ES2259668T3 - Espectrometria de masas por transformadas de fourier de muestras biologicas complejas. - Google Patents

Abstract

Un método para identificar unas o más moléculas que se diferencian en abundancia entre una primera población de células y una segunda población de células, que comprende: (a) comparar un primer perfil de picos de Espectrometría de Masas por Transformadas de Fourier (FTMS, por sus siglas en inglés) obtenido de la primera población de células con un segundo perfil de picos de FTMS obtenido de la segunda población de células, en donde el primer perfil de picos y el segundo perfil de picos no se obtienen de manera concurrente y en donde la primera y la segunda poblaciones de células no contienen una etiqueta; y (b) identificar uno o más picos que se diferencian en intensidad en el primer perfil de picos de FTMS con relación al segundo perfil de picos de FTMS, en el cual uno o más picos corresponden a una o más moléculas que se diferencian en abundancia entre una primera población de células y una segunda población de células, identificando así una o más moléculas que se diferencian en abundancia entre una primera población de células y una segunda población de células.

Description

Espectrometría de masas por transformadas de fourier de muestras biológicas complejas.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con métodos para análisis de alto contenido informativo (HIC) o investigación de sistemas biológicos complejos usando espectrometría de masas por transformadas de Fourier (FTMS, por sus siglas en inglés). Los métodos presentes son útiles para analizar mezclas biológicas complejas que contienen moléculas de alto peso molecular (por ejemplo, polinucleótidos, proteínas, polisacáridos) y moléculas de bajo peso molecular (por ejemplo, oligonucleótidos, péptidos, lípidos, oligosacáridos, hormonas esteroides, intermedios catabólicos y metabólicos) para permitir elucidar las diferencias moleculares entre las muestras biológicas complejas, y permitir identificar moléculas biológicamente activas (por ejemplo drogas terapéuticamente activas, etc.).

Antecedentes de la invención

La espectrometría de masas es una técnica analítica que mide la masa de un átomo o de una molécula (referidas como masa atómica y masa molecular, respectivamente). Puesto que la masa molecular es la suma estequiométrica de las masas atómicas de todos y cada uno de los elementos en la molécula, para cada analito se proporciona una medida característica que tiene una fórmula empírica diferente.

El instrumento usado para medir la masa molecular se conoce como espectrómetro de masas. Típicamente, la espectrometría de masas es realizada volatilizando (en una fase de gas) un analito, ionizando luego el analito y detectando señales. Para la mayoría de los tipos de espectrómetros de masas, el detector consiste en un tipo de multiplicador electrónico. Los iones que chocan sobre tal detector crean electrones secundarios que se registran como una corriente mensurable. A este respecto, el instrumento de FTMS es diferente de manera única por medir los iones indirectamente y de manera no destructiva al medir una corriente de imagen. Los datos generados finamente, es decir, un espectro de masas, tienen dos coordenadas: la escala de relación de masa a carga (eje x) y la escala de la intensidad (eje y).

Las masas moleculares de los iones en fase gaseosa, que se forman tanto de las moléculas neutrales como de las cargadas, se determinan con base en sus relaciones de masa a carga (m/z). Si se desea una fragmentación adicional de los iones de la fase gaseosa, se puede lograr haciéndolos colisionar con las moléculas del gas, lo que se llama "disociación inducida por colisión" (CID, por sus siglas en inglés). Los sub-fragmentos que se generan se separan entonces también por masa.

En años recientes, la espectrometría de masas se ha explotado en una variedad de contextos biológicos, incluyendo secuenciación de ácido nucleico, secuenciación e identificación de péptidos (Keen y Findlay, "Técnicas de secuenciación de proteínas," en Molecular Biology and Biotechnology, Roberto A. Meyers, ed., editores de VCH, inc. 1995, p. 771; Carr y Annan, descripción del análisis de péptido y de proteína por espectrometría de masas, en Protocolos presentes en la biología molecular (o Current Protocols in Molecular Biology por su nombre en inglés), Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., 1997, 10.21); detección de la modificación post-translacional y la expresión de proteína in vitro e in vivo (Rowley et al., 2000, Methods 20:383-397); explicación de la estructura terciaria de la proteína (Last y Robinson, 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:564-570); estudio de biomoléculas labiles, asociadas no covalentemente (Budnik et al., 2000, Rapid Commun Mass Spectrom. 14:578-584); diagnóstico de enfermedades (Bartlett y Pourfarzam, 1999, J. Inherit. Metab. Dis. 22:568-571); vigilancia de la contaminación del medio ambiente (Scribner et al., 2000, Sci. Total Environ. 248:157-167); investigación agrícola (Hau et al., 2000, J. Chromatogr. 878:77-86); y usos forenses (Hollenbeck et al., 1999, J. Forensic Sci. 44:783-788; Gaillard y Pepin, 1999, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 733:181-229).

La espectrometría de masas, que proporciona sensibilidad y exactitud femtomolar mejor de 0.01%, ha emergido como una atractiva alternativa a los métodos químicos para secuenciación e identificación de péptidos. La sensibilidad de la espectrometría de masas ha sido mejorada usando péptidos isotópicamente etiquetados y combinando una fuente de iones en nanoelectrospray (aspersión nanoeléctrica) con un espectrómetro de masas en tándem (combinados) de tiempo-de-vuelo y cuadripolar o cuadrupolo. Este enfoque explota una característica intrínseca del dispositivo de tiempo-de-vuelo y cuadripolar o cuadrupolo, produciendo una sensibilidad y resolución más altas que otros tipos de espectrómetros de masas (Shevchenko et al., 1997, Rapid Comm Mass Spectrom. 11:1015-1024). El etiquetado isotópico de los fragmentos de péptido C-terminal, por ejemplo, mediante digestión enzimática de una proteína en 1:116O/18O de agua, proporciona una distribución isotópica característica para estos fragmentos que pueden ser identificados fácilmente (Schnolzer et al., 1996, Electrophoresis, 17:945-953); de tal modo que se revele la secuencia del aminoácido.

La espectrometría de masas se puede también utilizar para estudiar la estructura de una proteína. Esta tecnología puede proporcionar las masas moleculares exactas para cantidades diminutas de las proteínas de interés con masas hasta de 500.000 Daltons ("Da"). Los espectros que resultan también pueden ayudar a determinar el plegamiento de la proteína, la autoasociación de la proteína y otros cambios conformacionales y la estructura terciaria (Nguyen et al., 1995, J Chromatogr A 705:21-45). Además, las modificaciones co- y post-translacionales de las proteínas pueden ser identificadas y mapeadas. Este método es preferible a usar métodos químicos tales como secuenciación de C-terminal, que requiere tratamiento relativamente áspero de la muestra, lo cual puede alterar o destruir tales modificaciones de la proteína. Las modificaciones post-translacionales que se pueden identificar usando espectrometría de masas incluyen fosforilación, glicosilación, deamidación, alquilación, formación de isoaspartil, y formación de enlaces disulfuro.

La espectrometría de masas también ha encontrado usos importantes en el estudio de interacciones proteína-proteína. Las proteínas objeto de estudio se pueden seguir in vivo para documentar sus cambios conformacionales, uso activo de sitio, reconocimiento de ligando, ensamblaje de complejos multiméricos (por ejemplo, holoenzimas), y tráfico entre organelas.

La espectrometría de masas por transformadas de Fourier (FTMS) también se conoce como resonancia de ciclotrón de iones por transformadas de Fourier (FTICR por sus siglas en inglés). El principio de la determinación de masas moleculares usado en FTMS se basa en una relación linear entre la masa de un ion y su frecuencia de ciclotrón. En un campo magnético uniforme, un ion procesará sobre el centro del campo magnético en un movimiento circular periódico, conocido como movimiento del ciclotrón. Se puede hacer un ensamblaje de iones que tienen una relación particular masa-a-carga (m/z) para efectuar el movimiento de ciclotrón en fase, produciendo una corriente de imagen. La corriente de imagen se detecta entre un par de electrodos receptores, produciéndose una señal de onda sinusoidal. La transformada de Fourier es un método matemático de de-convolución usado para separar las señales de muchos conjuntos diferentes de m/z en una frecuencia, también conocida como espectro de masas. A diferencia de otras formas de espectrometría de masas, la FTMS no es destructiva. Para una revisión general de FTMS, ver Hendrickson y Emmett, 1999, Ann. Rev. Phys. Chem. 50:517-536. El uso de FTMS a las ciencias biológicas es generalmente similar a otros usos de la espectrometría de masas. Vea, por ejemplo, Smith et al., 1996, "El papel de la espectrometría de masas de resonancia ión ciclotrónica por transformadas de Fourier en la investigación biológica - los nuevos progresos y usos" en Espectrometría de Masas en las ciencias Biológicas, eds. A.L. Burlingame y S.A. Carr, Humana Press, Totowa, Nuevo-Jersey; McLafferty, 1994, Acc. Chem. Res. 27:379-386.

Un número de investigadores han comenzado a evaluar el uso de FTMS en el análisis de muestras biológicas; ver Jensen et al., Electrophoresis 2000 21:1372-1380; Jensen et al., Anal. Chem. 1999 71:2076-2084; Palblad et al., Rapid Comm. Mass Spec. 2000, 14:1029-1034; WO 95/25281; WO 00/29987; WO 00/03240; WO 99/58727; WO 99/57318; WO 99/46047; U et al., Anal. Chem. 1999 71:4397-4402; Penn et al., Anal. Chem. 1997; 669:2471-2477; y patentes de EEUU Nos. 6.017.093 y 4.224.031.

Los métodos analíticos útiles en descubrimiento de drogas se basan sobre todo en observaciones individuales en el punto final. El apuntar a interacciones biológicas específicas (por ejemplo, receptor-ligando, substrato-enzima) para la intervención xenobiótica ha sido un paradigma común para buscar y evaluar bibliotecas químicas. El enfoque tradicional elegido para el descubrimiento de drogas por parte de compañías farmacéuticas de biotecnología y de genoma es el clásico Cribado (Tamizaje) de Alto Rendimiento (HTS, por sus siglas en inglés "High Throughput Screening"), que impone una investigación paralela en grandes bibliotecas químicas en objetivos individuales usando ensayos generalmente sin células. Las bibliotecas químicas usadas en HTS se generan lo más a menudo posible usando química combinatoria. Las colecciones de productos químicos obtenidos de fuentes naturales o generadas usando química "convencional" se utilizan en un grado inferior en HTS.

