen zu isolieren, die einen erwünschten Phänotyp aufzeigen. Diese isolierten Zellen werden dann einer FTMS unterzogen, um die zugrunde liegenden Wirkungen auf biomolekularer Ebene aufzuhellen und zu charakterisieren. Das heißt, ein biochemischer „Fingerabdruck" eines wünschenswerten Phänotyps kann erzeugt werden und er kann in Drogen- bzw. Arzneimittelentwicklungsprogrammen verwendet werden, als ein Beispiel. Wenn die Bibliotheken klein sind oder wenn einzelne Drogen oder Sätze von Drogen verwendet wurden, kann alternative dazu jede Zellpopulation einer FTMS-Analyse unterzogen werden, wie oben ausgeführt, um den „Fingerabdruck" der Wirkung der Droge herauszufinden. Wiederum kann diese Art der Analyse, wie unten ausgeführt, verwendet werden, um Datenbanken für unterschiedliche Gewebe, unterschiedliche Drogen, etc. aufzubauen.
Daher werden die Zellen in einer bevorzugten Ausführungsform, nach Zugabe von Bibliotheken von Kandidaten-Mitteln zu einer Population von Zellen, im Hinblick auf einen veränderten Phänotyp durchgemustert. Mit „veränderter Phänotyp" oder „veränderter Physiologie" oder anderen grammatikalischen Äquivalenten ist hierin gemeint, dass der Phänotyp der Zelle auf irgendeine Weise verändert ist, bevorzugt auf irgendeinem detektierbaren und/oder messbaren Weg. Es sollte erwähnt werden, dass sowohl wünschenswerte (z.B. im Falle von Krebszellen das Auftauchen von Differenzierung) als auch unerwünschte (z.B. Entdifferenzierung) Phänotypen nützlich sind. Wie von der Fachwelt anerkannt werden wird, ist eine Stärke der vorliegenden Erfindung die breite Vielfalt von Zelltypen und potentiellen phänotypischen Veränderungen, welche unter Verwendung der vorliegenden Verfahren getestet werden können. Dementsprechend kann jede phänotypische Veränderung, welche beobachtet, detektiert oder gemessen werden kann, die Grundlage der hierin beschriebenen Screeningverfahren bilden. Geeignete phänotypische Veränderungen umfassen, ohne Einschränkung auf diese: grobe physikalische Veränderungen wie Veränderungen in Zellmorphologie, Zellwachstum, Zellüberlebensfähigkeit, Adhäsion an Substrate oder andere Zellen, Auftauchen von Lipidinklusion, und zelluläre Dichte; Veränderungen in der Expression einer oder mehrerer RNAs, Proteine, Lipide, Hormone, Cytokine oder anderer Moleküle; Veränderungen in einem Gleichgewichtsstadium (z.B. Halbwertszeit) oder einer oder mehrerer RNAs, Proteine, Lipide, Hormone, Cytokine oder anderer Moleküle; Veränderungen in der Lokalisation einer oder mehrerer RNAs, Proteine, Lipide, Hormone, Cytokine oder anderer Moleküle; Veränderungen in der Bioaktivität oder spezifischen Aktivität einer oder mehrerer RNAs, Proteine, Lipide, Hormone, Cytokine, Rezeptoren oder anderer Moleküle; Veränderungen in der Sekretion von Ionen, Cytokinen, Hormonen, Wachstumsfaktoren oder anderer Moleküle; Veränderungen bei zellulären/er Membran-Potentialen, -Polarisierungen, -Integrität oder -Transport; Veränderungen der Infektiösität, Empfänglichkeit, Latenz, Adhäsion und Aufnahme von Viren und bakteriellen Pathogenen; etc. Mit „fähig bzw. geeignet, den Phänotyp zu verändern" ist hierin gemeint, dass das bioaktive Mittel den Phänotyp der Zelle auf irgendeinem detektierbaren und/oder messbaren Weg verändern kann.
Der veränderte Phänotyp kann auf eine breite Vielfalt von Wegen detektiert werden, wie vom Fachmann anerkannt werden wird, und die Wege werden im Allgemeinen von dem Phänotyp, der verändert wird, abhängen und diesem entsprechen. Im Allgemeinen wird der veränderte Phänotyp zum Beispiel unter Verwendung der folgenden Modalitäten detektiert: mikroskopische Analyse der Zellmorphologie; Standard-Zell-Überlebensfähigkeits-Assays, einschließlich sowohl verstärktem Zelltod als auch erhöhter Zell-Lebensfähigkeit, zum Beispiel Zellen, die dann resistent gegenüber Zelltod durch Virus, Bakterien oder bakterielle oder synthetische Toxine sind; Standardmarkierungsassays, wie fluorometrische Indikatorassays im Hinblick auf die Anwesenheit oder den Spiegel an einer besondere Zelle oder in einem besondere Molekül, einschließlich FACS oder anderer Färbetechniken; biochemische Detektion der Expression von Targetverbindungen nach Abtöten der Zellen, etc. In einigen Fällen kann der veränderte Phänotyp die Veränderung im FTMS-Spektrum selbst sein; zum Beispiel kann bei Erkrankungen oder anderen Bedingungen, die keine großartigen phänotypischen Veränderungen hervorrufen, die Aufhellung der Veränderung unter Verwendung von FTMS durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zelle, sobald eine Zelle mit einem geänderten Phänotyp detektiert ist, von der Vielzahl derer isoliert, welche keine veränderten Phänotypen aufweisen. Das kann auf eine Vielzahl von Wegen durchgeführt werden, wie im Stand der Technik bekannt, und wird in einigen Beispielen vom Assay oder Screen abhängen. Geeignete Isolierungstechniken umfassen ohne Einschränkung auf diese FTMS, Selektion durch Lyse unter Verwendung von Complement, Zellklonierung, Scanning mittels Fluorimager, Expression eines „Überlebens"- bzw. „survival"-Proteins, induzierte Expression eines Zelloberflächenproteins oder anderen Moleküls, dem Fluoreszenz verliehen werden kann oder das zur physikalischen Isolierung markierbar ist; Expression eines Enzyms, das ein nicht-fluoreszentes Molekül in ein fluoreszentes umwandelt; Überwachsen gegen einen Hintergrund ohne oder mit langsamem Wachstum; Tod von Zellen und Isolierung von DNA oder anderer Zellvitalitäts-Indikatorfarbstoffe etc.
Die isolierten Zellen, z.B. die Zellen, die einen veränderten Phänotyp vermutlich aufgrund der Anwesenheit des Kandidaten-Mittels aufweisen, werden dann einer FTMS-Analyse unterzogen, wie unten beschrieben.
Ein deutlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit von FTMS, einzelne Zellen oder kleine Zellpopulationen zu analysieren. Dies ist besonders im Krebsbereich relevant, da Heterogenität von Proben Unklarheit verursachen kann. Die Mikrodissektion von Geweben und Metastasen kann sehr kleine Proben ermöglichen, so dass sie einzelne Zellen umfassen, welche dann unter Verwendung der vorliegenden Verfahren analysiert werden können. Zusätzlich gibt es eine Vielfalt experimenteller Techniken, die eine Einzelzellanalyse ermöglichen (z.B. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)), die mit den Techniken der vorliegenden Erfindung kombiniert werden können.
In einigen Ausführungsformen können die Kandidaten-Mittel (einschließlich Drogen bzw. Arzneimittel) eher zu den Zell-Lysaten hinzu gegeben werden, als zu den intakten Zellen. Wenn zum Beispiel die Drogen bzw. Arzneimittel nur schwach absorbiert werden, kann die direkte Zugabe zum Zell-Lysat in der Vereinfachung der Wirkungen resultieren. Zusätzlich werden Drogen-Stabilitäts- oder -Metabolismus-Studien häufig mit Zellhomogenaten durchgeführt.
Zusätzlich dazu sollte erwähnt werden, dass die Screening-Protokolle, die verwendet werden, um Kandidaten zu screenen, jede beliebige Anzahl von Hochdurchsatzscreening („high throughput screening", HTS)-Techniken verwenden können. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Systeme der vorliegenden Erfindung Flüssigkeitshandhabungs-Komponenten, einschließlich Kom ponenten zur Beladung und Entnahme von Flüssigkeiten an jeder Station oder an jedem Satz von Stationen. Die Flüssigkeitshandhabungs-Systeme können Robotersysteme umfassen, welche jede beliebige Anzahl von Komponenten umfassen. Zusätzlich können beliebig viele oder alle hierin ausgeführten Schritte automatisiert sein; die Systeme können zum Beispiel vollständig oder teilweise automatisiert sein.
Wie vom Fachmann anerkannt werden wird, gibt es eine breite Vielfalt von Komponenten, welche verwendet werden kann, einschließlich eines oder mehrerer Roboterarme, Plattenhandhabungssystemen für die Positionierung von Mikrotiterplatten; Haltern mit Kartuschen, Steckmodulen und/oder Kappen bzw. Deckeln; automatisierter Kappen- oder Deckel-Handhabungssystemen, um Deckel für Vertiefungen auf Nicht-Querkontaminierungs-Platten zu entfernen und zu ersetzen; Spitzenanordnungen für die Probenverteilung mit Wegwerfspitzen; waschbarer Spitzenanordnungen für die Probenverteilung; Ladeblöcken für 96 Vertiefungen (oder mehr); gekühlten Reagenzgestellen; Microtiterplatten-Pipetten-Positionen (wahlweise gekühlt); Gestelltürmen für Platten und Spitzen; und Computersystemen. Vollständige Roboter- oder Microströmungssysteme umfassen automatisierte Flüssigkeits-, Partikel-, Zell- und Organismus-Handhabung, einschließlich Hochdurchsatzpipettieren, um alle Schritte von Screeninganwendungen durchzuführen. Dies umfasst Flüssigkeits-, Partikel-, Zell- und Organismus-Manipulationen wie Absaugen, Verteilen, Mischen, Verdünnen, Waschen, genaue volumetrische Transfers; Aufnahme und Verwerfen von Pipettenspitzen; und wiederholtes Pipettieren von identischen Volumina für die multiple Verteilung einer einzelnen angesaugten Probe. Diese Manipulationen sind Flüssigkeits-, Partikel-, Zell- und Organismus-Transfers ohne Querkontaminierung. Dieses Instrument führt eine automatisierte Replikation von Microtiterplattenproben auf Filtern durch, auf Membranen und/oder auf Tochterplatten, Transfers mit hoher Dichte, serielle Verdünnungen vollständiger Platten, und Hochkapazitätsoperationen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden chemisch mit Derivaten versehene Partikel, Platten, Kartuschen oder Kassetten, Röhrchen, magnetische Partikel oder andere Festphasenmatrizes mit Spezifität für die Assaykomponenten verwendet. Die Bindungsoberflächen von Microtiterplatten, Röhrchen und jeglichen Festphasenmatrizes umfassen nicht-polare Oberflächen, hochpolare Oberflächen, modifizierte Dextranbeschichtungen, um kovalente Bindung zu fördern, Antikörperbeschichtung, Affinitätsmedien, um Fusionsproteine oder -peptide zu binden, an der Oberfläche befestigte Proteine wie rekombinantes Protein A oder G, Nukleotid-Harze oder -Beschichtungen, und andere Affinitätsmatrizes sind bei dieser Erfindung nützlich.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Plattformen für Platten mit multiplen Vertiefungen, Multi-Röhrchen, Halter, Patronen bzw. Kassetten, Miniröhrchen, Platten mit tiefen Vertiefungen, Microzentrifugenröhrchen, Kryogefäße, Platten mit eckigen Vertiefungen, Filter, Chips, optische Fasern, Kügelchen und andere Festphasenmatrizes oder Plattformen mit verschiedenen Volumina für eine zusätzliche Kapazität auf einer erweiterungsfähigen modularen Plattform angeordnet. Diese modulare Plattform umfasst einen Orbitalschüttler mit variierbarer Geschwindigkeit, und Multipositionsarbeitsdecks für Quellenproben, Proben und Reagenzverdünnung, Assayplatten, Proben- und Reagenz-Reservoirs, Pipettenspitzen, und eine aktive Waschstation.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Thermocycler und thermoregulierende Systeme wie Peltier-Systeme zur Stabilisierung der Temperatur der Hitzeaustauscher verwendet, wie beispielsweise kontrollierte Blocks oder Plattformen, um eine genaue Temperaturkontrolle bei der Inkubation von Proben von 4°C bis 100°C sicherzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden austauschbare Pipettenköpfe (einzelne oder Multikanal) mit einzelnen oder multiplen magnetischen Sonden, Affinitätssonden, oder Pipettiermaschinen als Roboter die Flüssigkeiten, Partikel, Zellen und Organismen manipulieren. Magnetische Trennapparate im Multi-Vertiefungs- oder Multi-Röhrchen-Format manipulieren Flüssigkeiten, Partikel, Zellen und Organismen im Einzel- oder multiplen Probenformat.
In einigen Ausführungsformen wird die Ausstattung einen Detektor umfassen, wobei es sich um eine breite Vielfalt von unterschiedlichen Detektoren handeln kann, abhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von Markierungen und dem Assay. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen nützliche Detektoren ein Mikroskop bzw. mehrere Mikroskope mit multiplen Fluoreszenzkanälen; Plattenleser, um Fluoreszenz-, Ultraviolett- und sichtbare spektrophotometrische Detektion mit einzelnen und dualen Wellenlängen-Endpunkten und kinetischer Fähigkeit zu ermöglichen, Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET), Lumineszenz, Quenching, Zwei-Photonen-Anregung, und Intensitätsumverteilung; CCD-Kameras, um Daten und Bilder aufzunehmen und in quantifizierbare Formate umzuwandeln; einen Computerarbeitsplatz; und ein oder mehrere Barcode-Lesegeräte.
Diese Instrumente können in eine Laminarstrom- oder Abzugs-Haube passen oder sie sind abgeschlossen, in einem abgeschlossenen System, und zwar für Zellkulturwachstum und Transformation in Platten mit vielen Vertiefungen oder Röhrchen und für gefährliche Operationen. Ganz ähnlich können Operationen unter einer kontrollierten Umgebung wie beispielsweise einem Inertgas durchgeführt werden (zum Beispiel um Lipidoxidation zu verhindern). Die lebenden Zellen können unter kontrollierten Wachstumsbedingungen gezogen werden, mit Kontrollen in Bezug auf Temperatur, Feuchtigkeit und Gas über Zeitserien des Lebendzellassays. Automatisierte Transformation von Zellen und automatisierte Koloniepicker werden ein schnelles Screening erwünschter Zellen erleichtern.
Durchflusszytometrie oder Kapillarelektrophoreseformate können für das individuelle Entnehmen bzw. Aufnehmen magnetischer und anderer Kügelchen, Partikel, Zellen und Organismen verwendet werden.
Die flexible Hardware und Software ermöglicht eine instrumentelle Anpassungsfähigkeit für vielfältige Anwendungen. Die Softwareprogrammmodule ermöglichen die Gestaltung, Modifikation und das Durchführen von Verfahren. Die diagnostischen Systemmodule ermöglichen eine instrumentelle Anordnung, korrekte Verbindungen, und Motoroperationen. Die maßgeschneiderten Werkzeuge, Laborwaren und Flüssigkeits-, Partikel-, Zell- und Organismen-Transfer-Muster ermöglichen es, dass unterschiedliche Anwendungen durchgeführt werden. Die Datenbank ermöglicht die Speicherung von Verfahren und Parametern. Roboter- und Computer-Interfaces erlauben die Kommunikation zwischen Instrumenten.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Robotervorrichtung einen Prozessor bzw. eine Zentraleinheit, welche über eine Sammelleitung (Bus) mit einem Speicher und einem Satz von Input/Output-Geräten (z.B. Tastatur, Maus, Monitor, Drucker, etc.) kommuniziert. Wie hierin diskutiert, kann dies zusätzlich zu oder anstelle der CPU für die FTMS-Datenanalyse der Fall sein. Die allgemeine Interaktion zwischen einem Prozessor bzw. einer Zentraleinheit (CPU), einem Speicher, Input/Output-Geräten und einer Sammelleitung (Bus) ist im Stand der Technik bekannt. Daher wird eine Vielfalt unterschiedlicher Verfahren, abhängig von den durchzuführenden Experimenten, im CPU-Speicher gespeichert.
Diese Roboter-Flüssigkeitshandhabungssysteme können eine Vielzahl unterschiedlicher Reagenzien verwenden, einschließlich Puffer, Reagenzien, überkritische Flüssigkeiten und Gase (insbesondere für die Extraktion), Proben, Waschflüssigkeiten, Assaykomponenten, etc. Ganz ähnlich können alle Komponenten (Kapillaren, Verbindungen, etc.), wenn die Probe begrenzt ist, minimiert werden, um große Todvolumina oder Verdünnungseffekte zu verhindern.
Sobald die Zellen identifiziert sind und wahlweise die Kandidaten-Mittel hinzu gegeben sind, einschließlich Drogen bzw. Arzneimitteln, werden die Zellen für die FTMS-Analyse vorbereitet. Wie vom Fachmann anerkannt werden wird, kann dies von einer einfachen Lyse bis zu aufwendigeren Auftrennungstechniken reichen, abhängig von der Klasse der Moleküle, die zu untersuchen sind. Wie vom Fachmann anerkannt werden wird, können unterschiedliche Moleküle aufgrund einer Vielzahl unterschiedlicher Parameter klassifiziert werden, einschließlich Molekülart (z.B. proteinös, Lipid, Nukleinsäure, Kohlenwasserstoff, Metabolite, kleine Moleküle, etc.), der Größe des Moleküls (z.B. bezieht sich „kleines Molekül" im Allgemeinen auf Moleküle mit weniger als im Groben 2500 bis 1500 Dalton) oder auf der Grundlage anderer Eigenschaften des Moleküls (z.B. polar gegenüber nicht-polar, geladen, Metallionen-enthaltend, Bindungseigenschaften, etc.). Zum Beispiel können geeignete Moleküle für die Untersuchung Metaboliten (einschließlich Kataboliten) umfassen, die als Produkte von enzymatischen Reaktionen oder Oxidations-Reduktions-Reaktionen erzeugt wurden. Solche Metaboliten umfassen verschiedene kleine Moleküle, die in Nahrungsmitteln vorhanden sind (z.B. Vitamine, Fremdsubstanzen, Xenobiotika, Toxine, oxidierte Lipide, Pestizide, abgebaute Moleküle von Xenobiotika, etc.), sie werden durch enzymatischen Abbau von Nahrungsmitteln (z.B. Aminosäuren, insbesondere essentiellen Aminosäuren, Drogen bzw. Arzneimitteln, Fettsäuren, insbesondere essentiellen Fettsäuren, Glycolyse-Zwischenprodukten und -Endprodukten) erzeugt, werden durch die Zellen synthetisiert (Hormone, Neurotransmitter, Toxine, Prostaglandine, etc.), oder sind aus anderen Gründen vorhanden (teilweise metabolisierte Drogen bzw. Arzneimittel, etc.).