El enfoque de HTS se sienta como premisa para objetivos validados, usualmente proteínas (por ejemplo, enzimas, receptores, proteínas de transferencia) o ácidos nucleicos (genes, mRNAs). Por lo tanto, se conoce generalmente la proteína o el ácido nucleico objetivos usados en el análisis mediante HTS y se piensa que desempeña un papel en el estado de la enfermedad. Sólo entonces se buscan moduladores de la proteína objetivo tales como compuestos de plomo para desarrollo de droga. Los operarios han conducido HTS en objetivos solamente para encontrar después que la proteína objetiva era irrelevante para la enfermedad. Por ejemplo, debido a que los receptores pueden existir en forma de diferentes subtipos, sólo uno de los cuales puede ser críticamente esencial, un ratón para golpe de gracia que apunta al subtipo incorrecto del receptor no podría probablemente demostrar un fenotipo relevante. Se vuelve claro que muchas funciones biológicas son apoyadas por trayectorias bioquímicas redundantes. Cuando un camino falla, los mecanismos redundantes asumen el rol. Muchas drogas desarrolladas con base en un objetivo definido muestran poca o ninguna actividad terapéutica in vivo porque los caminos bioquímicos redundantes puentean el camino en el cual el objetivo está involucrado.

Para que el HTS sea exitoso, los objetivos requieren generalmente un ambiente celular apropiado o un contexto biológico. Por ejemplo, un receptor de la membrana debe estar en una membrana similar a aquella en la cual normalmente se encuentra el receptor; si no, las características del receptor pueden ser afectadas artificialmente. Un ajuste conveniente de la membrana puede requerir la reconstitución de la membrana con los lípidos apropiados. La reconstitución del ambiente conveniente de la membrana es la tarea más desafiante en tales situaciones, debido a una carencia del conocimiento suficientemente detallado de los componentes de tal ambiente, o debido a la complejidad del ajuste natural de la membrana.

Además, un HTS clásico exitoso requiere conocimiento del mecanismo de la enfermedad o del desorden del interés, permitiendo la selección de un objetivo conveniente para la validación y, eventualmente, cribándola o tamizándola (screening). En ausencia de tal conocimiento detallado, el HTS clásico no puede ser realizado.

Otra limitación de la técnica es que el HTS basado en un objetivo validado revela moduladores solamente de ese objetivo. En última instancia, el costoso y laborioso procedimiento de tamizaje o cribado (screening) puede, en el mejor de los casos, proporcionar un subconjunto pequeño de compuestos potenciales de prueba.

Por lo tanto, un método que permite la selección exacta, simultánea para moduladores de múltiples, objetivos no validados en sus ambientes naturales mejoraría mucho el paso de descubrimiento de la droga, mientras los costos se reducen. En particular, la identificación de moléculas pequeñas presentes en cantidades anormales en estados específicos (estados de enfermedad, estados de desarrollo, estados de diferenciación, etc.) deben facilitar el diseño de los análogos, de los agonistas o de los antagonistas de estas moléculas, conduciendo a una identificación rápida de drogas de alta especificidad que incluyen sin limitarse a drogas farmacéuticas, drogas para usos veterinarios, drogas para usos agrícolas (que eliminan malas hierbas, parásitos/insectos, agonistas de fitohormonas, etc.) y drogas para aplicaciones ambientales (bactericidas, proliferadores de bacterias para limpieza en derramamientos de petróleo, reguladores de proliferación de mejillón, reguladores de proliferación de algas, etc.).

La "bioinformática" se refiere generalmente a la gestión de datos biológicos usando medios de cómputo, incluyendo el almacenaje de datos (registro de datos de una manera eficaz para recuperar fácilmente la información) y el análisis de datos usando cálculos matemáticos intensivos computacionales (análisis estadístico, análisis no lineal, etc.). La bioinformática se utiliza intensamente para determinar las relaciones estructura - actividad usando la gran cantidad de datos generados gracias a la utilización de la Tamizaje o Cribado (screening) de Alto Rendimiento y la Química Combinatoria para diseñar moléculas biológicamente activas más eficaces. El estado de la bioinformática ha evolucionado a partir de la necesidad de organizar y hacer accesible la superabundancia de información sobre la secuencia genética que ha llegado a estar disponible en las últimas dos décadas. Mientras que inicialmente se había utilizado para catalogar las secuencias genéticas normales, la bioinformática se está ampliando para abarcar la identificación de las estructuras de la proteína basándose en el reconocimiento patrón en secuencias primarias y datos de expresión genética obtenidos usando microselección o microordenamiento (microarrays) (véase, por ejemplo, http://www.ebi.ac.uk).

Los métodos de perfilación de la expresión genética útil para identificar los productos genéticos que se expresan o regulan de manera diferencial, en diferentes tipos de células (por ejemplo, como un medio para identificar su función) incluyen la exhibición diferencial, el análisis serial de la expresión genética (SAGE, por sus siglas en inglés "Serial Analysis of Gene Expression"), la tecnología de ordenación (array) de ácido nucleico, la hibridación subtractiva, el análisis de proteoma, y la espectrometría de masas con geles proteínicos de dos dimensiones. Los métodos para perfilamiento de expresión genética se dan como ejemplos en las referencias siguientes, que describen la exhibición diferenciada (Liang y Pardee, 1992, Science 257:967-971), análisis de proteoma (Humphery-Smith et al., 1997, Electrophoresis 18:1217-1242; Dainese et al., 1997, Electrophoresis 18:432-442), SAGE (Velculescu et al., 1995, Science 270:484-487), hibridación subtractiva (Wang y Brown, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. E.E.U.U.. 88:11505-11509), y métodos basados en hibridación para usar ordenaciones del ácido nucleico (Heller et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. E.E.U.U.. 94:2150-2155; Lashkari et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. E.E.U.U. 94:13057-13062; Wodicka et al., 1997, Nature Biotechnol. 15:1259-1267).

Los proyectos de secuenciación de genoma, tales como el proyecto del Genoma Humano, han creado grandes bases de datos de secuencias de genes. La función biológica, sin embargo, no se puede determinar solamente a partir de datos de la secuencia del nucleótido, sino que debe ser establecida en última instancia estudiando los productos genéticos a nivel de la proteína. Solamente estudiando la proteína misma se puede reconocer su patrón de expresión, la asociación con otras moléculas in vivo, y su papel en tejidos normal y enfermo. Reconociendo estos inconvenientes de la investigación del genoma, los científicos han adoptado el enfoque de "Proteómica". El campo de la proteómica ha avanzado utilizando la electroforesis con gel poliacrilamídico de dos dimensiones (2-D PAGE), que es capaz de resolver millares de proteínas según su carga y masa. Los patrones de la proteína que resultan se comparan entonces, y se hacen tentativas de asignar patrones únicos a tipos particulares de célula o a estados particulares de enfermedad. Sin embargo, 2-D PAGE puede fallar al resolver el gran número de proteínas presentes en muestras complejas, y la técnica consume mucho tiempo, involucra trabajo intenso y es costosa. Además, 2-D PAGE puede también fallar perceptiblemente en la detección de proteínas con baja abundancia, poca concentración. 2-D PAGE tiene un rango dinámico relativamente bajo, particularmente en comparación con FTMS.

Resumen de la invención

De acuerdo con los objetos mencionados arriba, la presente invención tal como se describe en las reivindicaciones proporciona métodos que comprenden comparar un perfil de picos de FTMS de una primera muestra biológica derivada de células que no se han expuesto a un agente bioactivo candidato con un perfil de picos de FTMS de una segunda muestra biológica derivada de una célula que se ha expuesto al agente bioactivo candidato.

En un aspecto más, la presente invención suministra métodos que comprenden poner en contacto una primera población de células con un primer agente bioactivo candidato y someter la primera población de células al análisis por FTMS para obtener un primer perfil de picos o de pico. El primer perfil se compara con un perfil de referencia de la primera población de células en ausencia del primer agente.

En un aspecto adicional, la presente invención suministra métodos que comprenden someter una primera población de células al análisis de FTMS para obtener un primer perfil del pico (máximo) que comprende una pluralidad de picos, en la cual por lo menos dos picos corresponden a diferentes tipos de biomoléculas.

En un aspecto más, la presente invención suministra métodos que comprenden una población de células que comprenden por lo menos una primera y una segunda subpoblación de células y poner en contacto la primera subpoblación de células con un primer agente bioactivo candidato. La segunda subpoblación de células se pone en contacto con un segundo agente bioactivo candidato y se somete la primera y la segunda subpoblaciones de células al análisis de FTMS para obtener un primer y un segundo perfiles de pico, respectivamente. El primer y dicho segundo perfiles de pico se comparan con un perfil de referencia de la población de células en ausencia de los agentes.

En un aspecto adicional, la presente invención suministra métodos que comprenden poner en contacto una primera población de células con una droga y someter la población de células al análisis de FTMS para obtener un perfil de picos (de pico). El perfil se compara con un perfil de referencia de dicha población de células en ausencia de dicha droga.

En un aspecto más, la presente invención proporciona métodos que comprenden suministrar una población de células que comprenden por lo menos una primera y una segunda subpoblación y poner en contacto la primera subpoblación de células con una droga a una primera concentración y poner en contacto la segunda subpoblación de células con una droga a una segunda concentración. La primera y segunda subpoblaciones de células se someten al análisis de FTMS para obtener un primer y segundo perfiles de pico (máximos), respectivamente. El primer y segundo perfiles de pico (máximos) se comparan para identificar por lo menos un pico que difiera en intensidad, cuyo pico no corresponde a la droga.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos que comprenden someter una primera población de células al análisis de FTMS para obtener un primer perfil de pico (máximo) y someter una segunda población de células al análisis de FTMS para obtener un segundo perfil de pico, en donde dichas primera y segunda poblaciones son de diferentes tipos de célula. Los primeros y segundos perfiles de pico se comparan para identificar por lo menos un pico que se diferencie en intensidad.

En un aspecto más, la presente invención proporciona métodos para usar el software SAR (por sus siglas en inglés "software activity relationship" o relación de actividad del software) en combinación con el análisis de FTMS para generar hipótesis químicas y para crear nuevas moléculas biológicamente activas.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos de determinar los componentes y las rutas de los estados de enfermedad. Los métodos comprenden someter una población de células de un organismo con un estado de enfermedad al análisis de FTMS para obtener un primer perfil de pico. El perfil de picos se compara entonces con un perfil de referencia de células de un organismo sin el estado de enfermedad, o con las células del mismo organismo de un tejido que no esté enfermo. La comparación da lugar a la identificación por lo menos de un pico que diferencia o bien en intensidad o bien está presente en un perfil pero no en el otro. El componente celular que da lugar a este pico se identifica entonces. Esta información se puede utilizar en una variedad de maneras. Se puede buscar en las bases de datos para vincular asociados del componente celular con el fin de dilucidar las rutas celulares del estado de enfermedad. El componente celular o sus asociados vinculados se pueden utilizar en la selección de candidatos para la droga.