Im Allgemeinen wird eine Minimalpräparation durchgeführt, wie Extraktion der Zellen oder Zell-Lysate in ein für FTMS geeignetes Lösungsmittel, mit Zugabe von Puffern, Salzen und anderen Reagenzien, wie notwendig oder erwünscht.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Präparation von Proben für FTMS mittels jedes Verfahrens, das dem Fachmann bekannt ist, erreicht werden. Bevorzugt umfasst die Probenaufbereitung einen Entsalzungsschritt, um die Sensitivität und Auflösung der FTMS zu erhöhen. Zusätzlich wird, wie vom Fachmann anerkannt werden wird, die Kombination von präparativen Schritten, Lö sungsmitteln, Aufreinigungs- und Auftrennungs-Schemata von der Klasse bzw. den Klassen an Biomolekülen abhängen, die zu untersuchen sind. Meistens ist jedoch keine vorläufige Auftrennung erforderlich.
In einer Ausführungsform werden Proben mittels einer Proteinpräzipitation vorbereitet, gefolgt von einer Entsalzungsbehandlung. Eine Lösung aus Methanol und Wasser (49:49:2, Wasser:Methanol:Essigsäure V:V:V) wird zu jeder der Proben hinzu gegeben und die Proben werden abgekühlt. Dies präzipitiert die Proteine an den Boden des Röhrchens. Jedes Röhrchen wird dann zentrifugiert und der Überstand wird dekantiert. Für den Entsalzungsschritt wird eine kleine Menge (ungefähr 100 mg) DOWEX-Ionentauscherharz zu jedem Gefäß gegeben, und es wird ihm erlaubt, sich für ungefähr 10 Minuten abzusetzen. Die Probe wird dann zentrifugiert und der Überstand wird entfernt. Diese Lösung wird dann in den Massenspektrometer eingebracht.
Jedes Lösungsmittel, das dem Fachmann bekannt ist, kann in Verbindung mit einer Ionenquelle in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Dimethylsulfoxid, Acetonitril, N,N-Dimethylformamid, Propylencarbonat, Methylenchlorid, Nitromethan, Nitrobenzol, Hexan, Methanol und Wasser. Das Lösungsmittel kann mehr als ein Lösungsmittel umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Lösungsmittel eine Lösung aus Methanol und Wasser (49:49:2, Wasser:Methanol:Essigsäure V:V:V).
Die Auswahl eines geeigneten Lösungsmittels wird von der Art der Biomoleküle, deren Detektion durch FTMS zu erreichen ist, abhängen. Eine Lösung aus Methanol und Wasser wird als Lösungsmittel verwendet, wenn die Detektion löslicher Moleküle mittels FTMS erreicht werden soll, während Hexan verwendet werden kann, wenn die Detektion apolarer Moleküle wie Lipiden erreicht werden soll. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Probenquelle (z.B. Gewebe, Zellen) in unterschiedlichen Lösungsmitteln extrahiert und jede Extraktion wird einer FTMS unterzogen, so dass eine vollständigere Analyse der Moleküle, die in der Probenquelle vorhanden sind, erreicht werden kann.
Proben werden wahlweise gereinigt oder aufgetrennt, bevor mit dem FTMS-Verfahren begonnen wird. Nützliche Auftrennungstechniken umfassen, ohne Einschränkung auf diese, HPLC unter Verwendung von Wirbelstromchromatographie, Flüssigchromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Affinitätschromatographie, Chromatographie mit überkritischen Flüssigkeiten, Gaschromatographie (GC), Elektrophorese (einschließlich Kapillarelektrophorese, Polyacrylamidgelelektrophorese, Agarosegelelektrophorese, jedoch nicht auf diese beschränkt), Festphasenextraktion und Flüssigphasenextraktion, bevorzugt unter Verwendung unterschiedlicher Lösungsmittel (z.B. Chlorofonn/Methanol für Lipide, Wasser für polare Moleküle). Die Kapillare der Ionenquelle kann mit Silicakügelchen gefüllt sein (derivatisiert oder nicht) oder mit anderen Materialien, um eine Chromatographie/Auftrennung durchzuführen.
Zusätzlich sollte erwähnt werden, dass Aufreinigungs- und Auftrennungs-Techniken bei Proben simultan oder nacheinander durchgeführt werden können, in unterschiedlichen Reihenfolgen und in unterschiedlichen Kombinationen. Daher kann zum Beispiel eine einfache Proteinpräzipitation bei einem Teil der Probe durchgeführt werden, und dann ein HPLC-Schritt. Ganz ähnlich können Teile von Proben (z.B. Teile der zellulären Populationen) unterschiedlichen Techniken bei der Untersuchung oder Identifikation von Peaks unterworfen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird während eines bestimmten FTMS-Durchlaufs nur eine Art Biomolekül untersucht. Zum Beispiel können die Aufreinigungs-/Auftrennungs-Schemata so erzeugt werden, dass nur Proteine einer vorgegebenen Masse untersucht werden. Nachfolgende FTMS-Durchläufe können unterschiedliche Techniken auf derselben Probe zur Anwendung bringen, um zu ermöglichen, dass eine andere Untergruppe an Biomolekülen untersucht wird.
Alternativ dazu und auch bevorzugt werden mehr als eine Biomolekülart während eines einzelnen FTMS-Durchlaufs untersucht. Das heißt, Proteine und Lipide, Proteine und Kohlenhydrate, Proteine und kleine Metaboliten, etc. können gleichzeitig in der vorliegenden Erfindung untersucht werden.
Wie vom Fachmann anerkannt werden wird, kann jede Anzahl an Biomolekülen unter Verwendung von FTMS analysiert werden. Die Biomoleküle können alle vom selben Typ sein (z.B. Proteine) oder Gemische. Geeignete Biomoleküle in diesem Zusammenhang sind Proteine, wie oben definiert, Nukleinsäuren, Lipide, Kohlenhydrate und Metaboliten.
Die biologische Probe wird ionisiert, bevor die Probe der Massenspektroskopie unterzogen wird. Jedes Ionisationsverfahren, das die in der biologischen Probe vorhandenen Moleküle nicht zerstört, kann verwendet werden. Solche Methoden sind von Barker, 1999, „Mass Spectrometry", 2. Ausgabe, John Wiley & Sons, Ltd., England, beschrieben.
In einer Ausführungsform kann die biologische Probe mittels chemischer Ionisierung ionisiert werden. Chemische Ionisierung verwendet ein Reagenzion, das durch Bombardieren von Methan mit Elektronen unter Verwendung einer Elektronenstoßquelle erzeugt wird, um die Moleküle der biologischen Probe durch Proton- oder Hydrid-Transfer zu ionisieren. Alternativ dazu kann ein Elektronenstoß direkt verwendet werden, welcher einen Elektronenstrahl verwendet, um Gasphasen-Atome oder -Moleküle zu ionisieren. Das Elektron aus dem Strahl, das für gewöhnlich aus einem Wolfram-Filament erzeugt wird, ionisiert die Moleküle in der biologischen Probe, indem ein Elektron aus Atomen oder Molekülen herausgeschlagen wird.
In einer anderen Ausführungsform kann die biologische Probe mittels Glow Discharge Plasma ionisiert werden. Glow Discharge Plasma umfasst die Verwen dung von einem heißen, teilweise ionisierten Gas bei niedrigem Druck zwischen zwei Elektroden, um Atome anzuregen und zu ionisieren.
In einer anderen Ausführungsform wird schneller Atombeschuss (FAB) unter Verwendung eines Hochenergiestrahls neutraler Atome (typischerweise Xe oder Ar) verwendet, um die in der biologischen Probe vorhandenen Moleküle zu ionisieren. Der Strahl der Hochenergieatome wird erzeugt, indem Ionen von einer Ionenquelle über eine Ladungsaustauscherzelle beschleunigt werden, die daraus hervorgehenden Kollisionen resultieren in der Ionisierung des neutralen Atoms.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird Feldionisation verwendet, um die Moleküle zu ionisieren, die in der biologischen Probe vorhanden sind. In der Feldionisation werden elektrische Felder verwendet, die ausreichend stark sind, um Moleküle dazu zu veranlassen, Elektronen zu verlieren. Solche Felder werden in einer Ionenquelle erzeugt, indem eine hohe Spannung zwischen einer Kathode und einer Anode angelegt wird, welche als Feldemitter bezeichnet werden. Ein Feldemitter besteht aus einem Draht, der mit mikroskopischen Graphitdendriten bedeckt ist, welche das wirksame Feld an den Graphitendpunkten sehr stark verstärken.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird Plasmadesorptionsionisation angewandt, um die Moleküle zu ionisieren, die in der biologischen Probe vorhanden sind. Plasmadesorptionsionisation nutzt den Verfall von ²⁵²Cf aus, welcher zwei Spaltungsfragmente erzeugt, die in entgegengesetzte Richtungen wandern, ein Fragment trifft die biologische Probe, wobei Ionen aus den Molekülen in der Probe herausgeschlagen werden, und das andere trifft einen Detektor und löst den Start der Datenaufnahme aus.
In noch einer weitere Ausführungsform werden die in der biologischen Probe vorhandenen Moleküle durch Laserionisation ionisiert. Kurz, ein Laserpuls löst Material von der Oberfläche einer Probe heraus und bildet ein Microplasma, das einen Teil der Probeninhaltsstoffe ionisiert. Der Laserpuls erreicht sowohl eine Verdampfung als auch eine Ionisierung der Probe.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die in der biologischen Probe vorhandenen Moleküle unter Verwendung von Matrix-unterstützter Laser-Desorptions-Ionisation (MALDI) ionisiert. Die biologische Probe wird in einer festen Matrix, wie Nicotinsäure, dispergiert, und ein UV-Laserpuls löst die Matrix heraus. Die Matrix führt einige der großen Moleküle in einer ionisierten Form in die Gasphase mit, wonach diese in einen Massenspektrometer extrahiert werden können.
In der besonders bevorzugten Ausführungsform wird Elektrosprayionisierung (ESI) verwendet, um die in der biologischen Probe vorhandenen Moleküle zu ionisieren. Die ESI-Quelle besteht aus einer sehr feinen Nadel und einer Serie von Skimmer-Blenden. Eine Probenlösung wird in die Quellenkammer gesprüht, um Tröpfchen zu bilden. Die Tröpfchen tragen eine Ladung, wenn sie aus der Kapillare austreten, und mit Verdampfen des Lösungsmittels verschwinden die Tröpfchen und lassen hoch-geladene Moleküle in der biologischen Probe zurück. ESI ist bevorzugt, weil es für große biologische Moleküle nützlich ist, die schwierig zu verdampfen oder zu ionisieren sind. Zusätzlich sind Nanospraytechniken und -geräte im Stand der Technik bekannt und finden in der vorliegenden Erfindung eine Anwendung.
Andere Ionisierungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können bei der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Verfahren umfassen Resonanzionisierung, Sekundärionisierung und eine Funkenquelle, sind aber nicht darauf beschränkt.
Bei jeder beschriebenen Ionenquelle kann ein positiver oder ein negativer Ionisierungsmodus verwendet werden. Beim positiven Ionisierungsmodus wird oft eine Spur Ameisensäure hinzugegeben, um bei der Protonierung der Probenmoleküle zu helfen. Beim negativen Ionisierungsmodus wird eine Spur Ammoniumlösung oder ein flüchtiges Amin hinzu gegeben, um bei der Deprotonierung der Probenmoleküle zu helfen. Proteine und Peptide werden für gewöhnlich unter positiven Ionisierungsbedingungen analysiert, und Saccharide und Oligonukleotide unter negativen Ionisierungsbedingungen.
Die Proben werden dann in den FTMS eingebracht. Fourier-Transformations-Massenspektrometrie (FTMS) ist auch als Fourier-Transformations-Ionenzyklotronresonanz (FTICR) bekannt. Die Prinzipien der Bestimmung der molekularen Masse dieser Technik basieren auf einer umgekehrten linearen Beziehung zwischen der Masse eines Ions und seiner Zyklotron-Frequenz. Ein Ion (oder ein geladenes Partikel), das einem starken magnetischen Feld ausgesetzt wird, erfährt eine zirkuläre natürliche Bewegung, die als Zyklotronrotation bezeichnet wird. Ionen entgegengesetzter Ladung drehen sich in entgegengesetzte Richtungen. Bei FTMS grenzt die Zyklotronrotation die Ionen radial gegeneinander ab; das Hinzufügen eines elektrischen Wechselfeldes senkrecht zur Achse des magnetischen Feldes grenzt die Ionen axial ab. Diese Konfiguration umfasst, was im Allgemeinen als Ionenfalle bezeichnet wird. Die Frequenz der Zyklotronrotation eines Ions ist umgekehrt proportional zu seinem Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) und direkt proportional zur Stärke des angelegten magnetischen Feldes. Daher besitzen Ionen mit geringer m/z Zyklotronfrequenzen, die höher sind als jene von Ionen mit hohen m/z.
Wenn Ionen mit m/z's in der Ionenfalle vorhanden sind, wird die Ionenansammlung zu größeren Zyklotronorbits bzw. – radien angeregt, indem eine sich verändernde bzw. wechselnde Hochfrequenzanregung angelegt wird. Die sich verändernde bzw. wechselnde Hochfrequenzanregung enthält Frequenzkomponenten, die dem interessierenden Zyklotronfrequenzbereich entsprechen. Die sich in Orbitalen bzw. Umlaufbahnen befindlichen, kreisenden Ionenwolken – Ionen einer einzelnen Zyklotronfrequenz bei jeder m/z-Umlaufbahn – induzieren einen Bildstrom auf zwei oder mehr Detektionselektroden des Spektrometers. Der Bildstrom produziert Sinuskurven, die die Zyklotronfrequenz von jeder angeregten Ionenwolke besitzen. Dieses Signal ist eine Überlagerung von Sinuskurven, welche, wenn sie einer Fourier-Transformation unterworfen werden, zu einer extrem präzisen Messung der Zyklotronfrequenzen von jedem Bestandteil der Ionenansammlung führen. Dieses nicht-destruktive Bildstromdetektionsschema ist insbesondere für FTMS einzigartig und stellt einen deutlichen Vorteil im Hinblick auf Sensitivität und Vielseitigkeit dar, verglichen mit herkömmlichen destruktiven Detektionsmethoden. Dieses nicht destruktive FTMS-Detektionsschema kann auch zur wiederholten Messung von Ionen ausgenutzt werden, was zu Verbesserungen in der Sensitivität aus multiplen Messungen derselben Ionenpopulation führt. Das Signal-Rauschen-Verhältnis erhöht sich mit der Quadratwurzel zur Anzahl der Messungen; zum Beispiel nach vier Messungen verbessert sich das Signal-Rauschen-Verhältnis zweifach. Ein anderer Weg, das Signal zu erhöhen, ist es, genügend Ionen in die Falle zu „pumpen", um das Signal zu erhöhen. Sobald die Zelle „voll" ist, wird die Analyse durchgeführt. Massenspektroskopien, bei denen n > 2 ist, z.B. Tandem- oder erweiterte mehrstufige massenspektrometrische Studien, können ebenfalls auf einer Ionenpopulation durchgeführt werden, bei der Fragmentionen von Interesse selektiv in der FTMS-Falle zurückgehalten werden können, weiter aufgetrennt werden können, und erneut detektiert werden können. Diese mehrstufigen Studien bieten eine verbesserte strukturelle Information mit einer signifikanten Verbesserung der Gesamtsensitivität. FTMS ist in der Lage, eine femtomolare Sensitivität der Detektion zu ermöglichen. Wenn eine Ionenfragmentierung durchgeführt wird, spielt die Erfahrung des Massenspektroskopisten eine wichtige Rolle. Moleküle, die zwei Peaks niederer Intensität entsprechen, können fragmentiert werden, aber es können nicht alle Fragmente identifiziert werden, weil die Intensität zu klein werden wird. Wenn es zu viele Fragmente gibt, können einige durch andere „ausgelöscht" werden.
HICS-FTMS wendet FTMS an, um extrem komplexe biologische Gemische zu analysieren, die bis zu mehreren hundert Peaks innerhalb eines relativ engen Massebereichs bieten können. Unerwarteterweise ist die hohe Auflösung von FTMS- Scan erforderlich, um die Komponenten eines komplexen Gemisches zu unterscheiden, die im Hinblick auf m/z sehr nah beieinander liegen. FTMS bietet eine höhere Auflösung, indem mehr unterscheidbare „Kanäle" für die Masse bereitgestellt werden. Die meisten biologischen Moleküle, die Peaks entsprechen, welche bei dieser Art Analyse beobachtet werden, sind nicht identifizierbar, zumindest anfänglich nicht, bis Datenbanken von HICS-FTMS-Peakprofilen und die Identitäten von Molekülen, die diesen individuellen Peaks entsprechen, zusammengestellt sind. Die hohe Masse-Messungs-Genauigkeit, die mit FTMS erreicht werden kann, kann ausgenutzt werden, um die chemischen Strukturen und/oder Sequenzen zu identifizieren. FTMS ist in der Lage, routinemäßig Massenmessungsfehler zu erreichen, die bei weniger als (±)-3 ppm liegen und daher können extrem kleine Massedifferenzen aufgelöst werden. Zum Beispiel weisen C₁₃H₂₀N₂O₃ und C₁₄H₂₄N₂O₂ dieselbe nominelle Masse auf (MW = 252,1468 bzw. 252,1832), unter Verwendung von FTMS sind sie aber im Hinblick auf ihre tatsächlichen Massen aufgrund der 0,0364 Da-Differenz (oder 144 ppm relativer Abweichung) unterscheidbar.
Jeder kommerziell erhältliche Fourier-Transformations-Massenspektrometer kann bei HIC-Screening und/oder -Analyse verwendet werden. In einer Ausführungsform ist der Massenspektrometer ein Ultima FT- Massenspektrometer (der mit einer Kombination aus ESI und MALDI Ionisierungssystemen ausgerüstet ist und mit 4,7, 7,0 oder 7,4 T-Magneten erhältlich ist; IonSpec Corporation, Irvine, California). In einer anderen Ausführungsform ist der Massenspektrometer, der verwendet wird, um die vorliegende Erfindung auszuführen, ein FTMS^® 1000, 2000; FT/MS 2001; T30 FTMS, T70 FTMS oder ein NewStar (Finnigan San Jose, California). In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Massenspektrometer ein APEX III (Bruker Daltonics, Inc.; Fillerica, Massachusetts), erhältlich mit einem 9,4 T-Magneten und ESI- und MALDI-Quellen.
Die FTMS kann in einem FTMS-Servicelaboratorium durchgeführt werden, wie dem National High Magnetic Field Lab in Tallahassee, Florida; dem Environ mental Molecular Sciences Laboratory (EMSL; Abteilung für Energie, Pacific Northwest National Laboratory (PNNL), Richland, Washington), welches ein öffentlich zugängliches FTMS-Gerät bereitstellt (mit einem 11,5 T Weitbohrungs-Hochleistungs-Fourier-Transformations-Massenspektrometer und einem 7 T ESI-Fourier-Transformations-Massenspektrometer).
Die Leistungsfähigkeit des Magnetfeldes des Massenspektrometers ist für das Erreichen der Auflösung, die für HIC-Analyse und das Screenen mittels FTMS notwendig ist, entscheidend. Bevorzugt ist ein Magnet mit mindestens 7 Tesla (für eine obere Massengrenze der Detektion von ungefähr 66 kDa) zu verwenden. Noch mehr bevorzugt wird ein 9,4 Tesla Magnet verwendet (für eine obere Massengrenze der Detektion von ungefähr 120 kDa).
Die erfindungsgemäßen biologischen Proben können in den Massenspektrometer manuell (z.B. unter Verwendung einer handgetriebenen Pipette oder Spritze) oder über einen Roboter eingebracht werden. Bei Screenings mittels HICS-FTMS im Großmaßstab ist eine Beladung mittels Roboter für eine verbesserte Effizienz bevorzugt.
Bei einer beispielhaften Ausführungsform werden die biologischen Proben über ein PEEK-Rohr mit 64 μ Innendurchmesser in den Massenspektrometer eingebracht, welches mit einem Roboter für automatische Probennahme („autosampling robot", GILSON, Modell 215) verbunden ist. Der Roboter für automatisierte Probennahme kann so programmiert sein, dass er kleine Volumina (30 μl) von sogar 960 Probenvertiefungen abnehmen kann. Wenn jede Probe als 100 μl Extrakt präpariert ist, können 70 μl für zukünftige Verwendung aufbewahrt werden. Zwischen den jeweiligen Injektionen in die Transferreihe werden Nadel und Injektor mit 500 μl Lösung gewaschen, um eine Kreuzkontaminierung zu vermeiden. Eine konstante Durchflussrate einer mobilen Phase (30 μl/min bestehend aus 49:49:2 Methanol, Wasser, Essigsäure V:V) wird in die ESI-Quelle eingebracht. Aliquots von Proben, die mittels des Autosamplers erhalten werden, werden über eine Schleife in diesen Strom injiziert. Unter diesen Bedingungen kann eine Probendurchlaufsrate von ungefähr 1 Probe pro 3 Minuten erreicht werden. Sobald die Spektren für die 960 Proben erhalten wurden und digital gespeichert wurden, können weitere 960 Proben in den Massenspektrometer eingebracht werden. Der Roboter kann für multiple Durchläufe programmiert werden.
Zusätzlich kann eine Vielfalt von Programmen verwendet werden, um die derzeitigen Techniken zu maximieren und auszunutzen. Zum Beispiel kann die Beladung mit kleinen reproduzierbaren Mengen von Proben unter Verwendung einer Vielfalt von Microflüssigkeitstechniken einschließlich Kapillarelektrophoresetechniken, die Proben unter Verwendung von Kapillarverknüpfungen, die „T"s bilden, aufladen, erreicht werden. Das kann zur Auftrennung von Proben führen, wobei ein Teil in die FTMS injiziert wird und ein Teil entweder gelagert wird oder für andere Analysen verwendet wird; zum Beispiel können biologische Assays mit einem Teil der Probe durchgeführt werden. Zusätzlich können die Durchflussraten eingestellt werden; wenn zum Beispiel ein interessierender Peak von der HPLC-Säule elutiert wird, kann die Durchflussrate herabgesetzt werden, um zum Beispiel eine nachfolgende Fragmentierung zu ermöglichen.
Wie oben ausgeführt, ist der Massenspektrometer wahlweise mit einem HPLC-Roboter zur Probenauftrennung vor dem Einbringen in den Massenspektrometer gekoppelt. Eine Standardkalibrierung des Systems wird zusätzlich durchgeführt.
Wie bei jedem Hochdurchsatzverfahren, das in der Lage ist, einen großen Informationsgehalt schnell zu erhalten, ist Datenmanagement ein wichtiger Aspekt. Bei der hierin beschriebenen Erfindung werden sich die hauptsächlichen Informationstypen auf FTMS-Profile in unterschiedlichen Zelltypen beziehen (behandelt mit einem Testmolekül gegenüber unbehandelt; erkrankt gegenüber normal, unterschiedliche Gewebe, unterschiedliche Patientenproben; Zellen unterschiedlicher Stadien der Differenzierung oder Stress etc.), und indirekt auf die Moleküle, die sich bei den unterschiedlichen Zelltypen unterscheiden, und daher auf die Wirkung eines vorgegebenen Arzneimittels, einer vorgegebenen Droge oder eines Krankheitszustands auf das Molekül.
Wie vom Fachmann anerkannt werden wird, gibt es eine breite Vielfalt an Verfahren und Systemen, die verwendet werden können, um die Information zu sammeln und weiter zu verarbeiten bzw. zu prozessieren.
Das Erfassen und die grundlegende Analyse von HICS-FTMS- oder HICA-FTMS-Spektren kann die fertig erhältliche kommerzielle Software ausnutzen, die für die Analyse komplexer Daten gestaltet wurde. In einer Ausführungsform wird Omega Version 7,32-bit Windows 98 Software für das Erfassen und die Analyse von Fourier-Transformations-Massenspektren verwendet (IonSpec Corporation, Irvine, California). In einer anderen Ausführungsform wird MassSpec Calculator^TM Professional (ChemSW, Fairfield, California), eine Software, die für 32-bit-Prozessoren (Windows 95, 98 oder NT) optimiert ist. MassSpec Calculator^TM Professional stellt Zeichnungs-, Fragmentierungs- und Autofragmentierungsfähigkeiten bereit. Die Software unterstützt 79 Elemente, einschließlich aller Elementdaten wie Masse, Anzahl an Isotopen, und die Masse jedes Isotops und die relative Häufigkeit. In noch einer weiteren Ausführungsform wird eine Software wie XMASS^TM oder HYSTAR^TM bei dem Erfassen und der Analyse von Fourier-Transformations-Massenspektren verwendet (Bruker Daltonics, Inc.; Billerica, Massachusetts). In einer anderen Ausführungsform wird Charisma Software verwendet (Finnigan San Jose, California).
Die Daten, die unter Verwendung der grundlegenden Software erhalten werden, können bequem unter Verwendung von relationalen oder Tabellendatenformaten gehandhabt werden. Zusätzlich wird es in vielen Fällen nützlich sein, bei jeder neu erhaltenen Molekularsequenz in einer lokalen Datenbank zu suchen, beispielsweise in Strukturen, die über nicht-öffentliche Experimente erhalten wurden, und schließlich in globalen Datenbanken.
Man kann sich spezialisierte Tools ausmalen, die die Daten visualisieren, welche aus den vorliegenden Verfahren erhalten wurden, um die Muster der Gen- und Protein-Expression und das Spektrum an biologischen, einschließlich metabolischen Wirkungen, die bestimmte Behandlungen oder Erkrankungszustände hervorrufen, und zwar in spezifischen Zellen oder Organismentypen, zu interpretieren. Zum Beispiel können solche Tools multiple paarweise Vergleiche umfassen, oder ein Mittelungs- oder Summationsverfahren, das die kumulativen Ergebnisse mehrerer Experimente darstellt, beispielsweise um jene HICS-FTMS-Peaks zu identifizieren, die entweder am häufigsten durch Behandlung mit einer bestimmten Klasse von Drogen bzw. Arzneimitteln verändert wurden, oder welche am häufigsten mit einer spezifischen Nebenwirkung in Verbindung stehen, als Nebenprodukt bestimmter Therapien. Viele Datenbanken, Analysepakete, Suchmaschinen und graphische Schnittstellen können für die HICS-FTMS angepasst werden oder sie können für diese Zwecke speziell gestaltet werden. Also Grundeinstellung, Signal/Peak-Erkennungsprogramme, Peakzusammenfassungsprogramme, eine große Anzahl statistischer Analyseprogramme, einschließlich der Berechnung von durchschnittlichen oder Durchschnittspeaks, Mittelung von Massenspektren, Standardabweichungen, Testen von Hypothesen, Konfidenzintervallen, Clusteringanalyse, etc. Eine breite Vielfalt statistischer Analysen ist allgemein in Texten wie Freund und Walpole, Mathematical Statistics, Prentice Hall, Inc. New Jersey, 1980 beschrieben.
Ein beispielhaftes bevorzugtes Verfahren zur Identifizierung zellulärer Komponenten, deren Spiegel bzw. Level sich bei unterschiedlichen Zelltypen verändern, umfasst die folgenden Schritte:

1. Auswahl von Peaks, die bestimmte Kriterien erfüllen, aus jedem interessierenden Spektrum, und Ausschreiben dieser Peakinformation in Dateien. (siehe 1)
2. Auswahl der Peaks von den verschiedenen Spektrendatenverzeichnissen, Zuordnen zu notwendiger Behandlung und experimentellen Bedingungen, und Kombinieren der Daten zu einer einzelnen Datei. Abgleichen von Peaks zwischen den Spektren unter Verwendung von Clustering-Algorithmen und Ummarkieren von jedem Peak mit dem Durchschnitt der Massen aus dem entsprechenden Cluster. (siehe 2 und 3)
3. Analysieren der daraus hervorgehenden Daten (Behandlungsbedingungen, durchschnittliche Clustermasse, und relative Intensität) im Hinblick auf den Einfluss unterschiedlicher Behandlungen auf die relative Intensität (Menge, Abundanz) für jeden Massecluster (chemisches Gebilde).

Peakauswahl: Unter Bezugnahme auf 1, bei Schritt 110 werden Massenspektren von einem Apex II Massenspektrometer erfasst und prozessiert. Ein Macro, das für eine XMASS Software geschrieben wurde (Version 5.0.10, Bruker Daltonics, Inc.), verwendet eine interne XMASS-Macro-Einrichtung, um einen vorbestimmten Satz an Massenspektren zu öffnen, und zwar jeweils einzeln (siehe Schritte 115, 135 und 140) bei Schritt 120. „Spec[i]" bezeichnet das i-te Spektrum unter allen Spektren.
Bei Schritt 125 werden Parameter für die Auswahl von Peaks eingestellt, die die Sensitivität (PC), Anzahl (MaxPks) und den Bereich (pp) regulieren. PC ist die Peakauswahl („peak picking")-Sensitivität, die mit einem akzeptablen Signal-Rauschen-Verhältnis in Beziehung steht. Höhere Werte (> ~10) an PC wählen nur die hohen, herausstechenden Peaks aus einem Spektrum aus. Niedere Werte an PC (< ~2,5) wählen größere Anzahlen von Peaks aus, die sich weniger gut vom Hintergrund unterscheiden, was die Auswahl von Peaks mit niedriger Abundanz bzw. Menge, zusammen mit Rauschen, ermöglicht. Ein bevorzugtes Verfahren verwendet Werte von 2,5, 5 und 10. Diese Werte wurden basierend auf empirischen Beobachtungen ausgewählt. MaxPks ist die maximale Anzahl an Peaks, die ausgewählt wird. Wenn MaxPks = 1 ist, dann wird nur ein Peak ausgewählt (für gewöhnlich der Herausstechendste), unabhängig von der Einstellung der anderen Parameter. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dieser Wert auf eine sehr hohe Zahl eingestellt (z.B. 10.000), so dass alle Peaks, die die anderen Parameter erfüllen, ausgewählt werden. pp ist die Funktion, die aufgerufen wird, um die Peaks tatsächlich auszuwählen. Wenn diese ausgewählt wird, wird der Bereich des Spektrums, der betrachtet werden soll, als x- und y-Koordinaten bereitgestellt. Da alle Peaks in den beobachteten Spektren unter 1000 m/z lagen und keine Peaks größer als 1,5 waren, werden diese Werte in einer bevorzugten Ausführungsform so eingestellt: x0 = 0, y0 = 0, x1 = 1000 und y1 = 2,0.
Bei Schritt 130 wird der XMASS-Peak-Picking-Algorithmus (pp) für das Spektrum verwendet, um Peaks basierend auf den Parametern, die in Schritt 125 eingestellt wurden, herauszupicken bzw. auszuwählen. Die daraus hervorgehenden Peaks werden in eine ASCII-Textdatei herausgeschrieben (writePeaks). Die Daten in diesen Dateien umfassen die Masse von jedem ausgewählten Peak, und die relative Intensität bei der sie gemessen wurde.
Kombination von Peakdaten von allen Spektren: Unter Bezugnahme auf 2 bei Schritt 210 werden Peaks von jedem Spektrum mittels XMASS als getrennte Datei in einem Unterverzeichnis bei dem entsprechenden Spektrum abgespeichert.
Eine kurze Erklärung, wie die XMASS-Software Spektren organisiert, ist angezeigt. Die Organisation basiert vollständig auf Verzeichnishierarchien. Ein Verzeichnis wird ausgewählt, wobei Daten gespeichert werden sollten, während die Proben prozessiert werden. Während die Proben prozessiert werden, werden sie von eins bis zur Gesamtanzahl von Proben durchnummeriert, und jedes Probenergebnis (Spektrum und zusätzliche Informationen) wird in ein Unterverzeichnis abgelegt, das im Hinblick auf die Probennummer bezeichnet wird (XMASS bezieht sich hierauf als Experimentennummer). Innerhalb dieser Experimentennummerverzeichnisse gibt es ein Unterverzeichnis, das pdata genannt wird, welches nummerierte Unterverzeichnisse aufweist, die mit 1 beginnen, für jedes Mal, wenn die Probe analysiert wird (jeweils mit einem eigenen Spektrum). Innerhalb dieses Verzeichnisses werden die ASCII-Peakfiles geschrieben. Weil die XMASS-Software keinen bequemen Weg aufweist, experimentelle Bedingungen nachzuvollziehen, müssen sorgfältige Aufzeichnungen während der Prozessierung von Proben vorgenommen werden, um die erzeugten Experimentennummern diesen Bedingungen zuzuweisen.
Bei Schritt 220 werden die Daten aus diesen Dateien ausgewählt bzw. extrahiert und zu einer einzelnen Datei zusammengestellt, zusammen mit den relevanten Informationen über die Behandlung und die experimentellen Bedingungen, die mit der gemessenen Probe in Verbindung stehen, zu der jedes Spektrum gehört. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Programm (das unten gezeigt ist) in der Perl-Programmiersprache (Perl, Version 5.0.6, Copyright 1987–2000, Larry Wall), das experimentellen Bedingungen Experimentennummern zuweist, jede Peakdatei öffnet, den Inhalt dieser Datei liest und die experimentellen Bedingungen zusammen mit der Masse und der relativen Intensität in eine Datei ausschreibt. Alle interessierenden Proben sollten zu einem bestimmten Zeitpunkt durchgeführt werden, so dass die Daten in eine gemeinsame Datei ausgeschrieben werden können. Dieser Prozess wird jedesmal wiederholt, wenn die Peaks mit unterschiedlichen Werten für die Sensitivitätsparameter reprozessiert werden.
Per1-Programm:
Die Daten aus dieser kombinierten Datei werden dann in eine statistische Programmumgebung importiert (R. Version 1.0.1, Ihaka & Gentleman (1996), „R: A Language for Data Analysis and Graphics", Journal of Computational and Graphical Statistics 5:299–314).
Es ist sehr üblich, dass es geringe Abweichungen bei den aufgenommenen Peakmassen gibt, die bei den Spektren dasselbe chemische Gebilde repräsentieren. Daher müssen, um einen sinnvollen Vergleich von Peaks zwischen den Spektren zu ermöglichen, Peaks, die wahrscheinlich zu demselben chemischen Gebilde gehören, identifiziert werden und auf geeignete Weise markiert werden. Diese Aufgabe wird unter Verwendung eines Clustering-Algorithmus erfüllt.
Wiederum unter Bezugnahme auf 2 werden bei Schritt 130 Peakcluster-Sensitivitätsparameter eingestellt. Peakcluster-Sensitivitätsparameter, unabhängig von dem verwendeten Clustering-Algorithmus, werden bevorzugt auf der Grundlage von praktischer Erfahrung mit den Daten ausgewählt. Das Ziel ist es, alle Massen über die Spektren hinweg, von denen man glaubt, dass sie dasselbe chemische Gebilde repräsentieren, zu kombinieren, und keine anderen. Bei Schritt 140 werden Peaks, die Spektren gemein sind, unter Verwendung eines Clustering-Algorithmus aufgefunden. Für den Clustering-Prozess von diesem Schritt, (der weiter in 3 veranschaulicht ist) und die vorhandenen Daten multipler Experimente hat man herausgefunden, dass ein maxDist-Wert von 0,0008 bemerkenswert gut funktioniert. Benachbarte Peaks werden selten vermischt und Peaks, die einander zu entsprechen scheinen, werden in Clustern angeordnet. Unter Verwendung von speziell kodierten Funktionen werden Peaks, die bei den Massenspektren gemein sind bzw. einander entsprechen, unter Verwendung des relativ zielgerichteten Clustering-Algorithmus identifiziert, und zwar mit den angegebenen Sensitivitätsparametern, wie veranschaulicht in 3.
Unter Bezugnahme von 3 bei Schritt 310, wird ein variabler maxDist-Wert eingestellt, der maximal erlaubte Abstand zwischen Peakmassen innerhalb eines Clusters. Bei Schritt 315 wird massVec gebildet und numerisch sortiert, ein Vektor aus eindeutigen bzw. einzigartigen Massen aus allen Peaks, die aus allen Spektren ausgewählt wurden. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet einen Sortierungsalgorithmus, der von R bereitgestellt wird, obwohl der Fachmann erkennen wird, dass andere Sortierungsalgorithmen in diesem Zusammenhang verwendet werden können. Die ausgewählten Peaks von allen Spektren sind die Peaks in der kombinierten Datendatei, deren Bildung in Schritten 210 und 220 beschrieben ist (siehe 2). Bei Schritt 220 wird der Zähler mCnt, welcher verwendet wird, um den Vektor massVec zu wiederholen, anfänglich auf 2 eingestellt; ein Vektor growClust wird anfänglich auf den skalaren Wert massVec[1] eingestellt und ein variabler clustDict wird anfänglich als leere assoziative Reihe aufgestellt (hier auch als Hash-Tabelle oder Liste bezeichnet).
Bei Schritt 325 wird der Zähler mCnt mit der Länge von massVec verglichen. Wenn mCnt nicht größer ist als die Länge von (der Anzahl der Elemente in) massVec, dann wird bei Schritt 330 der Wert von massVec[mCnt] – mass- Vec[mCnt – 1] mit maxDist verglichen. Wenn der Wert von massVec[mCnt] – massVec[mCnt – 1] nicht größer als maxDist ist, dann wird angenommen, dass der Peak, der von massVec[mCnt] repräsentiert wird, zu demselben Cluster gehört wie massVec[mCnt – 1], somit wird bei Schritt 335 das Element massVec[mCnt] ans Ende des Vektors growClust geschoben, welcher schon massVec[mCnt – 1] enthält, wodurch ein Element der Länge von growClust zuwächst. Bei Schritt 340 wird der Zähler mCnt um 1 erhöht, und Schritt 325 wird wiederholt.
Wenn bei Schritt 330 der Wert von massVec[mCnt] – massVec[mCnt – 1] größer als maxDist ist, dann wird angenommen, dass der Peak, der von massVec[mCnt] repräsentiert wird, zu einem neuen Peak-Cluster gehört, so dass bei Schritt 345 die Peakmassen, die dem vorherigen Cluster entsprechen, welcher in dem Vektor growClust enthalten ist, zur Cluster-Dictionary clustDict hinzugefügt werden und der Probe ein ungewichteter Durchschnitt der Elemente in growClust als Clustername zugeteilt wird. Bei Schritt 350 wird die Variable glowClust dem Element massVec[mCnt] zugewiesen, wodurch der vorherige Gehalt von growClust überschrieben wird. Bei Schritt 340 wird der Zähler mCnt um 1 erhöht, und Schritt 325 wird wiederholt.