En un aspecto más, la invención proporciona métodos de tamizaje o cribado (screening) para el descubrimiento de drogas nuevas. Los métodos comprenden el uso de cualquier número de pre-tamizaje o pre-cribado (prescreening) de métodos que comprenden añadir agentes candidatos a células y seleccionar fenotipos alterados. Las células que exhiben fenotipos alterados se someten luego al análisis de FTMS y se identifican los picos relevantes. Alternativamente, una vez que se generan los perfiles de picos de los efectos deseables, se puede hacer tamizaje o cribado (screening) de las drogas candidatas, tales como aquellas generadas en los estudios de relación estructura-actividad (SAR, por sus siglas en inglés) que imitan estos perfiles de picos deseables.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para el diseño de droga novo. Los métodos incluyen la generación de una pluralidad de análisis de FTMS en un conjunto limitado o una biblioteca de compuestos candidatos. Los perfiles de picos que resultan se comparan luego con los perfiles de picos deseables (por ejemplo, ésos que se han generado usando drogas conocidas o células libres de enfermedad) para identificar las "formas" o "aspectos", los "farmacóforos" o los "sitios activos" que son relevantes. Los resultados se pueden entonces "tamizar" (screen) frente a bibliotecas químicas virtuales para identificar los compuestos adicionales para ensayar en la selección tradicional y la de FTMS.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra los pasos de un proceso preferido para seleccionar picos.

La fig. 2 ilustra los pasos del proceso preferido para analizar los resultados de HICS-FTMS para una muestra biológica.

La fig. 3 ilustra los pasos de un proceso preferido para identificar los picos comunes entre los espectros de masas.

La fig. 4 proporciona espectros ilustrativos de las muestras obtenidas de los hepatocitos no tratados (espectros A-C) vs. espectros de las muestras tratadas con lovastatina (espectros D-H).

La fig. 5 contiene el software para análisis de datos HICS-FTMS que fue utilizado para analizar 82 picos de masas moleculares bajas de los espectros HICS-FTMS generados a partir de los extractos de los hepatocitos de rata después de haber sido tratados con varias concentraciones de lovastatina. Las intensidades relativas de cada pico se grafican en el eje y (normalizadas frente a las intensidades de los picos de hepatocitos no tratados) frente a la concentración de lovastatina en PM sobre el eje x. El número en la cima de cada gráfico es la masa molecular de la molécula correspondiente. LOWESS fue utilizado para realizar el ajuste lineal y no lineal de la curva. Fue utilizada regresión logística para refinar el ajuste de curva y para proporcionar medidas estadísticas exactas.

Descripción detallada de la invención

Los solicitantes han descubierto que los espectros FTMS de muestras biológicas complejas tienen la resolución y la sensibilidad indispensables para permitir el análisis de moléculas individuales presentes en la muestra, cada una de las cuales puede dar lugar a uno o más picos FTMS únicos entre los picos del perfil de picos de la muestra. La capacidad de obtener picos específicos permite medir la intensidad del pico, y por lo tanto la concentración relativa de la molécula a la cual el pico corresponde, en la muestra biológica compleja. Esta característica es particularmente útil en estudios comparativos y permite el estudio de una molécula particular en una variedad de estados biológicos, y la caracterización de cada estado biológico específico, facilitando el cribado o tamizaje (screening) de alto contenido informativo (HICS) o el análisis de alto contenido de información (HICA). A la selección y al análisis de alto contenido de información mediante FTMS se refieren más abajo como HICS-FTMS e HICA-FTMS, respectivamente. Así, a diferencia de los enfoques tradicionales que investigan, en su mayoría, un puñado de moléculas a la vez, HICS-FTMS e HICA-FTMS tienen mayor aplicabilidad general, útiles en la mayoría de los problemas biológicos, que los métodos disponibles en la actualidad. Esto abarca el uso de HICS-FTMS y de HICA-FTMS para caracterizar y distinguir estados biológicos en los diversos momentos en sistemas complejos. En particular, esta poderosa técnica tiene implicaciones clínicas cuando es utilizada para comparar estados normales y estados de enfermedad, para identificar marcadores característicos durante la progresión de la enfermedad, y para supervisar las terapias con la droga. Por otra parte, la invención abarca el desarrollo de la droga con la ayuda de HICS-FTMS dilucidando interacciones proteína-proteína, definiendo organelas y componentes citoplásmicos, y caracterizando complejos multiméricos de la proteína.

FTMS proporciona un número de ventajas y beneficios distintivos por sobre la espectroscopia de masas tradicional (MS). La resolución, la exactitud y la sensibilidad de FTMS la hacen ideal para el análisis de muestras biológicas complejas. Estas muestras pueden incluir componentes de alta masa molecular tales como ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, y oligosacáridos, incluyendo pero sin limitar a las lipoproteínas, los proteoglicanos y las moléculas químicamente modificadas (por ejemplo, proteínas fosforilatadas), y componentes de masas moleculares bajas, tales como péptidos, intermedios metabólicos, metabolitos y catabolitos de la droga. Descifrar la complejidad química de un sistema celular así requiere energía de alta resolución y exactitud de masa. De todas las técnicas espectrométrica de masas, FTMS es la más capaz de alcanzar el rendimiento más alto en términos de energía de resolución y de exactitud de masa.

Además, la naturaleza no destructiva de FTMS permite el análisis y el re-análisis de cantidades pequeñas de muestra, y la resolución permite la caracterización y la identificación específicas de diferentes componentes celulares. Así, una ventaja es que mientras que el rango dinámico de masas de estas técnicas durante cualquier corrida particular puede estar en el orden de 103 a 104, el análisis secuencial permite la extensión de este rango. FTMS puede eliminar la necesidad de tener separación del tratamiento previo (2D-PAGE, HPLC, CG, etc.) como se requiere al usar espectrometría de masas clásica; FTMS tiene un rango dinámico más alto que 2D-PAGE. Además, como la fuerza magnética de FTMS aumenta mientras que la tecnología crece, el rango dinámico y la energía de resolución aumentarán. Además, la calidad no destructiva de FTMS puede permitir el análisis de diferentes tipos de biomoléculas (por ejemplo proteínas, lípidos, carbohidratos, metabolitos, etc.) inmediatamente o en corridas secuenciales sobre la misma muestra o en muestras similares. Es decir, la naturaleza no destructiva de FTMS permite la generación de información robusta, variando condiciones experimentales iniciales, variando los pasos preparatorios y variando solventes y condiciones de corrida (incluyendo topes de masas).

Así, la presente invención según lo descrito en las reivindicaciones proporciona un número de diferentes pruebas y análisis para permitir dilucidar una variedad de componentes, de mecanismos y de rutas celulares. Hay tres utilidades básicas para la presente invención. En una realización preferida, la presente invención se utiliza para dilucidar y para descubrir componentes y rutas de los estados de enfermedad. Por ejemplo, la comparación de tejido enfermo (o, según lo esbozado abajo, tejidos o células expuestos a diferentes tratamientos tales como calor, tensión, etc.) con el tejido "normal" permite dilucidar moléculas importantes implicadas en la enfermedad. Las rutas de la enfermedad pueden también ser aclaradas.

En segundo lugar, la presente invención también suministra el descubrimiento/tamizaje o cribado (screening) de nuevos candidatos de la droga que pueden ser utilizados para tratar enfermedad. Por ejemplo, habiendo identificado efectos relevantes (por ejemplo la presencia o la ausencia de ciertas moléculas; los picos en un espectro de la enfermedad o un espectro de una droga con un efecto deseable o indeseable), las bibliotecas químicas de candidatos de la droga se pueden seleccionar para una duplicación o elusión de un efecto relevante. Así, por ejemplo, las bibliotecas químicas nuevas se pueden "tamizar" para los "golpes" iniciales, o las relaciones de estructura-actividad (SAR) pueden ser hechas una vez se haya identificado una estructura (scaffold) relevante.

Finalmente, la presente invención también suministra el diseño de la droga de novo de la siguiente manera. El tamizado inicial FTMS de bibliotecas limitadas de compuestos candidatos se puede hacer para identificar compuestos relevantes. Esto puede ser seguido de un tamizado de bibliotecas virtuales y/o verdaderas de farmacoforos para identificar las estructuras que pueden tener actividades similares. Estas moléculas virtuales se pueden después sintetizar y probar para la actividad.

Comparando perfiles de picos de FTMS de diferentes muestras, pueden ser dilucidados datos complejos e intensivos; los métodos permiten la identificación de las biomoléculas que están presentes en diferentes muestras de manera diferenciada; esto incluye cambios tanto en presencia como en ausencia de picos así como también los cambios en la intensidad máxima. Por ejemplo, los perfiles de picos FTMS se pueden obtener de las células que se han expuesto a uno o más agentes o drogas candidatos, y se han comparado con los perfiles de las células no tratadas para identificar cambios celulares asociados a la droga o al compuesto; por ejemplo, los perfiles de toxicidad pueden ser obtenidos o se pueden tamizar bibliotecas de candidatos de la droga para efectos deseables o indeseables. De manera similar, las células de diferentes estados de la enfermedad, como, por ejemplo, la enfermedad cardiovascular, cáncer, diabetes, obesidad, enfermedades inflamatorias, las enfermedades de Alzheimer, las enfermedades autoinmunes, aquellas infectadas con patógenos, etc. pueden ser comparadas con los perfiles normales de tejido para identificar las rutas y los componentes celulares afectados por la enfermedad. Otro ejemplo implica el comparar perfiles de diferentes tejidos o tipos de célula para identificar componentes específicos de la célula, para construir una base de datos para comparaciones con nuevos tejidos, estados de la enfermedad, o diferentes individuos.