Wenn bei Schritt 325 der Wert von mCnt größer ist als die Länge von massVec, so dass alle Peakmassen in Clustern zusammengefasst wurden, dann werden bei Schritt 355 die Endgehalte von growClust clustDict hinzugefügt, wie in Schritt 345. Bei Schritt 360 wird die Cluster-Dictionary clustDict verwendet, um jede Peak-Masse im Datensatz aller ausgewählter Peaks, die in Schritt 220 erzeugt wurden, neu zu markieren bzw. umzubenennen (siehe 2).
Der Fachmann wird erkennen, dass andere Clusteringalgorithmen, als der, der in 3 veranschaulicht ist, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten. Eine Standard-Literaturstelle für andere Verfahren der Clusteranalyse ist: Kaufmann L. und Rousseeuw, P.J. (1990). Finding Groups in Data: An Introduction to Cluster Analysis. Wiley, New York. Andere bevorzugte Ausführungs formen der vorliegenden Erfindung wenden Clusteralgorithmen an, die in der oben-genannte Literaturstelle offenbart sind (oder in anderen Literaturstellen, die dem Fachmann bekannt sind), wobei jeder seinen eigenen Satz an Sensitivitätsparametern aufweist, die einzustellen sind, um ein annehmbares Maß unbeaufsichtigter Reproduzierbarkeit zu erreichen, wenn eine Anwendung auf Peakmuster stattfindet, die aus der Analyse unterschiedlicher Experimente stammt.
Wiederum unter Bezugnahme auf 2, sobald alle Peak-Cluster identifiziert sind, wird die Masse für jeden Peak in jedem Spektrum neu benannt, und zwar als gewichteter Durchschnitt der Massen innerhalb des entsprechenden Clusters. Mit der entsprechenden Behandlungs- und Experimentbedingungs-Information (z.B. Droge bzw. Arzneimittel, dessen Konzentration und Probentyp), durchschnittlicher Cluster-Masse und relativer Intensität, sind die Daten ausreichend informativ für eine Analyse bei Schritt 260.
Analvsieren der Behandlungswirkung auf relative Peakintensitäten:
In einer bevorzugten Ausführungsform sucht die primär durchgeführte Analyse nach Verhältnissen zwischen experimentellen Bedingungen und relativer Intensität (chemischem Vorhandensein bzw. Menge bzw. Abundanz) für jeden Peak (jede Chemikalie), jeweils einzeln und in Kombination. Beispiele umfassen, ohne Einschränkung, die Analyse der Wirkungen verschiedener Arzneimittelkonzentrationen für ein gegebenes Arzneimittel, unterschiedlicher Expositionszeiten gegenüber einem Arzneimittel, Vergleiche verschiedener Arzneimittelkonzentrationen und/oder Expositionszeiten unter vielen Arzneimitteln, und Vergleiche von einer Arzneimittelreaktion unter vielen biologischen und medizinisch relevanten Probentypen und experimentellen Bedingungen. Unter Verwendung der R-Programmierumgebung werden höhere Graphiken, allgemeine lineare Modelle und Verfahren der Clusteranalyse und Mustererkennung verwendet, um Peaks und Peakmuster von Interesse zu identifizieren.
Ein Fachmann wird anerkennen, dass es viele andere Wege gibt, auf welche diese Art von Daten verwendet werden können, um interessierende Frage in der pharmazeutischen und biotechnischen Industrie anzugehen. Beispiele für anderen Zusammenhänge, bei welchen das offenbarte Verfahren anwendbar wäre, sind in Abschnitten 5.6-5.10 unten offenbart, und sie umfassen, ohne Einschränkung darauf die Verwendung von biologisch relevanten Zell-basierten Modellen und Patientenproben für das Folgende: (1) simultane Messung und Analyse von Arzneimitteleinfluss auf gesamte metabolische Stoffwechselwege; (2) Zuordnung bekannter und/oder unbekannter Arzneimittel und chemischer Verbindungen zu funktionellen Gruppen, basierend auf ihrem Gesamteinfluss auf eine metabolische Aktivität; (3) Identifizieren neuer biochemischer Metabolite oder Katabolite oder Stoffwechselwege; (4) Definitionen von metabolischen Peakprofilen für Arzneimittel und chemische Verbindungen; und (5) Untergruppierung von Patienten auf Grundlage von metabolischen Grundprofilen und/oder Grundprofilen in Reaktion auf Arzneimittelbehandlung, um eine vorsichtige Anpassung von Behandlungskuren zu ermöglichen; und (6) SAR-Analyse in Kombination mit oder ohne Kombination mit Software wie Catalysis (MSI), um eine gezielte Datensuche durchzuführen und/oder neue aktive Moleküle zu kreieren.
Die Bestimmung der Identität eines Peaks im Profil kann auf eine Vielfalt von Wegen durchgeführt werden. Moleküle, welche in einer biologischen Probe vorhanden sein können, umfassen proteinöse Moleküle, einschließlich Glykoproteine, Lipoproteine, Proteine, Polypeptide, Peptide, Peptoide und Aminosäuren, jedoch nicht darauf beschränkt), Nukleinsäuren (einschließlich Polynukleotiden, Oligonukleotiden, Nukleotiden, Nukleosiden, DNA oder ein Derivat davon, oder RNA oder ein Derivat davon, jedoch nicht darauf beschränkt), Kohlenhydrate (einschließlich Polysacchariden, Oligosacchariden und Sacchariden, jedoch nicht darauf beschränkt), Lipiden (einschließlich gesättigter und gesättigter Phospholipide, Glykolipide, Lipopolysaccharide, Lipoproteine, Cholesterin und dessen Analoge, und Glyzeriden, jedoch nicht darauf beschränkt) und kleine Moleküle (einschließlich organischer Moleküle und anorganischer Moleküle). Jedes dieser Moleküle kann in seinem nativen Zustand vorliegen oder in chemisch modifizierten Formen.
Der Vergleich von Massenspektren von Extrakten von Testproben (z.B. von potentiell erkrankten Zellen oder Zellen, die mit einer Testverbindung behandelt wurden), verglichen mit Kontrollen oder Referenzproben (z.B. von normalen oder unbehandelten Zellen), ermöglicht die Identifizierung von Peaks, die erhöht oder erniedrigt sind (z.B. im Hinblick auf die Dosis der Arzneimittel oder die Schwere der Erkrankung), sowie von Peaks, die nicht variieren. Mit der Kenntnis der genauen Masse des Peaks kann es einfach möglich sein, das Molekül zu identifizieren (entweder direkt im Fall von einem kleinen Molekül, oder durch Aufhellen der chemischen Formel von einem oder mehreren Fragmenten im Falle eines großen Moleküls). Der erste Schritt ist es, die Peaks für kleine Moleküle zu bestimmen. Es gibt mindestens zwei Wege dafür, die allgemeine Formel zu bestimmen. Zuerst werden allgemeine Elemente, einschließlich C, N, H und O, jedoch nicht auf diese beschränkt, in einer linearen Kombination verwendet, um das Molekül zu rekonstituieren. Wie vom Fachmann anerkannt werden wird, wird in einigen Fällen die molekulare Masse ein zusätzliches Proton oder ein zusätzliches Atom in Betracht ziehen (zum Beispiel ein Natrium-Atom, im Falle dass die Verbindung mit Natrium versehen ist). Mehrfache Möglichkeiten werden untersucht, unter Verwendung von zugeordneten statistischen Wahrscheinlichkeiten. Ein zweiter Ansatz ist es, die geeignete Datenbank zu durchsuchen, die auf bekannten molekularen Massen basiert, wobei eine Isotopenverfügbarkeit berücksichtigt wird. Von den möglichen Kandidaten werden nur biologische Einträge in Betracht gezogen. Bei großen Molekülen wird ein Fragmentierungsschritt verwendet, um die Identifizierung des Moleküls zu ermöglichen. Zusätzlich wird die Erwägung mehrfach geladener Peaks zur Anwendung kommen.
Metabolische Stoffwechselwege in biologischen Systemen sind meist gut charakterisiert und alle identifizierten Peaks (Moleküle) könnten auf einem Diagramm, das den metabolischen Stoffwechselweg darstellt, angeordnet werden. Indem ein Molekül in einem metabolischen Stoffwechselweg identifiziert wird, das durch ein Arzneimittel oder einen Krankheitszustand verändert ist, ist es möglich, dafür einen Wirkungsmechanismus vorzuschlagen. Wenn das Molekül noch nicht bekannt ist, könnte seine Identifizierung zur Entdeckung eines neuen biochemischen Metaboliten oder Stoffwechselweges führen. Pleiotropische Effekte können ebenfalls entdeckt werden.
Um die chemische Struktur eines großen interessierenden Moleküls zu untersuchen, wird das Molekül bevorzugt fragmentiert und die Struktur von einem oder mehreren seiner Fragmente identifiziert. Vor der Fragmentierung kann die Natur des Moleküls jedoch durch einen oder durch zwei Ansätze bestimmt werden.
Der erste ist der biochemische Ansatz. Die Probe eines bestimmten FTMS-Peaks kann mit einem Enzym wie Nuklease behandelt werden, welches Nukleinsäuren hydrolysiert. Die behandelte Probe wird wiederum einer FTMS unterzogen. Die Abwesenheit oder das Vorhandensein des Peaks wird festlegen, ob die Probe Nukleinsäuren enthält. Die Probe kann ganz ähnlich mit einer oder mit mehreren Proteanen behandelt werden, mit Glukosidasen und Lipasen, um die Anwesenheit von Proteinen, Zuckern oder Lipiden in dem Molekül, das den interessierenden Peak hervorruft, festzustellen. Bevorzugt werden mehrere Klassen von Enzymen verwendet, so dass Moleküle, die mehr als eine Klasse von Komponenten umfassen (z.B. Glykolipide, Lipoproteine), so als Protein und Zucker identifiziert werden können. Ein zweites Verfahren, das möglicherweise angewandt werden kann, ist ein chemischer Ansatz. Eine Probe kann aufgrund ihrer chemischen reaktiven Eigenschaften identifiziert werden.
Die strukturelle Aufklärung kann in dem FTMS-Instrument durch Fragmentation des interessierenden Ions (Vorläuferions) durchgeführt werden. Um dies durchzuführen, wird zuerst ein Isolationspuls angewandt, um alle Ionen mit Ausnahme der Vorläuferionenpopulation „rauszuwischen". Wiederum wird ein Vorteil aus Cyklotronenfrequenzverhältnis gezogen und ein rf-Feld wird angelegt, welches eine Frequenz mit allen Ionen aufweist (Resonanz), welche aus der Falle (Detektor) ausgeworfen werden sollen. Die Ionen absorbieren in Form der Resonanz diese Strahlung und werden, bei ausreichender Energie, aus den Grenzen der Falle herausgetrieben. Dies lässt nur das Eltern-Ion (parent-ion) eingefangen in der Falle zurück.
Der nächste Schritt wird als Ionen-Aktivierungs-Prozess (Fragmentierungsschritt) bezeichnet. Dieser kann im Prinzip unter Verwendung von mehreren Verfahren durchgeführt werden, aber der bei FTMS am meisten verwendete ist die Kollisions-aktivierte Dissoziation („collisionally activated dissociation", CAD) oder die Infrarot-Multiphoton-Dissoziation (IRMPD). Der CAD-Prozess wird erreicht, indem eine rf-Frequenz angelegt wird, die mit der des Vorläuferions in Resonanz tritt. Es wird dem Ion genügend Energie zugeführt, um seine Cyklotronumlaufbahn anzuregen. Weil die Frequenz des Ions konserviert ist, wird seine Winkelgeschwindigkeit erhöht (d.h. es erlangt kinetische Energie), ein Pulsventil wird ausgelöst, um einen Stoß Kollisionsgas in den Fallenbereich einzuführen, indem die Ionen eingefangen sind. Zusätzlich können, wie von Fachmann anerkannt werden wird, unterschiedliche Gase verwendet werden (schwerere Gase erzeugen im Allgemeinen mehr Fragmente). Die angeregten Vorläuferionen führen energetische Kollisionen mit diesem Gas durch und dies induziert die Fragmentierung. Nach einer kurzen Abpumpverzögerung (um die neutralen Teilchen zu evakuieren) wird/werden das Produkt oder die Fragmentionen mit allen normalen Fähigkeiten detektiert, wie sie Abschnitt 5.2 oben beschrieben sind.
Eine IRMPD (Infrarot-Multiphoton-Dissoziation) ist im Prinzip noch einfacher zu implementieren. Die isolierten Ionen werden einem starken Strahl IR-Photonen ausgesetzt. Diese Photonen werden absorbiert und die Ionen werden durch die Vibrationen „heiß" bis zum Punkt der Aktivierung. Die daraus hervorgehenden Fragmentierungsprodukte werden detektiert.
Jede Methode produziert ein Fragmentierungsspektrum (das als MS/MS-Spektrum bezeichnet wird). Diese Art von Daten ist bei dem Untersuchen der Struktur sehr instruktiv. Beispielsweise kann, wenn ein Vorläuferion, das aus C₁₃H₂₀N₂O₃ oder C₁₄H₂₄N₂O₂ besteht, einem MS/MS-Experiment unterworfen wird, ein Peak beobachtet werden, welcher 46.005 Da geringer in der Masse ist als der Vorläufer, was darauf hindeutet, dass die Struktur CH₂O₂ verloren hat und mindestens eine Carboxylatgruppe enthält (d.h. Carbonsäure, Zucker, Lipid).
Der Zyklus der Isolierung und Fragmentierung kann immer und immer wieder an nachfolgenden Fragmentierungsionen durchgeführt weden (d.h. MSn). FTMS und andere Ionenfallenverfahren sind in der Lage, mehrere Schritte der Fragmentierung durchzuführen.
Sobald die gesamte oder eine teilweise Aminosäuresequenz eines isolierten Proteins experimentell bestimmt wurde, kann ein Computer verwendet werden, um verfügbare Datenbanken im Hinblick auf eine übereinstimmende Aminosäuresequenz oder eine Nukleotidsequenz zu durchsuchen, einschließlich eines „expressed sequence tags" (EST), dessen vorhergesagte Aminosäuresequenz mit der experimentell bestimmten Aminosäuresequenz übereinstimmt. Wenn keine übereinstimmende Nukleotidsequenz gefunden wird, wird ein degenerierter Satz von Nukleotidsequenzen, welche für die experimentell bestimmte Aminosäuresequenz kodieren, umgekehrt bearbeitet werden, mittels Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind; solch ein degenerierter Satz von Nukleotidsequenzen ist für die Klonierung des Gens, das für das isolierte Protein kodiert, und für die Expression des sequenzierten Proteins oder Peptidfragments nützlich. Alternativ dazu wird die Nukleinsäure fragmentiert und deren Fragmente sequenziert, wenn der FTMS-Peak einer Nukleinsäure entspricht. Fragmentsequenzen können verwendet werden, um das Gen zu identifizieren, zu welchem es gehört, z.B. Genbank. Wenn die Fragmentsequenz(en) zu keinem/keinen bekannten Gen(en) gehört, kann eine Nukleinsäure synthetisch hergestellt werden oder mittels PCR amplifiziert werden, und zwar entsprechend Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind; siehe z.B. Methods of Enzymology, Vol. 152, „Guide to Molecular Cloning Techniques", Herausgeber Berger und Kimmel (Academic Press 1987); Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harber Laboratory 1982), auf beide Literaturstellen wird vollständig expressis verbis Bezug genommen. Die so erzeugten Nukleinsäuren können verwendet werden, um eine genomische oder cDNA-Bibliothek durchzumustern, um das Voll-Längen-Gen zu identifizieren, zu welchem das Fragment gehört. Alternativ dazu kann die Sequenz des Gens oder mindestens ein offener Leserahmen davon, zu welchem die Nukleinsäure gehört, identifiziert werden, indem die Information, die mittels Sequenzierung überlappender Nukleinsäurefragmente des ursprünglich interessierenden HICS-FTMS-Peaks erhalten wurden, zusammengesetzt werden.
Zellen, die so genmanipuliert wurden, dass sie solch ein rekombinantes Protein exprimieren, können verwendet werden, um große Mengen des rekombinanten Proteins herzustellen, beispielsweise zur therapeutischen Verabreichung. Der Besitz des klonierten Gens erlaubt eine Gentherapie, um ein Protein zu ersetzen oder zu supplementieren, dessen Abwesenheit oder verminderte Expression mit einer Erkrankung in Verbindung steht. Der Besitz des klonierten Gens erlaubt ebenfalls die Verwendung einer Antisense- oder Tripple-Helix-Therapie, um die Expression eines Proteins zu unterdrücken, dessen Vorhandensein oder verstärkte Expression mit einer Erkrankung in Verbindung steht, oder die Ausnutzung rekombinanter Expression des Proteins in ausreichenden Mengen für Immuntherapie, um beispielsweise einen monoklonalen Antikörper dagegen zu ziehen, welcher chimerisiert werden kann (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 6851–6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312, 604–608; Takeda et al., 1985; Nature 314, 452–454), oder er kann humanisiert werden (siehe z.B. Queen, US-Patent 5,585,089 und Winter, US-Patent 5,225,539) und zwar vor der therapeutischen Verabreichung.
Die FTMS-Analyse führt zu einem Peakprofil. Ein Peakprofil ist die graphische Darstellung von dem, was vom Detektor des FTMS detektiert wird, es enthält eine Vielzahl von Peaks, die den unterschiedlichen Biomolekülen entsprechen (sowie unterschiedliche Peaks desselben Moleküls mit unterschiedlichen Isotopen), und Fragmenten von Biomolekülen sowie mehrfach geladenen Molekülen. Ein Peakprofil einer bestimmten Probe, die auf eine bestimmte Weise behandelt wurde, ist im Wesentlichen ein „Fingerabdruck" des Zustands der Probe; während bei zwei Zuständen jedes einzelne Biomolekül auf ähnliche Weise vorhanden sein kann, erlaubt die Ermittlung einer Vielzahl von Biomolekülen simultan die Erzeugung eines Peakprofils, welches für den Zustand der Zelle einzigartig ist. Dies entspricht den Genexpressionsprofil-„Fingerabdrücken", die auf Biochips erzeugt werden. Das heißt, normales Gewebe kann von Brustkrebsgewebe unterschieden werden, und innerhalb des Brustkrebsgewebes können unterschiedliche Prognosestadien bestimmt werden (gute oder geringe Aussichten für Langzeitüberleben beispielsweise). Ganz ähnlich können Peakprofile von Lungengewebe mit Nierengewebe verglichen werden, Profile von Brustkrebsproben von unterschiedlichen Patienten können verglichen werden, Profile von Proben vor, während oder nach einer Behandlung mit einem Arzneimittel, oder bei unterschiedlichen Arzneimittelkonzentrationen, können alle wie hierin beschrieben untersucht werden.
Wie vom Fachmann anerkannt werden wird, können diese Arten von Vergleichen unter Verwendung eines einzelnen Peakprofils von der Probe durchgeführt werden, oder mit multiplen Peakprofilen; beispielsweise kann die Probe auf mehrere Art und Weisen präpariert oder aufgetrennt werden, und die Peaks können einzeln analysiert werden, oder überlagert und kombiniert werden.
Indem Peakprofile von Proben in unterschiedlichen Zuständen verglichen werden, wird eine Information im Hinblick darauf erhalten, welche Biomoleküle bei diesen Zuständen wichtig sind (einschließlich Hoch- und Runterregulierung). Die Identifizierung von Biomolekülen, die unterschiedlich vorhanden sind (einschließlich Auftauchen oder Verschwinden oder Veränderungen in der Peakintensität) erlaubt die Verwendung dieser Information auf Vielzahl von Wegen, wie hierin ausgeführt. Beispielsweise kann eine Diagnose und eine Krankheitsüber wachung durchgeführt werden; die Evaluierung einer bestimmten Behandlungskur kann untersucht werden: verbessert ein chemotherapeutisches Arzneimittel die Langzeitprognose für einen bestimmten Patienten. Ganz ähnlich kann eine Diagnose durchgeführt werden oder durch Vergleich von Patientenproben mit den bekannten Peakprofilen bestätigt werden. Darüber hinaus ermöglichen diese Profile das Screenen von Arzneimittelkandidaten im Hinblick auf eine Nachahmung oder Veränderung eines bestimmten Peakprofils; beispielsweise kann ein Screening für Arzneimittel durchgeführt werden, das das Brustkrebs-Peakprofil unterdrückt oder ein Profil mit geringer Aussicht in ein besseres Prognose-Profil umwandelt.
Daher findet die vorliegende Erfindung in einer breiten Vielfalt von Anwendungen eine Anwendung. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die hierin dargestellten Verfahren verwendet, um Proben zu analysieren und Datenbanken aufzubauen und auf diese zurückzugreifen. In einer bevorzugten Ausführungsform ermöglichen die Verfahren die Erzeugung einer breiten Vielfalt von Datenbanken, insbesondere im Hinblick auf kleine Moleküle, aber nicht auf diese beschränkt, da die FTMS solch eine hohe Präzision ermöglicht.
Daher wird die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform verwendet, um schnell zelluläre oder Proben-Komponenten zu identifizieren. Unter Verwendung von FTMS in Verbindung mit anderer Chemie-Computersoftware, wie MSI CATALYST, kann eine schnelle Identifizierung und Charakterisierung neuer aktiver Moleküle durchgeführt werden. CATALYST ist ein Programm, das die mögliche aktive Form von Arzneimittelkandidaten untersucht. Durch den Durchlauf einer kleinen Bibliothek von Verbindungen und Suche nach einem wünschenswerten Spektrum von Attributen kann eine „Pharmacophor"-Beschreibung unter Verwendung von CATALYST oder ähnlichen Programmen erzeugt werden. Diese „Beschreibung" kann dann verwendet werden, um virtuelle Bibliotheken durchzumustern, um zusätzliche Kandidaten zu erzeugen, welche dann getestet werden können.
Zusätzlich sollte erwähnt werden, dass eine Quantifizierung und ein Vergleich unterschiedlicher Spektren auf eine Vielzahl von Wegen durchgeführt werden können. In einer Ausführungsform wird die Probe elektroversprüht (wobei die Verwendung einer Doppelsprayquelle bevorzugt ist) zusammen mit simultanem Versprayen einer Bezugsprobe, um eine Quantifizierung und einen Vergleich zu ermöglichen. Alternativ dazu wird die Bezugsprobe zur Probe hinzu gegeben. Eine andere Alternative ist es schließlich, unter Verwendung von Komponenten zu normalisieren, von denen bekannt ist, dass sie grob gleichmäßig in den fraglichen Proben vorhanden ist, beispielsweise unter Verwendung unterschiedlicher zellulärer Housekeeping-Gene oder -Proteine oder Metaboliten, die im Gleichgewicht vorliegen.
Indem daher große Anzahlen von Proben aus einer Vielfalt unterschiedlicher Quellen und unter unterschiedlichen Bedingungen bearbeitet werden, werden Datenbanken aus Daten erzeugt. Diese können auf eine Vielfalt von Wegen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Datenbanken in weiteren Experimenten verwendet, um Peaks zu identifizieren. Alternativ dazu können sie verwendet werden, um Proben zu vergleichen, oder die Wirkungen von Arzneimitteln oder Kandidatenmitteln auf Proben, um Signalübertragungswege und therapeutisch relevante Verbindungen zu identifizieren.
Zusätzlich können die Datenbanken, wenn sie erzeugt werden, unter Verwendung einer Reihe von graphischer Darstellungssoftware visualisiert werden, einschließlich einer Visualisierungssoftware wie SPOTFIRE^®, 3D-Contour-Mapping, Topologie-Mapping, Dreieckstechniken etc.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die Analyse einer komplexen biologischen Probe bereit, welche die Schritte umfassen, dass die Probe einer FTMS unterzogen wird, welche ein Peakprofil der Probe bereitstellt und Untersuchen des Peakprofils der Probe. In einer Ausführungsform umfassen die Verfahren außer dem den Vergleich des Peakprofils der Probe mit einem Peakprofil einer Bezugsprobe. Dementsprechend kann die biologische Probe eine Testprobe sein. Die Referenz- bzw. Bezugsprobe kann vorbestimmt sein, d.h. eine historische Probe sein. Das Peakprofil der Bezugsprobe kann das Peakprofil einer Probe sein oder ein Durchschnittspeakprofil für zwei oder mehr Proben. In einer Ausführungsform ist die Bezugsprobe von einer normalen Zelle abgeleitet und die Testprobe von einer erkrankten Zelle desselben Typs. In einer anderen Ausführungsform ist die Bezugsprobe von einer erkrankten oder normalen Zelle abgeleitet und die Testprobe ist von einer erkrankten Zelle, nachdem die erkrankte Zelle einem Biomodulator wie einem Arzneimittel oder Hormon ausgesetzt worden ist, abgeleitet.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Detektion einer Reaktion einer Zelle auf einen Biomodulator bereit, welche das Vergleichen eines FTMS-Peakprofils einer ersten biologischen Probe, die von einer Zelle abgeleitet ist, die dem Biomodulator nicht ausgesetzt worden ist, mit einem FTMS-Peakprofil einer zweiten biologischen Probe, die von einer Zelle abgeleitet ist, die dem Biomodulator ausgesetzt wurde, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Identifizierung eines Markers als Reaktion einer Zelle auf einen Biomodulator bereit, was die Detektion einer Reaktion einer Zelle auf den Biomodulator entsprechend der beanspruchten Verfahren umfasst, wie sie hier beschrieben sind, und die Identifizierung eines Peaks, der sich in der Intensität bei den Peakprofilen für die ersten und zweiten biologischen Proben unterscheidet, wobei der Peak nicht der molekularen Masse des Biomodulators entspricht, wobei ein so identifizierter Peak einem Marker für eine Reaktion der Zelle auf den Biomodulator entspricht.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Charakterisierung eines Markers für die Reaktion einer Zelle auf einen Biomodulator bereit, umfassend die Identifizierung eines Markers für eine Reaktion einer Zelle auf einen Biomodulator entsprechend den hierin beschriebenen Verfahren, das Isolieren eines Markerions mit dem m/z-Verhältnis des Markers; und Erhalten der molekularen Sequenz oder chemischen Struktur des Ions oder eines Fragments davon.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Identifizierung eines Moleküls bereit, dessen Konzentration sich in einer Zellen verändert, wenn die Zelle mit einem Biomodulator in Kontakt gebracht wird, umfassend das Vergleichen eines FTMS-Probenprofils einer ersten biologischen Probe, die von einer Zelle abgeleitet ist, die dem Biomodulator nicht ausgesetzt wurde mit einem FTMS-Profil einer zweiten biologischen Probe, die von einer Zelle abgeleitet ist, welche dem Biomodulator ausgesetzt wurde, und Identifizieren eines Peaks, der sich im Hinblick auf seine Intensität bei den Peakprofilen für die erste und zweite biologische Probe unterscheidet, wobei der Peak nicht der molekularen Masse des besagten Biomodulators entspricht, und wobei ein Peak so identifiziert wird, dass er zu einem Molekül gehört, dessen Konzentration sich in einer Zelle verändert, wenn die Zelle mit einem Biomodulator in Kontakt gebracht wird.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren bereit zur Identifizierung von mindestens einem Marker einer Erkrankung oder eines Zustandes, umfassend das Vergleichen eines FTMS-Peakprofils einer ersten biologischen Probe, die von einer normalen Zelle abgeleitet ist, mit einem FTMS-Peakprofil einer zweiten biologischen Probe, die von einer Zelle abgeleitet ist, welche eine Krankheit oder einen Zustand aufweist, und Identifizieren eines Peaks, der sich im Hinblick auf die Intensität bei den Peakprofilen für die ersten und zweiten biologischen Proben unterscheidet, wobei ein Peak so identifiziert wird, dass er einem Marker der Erkrankung oder des Zustandes entspricht.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung oder für einen bestimmten Zustand bei einem Patienten bereit, umfassend die Identifikation von (mindestens einem) Marker der Erkrankung oder für diesen Zustand entsprechend den hierin beschriebenen Verfahren, und Bestimmen der Intensität des Peaks, der in einer biologischen Probe zu dem Marker gehört, wobei die biologische Probe von einem Patienten erhalten wurde, und wobei die Intensität des Peaks für die Anwesenheit oder das Ausmaß der Erkrankung oder des Zustandes bei dem Patienten indikativ ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Überwachung bzw. des Monitorings der Wirksamkeit einer therapeutischen Behandlung bei einem Patienten bereit, der unter einer Erkrankung oder an einem Zustand leidet, umfassend die Identifizierung eines Markers der Erkrankung oder des Zustandes entsprechend den hierin beschriebenen Verfahren; und Bestimmen der Intensität des Peaks, der zu dem besagten Marker gehört, in einer biologischen Probe, die von einer Zelle von einem Patienten erhalten wurde, nachdem der Patient der therapeutischen Behandlung unterzogen wurde, wobei die Intensität des Peaks für die Anwesenheit oder das Ausmaß der Erkrankung oder des Zustandes bei dem Patienten indikativ ist und die Wirksamkeit der besagten therapeutischen Behandlung widerspiegelt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren bereit zur Identifizierung eines Leitmoleküls für die Arzneimittelentwicklung, umfassend die Identifikation eines Markers einer Erkrankung oder eines Zustandes entsprechend der hierin beschriebenen Verfahren, wobei für die Erkrankung oder den Zustand die Identifikation eines Leitmoleküls für die Arzneimittelentwicklung wünschenswert ist, Ermitteln eines FTMS-Peakprofils der Probe, die sich von einer Zelle ableitet, die eine Konzentration des Markers aufweist, die für die Erkrankung oder den Zustand charakteristisch ist, wobei die Probe von einer Zelle abgeleitet ist, nachdem die Zelle einem Testmolekül ausgesetzt wurde, und Bestimmen ob in der Zelle die Konzentration des Markers durch das Testmolekül verändert ist, wobei das Bestimmen es umfasst, dass die Intensität des Peaks, der zu dem Marker gehört, gemessen wird, wobei einer Veränderung in der Konzentration des Markers, wobei die Veränderung nahe an die normalen Spiegel des Markers heranreicht, darauf hindeutet, dass das Testmolekül ein Leitmolekül für die Arzneimittelentwicklung oder Prävention der Erkrankung oder des Zustandes ist.
Zusätzlich kann die vorliegende Erfindung bei der Leitverbindungsentwicklung in Struktur-Aktivitäts-Verhältnissen („structure-activity relationships", SAR) verwendet werden. Daher kann die Analyse der Spektren von verwandten Verbindungen dazu dienen, die Struktur der Verbindung seiner gewünschten Aktivität zuzuordnen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Identifizierung toxikologischer Targets von Arzneimitteln bereit, was den Vergleich von drei FTMS-Peakprofilen umfasst, wobei die drei FTMS-Peakprofile einer ersten biologischen Probe, erhalten von einer Zelle, welche einem ersten Arzneimittel mit einer toxischen Nebenwirkung ausgesetzt wurde; einer zweiten biologischen Probe, erhalten von einer Zelle, welche einem zweiten Arzneimittel ohne eine toxische Nebenwirkung ausgesetzt wurde, wobei das erste Arzneimittel und das zweite Arzneimittel zur selben Klasse von Arzneimitteln gehören; und einer dritten biologischen Probe, erhalten von einer Zelle, welche keinem Mitglied der besagten Klasse von Arzneimittel zugehört, ausgesetzt wurde; entsprechen; und Identifizieren eines Peaks, der im Hinblick auf die Intensität bei den FTMS-Profilen der zweiten und dritten Proben ähnlich ist, aber sich in der Intensität im FTMS-Profil der ersten Probe unterscheidet, wobei ein Peak so identifiziert wird, dass er zu einer toxischen Nebenwirkung für die Arzneimittelentwicklung gehört.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin andere Verfahren zur Identifizierung toxikologischer Targets von Arzneimitteln bereit, umfassend den Vergleich von drei FTMS-Peakprofilen, wobei die drei FTMS-Peakprofile den folgenden biologischen Proben entsprechen: einer ersten biologischen Probe, die von einer Zelle erhalten wird, welche einem ersten Arzneimittel mit einer toxischen Nebenwirkung ausgesetzt wurde; einer zweiten biologischen Probe, die von einer Zelle erhalten wurde, welche einem zweiten Arzneimittel ausgesetzt wurde, welche dieselbe toxische Nebenwirkung aufweist; und einer dritten biologischen Probe, die von einer Zelle erhalten wurde, welche keinem Arzneimittel ausgesetzt wurde, das die besagte toxische Nebenwirkung aufweist; und Identifizieren eines Peaks, der im Hinblick auf seine Intensität bei den FTMS-Profilen der ersten und zweiten Proben ähnlich ist, sich aber im Hinblick auf die Intensität vom FTMS-Profil der dritten Probe unterscheidet; wobei ein so identifizierter Peak einer toxischen Nebenwirkung bei der Arzneimittelentwicklung zugeordnet wird.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Charakterisierung der toxischen Eigenschaften eines Test-Mittels bereit, umfassend die Bestimmung der Intensität eines Peaks in einem FTMS-Peakprofil einer biologischen Probe, die von einer Zelle erhalten wurde, welche der besagten Test-Verbindung ausgesetzt wurde, wobei der Peak mittels eines oder mehrer der hierin beschriebenen Verfahren als toxikologisches Target identifiziert worden war, und wobei die Intensität des Peaks für die Toxizität der Test-Verbindung indikativ ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren für die Hochinformationsgehalt(HIC)-Analyse einer komplexen biologischen Probe bereit, welche es umfassen, die Probe einer Vielzahl von Vorgängen der Fourier-Transformations-Massenspektrometrie (FTMS) zu unterwerfen; und wobei für jeden Vorgang der FTMS eine FTMS-Peakprofilinformation für die Probe erzeugt wird; ein Peak-Picking-Algorithmus für die erzeugte Peakprofilinformation angewandt wird, um Peaks auszuwählen, die bestimmte vorgegebene Kriterien erfüllen; und Anwenden eines Clustering-Algorithmus, um die ausgewählten Peaks zu identifizieren, die wahrscheinlich zu demselben chemischen Gebilde gehören.
In einer Ausführungsform wird die Peakprofilinformation in eine getrennte Datei für jeden Vorgang der FTMS geschrieben, und sie umfasst weiterhin den Schritt, eine einzelne Datei zu erstellen, die die Information von jeder der getrennten Dateien für die Peaks, die mittels des Peak-Picking-Algorithmus ausgewählt wurden, enthält. In einem Modus der Ausführungsform wird der Clustering-Algorithmus auf die Information angewandt, die in der besagten einzelnen Datei enthalten ist, umfassend die Information von jeder der getrennten Dateien für die Peaks, die mittels des Peak-Picking-Algorithmus ausgewählt wurden.
In einer anderen Ausführungsform wird jeder der ausgewählten Peaks mit dem Durchschnitt der Massen eines entsprechenden Clusters von Peaks neu benannt.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Erzeugung von FTMS-Spektren von komplexen biologischen Proben bereit und das Analysieren der Peakprofile in den Spektren. Komplexe biologische Proben umfassen Proben, die von biologischem Material abgeleitet sind, welches ohne Einschränkung auf diese Blutserum, kultivierte Zellen, Gewebebiopsien umfasst. Vergleichsanalysen von Spektren, die für Zellen in unterschiedlichen Zuständen oder Zellen unterschiedlicher Zelltypen erzeugt wurden, sind für spezifische phänotypische Unterschiede nützlich, welche zwischen normalen und anormalen, beispielsweise nicht erkrankten und erkrankten Zellen und/oder Geweben desselben Typs existieren. Weiterhin können die Moleküle, die zu den Peaks gehören, sobald spezifische phänotypische Unterschiede in Form von FTMS-Peaks unterschiedlicher Intensität identifiziert wurden, identifiziert und/oder als Leitbiomoleküle für die diagnostische und/oder pharmazeutische Entwicklung verwendet werden.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen die Identifizierung eines Peaks oder von Mustern von HICS-FTMA-Peaks, die für eine bestimmte Pathologie oder Klasse von Pathologien charakteristisch sind. Solche Peakprofile bieten eine wertvolle Information, die für das vollständige und genaue Definieren und Klassifizieren von Pathologie-Unterarten bzw. -Subtypen nützlich ist.
Unter Verwendung der Prinzipien der vorliegenden Erfindung können Proben von unterschiedlichen Patienten mit bekannten Gesundheitsbedingungen entnommen werden und einer HICA-FTMS unterzogen werden. Die erzeugten Profile werden analysiert, um Peaks zu identifizieren, die einzigartig vorhanden oder nicht vorhanden in den Proben sind, die von Zellen von Patienten mit anderen Gesund heitsbedingungen sind, und die daraus hervorgehenden Daten werden verwendet, um eine Datenbank aufzubauen, die alle so identifizierten Peaks umfasst. Daten, die zu Proben gehören, die von Patienten erhalten wurden, die eine Pathologie oder eine interessierende Erkrankung aufweisen, können dann für die Analyse extrahiert werden und mit den übrigen Aufnahmen in der Datenbank verglichen werden, um Peaks oder Peakmuster von Interesse zu identifizieren, die für die Pathologie oder den Krankheitszustand eine Vorhersage ermöglichen.
In bestimmten Ausführungsformen ist HICA-FTMS daher ein Werkzeug, um Peakprofile zu erzeugen und ein Muster von molekularen Peaks zu identifizieren, oder Markerpeaks, welches für eine bestimmte Pathologie oder Klasse von Pathologien charakteristisch sind. Die Überwachung der Intensitäten von Markerpeaks, welche die relative Menge der Markermoleküle widerspiegeln, zu welchen die Peaks gehören, und zwar in Peakprofilen, die von derselben Probenquelle unter unterschiedlichen Bedingungen oder Zeitpunkten erzeugt wurden, können bei der Fortführung des Monitorings der Reaktion auf eine Therapie für eine Erkrankung und für Target-bezogene Drug Discovery für die Erkrankung verwendet werden.