Los métodos descritos en la presente además permiten la detección y/o la identificación de modificaciones químicas de moléculas naturales, la identificación de modificaciones de rutas metabólicas inducidas patológicamente, (es decir, cambios en flujos, acumulación de metabolitos, agotamiento de metabolitos, modificación de metabolitos), la identificación de efectos yatrogénicos, la identificación de la reacción bioquímica y de las rutas bioquímicas, la identificación de intermedios catabólicos y metabólicos, la identificación de las rutas redundantes de bioquímicas/metabólicas, la identificación de rutas bioquímicas/metabólicas de SOS, y la identificación de las rutas de apoptosis. Los intermedios metabólicos y los metabolitos de interés incluyen pero no se limitan a los metabolitos naturales, a las moléculas sintetizadas o degradadas in vivo, a las moléculas modificadas durante reacciones de oxidación o reducción, en células y en fluidos biológicos, así como también diversas moléculas pequeñas y grandes presentes en alimentos (por ejemplo, vitaminas, substancias extrañas) o se generan por la digestión enzimática de alimentos (por ejemplo, aminoácidos, aminoácidos particularmente esenciales, ácidos grasos), así como catabolitos y xenobioticos.

Además, los métodos de la invención se pueden utilizar para generar un número de bases de datos para uso en análisis de muestras. Por ejemplo, los métodos se pueden utilizar para generar una base de datos de las transformaciones metabólicas que ocurren in vivo. Es decir, las moléculas de referencia (por ejemplo estructuras) que contienen subestructuras químicas de interés son administradas y los metabolitos nuevos o alterados son identificados por FTMS. Por ejemplo, las transformaciones metabólicas de aminas secundarias o de alcoholes secundarios se pueden identificar, registrar y puestas en una base de datos de inventario. Cualquier compuesto nuevo con una amina secundaria será evaluado usando la base de datos de transformación metabólica. De manera similar, la presente invención se puede utilizar para generar bases de datos altamente exactas de moléculas pequeñas.

Así, la presente invención proporciona composiciones y métodos implicados en análisis de espectroscopia de masas por transformadas de Fourier (FTMS). FTMS se puede hacer con cualquier número de muestras. Como será apreciado por aquellos versados en el arte, la muestra puede comprender cualquier número de cosas, incluyendo, pero sin limitarse a, células (incluyendo células primarias y las líneas de célula cultivadas), los tejidos y los fluidos corporales (incluyendo, pero sin limitarse a, sangre, orina, suero, linfa, bilis, fluido cerebroespinal, fluido intersticial, humor acuoso o vítreo, colostro, esputo, líquido amniótico, saliva, secreciones anales y vaginales, transpiración y semen, un transudado, un exudado (por ejemplo líquido obtenido de un absceso o de cualquier otro sitio de una infección o de una inflamación) o líquido obtenido de un injerto (por ejemplo un injerto normal o un injerto afectado por enfermedad tal como artritis reumatoide, osteoartritis, gota o artritis séptica) de virtualmente cualquier organismo, siendo preferidas las muestras de mamíferos y siendo particularmente preferidas las muestras humanas; muestras ambientales (que incluyen, pero no se limitan a, muestras de aire, agrícolas, de agua y de suelos); muestras de agente de combate biológico; muestras de investigación que incluyen fluidos extracelulares, los superflotantes extracelulares de cultivos celulares, cuerpos de inclusión en bacterias, compartimientos celulares, periplasma celular, compartimiento de las mitocondrias, etc., muestras purificadas, muestras extraterrestres tales como meteoritos, etc. Como será apreciado por los versados en el arte y esbozado abajo, las muestras pueden ser o bien "nativas", por ejemplo sin manipulación o tratamiento adicional, o "tratadas", que pueden incluir cualquier número de tratamientos, incluyendo la exposición a los agentes candidato que incluyen drogas, ingeniería genética (por ejemplo adición o cancelación de un gen), etc. Esto debe ser distinguido del tratamiento o de la preparación de las muestras para el análisis FTMS, según lo descrito más abajo.

En una realización preferida, se hace FTMS sobre muestras que comprenden células. Como será apreciado por aquellos versados en el arte, hay una variedad amplia de tipos de célula que encuentran uso en la presente invención, incluyendo las células eucariótidas y procariótida, siendo preferido el primero. Las células procarótidas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las bacterias tales como E. coli, especies de bacilos, las bacterias extremofilas tales como termófilas, etc., y cualquiera o todas las bacterias y los organismos listados debajo, incluyendo el micoplasma, la rickettsia, los organismos unicelulares planctónicos, los paramecio, los pseudomonas, nitrosomonas, nitrobacter etc. Se incluyen en esta definición los priones y los radicales que causan la enfermedad de Kreutzfeld-Jacob.

Las células eucariótidas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las células de insecto; hongos tales como levadura y hongos filamentosos, incluyendo la especie de aspergillus, Trichoderma, Pichia y neuroespora, micoplasmas, etc. e incluyen estructuras y esporas florecientes así como líquenes; células de plantas que incluyen las de algas, maíz, zahína, tabaco, canola, soja, algodón, tomate, patata, alfalfa, girasol, etc., e incluyen la flor, el tallo, la savia, las células de la hoja y del polen, etc.; y células animales, incluyendo pescados, pájaros y mamíferos. Las células adecuadas de los pescados incluyen, pero no se limitan a, aquellas de la especie del salmón, trucha, tilapia, atún, carpa, platija, halibut, los peces espadas, bacalao y pez cebra (zebrafish). Las células adecuadas de pájaro incluyen, pero no se limitan a, aquellas de los pollos, los patos, las codornices, los faisanes y los pavos, y otros pájaros de selva foul o de juego. Las células mamíferas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las células de caballos, vacas, búfalo, ciervos, ovejas, conejos, roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y cerdos de Guinea, cabras, cerdos, primates, y seres humanos, los mamíferos marinos incluyendo delfines y ballenas, células primarias así como líneas de célula, tales como líneas de células humanas de cualquier tipo o tipos de vástagos de célula o células de vástago, que incluyen células de vástago pluripotentes y no pluripotentes. Además, las células pueden ser células tumorales según lo esbozado abajo, cardiomiocitos, células endoteliales, células epiteliales, linfocitos (célula T y célula B), mastocitos, eosinofilos, células intimales vasculares, hepatocitos, leucocitos incluyendo los leucocitos mononucleares, células de vástago tales como haemopoetic, de los nervios, piel, pulmón, riñón, las células de vástago del hígado y del miocito, los osteoclastos, los condrocitos y otras células del tejido conectivo, keratinocitos, melanocitos, células del hígado, células del riñón, y adipocitos. Las células adecuadas también incluyen células conocidas de investigación, incluyendo, pero no sin limitarse a, células de Jurkat T, las células NIH3T3, CHO, Cos, etc. Ver el catálogo de la línea celular del ATCC. Como será apreciado por aquellos en el arte, las células pueden tener un número de formatos, incluyendo el uso de muestras congeladas (células y tejidos), los tejidos deshidratados, liofilizados o embalsamados, las células y los tejidos momificados, las células y los tejidos muertos (análisis forense así como la etnología), las bacterias esporuladas, etc. De manera similar, las células pueden ser células diploides o haploides, células mono o multinucleares, plaquetas, células anucleares tales como los eritrocitos, macrófagos y macrófagos activados, células pluripotentes, células diferenciadas y no diferenciadas, células de vástago, y células con las extracromosomas o el material de ácido nucleico. Debe también ser observado que las poblaciones de células incluyen animales reales; es decir, un animal puede ser considerado una población de células.

En una realización preferida y según lo esbozado más abajo, las células usadas en análisis de FTMS son de diferentes tejidos, particularmente de tejidos humanos. Así por ejemplo, los perfiles de picos (de pico) de las células de diferentes tejidos se pueden comparar, para permitir dilucidar marcadores específicos a células así como componentes funcionales no específicos o domésticos. En esta realización, las células pueden ser o bien células primarias o líneas de celulares del cerebro, de la piel, del pulmón, endoteliales, epiteliales, adiposas, de músculo, de hueso, del estómago, del colon, del bazo, del páncreas, del riñón, de la vejiga, del corazón, del sistema linfático, de la sangre, del hígado, etc. En esta realización, los perfiles de FTMS de diferentes tejidos se pueden comparar y utilizar para construir una base de datos, según lo esbozado más abajo. De manera similar, las células pueden ser del mismo tejido pero de diferentes individuos para construir una base de datos para normalizar y evaluar marcadores específicos de células. Las células pueden ser del mismo o de diferentes individuos, especies, subespecies, subgrupos en diferentes biotipos, etc.

En algunas realizaciones, las células primarias se comparan con las líneas de célula del mismo tejido, para identificar diferencias entre las dos. Como se conoce en el arte, algunas líneas de célula no muestran los mismos perfiles y susceptibilidad a las drogas que las células primarias. Así, la presente invención se puede utilizar para evaluar diferencias celulares entre los dos.

En una realización preferida, las comparaciones entre diferentes estados de la célula o las células sometidas a diferentes tratamientos se pueden evaluar usando las técnicas de la presente invención. Por ejemplo, los tratamientos diferenciados convenientes incluyen, pero no se limitan a, el tratamiento físico (tensión, calor, frío, presión, irradiación, etc.), los tratamientos con las hormonas de crecimiento o las hormonas de la metamorfosis (por ejemplo en oruga, anfibios), tratamientos del crecimiento con excitadores químicos (café, drogas, excitadores aminoácidos, etc.) y tratamientos con la excitación eléctrica (por ejemplo en nervios, en células del músculo).

En una realización preferida, las células son de un animal con un estado de enfermedad. El "estado de la enfermedad" en este contexto incluye cualquier dolencia para la cual se desee o bien la información, diagnóstico o tratamiento. El estado de la enfermedad puede ser el resultado de enfermedad genética (incluyendo enfermedades genéticas basadas en cambios proteínicos tales como anemia de fibrosis enquistada o de célula de hoz, o la presencia de polimorfismos nucleótidos particulares individuales, mutaciones en genes supresores de tumor, etc.), cambios celulares somáticos, etc. Por consiguiente, las células convenientes del estado de la enfermedad son aquellas del cáncer, de la enfermedad cardiovascular, de la infección viral o bacteriana, de la obesidad, de la diabetes, de enfermedad inflamatoria, de enfermedad autoinmune, etc. De manera similar, las células de individuos con anormalidades cromosómicas (por ejemplo trisomy, etc.), terapia genética pre- o post-, etc.

En una realización preferida, las células o los tejidos cancerosos se utilizan en la presente invención. En esta realización, las células tumorales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas de los cánceres de la piel incluyendo melanoma, leucemia mieloide, los carcinomas del pulmón, pecho, ovarios, colon, riñón, próstata, páncreas, estómago, cerebro, sistema linfático, timo, tiroides, las glándulas suprarrenales, los testes, etc.

En una realización preferida, las células se obtienen de individuos con enfermedad cardiovascular. Así, las células adecuadas del estado de la enfermedad en esta realización incluyen, pero no se limitan a, los cardiomiocitos, las células endoteliales del sistema circulatorio, los macrófagos, las células del hígado (hepatocitos), los adipocitos, las células de músculo liso, las células intestinales, etc.

En una realización preferida, las células se obtienen de individuos con diabetes. Así, las células adecuadas del estado de la enfermedad en esta realización incluyen, pero no se limitan a, los cardiomiocitos, las células endoteliales del sistema circulatorio, los macrófagos, las células del páncreas, las células del hígado (hepatocitos), los adipocitos, las células de músculo liso, las células intestinales, etc.

En una realización preferida, las células se obtienen de individuos con obesidad. Así, las células adecuadas del estado de la enfermedad en esta realización incluyen, pero no se limitan a, los cardiomiocitos, las células endoteliales del sistema circulatorio, los macrófagos, las células del hígado (hepatocitos), los adipocitos, las células de músculo liso, las células intestinales, etc.

En una realización preferida, las células del estado de la enfermedad se clasifican como tales debido a la infección con virus o bacterias. Los virus adecuados incluyen, pero no se limitan a, los ortomixoviruses, (por ejemplo virus de la gripe), los paramixoviruses (por ejemplo, virus syncytial respiratorio, virus de las paperas, virus del sarampión), adenovirus, rinoviruses, coronaviruses, reovirus, togaviruses (por ejemplo virus del sarampión), parvoviruses, poxviruses (por ejemplo virus de variola, virus del vaccinia), enterovirus (por ejemplo poliovirus, coxsackievirus), virus de la hepatitis (A incluyendo, B y C), herpesviruses (por ejemplo virus symplex del herpes, virus de la varicela-zoster, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr), rotaviruses, virus de Norwalk, hantavirus, arenavirus, rhabdovirus (por ejemplo virus de la rabia), retroviruses (VIH incluyendo, HTLV-I y - II), papovaviruses (por ejemplo papillomavirus), poliomaviruses, y picomaviruses. Las bacterias adecuadas incluyen, pero no se limitan a, una variedad amplia de prokaryotes patógenos y no patógenos de interés incluyendo bacilos; Vibrio, por ejemplo v. cholerae; Escherichia, por ejemplo E. enterotoxigenic coli, Shigella, por ejemplo S. disenterías; Salmonelas, por ejemplo tifus del S.; Tuberculosis del M. del mycobacterium por ejemplo, leprae del M.; Clostridium, por ejemplo C. botulinum, tetani de la C., C. difficile, C. perfringens; Cornyebacterium, por ejemplo diphtheriae de la C.; Estreptococo, pyogenes del S., pneumoniae del S.; Estafilococo, por ejemplo aureus de S.; Haemophilus, por ejemplo influenzae del H.; Neisseria, por ejemplo meningitidis del N., gonorreas del N.; Yersinia, por ejemplo lamblia del G., pestis del Y., mycoplasms, rikettias, pseudomonas, por ejemplo aeruginosa del P., putida del P.; Leischmania, Chlamydia, por ejemplo, trachomatis de la C.; Bordetella, por ejemplo pertussis del B.; y ON treponema, por ejemplo paladio del T.. Sin embargo, en algunas realizaciones, el estado de la enfermedad no incluye la infección bacteriana o viral.

En una realización, las células pueden ser producto de la ingeniería genética, es decir, pueden contener ácido nucleico exógeno (por ejemplo células de "knock-out" o animales transgénicos) o tener ácidos nucleico (incluyendo genes) suprimidos o alterados (por ejemplo las células de "knock-out" o animales transgénicos).

En una realización preferida como se esboza de manera más completa abajo, las células de estados de la enfermedad se comparan con las células del tejido correspondiente que no tienen la enfermedad, es decir tejido normal, para aclarar las diferencias. La muestra normal puede ser del mismo individuo o de un segundo individuo, incluyendo miembros de la familia, gemelos, etc. Además, la muestra normal puede ser de post-tratamiento, por ejemplo después del recibo de los trasplantes de la médula, de quimioterapia, etc.

En una realización preferida, las células se exponen a uno o más agentes bioactivos candidatos (a los que se refiere a veces en la presente como "drogas" o "biomoduladores") antes del análisis de FTMS. El término "agente bioactivo candidato" o "biomodulador", según lo utilizado en la presente, describe cualquier molécula natural o sintética, por ejemplo, una proteína, una molécula orgánica pequeña, carbohidratos (incluyendo polisacáridos), polinucleótidos, lípidos, etc. que se probarán en los sistemas de la invención, particulares para ser probados en la capacidad de sacar una respuesta o una perturbación en un sistema celular. Los ejemplos incluyen drogas, ácidos nucleicos de antisense o de hélice triple, los ribozymas, hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, ligandos, anticuerpos, feromonas, agonistas, antagonistas, análogos, bloqueadores de canal, toxinas, herbicidas, desodorantes o cualquier otra molécula química.

Los agentes candidatos abarcan numerosas clases químicas, aunque son típicamente moléculas orgánicas, compuestos orgánicos preferiblemente pequeños que tienen un peso molecular de más de 100 y menos de cerca de 2.500 daltons, con moléculas extendiéndose preferiblemente de cerca de 100 a cerca de 1000-1500, lo que es preferido. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente enlaces de hidrógeno, e incluyen típicamente por lo menos uno de una amina, de un carbonilo, de un hidroxilo o de un grupo carboxilo, preferiblemente por lo menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos comprenden a menudo carbón cíclico o estructuras heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas substituidas con uno o más de los grupos funcionales antedichos. Los agentes candidatos también se encuentran entre biomoléculas incluyendo péptidos, sacáridos, lípidos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, los derivados, los análogos estructurales o las combinaciones de los mismos. Particularmente preferidos son las moléculas pequeñas, los péptidos, los análogos de péptidos, los análogos de lípidos y los análogos de los carbo-
hidratos.

Los agentes candidatos se obtienen de una variedad amplia de fuentes incluyendo bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para la síntesis al azar y dirigida de una variedad amplia de compuestos orgánicos y de biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos seleccionados al azar. Alternativamente, las bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, de hongos, de plantas y de animales son disponibles o producidas fácilmente. Además, las bibliotecas o las especies nuevas de los agentes candidatos pueden ser hechas alimentando con moléculas precursoras (por ejemplo estructuras scaffold químicas) a los microorganismos (incluyendo bacterias, levadura, etc.) u otros organismos (plantas, actinomicetes, hongos, etc.) para generar nuevos productos químicos o dificultar la síntesis artificial de químicos/moléculas.

Además, las bibliotecas y los compuestos naturales o sintéticamente producidos se modifican fácilmente con medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Los agentes farmacológicos conocidos se pueden someter a modificaciones químicas dirigidas o al azar, tales como la acilación, alquilación, esterificación, amidificación para producir análogos estructurales. Los compuestos pueden ser mezclas o isómeros racémicos.

Además, una o más bibliotecas se pueden tamizar (screened) simultánea o secuencialmente; las bibliotecas pueden estar relacionadas (por ejemplo las bibliotecas ortogonales, las bibliotecas sintéticas de estructuras relacionadas, las bibliotecas naturales de los extractos de planta) o no tener relación.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son proteínas. Por "proteína" se entiende aquí a por lo menos dos aminoácidos covalentemente unidos, lo que incluye proteínas, polipéptidos, los oligopéptidos y los péptidos. La proteína puede componerse de aminoácidos y de enlaces peptídicos que ocurren naturalmente, o estructuras peptidomiméticas sintéticas tales como peptoides. Así el "aminoácido", o el "residuo del péptido", según como se utiliza aquí significa aminoácidos tanto de ocurrencia natural como sintéticos. Por ejemplo, homofenilalanina, citrulline y noreleucine se consideran los aminoácidos para los propósitos de la invención.

El "aminoácido" también incluye residuos ácidos de imino ácidos tales como prolina e hidroxiprolina. Las cadenas laterales pueden estar tanto en la configuración (R) como en la (S). En la realización preferida, los aminoácidos están en configuración (S) o (L). Si se utilizan cadenas laterales de ocurrencia no natural, los sustitutos que no son aminoácidos se pueden utilizar, por ejemplo, para prevenir o para retardar degradaciones in vivo. También se pueden agregar grupos de bloqueo químico u otros sustitutos químicos.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son proteínas de ocurrencia natural o fragmentos de proteínas de ocurrencia natural. Así, por ejemplo, pueden ser utilizados extractos celulares que contienen proteínas, o digestiones aleatorias o dirigidas de extractos celulares proteínicos. De esta manera pueden ser hechas las bibliotecas de proteínas procariotidas y eucariótidas para el tamizado o selección (screening) en los sistemas descritos en la presente. En esta realización se prefieren particularmente las bibliotecas de proteínas bacterianas, de hongos, virales, y mamíferas, siendo las últimas las preferidas y las proteínas especialmente humanas preferidas.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son péptidos de cerca de 5 a cerca de 30 aminoácidos, siendo preferidos aquellos con cerca de 5 a cerca de 20 aminoácidos, y siendo aquellos con cerca de 7 a cerca de 15 particularmente preferidos. Los péptidos pueden ser digestiones de proteínas de ocurrencia natural, tal como se esboza arriba, péptidos aleatorios, o péptidos aleatoriamente "sesgados". Por "aleatorios" o sus equivalentes gramaticales en la presente se entiende que cada ácido nucleico y péptido consiste esencialmente de nucleótidos y aminoácidos aleatorios, respectivamente. Puesto que estos péptidos aleatorios (o los ácidos nucleicos, discutidos abajo) se sintetizan químicamente por lo general, ellos pueden incorporar cualquier nucleótido o aminoácido en cualquier posición. El proceso de síntesis se puede diseñar para generar proteínas o ácidos nucleicos seleccionados al azar, para permitir la formación de todos o la mayoría de las combinaciones posibles sobre la longitud de la secuencia, formando así una biblioteca de agentes candidatos proteínicos bioactivos seleccionados al azar. Así por ejemplo, pueden ser hechas
bibliotecas de péptidos anfifáticos helicoidales, de péptidos de lámina beta, péptidos de lámina beta anfifáticos, etc.