Unter Verwendung der Prinzipien der vorliegenden Erfindung können Gewebe oder Zellproben von Versuchstieren, die Modelle für die Erkrankung sind, die mit einem der bekannten Therapeutika behandelt wird, welche bei der Handhabung oder Behandlung der Erkrankung verwendet werden, oder biologische Proben von Menschen, die diese Behandlungen erfahren, oder ein Zellkulturmodell von dieser, einer HICS-FTMS unterzogen werden, und die daraus hervorgehenden Daten können verwendet werden, um eine Datenbank zu erzeugen, die alle gemeinsamen und alle einzigartigen Peaks, die entweder vorhanden oder nicht vorhanden in Proben unbehandelter Subjekte (Tiermodell oder Mensch) sind, umfassen, und zwar durch Vergleich der unbehandelten Gegenparts. Markermoleküle, die Markerpeaks entsprechen, können als Targets für die Entwicklung einer Therapie oder eines Pharmazeutikums verwendet werden. Ganz ähnlich können Peakprofile von biologischen Proben, die von normalen Pflanzen abgeleitet sind, mit Peakprofilen biologischer Proben verglichen werden, die von Pflanzen abgeleitet sind, die mit Pflanzenschutzmitteln, Unkrautvernichtern oder Hormonen behandelt wurden, oder von Pflanzen, die mit Pathogenen, wie beispielsweise Viren, infiziert wurden. Markermoleküle, die zu Markerpeaks gehören, die in diesen Screens identifiziert wurden, können Targets für die Entwicklung von Insektiziden sein. Ganz ähnlich können Peakprofile von biologischen Proben, die von Mikroorganismen abgeleitet sind, die mit Antibiotika behandelt wurden, mit Peakprofilen von biologischen Proben verglichen werden, die von unbehandelten Mikroorganismen derselben Spezies abgeleitet wurden, beispielsweise um Markermoleküle der Antibiotikaresistenz zu identifizieren, die als Drogen bzw. Arzneimittel-Screeningmarker verwendet werden können.
Zusätzlich zur Überwachung von Drogen bzw. Arzneimittel-Reaktionen kann HICS-FTMS verwendet werden, um die Drogen bzw. das Arzneimittel selbst zu überwachen. Daher können bestimmte Attribute einer Ziel-Droge bzw. eines Ziel-Arzneimittels aufgedeckt werden, beispielsweise Clearance-Profile, molekulare Interaktionen und Modifikationen, Drogen bzw. Arzneimittel-Metabolismus, Wirkungsweise, und subzelluläre Lokalisation.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit für die Identifizierung von neuen Drogen bzw. Arzneimitteln, die bei der Behandlung einer Erkrankung oder eines Krankheitszustandes nützlich sind, für welche schon eine geläufige Drogen bzw. ein geläufiges Arzneimittel bekannt ist, beispielsweise um ein Arzneimittel mit erhöhter Wirksamkeit, höherer Toleranz zu identifizieren. HICS-FTMS-Spektren werden für Extrakte von Zellen, Gewebe oder Zellkulturproben erzeugt, welche (i) unbehandelt, (ii) mit dem bekannten Arzneimittel behandelt, oder (iii) mit einem Testmolekül behandelt sind. Testmoleküle, die Veränderungen in den FTMS-Peaks hervorrufen, die ähnlich zu jenen sind, die in Extrakten von Zellkulturproben beobachtet werden, die mit dem bekannten Arzneimittel behandelt wurden, sind dann Kandidaten-Leitverbindungen für die Drug Discovery. Wenn kultivierte Zellen oder Gewebe in der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beispielsweise als Modellsystem für Drug Discovery, können die Zellen im Hinblick auf Isotopen abgereichert oder angereichert sein, um eine Charakterisierung und die Sensitivität zu erleichtern.
Die erfindungsgemäßen Screeningassays ermöglichen die Identifikation von Peaks, die Targets für individuelle Arzneimittel bzw. Drogen sind, und von allgemeinen Peaks, die in Proben von Zellen oder Organismen sind, die einer Behandlung mit unterschiedlichen Mitgliedern einer Klasse von interessierenden Drogen bzw. Arzneimitteln ausgesetzt wurden beziehungsweise eine Behandlung durchgemacht haben, z.B. anti-hyperlipidemische Arzneimittel. Gleichzeitig können Targetpeaks, die in Proben vorhanden oder abwesend sind, welche nur mit einem Arzneimittel oder nur einer Teilgruppe der Klasse von Arzneimitteln behandelt wurden, erkannt werden, und diese Peaks korrelieren mit Aktivitäten, die einzigartig für dieses Arzneimittel bzw. diese Arzneimittel ist/sind. Ein Anstieg oder eine Verminderung der Intensität eines solchen Peaks kann mit wünschenswerten Aktivitäten oder Eigenschaften des Arzneimittels/der Arzneimittel korrelieren, beispielsweise einer Glukose-herabsetzenden Aktivität bei einem antihyperlipidemischen Arzneimittel, oder einer unerwünschten Aktivität oder Eigenschaft, beispielsweise der Tendenz, Übelkeit oder Benommenheit als Nebenwirkung einer Behandlung auszulösen. Diese Information kann bei der Entdeckung von Arzneimitteln verwendet werden, die nach Aussetzen gegenüber biologischen Systemen nur die erwünschten Reaktionen hervorrufen.
Bestimmte Arzneimittel werden ihre Wirkungen über eine große Anzahl zellulärer Targets ausüben, wobei andere mit begrenzteren Wirkungen nur wenige Targets beeinflussen werden. Ganz ähnlich werden einige Arzneimittel ihre Wirkungen auf multiple Zelltypen ausüben, während andere nur einen oder einige wenige Zelltypen beeinflussen werden.
Eine Anzahl an Beispielen ist unten ausgeführt.
Stoffwechselsyndrom oder Syndrom X äußert sich in einem gestörten Glukosemetabolismus (Insulinresistenz), erhöhtem Blutdruck (Hypertonie), einem gestörten Blutlipidgleichgewicht (Dyslipidemie, einschließlich der Spiegel zirkulierender hoher Triglyzeride und geringer Spiegel an zirkulierendem „guten" oder HDL-Cholesterin) und zentraler Fettsucht (übermäßiges Fettgewebe in der Abdominalregion) (siehe z.B. Reaven, 1993, Annu. Rev. Med. 44:121–131). Syndrom X Patienten werden derzeit einzelne getrennte Arzneimittel verabreicht, um die einzelnen Symptome zu behandeln, weil kommerziell erhältliche Arzneimittel so optimiert wurden, dass sie ein spezifisches Target regulieren oder einen spezifischen Parameter eines Krankheitszustandes regulieren. Die Verwendung von multiplen Arzneimitteln erhöht das Risiko schwerer Nebenwirkungen und beeinträchtig die Lebensqualität. HICS-FTMS kann die Identifizierung neuer Arzneimittel ermöglichen, die multiple, simultane therapeutische Wirkungen besitzen. Dies ist unter Verwendung von HTS-Ansätzen, die auf einzelnen Targets basieren, unmöglich.
Die Anzahl an Syndrom X Patienten steigt schnell an und scheint mit dem westlichen Lebensstil in Verbindung zu stehen; besonders hohe Risikofaktoren sind Alter und Diät. Syndrom X Arzneimittel, die pleiotropische Wirkungen besitzen, d.h. Arzneimittel, die multiple oder bevorzugt alle Symptome von Syndrom X kontrollieren, sind dringend notwendig.
HICS-FTMS ermöglicht die Identifizierung von Markermolekülen, die gewebespezifisch sind, welche als Marker für das anschließende Screening nach gewebespezifischen Arzneimitteln verwendet werden können. Solche Arzneimittel hätten eine große Anwendbarkeit in therapeutischen Kuren. Zum Beispiel werden insulinresistenten Diabetikern Thiazolidindion (TZD-)Arzneimittel verabreicht, um ihre Erkrankung zu handhaben. TZDs aktivieren Peroxisomen-Proliferatoraktivierten Rezeptor gamma (PPARγ). Die Sensitivität gegenüber Insulin wird nach der Behandlung mit TZDs erhöht, aber ebenso die Fettablagerung in Adipo sitengewebe. Kürzlich wurde ein Leit-TZD, Rezulin, zurückgerufen, und zwar aufgrund der schweren Nebenwirkungen einer Leberkrankheit, die durch Gelbsucht, Übelkeit, Erbrechen, Unterleibsschmerzen, Mattheit, Appetitmangel und dunkles Urin gekennzeichnet war, welche zum Tod und/oder der Notwendigkeit von Lebertransplantationen führte. HICS-FTMS ist ein Verfahren der Wahl, um nach Arzneimitteln zu screenen und diese zu identifizieren, die wie TZDs die Sensitivität gegenüber Insulin fördern, aber im Gegensatz zu TZDs nicht zu einer Lebererkrankung führen.
In einer anderen Ausführungsform, bei der ein Arzneimittel seine Wirkungen über multiple Targets ausübt, ermöglicht HICS-FTMS die Charakterisierung von verbesserten Analoga. Moleküle können identifiziert werden, die jene selben Wirkungen effektiver oder mit reduzierten unspezifischen Nebenwirkungen oder schnellerer Clearance hervorrufen. Im Wesentlichen werden HICS-FTMS-Peakprofile für Proben erzeugt, die einem bekannten Arzneimittel oder einer bekannten Klasse von Arzneimitteln ausgesetzt wurden, und es werden Peaks identifiziert, die den therapeutischen Eigenschaften des Arzneimittels entsprechen. Eine kombinatorische Chemie kann verwendet werden, um Bibliotheken von Analoga zu dem Arzneimittel zu erzeugen, und diese Analoga können in HICS-FTMS-Assays verwendet werden, die das experimentelle Modell verwenden, das verwendet wurde, um die vorteilhaften Peaks zu identifizieren, welche mit dem Ausgangsarzneimittel in Verbindung standen. Analoga mit höherer Wirksamkeit als das Ausgangsarzneimittel, zum Beispiel jene, die die Target-Peaks bei geringeren Konzentrationen beeinflussen als das Ausgangsarzneimittel, werden dann als Leitverbindungen für eine Arzneimittelentwicklung verwendet.
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird das Drug Discovery erreicht, ohne einen Vergleich mit bekannten Arzneimitteln, rein basierend auf der Fähigkeit eines Testmoleküls, spezifische Veränderungen in FTMS-Peakprofilen bei sehr geringen Konzentrationen (im nanomolaren Bereich) hervorzurufen. Die Identität der Peaks, die durch das Testmolekül beeinflusst wer den, wird dann identifiziert, wie in Abschnitt 5.5 oben beschrieben, was eine Leitlinie bereitstellen kann, welchen Stoffwechselweg das Testmolekül moduliert, und für welche Erkrankungen das Testmolekül daher als Arzneimittel getestet werden kann. Tests in vivo für das Testmolekül können anfänglich unter Verwendung eines Zellkulturmodells durchgeführt werden, bevorzugt unter Verwendung einer Zelle, die für einen Krankheitszustand repräsentativ ist (z.B. eine Tumorzell-Linie), oder unter Verwendung eines Tiermodells, bevorzugt in einem Tiermodell für die Erkrankung, und bevorzugt in Ratten oder Mäusen, bevor zu klinischen Versuchen weitergegangen wird. Arzneimittel für die Verwendung als Antibiotika können in bakteriellen Kulturen getestet werden. Pflanzendrogen (z.B. antivirale) können unter kontrollierten Laborbedingungen vor dem Freigeben in das Ökosystem getestet werden.
Es gibt mehrere allgemeine Quellen für Leitverbindungen (Arzneimittel bzw. Drogenkandidaten) einschließlich natürlicher Produktsammlungen, synthetischchemischer Sammlungen, und synthetisch-kombinatorischer chemischer Bibliotheken, beispielsweise Nukleotide, Peptide oder andere polymere Moleküle.
Die Testmoleküle der vorliegenden Erfindung können erhalten werden unter Verwendung von jedem der zahlreichen Ansätze in kombinatorischen Bibliothekenverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich: biologische Bibliotheken; räumlich adressierbare parallele Festphasen- oder Flüssigphasenbibliotheken; synthetische Bibliothekenverfahren, die eine Dekonvolution erfordern; das Bibliothekenverfahren nach dem „Ein-Kügelchen-Eine-Verbindung"-Prinzip (one-bead-one-compound); und synthetische Bibliothekenverfahren unter Verwendung von einer Selektion durch Affinitätschromatographie. Der biologische Bibliothekenansatz ist auf Peptidbibliotheken beschränkt, währen die anderen vier Ansätze auf Peptid-, Nicht-Peptid-Oligomer- oder Kleinmolekül-Bibliotheken von Verbindungen anwendbar sind (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145).
Beispiele für Verfahren für die Synthese molekularer Bibliotheken können im Stand der Technik aufgefunden werden, beispielsweise in: DeWitt et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261:1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1233.
Bibliotheken von Verbindungen können in Lösung angeboten werden (z.B. Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412-421), oder auf Kügelchen (Lam, 1991, Nature 3544:82-84), oder auf Chips (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), auf Bakterien (US-Patent 5,223,409), auf Sporen (US-Patente 5,571,698; 5,403,484; und 5,223,409), auf Plasmiden (Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865–1869) oder Phagen (Scott und Smith, 1990, Science 249:386–390; Devlin, 1990, Science 249:404–406; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378–6382; und Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301–310).
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auf die Selektion von Patienten für die Behandlung durch ein Arzneimittel angewandt werden.
Proben von solchen Individuen können beispielsweise einer HICS-FTMS unterzogen werden, um zu bestimmen, ob ein Peak, der mit einer bestimmten Sensitivität oder Resistenz gegenüber einer Droge bzw. einem Arzneimittel, oder einer Allergie gegenüber einer Klassen von Arzneimitteln, in Verbindung steht, vorliegt oder nicht vorhanden ist, und zwar aus ihren FTMS-Peakprofilen. Ein Peak, der mit einer bestimmten Sensitivität gegenüber einem Arzneimittel in Verbindung steht, wird vorher bestimmt, indem die HICS-FTMS-Spektren von Individuen verglichen werden, die mit dem Arzneimittel oder einer Klasse von Arzneimitteln behandelt wurden, und indem jene Peaks identifiziert werden, deren relative Intensität mit einer Sensitivität oder einer Resistenz gegenüber einer Behandlung korreliert.
Die hierin präsentierten Verfahren können verwendet werden, um die optimale Dosis eines Arzneimittel zu bestimmen. Die HICS-FTMS-Peakprofile von Extrakten von Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen eines Arzneimittels behandelt wurden, werden im Hinblick auf die Intensitäten von einem oder mehreren Peaks verglichen, die einer bevorzugten Reaktion auf das Arzneimittel entsprechen, beispielsweise von einem Targetmolekül des Arzneimittels. Dieselben Peakprofile werden auch analysiert, um die Intensitäten von einem oder mehreren Peaks, die mit einer unerwünschten Reaktion auf das Arzneimittel in Verbindung stehen, zu bestimmen, beispielsweise im Hinblick auf Toxizität. Eine Dosis oder ein Dosisbereich, bei welchem das Arzneimittel die maximale vorteilhafte Reaktion mit einer minimalen Toxizität hervorruft, wird dabei identifiziert.
HICS-FTMS-Technologie kann außerdem allgemein verwendet werden, um zelluläre oder Organismus-Reaktionen auf Signalmoleküle zu charakterisieren, beispielsweise auf Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytokine und Neurotransmitter. Daher kann ein Vergleich von Peakprofilen, die von Proben abgeleitet wurden, die Zellextrakte von Zellen enthalten, die mit einem bestimmten Wachstumsfaktor behandelt wurden, ein Muster zeigen, das mit dem Wachstumsfaktor in Verbindung steht. Zeitverlaufsstudien können durchgeführt werden, um beispielsweise Peaks zu untersuchen, die mit frühen gegenüber späten Reaktionen auf den Wachstumsfaktor in Verbindung stehen. Die Identifizierung einzelner Peaks führt zur Identifizierung von Markern, und die nachfolgende chemische Untersuchung der entsprechenden Ionen kann schließlich bei der pharmazeutischen Gestaltung helfen.
Ähnlich zur Anwendung von HICS-FTMS bei dem Studieren von Erkrankungen können biologische Reaktionen auf die Einführung einer genetischen Störung auf zellulärer oder Organismus-Ebene untersucht werden. Eine genetische Störung kann eine hypomorphische, hypermorphische oder neomorphische Mutation in einem nativen Gen sein, eine rekombinante Überexpression eines nativen Gens, das in der interessierenden Zelle normal exprimiert oder nicht exprimiert sein kann, rekombinante Expression eines Fremdgens, Verwendung von Antikörpern gegen ein Genprodukt, Einführung einer Antisense-Nukleinsäure oder eines Tripplehelixmoleküls, welches das Gen inhibieren würde. Vergleiche der Peakprofile von Extrakten von Zellen, die im Hinblick auf ein Gen Wildtyp, heterozygot und/oder homozygot sind, und/oder mit Überexpression des Gens, können zu nützlichen Informationen im Hinblick auf den genetischen Locus führen, beispielsweise als biochemische Stoffwechselwege, bei denen das Gen involviert ist, das Ausmaß der Störung des Systems als Ergebnis der Störung des Gens, in Form von zellulären Targets des mutierten Genprodukts (z.B. Rezeptor, enzymatische Komplexe, Substrate). Das Gen, das die Mutation erfährt, braucht vorher nicht identifiziert worden zu sein, so dass das HICS-FTMS-Verfahren nach Unbekannten screent, welche als Ergebnis der Mutation eine Reihe von interessierenden Molekülen beeinflussen. Das Verfahren ist gleichermaßen anwendbar, wenn die Mutation eine natürlich vorkommende ist.
In einer besonderen Anwendung kann HICS-FTMS verwendet werden, um Speisen oder Nahrungsmittelprodukte zu überwachen. Peakprofile von jedem Produkt können erhalten werden, um als Referenz für Qualitätskontrolltests zu dienen, oder um die Integrität des Stammes sicherzustellen, indem eine genetische Variation über die Zeit überwacht wird. Ganz ähnlich zu den Arzneimittel-Screeningtests kann HICS-FTMS verwendet werden, um vorteilhafte Charakterzüge auszuwählen und beizubehalten, während ungewollte Charakterzüge identifiziert werden können.
Diese Technologie besitzt auch eine potentielle Anwendung auf systemischer Ebene, wie beispielsweise einem aquatischen Ökosystem, Bodenzusammensetzungen und atmosphärischen Systemen. Diese komplexen biologischen Systeme können durch HICS-FTMS charakterisiert werden, und durch Peakprofile, die über die Zeit erstellt werden, um entweder natürliche Veränderungen oder Veränderungen aufgrund humaner Intervention zu überwachen.
Die vorliegende Erfindung erleichtert das Feld der Diagnostika großartig. In einer Ausführungsform kann eine Serumprobe eines Patienten einer HICS-FTMS unterzogen werden, und das dabei erzeugte Peakprofil oder „Peakprofil" würde einen Schnappschuss der Serumparameter des Patienten bereitstellen, der andererseits eine individuelle Testung erfordern würde. Individuelle Peaks, von denen bekannt ist, dass sie interessierende Parameter repräsentieren, werden mit einem entsprechenden Bereich von Peaks von normalen Individuen verglichen, um deren Konzentration im Serum zu bestimmen. Parameter, die untersucht werden können, umfassen, ohne Einschränkung darauf, Cholesterin, Fettsäuren, Lipoproteine, Glukose, Hämoglobin, Cytokine, Hormone (z.B. Insulin, TSH, T4, T3), Antikörper (z.B. für Autoimmunerkrankungen, wie systemischen Lupus erythematosus, Hashimoto-Erkrankung), Tumorantigene (z.B. PSA).