En una realización, la biblioteca se selecciona al azar completamente, sin preferencias de secuencia o constantes en ninguna posición. En una realización preferida, la biblioteca está sesgada. Es decir, algunas posiciones dentro de la secuencia son mantenidas o bien constantes, o se seleccionan de un número limitado de posibilidades. Por ejemplo, en una realización preferida, los nucleótidos o los residuos de aminoácido se seleccionan al azar dentro de una clase definida, por ejemplo, de aminoácidos hidrofóbicos, residuos hidrofílicos, los residuos estéricamente sesgados (ya sean pequeños o grandes), hacia la creación de cisteínas, para entrecruzamiento o reticulado, prolinas para dominios SH-3, serinas, treoninas, tirosinas o histidinas para los sitios de fosforilación, etc., o a purinas, etc.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son ácidos nucleicos. Por "ácido nucleico" o "oligonucleótido" o equivalentes gramaticales en la presente se entiende por lo menos dos nucleótidos ligados juntos de manera covalente. Un ácido nucleico de la presente invención contendrá generalmente enlaces de fosfodiéster, aunque en algunos casos, como se esboza abajo, se incluyen análogos de ácido nucleico que pueden tener espinas dorsales alternas, comprendiendo, por ejemplo, fosforamida (Beaucage, et al., Tetrahedron, 49(10):1925 (1993) y las referencias de la misma; Letsinger, J. Org. Quím., 35:3800 (1970); Sprinzl, et al., J. Biochem, 81:579 (1977); Letsinger, et al., Nucl. Acids Res., 14:3487 (1986); Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984), Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); y Pauwels, et al., Chemica Scripta, 26:141 (1986)), fosforotioato (Mag, et al., Nucleic Acids Res., 19:1437 (1991); y la patente de Estados Unidos No. 5,644,048), fosforoditioato (Briu, et al., J. Am. Chem. Soc., 111:2321 (1989)), acoplamientos de O-metilfosforoamidita (véase Eckstein, Oligonudeotides y análogos: Un enfoque práctico, Oxford University Press), y espinas dorsales y acoplamientos del ácido nucleico del péptido (véase Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114:1895 (1992); Meier, et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson, et al., Nature 380:207 (1996))). Otros ácidos nucleicos análogos incluyen aquellos con las espinas dorsales positivas (Denpcy, et al., Proc. Nacional. Acad. Sci. E.E.U.U., 92:6097 (1995)); espinas dorsales no iónicas (patente de Estados Unidos Nos. 5.386.023; 5.637.684; 5.602.240; 5.216.141; y 4.469.863; Kiedrowshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. Inglés, 30:423 (1991); Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); Letsinger, et al., Nucleósidos y nucleótidos, 13:1597 (1994); Capítulos 2 y 3, serie 580 del simposio del ASC, "Modificaciones del carbohidrato en la investigación de Antisense", Ed. Y.S. Sanghui y P. Dan Cook; Mesmaeker, et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994); Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994); Tetrahedron Lett., 37:743 (1996)) y espinas dorsales no-ribosa, incluyendo aquellos descritos en las patentes de Estados Unidos Nos.. 5.235.033 y 5.034.506, y los capítulos 6 y 7, serie 580 del simposio del ASC, "Modificaciones del carbohidrato en la investigación de Antisense", Ed. Y.S. Sanghui y P. Dan Cook. Los ácidos nucleicos que contienen unas o más azúcares carbocíclicos también se incluyen dentro de la definición de ácidos nucleicos (véase Jenkins, et al., Chem. Soc. Rev., (1995) pp. 169-176). Varios análogos del ácido nucleico se describen en Rawls, C & E News, de junio 2 de 1997, página 35. Estas modificaciones de la espina dorsal ribosa-fosfato se pueden hacer para facilitar la adición de moléculas adicionales tales como etiquetas, o para aumentar la estabilidad y la vida media de tales moléculas en ambientes fisiológicos. Además, pueden ser hechas mezclas de ácidos nucleico de ocurrencia natural y de análogos. Alternativamente, pueden ser hechas mezclas de diferentes análogos de ácido nucleico, y las mezclas de ácidos nucleicos de ocurrencia natural con sus análogos. Los ácidos nucleicos pueden ser trenzados de manera sencilla o doble, según lo especificado, o contener porciones de secuencia tanto de doble trenzado como de trenzado único sencillo. El ácido nucleico puede ser DNA, tanto genómico y cDNA, RNA como un híbrido, donde el ácido nucleico contiene cualquier combinación del deoxyribo- y ribo-nucleótidos, y cualquier combinación de bases, incluyendo el uracilo, la adenina, la timina, la citosina, la guanina, la inosina, la xantina, la hipoxantina, la isocitosina, la isoguanina, etc.

Según lo descrito arriba de manera general para las proteínas, los agentes bioactivos candidatos de ácido nucleico pueden ser ácidos nucleicos de ocurrencia natural, ácidos nucleicos aleatorios, o ácidos nucleicos aleatorios "sesgados". Por ejemplo, las digestiones de genomas procarótidas o eucarótidas pueden ser utilizadas como se ha esbozado arriba para las proteínas.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son moléculas químicas orgánicas, una variedad amplia de los cuales está disponible en la literatura.

En una realización preferida, se utiliza una biblioteca de diferentes agentes bioactivos candidatos. Preferiblemente, la biblioteca debe proporcionar una población suficientemente diferente desde el punto de vista estructural de agentes seleccionados al azar para provocar que un rango probabilísticamente suficiente de diversidad permita enlazar a un objetivo particular. Por consiguiente, una biblioteca de interacción debe ser bastante grande para que por lo menos uno de sus miembros tenga una estructura que le dé su afinidad para el objetivo. Aunque es difícil calibrar el tamaño absoluto requerido de una biblioteca de interacción, la naturaleza suministra una pista con la respuesta de inmunidad: una diversidad de 107-108 anticuerpos diferentes proporciona al menos una combinación con suficiente afinidad para interactuar con la mayoría de los antígenos potenciales hechos enfrentados por un organismo. Las técnicas de selección in vitro publicadas también han mostrado que un tamaño de biblioteca de 107 a 108 es suficiente para encontrar las estructuras con la afinidad para el objetivo. Una biblioteca de todas las combinaciones de un péptido de 7 a 20 aminoácidos en longitud, tal como el propuesto de manera general en la presente, tiene el potencial de codificar de 207 (109) a 2020. Así, con bibliotecas de 107 a 108 moléculas diferentes los métodos presentes permiten un subconjunto de "trabajo" de una biblioteca de interacción teóricamente completa para 7 aminoácidos, y un subconjunto de formas para la biblioteca 2020. Así, en una realización preferida, por lo menos 103 diferentes agentes candidatos se tamizan (screened), siendo por lo menos 104 los preferidos, siendo por lo menos 105-106 especialmente preferidos, y en algunos casos, dependiendo de las técnicas de tamizado, tantas como 107, 108 o 109 diferentes agentes candidatos se analizan simultáneamente en los métodos materia de la presente. Los métodos preferidos maximizan el tamaño y la diversidad de la biblioteca.

En una realización preferida, el agente candidato es una droga conocida, por ejemplo un agente bioactivo conocido para tener por lo menos un efecto deseable. Sin embargo, como se esboza más completamente abajo, muchas drogas tienen efectos secundarios o problemas de toxicidad, y la presente invención se puede utilizar para dilucidar los mecanismos de toxicidad y para la selección por tamizado de los análogos de la droga de segunda generación que no tienen tantos o ningún efecto secundario. Por ejemplo, los picos de un espectro se pueden asociar a toxicidad según lo identificado con el uso de marcadores o tintes clásicos, tales como tintes de viabilidad, o etiquetas de masa como se conoce en el arte. Además, en unas realizaciones, dos o más drogas se agregan a la muestra simultánea o secuencialmente para permitir dilucidar los mecanismos y las complicaciones de la interacción de la droga o para bloquear una ruta o camino de biológico/metabólico o una enzima.

Como se apreciará por aquellos versados en el arte, hay una variedad amplia de drogas posibles que puedan encontrar uso en la presente invención, dependiendo de las pruebas y de las características deseadas. Por ejemplo, en aplicaciones para el cáncer, las drogas apropiadas para cáncer incluyen, pero no se limitan a, las drogas antineoplásticas, incluyendo agentes de alquilación tales como sulfonatos de alquilo (busulfan, improsulfan, piposulfan); aziridinas (benzodepa, carboquone, meturedepa, uredepa); etileniminas y metilmelaminas (altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetofosforamida, trimetilolmelamina); mostazas de nitrógeno (clorambucil, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, clorhidrato de mecloroetamina, de óxido de mecloretamina, melfalan, novembichin, fenesterina, prednimustina, trofosfamide, mostaza del uracilo); nitrosoureas (carmustina, clorozotocina, fotenmustina, lomustina, nimustina, ranimustina); dacarbazina, mannomustina, mitobranitol, mitolactol; pipobroman; doxorubicin, y cisplatin (incluyendo derivados).

Con particular atención a la enfermedad cardiovascular, hay un número de drogas adecuadas para agregar a las células para dilucidar el mecanismo de acción, caracterizar la respuesta al nivel de la biomolécula, o identificar biomoléculas relevantes en la ruta de acción de la droga. Éstas incluyen, pero no se limitan a, las estatinas (agentes que bajan el colesterol que bloquean síntesis del colesterol inhibiendo la reductasa HMGCoA que incluyen atorvastatina, pravastaina, lovastatina, cerivastatina, sinvastatina), fibratos (fenofibrato, bezafibrato, gemfibrozilo), niacina, ácido nicotínico, estrógenos, resinas aglomerantes de ácido biliar (incluyendo colestiramina y clorhidrato del colestipol), inhibidores de ACAT, inhibidores intestinales de absorción del colesterol, ligandos de PPAR (alfa, gamma, etc.), y los ligandos de factor nuclear tales como RXR, FXR, ROR, etc.

Las drogas adecuadas para la diabetes incluyen, pero no se limitan a, las biguanidas (que incluyen sin limitarse a metformina, al fenformina y bufomina); sulfonilureas (incluyendo sin limitarse a tolbutamida, acetohexamida, tolazamida, cloropropamida, gliplzida y gliburida); derivados de tazolidinediona (incluyendo, pero sin limitarse, ciglitazona, ploglitazona, englitazona, y troglitazona); y otros descritos en Cornicelli, Atherosclerosis 2(2): 43 (1999).

Las drogas adecuadas para la hipertensión incluyen pero sin limitarse a, beta bloqueadores, inhibidores de AS, los diuréticos; inhibidores de la angiotensina tales como losartan, etc.