In einer weiteren Ausführungsform wird die Cerebrospinalflüssigkeit eines Patienten auf Anwesenheit oder Intensität von Markern neurodegenerativer Erkrankungen getestet, wie beispielsweise Alzheimer, Parkinson, Prionenerkrankungen, Frontalhirndemenz. Bestimmte Marker für die Erkrankungen sind schon bekannt (zum Beispiel phosphoryliertes Tau-Protein oder die 42-Aminosäuren-Form des Aβ (Amyloid β) Peptid bei Alzheimer), und zusätzliche Marker oder Markerpeaks können mittels der hierin offenbarten Verfahren identifiziert werden. Ein Markerpeak kann ein Peak sein, dessen Intensität sich mit Fortschreiten einer neurodegenerativen Erkrankung erhöht oder vermindert.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch angewandt werden, um das Fortschreiten einer Erkrankung bei einem Patienten oder die Reaktion eines Patienten auf eine Behandlung zu überwachen. Multiple HICS-FTMS-Peakprofile der Patientenproben (Serum, Gewebebiopsie) werden nach Indikationen für ein hohes Risiko für eine Erkrankung oder der Diagnose bei einem Patienten mit einer Krankheit (mit oder ohne Behandlung) erzeugt. Zum Beispiel kann eine Person mit mittleren Spiegeln von einem oder mehreren Markern, die mit neurodegene rativen Erkrankungen in Verbindung stehen, wobei die Spiegel nicht ausreichend hoch sind, um ein Signal für einen Krankheitszustand zu ergeben, jedoch über dem Durchschnitt liegen, periodisch überwacht werden, um zu bestimmen, ob die Markerpeaks auf einen Spiegel ansteigen, der für einen Krankheitszustand indikativ ist, so dass die Behandlung beginnen kann. Alternativ dazu kann ein Patient, bei dem eine Krankheit diagnostiziert wurde, zu überwachen, um die Wirksamkeit der Medikamentierung (bei Behandlung) oder das Fortschreiten der Erkrankung (wenn die Krankheit unheilbar ist) überwacht werden, zum Beispiel indem die Spiegel von Antigenen, die mit einer neurodegenerativen Krankheit in Verbindung stehen, nach der Diagnose einer neurodegenerativen Erkrankung überwacht werden.
HICS-FTMS kann allgemein verwendet werden, um toxikologische Folgen von Arzneimittelbehandlungen zu charakterisieren. Zum Beispiel kann ein HICS-FTMS-Peakprofil von einem Testsubjekt erhalten werden, das eine besondere Art Arzneimittelnebenwirkung erfährt. Peakprofile von allen bekannten Arzneimitteln, die eine im Wesentlichen ähnliche Nebenwirkung hervorrufen, können verglichen werden, um Muster zu vergleichen, welche sich als Diagnose oder Charakteristikum für eine bestimmte toxikologische Nebenwirkung erweisen können. Diese Analyse kann so ausgeweitet werden, dass Nebenwirkungen, die von Kombinationstherapien verursacht werden, charakterisiert werden können, wobei die HICS-FTMS-Peakprofile eine Vorhersage unerwünschter Arzneimittelkombinationen ermöglichen können. Weiterhin können Peakprofile für viele verschiedene Dosierungen eines spezifischen Arzneimittels erhalten werden, um eine Vorhersagemöglichkeit im Hinblick auf geeignete Dosierungen zu erreichen.
Testsubjekte können Menschen, Labortiere, Zellkulturen, Hefemodelle, bakterielle Modelle, zellfreie Systeme oder andere in vitro-Systeme sein.
Peakprofile können erhalten werden, indem Biopsien, Gewebeexplantate, Zellkulturen oder Körperflüssigkeiten analysiert werden. Die toxikologischen Marker müssen nicht in Zellen oder Geweben aufgefunden werden, in denen das Arzneimittel seine therapeutische Wirkung ausübt. Obwohl beispielsweise ein Arzneimittel eine lokale Wirkung aufweisen kann, kann die Toxizität des Arzneimittels in Metaboliten begründet sein, welche in der Leber, dem Blutstrom und/oder dem Urin aufgefunden werden könnten.
Mit den gegebenen HICS-FTMS-Peakprofilen, die eine bestimmte Nebenwirkung charakterisieren, können spezifische Peaks als toxikologische Marker für diese Nebenwirkung ausgemacht werden. Diese Marker können als schnelles diagnostisches Verfahren dienen. Weiterhin kann die Identifikation dieser Marker die toxikologischen Stoffwechselwege aufdecken und daher schließlich für das Design von Therapeutika nützlich sein. Bestimmte Marker können nur in einer Untergruppe von Subjekten vorhanden sein, was individuelle Sensitivitäten gegenüber Medikamentierungen reflektiert. Diese Variabilität bei der Arzneimittelsensitivität kann ausgenutzt werden, um toxikologische Marker für unterschiedliche Untergruppen weiter zu definieren.
Die Auslegung von HICS-FTMS-Peakprofilen bei multiplen Zeitpunkten über den Verlauf einer Behandlung kann Zwischenstufen in einer toxikologischen Episode identifizieren. Somit können nicht nur charakteristische HICS-FTMS-Peakprofile für den Endpunkt aufgefunden werden (Nebenwirkung gegen keine Nebenwirkung), sondern HICS-FTMS-Peakprofile können die Identifizierung von mehreren Zwischenstufen bis zu einem Endpunkt ermöglichen. Diese unterscheidbaren Zwischenstufen können dann verwendet werden, um toxikologische Nebenwirkungen und ihre Absenkung während einer Behandlungskur zu überwachen.
Sobald eine Datenbank von HICS-FTMS-erzeugten Spektren von verschiedenen Arzneimittelreaktionen erzeugt worden ist, kann ein HICS-FTMS-Peakprofil, das von einem Testsubjekt erhalten wurde, das einer neuen Droge bzw. einem neuen Arzneimittel oder einer neuen Behandlungskur ausgesetzt wurde, potentielle nachteilige Nebenwirkungen vorhersagen. Somit könnten Behandlungen oder Dosierungen vor der Verabreichung eingestellt werden.
Die Nützlichkeit für die Praxis dieser Technologie kann beispielhaft durch den Verlauf einer Behandlung zum Senken von Serumcholesterin dargestellt werden. Viele Arzneimittel wurden bei der Behandlung von hohem Serumcholesterin verwendet, einschließlich Gallensäure-bindende Harze (z.B. Cholestyramin (Questran Light^®, Bristol-Myers Squibb), Colestipolhydrochlorid (Colestid^®, The Upjohn Company), Statine (z.B. Lovastatin (Mevacor^® , Merck & Co., Inc.), Pravastatin (Pravachol^®, Bristol-Myers Squibb Co.,), Atovastatin (Lipitor; Parke Davis), Nikotinsäure, Fibrat (z.B. Clofibrat (Atromid-S^®, Wyeth-Ayerst Laboratories)), Gemfibrozil (Lopid^®, Parke Davis), orales Östrogen, langkettige Carbonsäuren (z.B. langkettige α,ω-Dicarbonsäuren, β,β,β',β'-tetrasubstituierte α,ω-Alkandionsäuren). Leider waren diese Medikamentierungen mit zahlreichen Nebenwirkungen verbunden, einschließlich gastrointestinalen Erkrankungen, selektiven Vitaminmangeln, Leber- und Nieren-Fehlfunktion, Krebs, Gallenblasenerkrankungen, thromboembolischen Erkrankungen, hepatischem Adenom, Rabdomyolysis, erhöhtem Blutdruck, Glukoseintoleranz und Hypercalcämie. Viele andere Moleküle, die in vivo und/oder in vitro eine Aktivität aufweisen, einschließlich Leitverbindungen für die Entwicklung von Anti-Hypercholesterinämie-Arzneimitteln, wurden niemals in therapeutischen Kuren verwendet, und zwar aufgrund einer Vielzahl von Gründen. Es besteht daher ein klarer Bedarf, Therapeutika zu entwickeln, die keine Nebenwirkungen aufweisen, und gleichzeitig hohes Serumcholesterin bekämpfen und Erkrankungen, die aus einem unerwünschten Lipidmetabolismus resultieren.
HICS-FTMS-Peakprofile könnten für jede Behandlungskur und für jede präklinische Verbindung mit der gewünschten Aktivität erhalten werden. Ein Vergleich der Peakprofile von allen Behandlungen könnte bestimmte Peaks ausmachen, die mit der schädlichen Wirkung des Arzneimittels verbunden wären. Diese unterscheidbaren Peaks können einen Assay zum Aussortieren von Verbindungen be reitstellen, die für die Verwendung bei der Behandlung von hohem Serumcholesterin angeboten sind, welche unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen. Weiterhin kann die Identifizierung der Verbindungen, die von diesen Peaks repräsentiert werden, Hinweise für das Arzneimitteldesign bereitstellen, welche Nebenwirkungen verhindern könnten. Die weitere Untersuchung durch HICS-FTMS über den Zeitverlauf einer Arzneimittelbehandlung könnte eine Wirkungsweise aufdecken oder neue Punkte der Intervention aufdecken.
Eine Strategie ähnlich zu der, die für das Studieren der Arzneimitteltoxikologie vorgeschlagen wurde, könnte für schädliche biologische Reaktionen auf Karzinogene, Gifte und Strahlungen angewandt werden. Charakteristische Peakprofile von Reaktionen auf diese Agenzien könnten bestimmt werden, mit unbehandelten Proben verglichen werden, um Markerpeaks zu identifizieren und dann verwendet werden, um biologische Reaktionen oder Screens von Unbekannten im Hinblick auf potentiell nachteilige Mittel durchzuführen. Sobald charakteristische Peaks identifiziert sind, kann ein Testmittel mit unbekannten Eigenschaften untersucht werden, zum Beispiel im Hinblick auf Karzinogenität, indem das Ausmaß, mit dem das Mittel die interessierenden Peaks bzw. den interessierenden Peak verstärken oder inhibieren kann, wenn es ein solches gibt, bestimmt wird.
HICS-FTMS besitzt die Fähigkeit, geradezu alle molekularen Unterschiede zu charakterisieren, die zwischen normalen und erkrankten Zellen und/oder Geweben desselben Typs auftreten, oder zwischen Zellen, die mit einem Testmolekül wie einem Arzneimittel behandelt wurden, und ihren unbehandelten Gegenpart. Die erfindungsgemäßen HICS-FTMS-Verfahren stellen viel mehr Informationen bereit als bestehende Target-Discovery-Verfahren wie genomische oder differenzielle Expressions-Techniken, die sich auf die Detektion von genotypischen Veränderungen fokussieren und nur DNA- oder mRNA-Veränderungen detektieren. Weiterhin detektieren Proteomics kein Nicht-Protein- oder Krankheits-Target, und sie beziehen sich daher nur auf Proteine, die von den bestimmten Sequenzen kodiert werden. Es gibt derzeit keine Verfahren, mittels derer die Unterschiede im Metabolitengehalt von Zellen untersucht werden können. Im Gegensatz dazu ermöglichen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Detektion von allen Arten von Arzneimittel- oder Krankheits-Targets, wobei die Targets Proteine, kleine Peptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, Metaboliten oder irgendein anderes Molekül sein können, die eine Masse oder Struktur aufweisen, die mittels FTMS detektiert werden kann. Die von HICS-FTMS produzierte Information kann in Datenbanken zusammengestellt werden, und zwar zur Verwendung als Referenzpunkte für zukünftige HICS-FTMS-Screens, für komplexe Vergleiche von großen Anzahlen von Peakprofilen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können weiterhin verwendet werden, um zelluläre oder Organismen-Reaktionen auf Stress zu überwachen und um Schlüsselkomponenten zu identifizieren, die als Targets für die Entdeckung von Mitteln verwendet werden können, welche entweder die Stressreaktionen nachahmen oder diese inhibieren. Wie hier verwendet, bezieht sich Stress auf jede Art von Angriff auf die Umgebung oder Integrität einer Zelle oder eines Organismus. Solche Angriffe umfassen, ohne Einschränkung auf diese, extreme Temperaturen, emotionalen Stress (Kälte, Schock), Wunden, Nahrungsmittelabreicherung, metabolische Reaktionen, Infektion mit intrazellulären Pathogenen und Sauerstoffradikale.
Kurz, FTMS-Peakprofile erhält man für Zellen oder Organismen in ihren normalen Zuständen und zu verschiedenen Zeitpunkten nach einer Beschädigung, einer Verletzung bzw. einem Insult. Peaks, die mit signifikant höheren Spiegeln in den beschädigten Zellen vorhanden sind, sind potentielle Effektoren der zellulären oder Organismus-Reaktion auf die Beschädigung. Sobald ein Effektor identifiziert ist, kann HICS-FTMS oder rationelles Arzneimitteldesign weiter angewandt werden bei der Aufdeckung von Analoga/Agonisten und Antagonisten des Effektors. Wenn die Reaktion gut ist (beispielsweise natürliche Pflanzeninsektizide, die in Reaktion auf eine Pestizidattacke hergestellt werden), können Analoga oder Agonisten des Effektors für die Behandlung oder Verhinderung von zukünftigen In sults entwickelt werden. Wenn die Reaktion schädlich ist (beispielsweise anaphylactischer Schock in Reaktion auf Insektenstich) können Antagonisten für den Effektor entwickelt werden, um die schädliche Reaktion bei zukünftigen Insulten zu verhindern. So identifizierte Arzneimittel können im Hinblick auf ihre Wirksamkeit bei der Modulierung der Reaktionen in Tiermodellen, die denselben Insulten ausgesetzt werden, getestet werden.
BEISPIELE
Verfahren und Instrumente
Isolierung und Testen von primären Ratten-Hepatozytenzellen mit Lovastatin
Eine männliche Sprague-Dawley-Ratte wurde durch Verabreichung von 50 mg/kg Körpermasse Natriumpentobarbital durch intraperitoneale Injektion anästhetisiert. Die Perfusion der Leber wurde in situ wie folgt durchgeführt. Das Abdomen des Tieres wurde geöffnet, die Pfortader wurde kanüliert, und die Leber wurde mit WOSH-Lösung (149 mM NaCl, 9,2 mM Na HEPES, 1,7 mM Fructose, 0,5 mM EGTA, 10 U/ml Heparin, pH-Wert 7,5) mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/min für 6 Minuten perfundiert. Um die Leber zu verdauen, wurde DSC-Lösung (6,7 mM KCl, 143 mM NaCl, 9,2 mM Na HEPES, 5 mM CaCl₂-2H₂O, 1,7 mM Fructose, 0,2 % BSA, 100 U/ml Collagenase Typ I, 80 U/ml, 160 BAEE/ml Trypsininhibitor, pH-Wert 7,5) mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/min für 6 Minuten bei einer Temperatur von 37°C durch die Leber perfundiert. Nach dem Verdau wurden die Zellen in einer Lösung DMEM- (DMEM enthaltend 2 mM GlutMax-1, 0,2 % BSA, 5 % FBS, 12 nM Insulin, 1,2 μM Hypercortison) dispergiert, um den Verdauungsprozess abzustoppen. Die rohe Zellsuspension wurde durch drei Lagen von einem rostfreien Stahlnetz mit Porengrößen von 250, 106 und 75 μm filtriert. Filtrierte Zellen wurden bei 50 × g für zwei Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Das Zellpellet wurde in DMEM- resuspendiert und erneut zentrifugiert. Dieses End-Zellpellet wurde in DMEM+HS-Lösung (DMEM enthaltend 2 μM GlutMax-1, 20 nM Delta-Aminolevolinsäure, 17,4 mM MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 20 % FBS, 12 nM Insulin, 1,2 μM Hydrocortison) resuspendiert und ausplattiert, unter Bildung von Einzellagenkulturen mit einer Dichte von 100 × 10³ Zellen/cm² auf Collagen-beschichteten Kulturplatten. Vier Stunden nach der anfänglichen Ausplattierung wurde das Medium gegen SF-DMEM+ ausgetauscht (DMEM enthaltend 2 mM GlutMax-1, 20 nM Delta-Aminolevolinsäure, 17,4 mM MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 12 nM Insulin, 1,2 μM Hydrocortison) und die Zellen blieben so über Nacht.
Um die Wirkungen von Lovastatin auf Hepatozytenzellen zu untersuchen, wurden Zellen für 4 Stunden ansteigenden Konzentrationen in einem Bereich von 0,03 bis 30 μM ausgesetzt. Kontrollzellen wurden demselben Medium ohne Lovastatin ausgesetzt. Um Medien herzustellen, die Lovastatin enthielten, wurde eine 30 mM Lovastatin-Lösung in Dimethylsulfoxid unter aseptischen Bedingungen hergestellt. In einer sterilen biosicheren Kammer wurde die 30 μM-Konzentration hergestellt, indem die Stamm-DMSO-Formulierung 1:1000 in SF-DMEM+ verdünnt wurde. Geringere Konzentrationen wurden durch Verdünnung des 30 μM-Stammes mit 0,1 % DMSO in SF-DMEM+ hergestellt. Um Zellen zu behandeln, wurde das Medium entfernt und 100 μl pro Vertiefung von vorformulierten Lovastatin hinzu gegeben. Die Zellen wurden für 4 Stunden bei 37°C in befeuchteter 95 % Luft/5 % CO₂ Umgebung inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wurde das Medium entfernt und auf Eis mit zwei Volumina Methanol:Wasser:Essigsäure (MeOH:DIW:HAc; 49:49:2) extrahiert. Zellen wurden dreimal mit je 200 μl MeOH:DIW:HAc extrahiert. Das Salz wurde sowohl vom Medium als auch von den Zellextrakten durch das kationische Harz AG^® 50W-X9 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) entfernt. Um das Harz zu entfernen, wurden Proben bei 1000 Upm zentrifugiert und die Überstände wurden in HPLC-Probengefäße transferiert.
FTMS von Extrakten von Rattenhepatozyten die mit Lovastatin behandelt wurden
Alle Messungen wurden mit einem Bruker APEX II FTMS durchgeführt, der mit einem 7,0 Tesla-Magnet ausgerüstet war. Kulturmedien und Zellen wurden mit unterschiedlichen Lösungsmitteln extrahiert, in einzelne Probengefäße transferiert und in einem Gestell für die automatische Probenhandhabung platziert („auto sampling"). Ein „Gilson 215 liquid handler" wurde für die automatische Probenhandhabung von allen 200 Vertiefungen verwendet. Die Kontrolle des Gilson 215 wurde über das XMAS S-Paket gehandhabt, welche auch als grundlegende Softwareplattform für die Kontrolle des FTMS-Spektrometers dient. Eine akkurate Massendetektion wurde unter Verwendung einer externen Kalibrierung durchgeführt. Der Massenspektrometer wurde unter Verwendung eines Gemisches aus Standardpeptiden vor dem Durchlauf mit der automatischen Probenhandhabung kalibriert. Die genauen Massendaten wurden dann unter Verwendung Tcl/Tk-Routinen analysiert, welche seriell die Massenspektren von jeder Vertiefung im Hinblick auf chemische Zusammensetzung und metabolische Produkte durchsuchen.
Ergebnisse
Nachdem genaue FTMS-Spektren gesammelt und analysiert wurden, wurde eine HICS-FTMS-Datenanalyse-Software (in Abschnitt 5.3.1 oben beschrieben) verwendet, um Peaks aus den Spektren auszuwählen, zu vergleichen und zu analysieren. Stichproben der erzeugten Spektren sind in 4 gezeigt, wobei Pfeilspitzen auf beispielhafte Peaks deuten, deren Intensitäten durch Lovastatinbehandlung verstärkt wurden.
Eine HICS-FTMS-Datenanalyse-Software wurde verwendet, um FTMS-Spektrendaten von Proben von Hepatozyten zu analysieren, welche mit unterschiedlichen Konzentrationen von Lovastatin behandelt wurden. 82 niedermolekulare Massenpeaks wurden ausgewählt und in graphischem Format weiter analysiert, dargestellt als relative Intensität des Peaks bei jeder Konzentration an Lova statin (gegen die Messungen, die von unbehandelten Tieren erhalten wurden, normalisiert) gegen Konzentration in μM (siehe 5a–5h). LOWESS, ein robustes örtliches Fitting-Verfahren wurde verwendet, um eine lineare und nichtlineare Kurvenanpassung durchzuführen. Eine logistische Regression wurde ebenfalls verwendet, um die Kurvenanpassung zu verfeinern und um genaue statistische Werte zu liefern; es kann auch eine lineare Regression für diesen Zweck verwendet werden.
Einige Kurven zeigen eine gute Korrelation zwischen Lovastatinkonzentration und der relativen Intensität, während andere eine geringe Korrelation zeigen. Kurven, die geringe oder keine Korrelation aufweisen, können Artefakte sein und sind an dieser Stelle von geringem Interesse. Die Moleküle von praktischer Relevanz sind diejenigen, die eine starke Korrelation zwischen Konzentration des Arzneimittels und der relativen Intensität aufweisen. Solche interessierenden Peaks können linear oder sigmoidal mit einer Arzneimittelkonzentration ansteigen oder fallen. Diese Peaks können als die relevantesten für die therapeutische Aktivität, toxische Wirkungen und/oder andere biologische Wirkungen in diesem Zusammenhang angesehen werden.
Ein bemerkenswerter Aspekt des Ergebnisses ist die Sensitivität von FTMS beim Auftrennen von Peaks in diesem komplexen zellulären System. Beispielsweise wurden zwei Peaks mit molekularen Massen von 85,02815 und 85,64405 identifiziert, eine Differenz in der Masse von 0,7 %. Während der Peak mit der molekularen Masse 85,02815 einen sinkenden Trend bei ansteigenden Lovastatinkonzentrationen zeigte, zeigte der Peak mit einer molekularen Masse von 85,64405 einen ansteigenden Trend. Ganz klar wurden zwei Moleküle mit unterschiedlicher, aber sehr nahe beieinander liegender molekularer Masse von dem Arzneimittel auf zwei unterschiedliche Weise beeinflusst, und diese Unterschiede wurden durch HICS-FTMS erfolgreich aufgelöst.
Diskussion
Die Daten zeigen die Detektion von sowohl Behandlungs-abhängigen als auch -unabhängigen Veränderungen bei intrazellulären und extrazellulären Komponenten. Das Vorhandensein bzw. die Abundanz der Ausgangsverbindung und mehrerer Metabolite entspricht Veränderungen in der Abundanz von anderen kleinen Molekülen, die in den Vertiefungen vorhanden sind. Außerdem stellt die Massegenauigkeit, die für jede der Proben gezeigt wurde (< 2 ppm) unzweideutige Informationen im Hinblick auf die Struktur und die Formeln für metabolische Produkte bereit.
HICS-FTMS-Anwendungen bei der Überwachung von biologischen Reaktionen im Serum
Drei Ratten wurden täglich mit 100 mg/kg 6-(6-Hydroxy-5,5-dimethylhexyloxy)-2,2-dimethylhexan-1-ol mittels Verabreichung durch Schlundsonde über den Verlauf von einer Woche behandelt. 6-(6-Hydroxy-5,5-diemethylhexyloxy)-2,2-dimethylhexan-1-ol erhöht HDL-Cholesterin und verbessert die Verwendung von Glukose bei experimentellen Ratten (siehe US-Anmeldung Seriennummer 09/540,738, eingereicht am 31. März 2000). Am Ende der Woche wurde Blut von jeder der drei Ratten abgenommen, sowie von drei (unbehandelten) Kontrollratten. Das Blut ließ man koagulieren und das Plasma wurde durch Zugabe einer Wasser- und Methanol-Lösung (49:49:2, Wasser:Methanol:Essigsäure, v:v:v) zu jeder der Plasmapräparationen für die FTMS vorbereitet. Das Gemisch wurde abgekühlt, um die Proteine an den Boden des Röhrchens zu präzipitieren. Jedes Röhrchen wurde zentrifugiert, der Überstand wurde dekantiert und die Probe wurde durch Zugabe von ungefähr 100 mg DOWEX-Ionentauscherharz zu jedem Gefäß und durch Inkubieren der Probe mit dem Harz für ungefähr 10 Minuten entsalzt. Die Probe wurde dann zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Diese Lösung wurde dann in den FT-Massenspektrometer eingebracht.
Eine ausgewählte Region des Peakprofils für die Proben ist in 6 gezeigt. 6A–C sind Spektren von Proben, die von dem Plasma unbehandelter Ratten abgeleitet sind, während 6D–F Spektren von Proben sind, die von dem Plasma von Ratten, welche mit 6-(6-Hydroxy-5,5-diemethylhexyloxy)-2,2-dimethylhexan-1-ol behandelt wurden, abgeleitet sind. Mindestens zwei Peaks entsprechen Molekülen mit einer molekularen Masse von ungefähr 766,4 und 766,8 Dalton, und sie weise reproduzierbar höhere Intensitäten in den Spektren von Proben auf, die von dem Plasma von mit 6-(6-Hydroxy-5,5-diemethylhexyloxy)-2,2-dimethylhexan-1-ol-behandelten Ratten abgeleitet sind.
Dieses Experiment zeigt die Nützlichkeit der erfindungsgemäßen Verfahren bei dem Screenen nach Markern von biologischen Reaktionen auf Arzneimittel in biologischem Material, das aus Säugergewebe erhalten wurde.
Identifikation von neuen antidiabetischen Arzneimitteln
Insulinresistenz und die Verbreitung von Syndrom X steigen in der Bevölkerung. Die Häufung von Insulinresistenz, Bluthochdruck, Hypertriglyzeridämie und geringem Plasma-HDL-Cholesterin sind Merkmale von Syndrom X (Cornicelli, 1997, Atherosclerosis 2(2):43-49).
Mehrere Arzneimittel sind für die Behandlung von Syndrom X Patienten erhältlich, einschließlich Sulfonylharnstoff-Arzneimittel, Biguanide und TZD-Derivate. Sulfonylharnstoff-Arzneimittel werden einigermaßen gut toleriert, aber nach mehreren Jahren der Behandlung sinkt die Fähigkeit der Arzneimittel, Glukose zu kontrollieren, bemerkenswert. Biguanide werden breit verwendet, können aber schwere Nebenwirkungen hervorrufen, z.B. Lactatacidose und gastrointestinale Erkrankungen. TZD-Derivate rufen Körpergewichtszunahme und Leberfehlfunktion hervor. Arzneimittel, die derzeit für die Behandlung von Syndrom X-bezogenen Erkrankungen in Entwicklung sind, sind vornehmlich Kernrezeptorliganden/-aktivatoren. Mehrere in vitro und in vivo Studien haben gezeigt, dass PPARγ-Agonisten Triglyzeride reduzieren und die Insulin-Sensibilität erhöhen können.
TZDs sind PPARγ Aktivatoren. Andere Arzneimittel, die für die Behandlung von Syndrom X nützlich sind – durch Regulieren von Cholesterin und Gallensäuregleichgewicht, Adipozytenfunktion und Glukosemetabolismus – aktivieren andere Kernrezeptoren, z.B. RXR (Retinsäurerezeptor), FXR (Gallensäurerezeptor), LXR (Oxysterolrezeptor).
Humane Hepatozyten-, Enterozyten-, Adipozyten- und Muskelzell-Kulturen werden unabhängig voneinander mit (i) Verbindungen, die für die Handhabung von mindestens einem Aspekt von Syndrom X beim Menschen nützlich sind (beispielsweise Arzneimitteln, die wirksam beim Herabsetzen von Triglyzeriden und LDL-Cholesterin sind sowie beim Erhöhen von HDL, z.B. Fenofibrat, Benzafibrat und Gemfibrozil),; (ii) Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie in vitro aktiv sind, und die in einem Tiermodell validiert wurden, aber noch nicht zur menschlichen Verwendung entwickelt wurden (FMOC-L-Leucin, von dem beschreiben ist, dass es ein PPARγ-Aktivator ist, und zwar auf dem XII. Internationalen Stockholm-Symposium über Atherosklerose, Retinsäure, und 6-(6-Hydroxy-5,5-diemethylhexyloxy)-2,2-dimethyl-hexan-1-ol); und (iii) Verbindungen, deren Aktivität in vitro etabliert wurde, aber für welche noch keine Tiermodelle entwickelt wurden, behandelt.
Unter Verwendung der hierin beschriebenen Multiplex-HICS-FTMS-Screens werden Peakprofile von Proben hergestellt, die von Zellgehalten und Zellüberständen von Zellen erhalten wurden, welche multiplen Mitgliedern von jeder Klasse von Verbindungen, welche oben beschrieben sind, ausgesetzt wurden, bevorzugt in dreifacher Ausführung, bevorzugt unter Verwendung von unterschiedlichen Zelltypen und bevorzugt jeweils mit einem Konzentrationsbereich und einem Bereich von Inkubationszeiten für jede Verbindung. Die Peakprofile inner halb jeder Klasse von Verbindungen und zwischen den Klassen von Verbindungen werden für jeden Zelltyp verglichen.
Peaks, die gemeinsam in Proben vorhanden sind, die aus Zellen präpariert wurden, die mit Fibraten, Glitazonen und Biguaniden in Kontakt gebracht wurden, werden identifiziert und charakterisiert.
Peaks, die Retinsäure, esp 24232, FMOC-L-Leucin gemeint sind, werden identifiziert und charakterisiert.
Bevorzugt werden Peaks identifiziert, die gemeinsam in Peakprofilen von Proben vorhanden sind oder abwesend sind, welche von Zellen abgeleitet wurden, die mit allen drei Arzneimittelklassen behandelt wurden.
Nachdem gemeinsame Peaks identifiziert wurden, werden experimentelle Tiermodelle (Zuckerratten, Diabetes-Rattenmodell (Streptozotocin-Injektion), ob/ob-Mäuse, Streptozotocin-behandelte syrische Hamster (welche CETP Cholesterinestertransferprotein aufweisen, was für den HDL-Metabolismus essentiell ist, was in Menschen vorhanden ist und in Ratten und Mäusen nicht vorhanden ist)) für 2 bis 4 Wochen mit den unterschiedlichen Arzneimitteln behandelt, und Blutproben werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten abgenommen und mittels FTMS wie in Abschnitt 7 oben beschrieben analysiert. Peaks in den unterschiedlichen Massenspektren werden verglichen. Wiederum werden Peaks charakterisiert, die allen Arzneimitteln gemein sind.
Eine Sammlung von Verbindungen (von kombinatorischen Bibliotheken und kommerziell erhältlichen Bibliotheken) wird mit unterschiedlichen humanen Zell-Linien inkubiert (Adipozyten, Hepatozyten, Enterozyten, Muskelzellen). Zellgehalte und Überstände werden mittels FT-MS analysiert. Verbindungen, die ähnliche Peaks wie Referenzmoleküle in Zellen und Tieren erhöhen, werden verglichen und Struktur-Aktivitäts-Beziehungen werden bestimmt. Moleküle werden unter Verwendung von Chemie-Computer-Software wie Catalyst (MSI) verglichen. Pharmacophore werden identifiziert und es werden Hypothesen aufgestellt.
Die Hypothesen werden dann verwendet, um virtuelle Bibliotheken von Verbindungen durchzumustern. Die aktivsten werden dann in Tieren in einem iterativen Prozess getestet.
Das Testen von Pharmacophoren/Hypothesen führt zur Synthese neuer chemischer Gebilde der aktivsten identifizierten Verbindungen. Auf diese Weise neu identifizierte Verbindungen sind Leitverbindungen für die Arzneimittelentwicklung.

Claims

Verfahren zur Identifizierung eines oder mehrerer Moleküle, welche sich in der Abundanz zwischen einer ersten Zellpopulation und einer zweiten Zellpopulation unterscheiden, welches umfasst: (a) Vergleichen eines ersten Peakprofils eines Fourier-Transformations-Massenspektrums (FTMS), welches aus der ersten Zellpopulation erhalten wird, mit einem zweiten FTMS-Peakprofil, welches aus der zweiten Zellpopulation erhalten wird, wobei das erste Peakprofil und das zweite Peakprofil nicht gleichzeitig erhalten werden, und wobei die ersten und zweiten Zellpopulationen keine Markierung enthalten; und (b) Identifizieren eines oder mehrerer Peaks, welche sich in der Intensität im ersten FTMS-Peakprofil relativ zum zweiten FTMS-Peakprofil unterscheiden, wobei ein oder mehrere Peaks einem oder mehreren Molekülen entsprechen, welche sich in der Abundanz zwischen einer ersten Zellpopulation und einer zweiten Zellpopulation unterscheiden, wobei dadurch ein oder mehrere Moleküle, welche sich in der Abundanz zwischen einer ersten Zellpopulation und einer zweiten Zellpopulation unterscheiden, identifiziert werden.
Verfahren zur Identifizierung eines oder mehrerer Moleküle, welche sich in der Abundanz zwischen einer ersten Zellpopulation und einer zweiten Zellpopulation unterscheiden, welches umfasst: (a) Vergleichen eines ersten Peakprofils eines Fourier-Transformations-Massenspektrums (FTMS), welches aus der ersten Zellpopulation erhalten wird, mit einem zweiten FTMS-Peakprofil, welches aus der zweiten Zellpopulation erhalten wird, wobei das erste Peakprofil und das zweite Peakprofil unabhängig voneinander erhalten werden; und (b) Identifizieren eines oder mehrerer Peaks, welche sich in der Intensität im ersten FTMS-Peakprofil relativ zum zweiten FTMS-Peakprofil unterscheiden, wobei ein oder mehrere Peaks einem oder mehreren Molekülen entsprechen, welche sich in der Abundanz zwischen einer ersten Zellpopulation unterscheiden, wobei die Moleküle, welche sich in der Abundanz unterscheiden, ausgewählt werden aus der Gruppe Lipide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Metabolite oder kleine Moleküle.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Moleküle, welche sich in der Abundanz unterscheiden, kleine Moleküle mit einem Molekulargewicht kleiner als 2.500 Dalton sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches weiter umfasst: (c) vor Schritt (a): Erhalten des ersten FTMS-Peakprofils aus der ersten Zellpopulation durch Unterwerfen der besagten ersten Zellpopulation der FTMS.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches weiter umfasst: (c) vor Schritt (a): Erhalten des zweiten FTMS-Peakprofils aus der zweiten Zellpopulation durch Unterwerfen der besagten zweiten Zellpopulation der FTMS.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die erste Zellpopulation eine Referenz-Zellpopulation und die zweite Zellpopulation eine Test-Zellpopulation ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die erste und die zweite Zellpopulation aus verschiedenen Zelltypen bestehen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die erste und die zweite Zellpopulation aus verschiedenen Gewebetypen aus dem gleichen Organismus bestehen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die erste und die zweite Zellpopulation aus dem gleichen Gewebetyp aus verschiedenen Organismen bestehen.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die erste und die zweite Zellpopulation aus dem gleichen Zelltyp bestehen.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die erste Zellpopulation eine normale Zellpopulation und die zweite Zellpopulation eine erkrankte Zellpopulation ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die erkrankte Zellpopulation eine kanzeröse Zellpopulation ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die kanzeröse Zellpopulation eine Population eines Melanoms, einer myeloiden Leukämie oder von Karzinomzellen ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Karzinom ein Lungen-, Brust-, Ovar-, Dickdarm-, Nieren-, Prostata-, Pankreas-, Magen-, Gehirnkarzinom, ein Karzinom des lymphatischen Systems, des Thymus, der Schilddrüse, der Nebenniere oder der Hoden ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die erkrankte Zellpopulation aus einem Individuum mit einer kardiovaskulären Erkrankung stammt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die erkrankte Zellpopulation eine Population von Cardiomyocyten, endothelischen Zellen, Makrophagen, Hepatocyten, Adipocyten, Zellen der glatten Muskulatur oder intestinalen Zellen ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die erkrankte Zellpopulation aus einem Individuum stammt, welches Diabetes hat.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die erkrankte Zellpopulation eine Population von Cardiomyocyten, endothelischen Zellen, Makrophagen, Zellen des Pankreas, Hepatocyten, Adipocyten, Zellen der glatten Muskulatur oder intestinalen Zellen ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die erkrankte Zellpopulation aus einem fettleibigen Individuum stammt.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die erkrankte Zellpopulation eine Population von Cardiomyocyten, endothelischen Zellen, Makrophagen, Hepatocyten, Adipocyten, Zellen der glatten Muskulatur oder intestinalen Zellen ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die erste Zellpopulation nicht bereits einem Testwirkstoff unterworfen wurde, und wobei die zweite Zellpopulation bereits einem Testwirkstoff unterworfen wurde.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Testwirkstoff ein bekanntes Arzneimittel ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Testwirkstoff ein Kandidat für ein Arzneimittel ist.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei der Testwirkstoff ein kleines Molekül ist.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei der Testwirkstoff ein Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Protein ein Hormon, ein Wachstumsfaktor, ein Cytokin, ein Ligand oder ein Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei der Testwirkstoff eine Nukleinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Nukleinsäure eine Antisense-Nukleinsäure, eine Nukleinsäure mit einer Dreifachhelix oder ein Ribozym ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Nukleinsäure eine DNA, eine RNA oder ein DNA-RNA-Hybrid ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das erste FTMS-Peakprofil aus einer früheren Kontrolluntersuchung stammt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das erste FTMS-Peakprofil aus einer gleichzeitigen Kontrolluntersuchung stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die erste und zweite Zellpopulationen Populationen von Primärzellen aus einem Gewebe oder einem Organ sind.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei sich in den Primärzellen primäre Gehirn-, Haut-, Lungenzellen, endothelische Zellen, epithelische Zellen, Fett-, Muskel-, Knochen-, Magen-, Dickdarm-, Milz-, Pankreas-, Nieren-, Blasen-, Herzzellen, Zellen des lymphatischen Systems, Blut- oder Leberzellen befinden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33, wobei das erste Peakprofil und das zweite Peakprofil aus ganzen Zellextrakten erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei der ganze Zellextrakt ein Zellextrakt ist, der mit einem Lösungsmittel extrahiert wurde.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei der ganze Zellextrakt entsalzt wird.
Verfahren nach Anspruch 34, welches weiter umfasst: (c) vor Schritt (a): Erhalten des ersten FTMS-Peakprofils aus der ersten Zellpopulation durch Unterwerfen der besagten ersten Zellpopulation der FTMS.
Verfahren nach Anspruch 34, welches weiter umfasst: (c) vor Schritt (a): Erhalten des zweiten FTMS-Peakprofils aus der zweiten Zellpopulation durch Unterwerfen der besagten zweiten Zellpopulation der FTMS.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei die erste Zellpopulation eine Referenz-Zellpopulation und die zweite Zellpopulation eine Test-Zellpopulation ist.