Los agentes bioactivos candidatos se combinan o se agregan a una célula o a una población de células. Los tipos adecuados de célula para diferentes realizaciones se han esbozado arriba. Se combina el agente bioactivo candidato con las células. Como se apreciará por aquellos versados en el arte, esto se puede llevar a cabo en cualquier número de maneras, incluyendo la adición de agentes candidatos a la superficie de las células, a los medios que contienen las células, o a una superficie sobre la cual las células están creciendo o se encuentran en contacto; agregando los agentes a las células, por ejemplo usando vectores que introducirán los agentes a las células (es decir cuando los agentes son ácidos nucleicos o proteínas). Como se apreciará por aquellos versados en el arte, hay una variedad amplia de métodos de entrega disponibles, incluyendo el uso de vesículas y de otros vehículos tales como liposomas, soluciones orgánicas, dispersiones, suspensiones, electroporación, etc.

En general, los agentes candidatos se agregan a las células (ya sea extracelularmente o intracelularmente, según lo esbozado arriba) bajo condiciones de reacción que favorezcan interacciones del agente con el objetivo. Generalmente, éstas serán condiciones fisiológicas. Las incubaciones se pueden realizar a cualquier temperatura que facilite actividad óptima, típicamente entre 4 y 40ºC. Los períodos de incubación se seleccionan para una actividad óptima, pero se pueden también optimizar para facilitar un desempeño alto y rápido de tamizado y selección (screening). Típicamente entre 0.1 y 4 horas será suficiente, preferiblemente entre 0.1 y 1 hora. El exceso de reactivo generalmente se retira o se lava.

Se puede incluir una variedad de otros reactivos en las reacciones y las pruebas esbozadas abajo. Éstos incluyen reactivos tales como sales, proteínas neutrales, por ejemplo albúmina, detergentes, etc. que se pueden utilizar para facilitar el enlace óptimo proteína-proteína y/o para reducir interacciones de fondo no específicas. También pueden ser utilizados reactivos que mejoran de otra manera la eficacia de la prueba, tal como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos, etc.. La mezcla de componentes se puede agregar en cualquier orden que garantice como fuera necesario el análisis y el tamizado y selección (screening). El lavado o enjuague se lleva a cabo de tal manera que sea apreciado por aquellos versados en el arte en diferentes momentos, y puede incluir el uso de filtración y de centrifugación.

En una realización preferida, más que utilizar un producto químico o una molécula bioquímica como agente candidato, se utilizan perturbadores. En este contexto, el término "perturbador" se refiere a un parámetro o a un estímulo físico o no físico que obtengan una respuesta o una perturbación en un sistema biológico (a nivel celular, de tejido o del organismo). Los estímulos físicos incluyen pero no se limitan a las condiciones ambientales (que incluyen pero no se limitan a gas, olores, electrocución, irradiación y otros efectos físicos), organismos vivientes (que incluyen pero no se limitan a bacterias, virus, levaduras, parásitos de planta o animales) y sustancias extrañas (por ejemplo, un órgano o un tejido injertado, un implante). Los estímulos no físicos incluyen pero no se limitan a las condiciones ambientales (que incluyen pero no se limitan a temperaturas altas o bajas, presión), o a los estados emocionales (que incluyen pero no se limitan al miedo, a la tensión, al desafío mental, a angustia emocional, a la atracción sexual, y al placer).

Una vez que las células se hayan expuesto al (los) agente(s) candidato(s) y se hayan permitido incubar por un cierto período del tiempo, se pueden tomar varias medidas. En una realización preferida, por ejemplo cuando las bibliotecas de los agentes candidatos se han agregado a las células, las células se pueden tamizar y seleccionar (screened) por un fenotipo alterado para aislar células que exhiban un fenotipo deseable. Estas células aisladas se someten entonces a FTMS para dilucidar y caracterizar los efectos subyacentes a nivel biomolecular. Es decir, puede generarse una "huella digital bioquímica" de un fenotipo deseable, y utilizarse en programas de desarrollo de drogas, por ejemplo. Alternativamente, cuando las bibliotecas son pequeñas, o cuando se han utilizado drogas individuales o sistemas de drogas, cada población de células se somete al análisis de FTMS según lo esbozado abajo para dilucidar la "huella digital" del efecto de la droga. Una vez más según lo esbozado abajo, este tipo de análisis se puede utilizar para construir bases de datos de diferentes tejidos, de diferentes drogas, etc.

Así, en una realización preferida, después de la introducción de bibliotecas de los agentes candidatos a una población de células, las células se tamizan y seleccionan por un fenotipo cambiado o alterado. Por "fenotipo alterado" o "fisiología alterada" u otros equivalentes gramaticales en la presente se entiende que el fenotipo de la célula se altera de una cierta manera, preferiblemente de una cierta manera perceptible y/o mensurable. Se debe anotar que son útiles tanto los fenotipos deseables (por ejemplo en el caso de las células de cáncer, del aspecto de la diferenciación) como los fenotipos indeseables (por ejemplo de des-diferenciación). Como será apreciado en el arte, una fortaleza de la presente invención es la amplia variedad de tipos de célula y de cambios fenotípicos potenciales que se pueden probar usando los presentes métodos. Por consiguiente, cualquier cambio fenotípico que pueda ser observado, detectado, o medido puede ser la base de los métodos de investigación (tamizado y selección) de la presente. Los cambios fenotípicos adecuados incluyen, pero no se limitan a: cambios físicos gruesos tales como cambios en la morfología de la célula, crecimiento de la célula, viabilidad de la célula, la adherencia a los substratos o a otras células, el aspecto de la inclusión de lípido, y la densidad celular; cambios en la expresión de uno o más RNAs, proteínas, lípidos, hormonas, citoquinas, u otras moléculas; cambios en el estado del equilibrio (es decir período de vida media) o uno o más RNAs, proteínas, lípidos, hormonas, citoquinas, u otras moléculas; cambios en la localización de unos o más RNAs, proteínas, lípidos, hormonas, citoquinas u otras moléculas; cambios en la bioactividad o la actividad específica de uno o más RNAs, proteínas, lípidos, hormonas, citoquinas, receptores, u otras moléculas; cambios en la secreción de iones, de citoquinas, de hormonas, de factores de crecimiento, o de otras moléculas; alteraciones en potenciales de membrana, la polarización, la integridad o el transporte celulares; cambios en contagiosidad, susceptibilidad, latencia, adherencia, y toma de virus y de patógenos bacterianos; etc. Por "capaz de alterar el fenotipo" en la presente se entiende que el agente bioactivo puede cambiar el fenotipo de la célula de una cierta manera perceptible y/o mensurable.

Se puede detectar el fenotipo alterado en una variedad amplia de maneras, como será apreciado por aquellos versados en el arte, y generalmente dependerá y corresponderá al fenotipo que está siendo cambiando. Generalmente, el fenotipo alterado es detectado usando, por ejemplo: análisis microscópico de la morfología de la célula; pruebas estándares de la viabilidad de la célula, incluyendo tanto la muerte aumentada como la viabilidad aumentada de la célula, por ejemplo, células que son resistentes ahora a la muerte celular por virus, bacterias, o toxinas bacterianas o sintéticas; pruebas de etiquetado estándares tales como prueba de indicador fluorométrico para la presencia o el nivel de una célula o de una molécula particular, incluyendo FACS u otras técnicas de coloración por tinte; detección bioquímica de la expresión de los compuestos objetivo después de matar a las células, etc. En algunos casos, el fenotipo alterado puede ser el cambio mismo en el espectro de FTMS; por ejemplo, para enfermedades u otras condiciones que no exhiben cambios fenotípicos grandes, la dilucidación del cambio se puede hacer usando FTMS.

En una realización preferida, una vez se ha detectado una célula con un fenotipo alterado, la célula se aísla de la pluralidad que no tiene fenotipos alterados. Esto se puede hacer en cualquier número de maneras, como se conoce en el arte, y dependerá en algunos casos de la prueba o tamizado y selección. Las técnicas adecuadas de aislamiento incluyen, pero no se limitan a, FACS, selección de lisis usando complemento, clonación de la célula, exploración por Fluorimager, expresión de una proteína de "supervivencia", la expresión inducida de una proteína de la superficie de la célula u otra molécula que se pueda hacer fluorescente o etiquetable para el aislamiento físico; expresión de una enzima que cambia una molécula no fluorescente a fluoroscente; crecimiento excesivo frente a un fondo de no crecimiento o crecimiento lento; la muerte de células y aislamiento del DNA u otros tintes de indicador de la vitalidad de la célula, etc.

Las células aisladas, por ejemplo las células que exhiben un fenotipo cambiado probablemente debido a la presencia del agente candidato, se someten al análisis de FTMS según como se describe abajo.

Una ventaja distintiva de la presente invención es la capacidad de FTMS para analizar células individuales o poblaciones pequeñas de células. Esto es particularmente relevante en el área del cáncer, pues la heterogeneidad de muestras puede causar ambigüedad. La microdisección de tejidos y de metástasis puede permitir muestras muy pequeñas, incluyendo las células, que se pueden analizar luego usando los presentes métodos. Además, hay una variedad de técnicas experimentales que permiten el análisis de células individuales (por ejemplo clasificación de célula activada por fluorescencia (FACS)) que se puede combinar con las técnicas de la presente invención.

En algunas realizaciones, los agentes candidatos (incluyendo drogas) se pueden agregar al lisado celular, más que a las células intactas. Por ejemplo, si las drogas se absorben mal, la adición directa al lisado celular puede dar lugar a la facilitación de los efectos. Además, los estudios de estabilidad o metabolismo de la droga se hace con frecuencia con los homogenados de la célula.

Además, se debe observar que los protocolos de tamizado y selección usados para la investigación del candidato pueden utilizar cualquier número de técnicas de screening (investigación, tamizado y selección) de alto rendimiento (HTS). En una realización preferida, los sistemas de la invención comprenden componentes líquidos de manejo, incluyendo componentes para cargar y descargar fluidos en cada estación o conjunto de estaciones. Los sistemas líquidos de manejo pueden incluir sistemas robotizados que comprenden cualquier número de componentes. Además, cualesquiera o todos los pasos esbozados en la presente pueden ser automatizados; así, por ejemplo, los sistemas pueden ser completa o parcialmente automatizados.

Como será apreciado por aquellos versados en el arte, hay una amplia variedad de componentes que se pueden utilizar, incluyendo sin limitar a, uno o más brazos robotizados; manejadores de placa o platos para colocar o posicionar las microplacas o microplatos; sostenedores con cartuchos y/o casquillos; manejadores automatizados de tapa o casquillo para quitar y para sustituir las tapas para pozos sobre platos de contaminación no cruzada; ensamblajes de punta para la distribución de muestras con puntas desechables; ensamblajes de puntas lavables para la distribución de la muestra; 96 bloques de carga de pozo (o más alto); estantes enfriados de reactivo; posiciones de pipeta de plato de microtitulación (enfriadas opcionalmente); torres de apilar para los platos y las puntas; y sistemas informáticos.

Sistemas completamente robotizados o microfluidizados incluyen manejo automatizado del líquido, la partícula, la célula y el organismo incluyendo medición de alto rendimiento con pipeta para llevar a cabo todos los pasos de los aplicaciones del screening (investigación, tamizado y selección). Esto incluye manipulaciones del líquido, la partícula, la célula, y el organismo tales como aspiración, dispensado, mezclado, dilución, lavado, transferencias volumétricas exactas; recuperación y descarte de puntas de pipetas; y mediciones repetidas con pipeta de volúmenes idénticos para entregas múltiples de una sola aspiración de la muestra. Estas manipulaciones son transferencias de líquido, partículas, células y organismos libres de contaminación cruzada. Este instrumento realiza replicación automática de las muestras de microplatos a los filtros, membranas, y/o los platos descendientes, las transferencias de alta densidad, las diluciones seriales de plato lleno, y la operación de alta capacidad.

En una realización preferida, se utilizan partículas químicamente derivadas, platos, cartuchos, tubos, partículas magnéticas, u otra matriz de fase sólida con especificidad a los componentes de la prueba. Las superficies enlazantes de microplatos, de tubos o de cualquier matriz de fase sólida incluyen superficies no polares, superficies altamente polares, recubrimiento modificado de dextran para promover enlace covalente, recubrimiento de anticuerpo, medios de afinidad para enlazar proteínas o péptidos de fusión, proteínas fijas a superficies, tales como proteína recombinante A o G, resinas o recubrimientos nucleótidos, y otras matrices de afinidad son útiles en esta invención.

En una realización preferida, las plataformas para platos multipozo, multi-tubos, sostenedores, cartuchos, minitubes, platos de pozo profundo, tubos de microfuga, crioviales, platos de pozo cuadrado, filtros, chips, fibras ópticas, granos y otras matrices o plataformas de fase sólida con diversos volúmenes se acomodan en una plataforma modular capaz de mejorar para capacidad adicional. Esta plataforma modular incluye un mezclador de velocidad orbital variable, y mesas de trabajo con posiciones múltiples para las muestras originales, dilución de la muestra y el reactivo, platos de prueba, depósitos de muestras y reactivos, las puntas de pipeta, y una estación activa de lavado.

En una realización preferida, se usan sistemas termociclador y termoregulador tales como los sistemas de Peltier para estabilizar la temperatura de los intercambiadores de calor tales como los bloques o plataformas controlados para proporcionar un control exacto de la temperatura de las muestras de incubación desde 4ºC hasta 100ºC.

En una realización preferida, las cabezas de pipetas intercambiables (solas o de varios canales) con sondas magnéticas, una o varias, sonda de afinidad o pipeteadores que manipulan con robots el líquido, las partículas, las células y los organismos. Los separadores o plataformas magnéticos de múltiples pozos o múltiples tubos manipulan líquido, partículas, células y organismos en formatos de muestras individuales o múltiples.

En algunas realizaciones, la instrumentación incluirá un detector, que puede ser de una variedad amplia de diferentes detectores, dependiendo de la presencia o de la ausencia de etiquetas y del análisis o prueba. En una realización preferida, los detectores útiles incluyen microscopio(s) con canales múltiples de fluorescencia; lectores de platos para suministrar detección espectrofotométrica fluorescente, ultravioleta y visible con longitud de onda de punto final sencillo y dual y capacidad cinética, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés), de luminescencia, de apagamiento, de excitación de dos fotones y de redistribución de la intensidad; cámaras CCD para capturar y transformar datos e imágenes en formatos cuantificables; un sitio de trabajo con ordenador o computadora; y uno o más lectores de código de barras.

Estos instrumentos pueden caber en una cabina de flujo laminar estéril o cubierta de gases, o son sistemas encerrados, autónomos, para el crecimiento de cultivo celular y transformación en platos multi-pozos o tubos y para operaciones peligrosas. De manera similar, las operaciones se pueden realizar en ambientes controlados tales como gas inerte (por ejemplo para prevenir la oxidación del lípido). Las células vivas crecerán bajo condiciones controladas de crecimiento, con controles para la temperatura, la humedad, y el gas para series de tiempo de análisis de célula viva. La transformación automatizada de células y los cuentacolonias automatizados facilitarán un screening (investigación, tamizado y selección) rápido de células deseadas.

Los formatos de electroforesis de citometría de flujo o capilar se pueden utilizar para la captura individual de granos magnéticos y otros, de partículas, de células, y de organismos.

El hardware y el software flexibles permiten la adaptabilidad del instrumento para las múltiples aplicaciones. Los módulos del programa de software permiten la creación, la modificación y el funcionamiento de métodos. Los módulos de diagnóstico del sistema permiten la alineación del instrumento, las conexiones correctas y las operaciones del motor. Las herramientas, el material de laboratorio y los patrones modificados para requisitos particulares de la transferencia del líquido, de la partícula, de la célula y del organismo permiten que sean realizadas diferentes aplicaciones. La base de datos permite almacenamiento del método y del parámetro. Las interfaces robotizadas y de la computadora permiten la comunicación entre los instrumentos.

En una realización preferida, el aparato robotizado incluye una unidad central de procesamiento que se comunica con una memoria y un conjunto de dispositivos de entrada y salida (por ejemplo, teclado, ratón (mouse), monitor, impresora, etc.) a través de un bus. Según lo discutido en la presente, esto puede estar en adición a o en lugar de la CPU (por sus siglas en inglés para unidad central de procesamiento) para el análisis de datos de FTMS. La interacción general entre una unidad central de procesamiento, una memoria, dispositivos de entrada y salida, y un bus es conocida en el arte. Así, una variedad de diferentes procedimientos, que dependen de los experimentos que se van a correr, se almacena en la memoria de la CPU.

Estos sistemas robotizados de manejo de fluidos pueden utilizar cualquier número de reactivos diferentes, incluyendo búferes o tampones, reactivos, fluídos y gases supercríticos (particularmente para extracción), muestras, lavados, componentes de análisis o prueba, etc. De manera similar, cuando la muestra es limitada, todos los componentes (tubos capilares, conexiones, etc.) pueden ser reducidos al mínimo para evitar grandes volúmenes muertos o efectos de dilución.

Una vez que se identifiquen las células y se añaden los agentes candidatos opcionales, incluyendo las drogas, las células están preparadas para el análisis de FTMS. Como será apreciado por aquellos versados en el arte, esto puede extenderse desde una simple lisis hasta tecnologías de separación más elaboradas, dependiendo de la clase de moléculas que se evaluarán. Como se apreciará por aquellos versados en el arte, diferentes moléculas se pueden clasificar por un número de parámetros diferentes, incluyendo el tipo de la molécula (por ejemplo proteico, lípido, ácido nucleico, carbohidrato, metabolitos, moléculas pequeñas, etc.), el tamaño de la molécula (por ejemplo la "molécula pequeña" se refiere generalmente a las moléculas menores que aproximadamente 2500 a 1500 daltons), o con base a otras características de la molécula (por ejemplo polar vs. no polar, cargada, si contiene ion metálico, características de enlace, etc.) Por ejemplo, las moléculas adecuadas para la evaluación incluyen metabolitos (incluyendo catabolitos) producidos como productos de reacciones enzimáticas o de reacciones de oxidación/reducción. Tales metabolitos incluyen diversas moléculas pequeñas que están presentes en alimentos (por ejemplo vitaminas, sustancias extrañas, xenobióticos, toxinas, lípidos oxidados, pesticidas, moléculas degradadas a partir de xenobióticos, etc.), son generadas por la digestión enzimática del alimento (por ejemplo aminoácidos, particularmente aminoácidos esenciales, ácidos grasos, particularmente ácidos grasos esenciales, intermediarios y productos finales de la glicólisis), son sintetizados por las células (hormonas, neurotransmisores, toxinas, prostaglandinas, etc.) o están presentes de otra manera (drogas parcialmente metabolizadas, etc.).

En general, se hace una preparación mínima, tal como una extracción de células o un lisado de célula en un solvente adecuado para FTMS, con la adición de búferes o tampones, sales y otros reactivo en la medida que sean necesarios o deseados.

En una realización preferida, la preparación de las muestras para FTMS se puede alcanzar por cualquier método conocido a aquellos con habilidad en el arte. Preferiblemente, la preparación de la muestra incluye un paso de desalinización para aumentar la sensibilidad y la resolución del FTMS. Además, como se apreciará por aquellos en el arte, la combinación de pasos preparatorios, de solventes, de purificación y de esquemas de separación, todos dependerán de la(s) clase(s) de biomoléculas que se evaluarán. Sin embargo, la mayoría del tiempo no se requiere ninguna separación preliminar.

En una realización, las muestras son preparadas mediante una precipitación de proteína seguida por un tratamiento de desalinización. Una solución de metanol y de agua (49:49:2, agua:metanol:ácido acético) se agrega a cada una de las muestras y las muestras se enfrían. Esto precipita las proteínas al fondo del tubo. Cada tubo entonces se centrifuga y el flotante se decanta. Para el paso de la desalinización, la cantidad pequeña (aproximadamente 100 mg) de resina de intercambio iónica DOWEX se agrega a cada vial y se permite sentarse por aproximadamente 10 minutos. La muestra entonces se centrifuga y el flotante se retira. Esta solución se introduce luego al espectrómetro de masas.

En la práctica de la presente invención cualquier solvente conocido a aquellos con habilidad en el arte se puede utilizar conjuntamente con una fuente iónica. Ejemplos de solventes adecuado son dimetilsulfoxido, acetonitrilo, N, formamida n-dimetil, carbonato de propileno, cloruro de metileno, nitrometano, nitrobencina, hexano, metanol y agua. El solvente puede comprender más de un solvente. En una realización preferida, el solvente es una solución de metanol y agua (49:49:2, agua:metanol: ácido acético v:v:v).

La selección de un solvente adecuado del tipo de biomoléculas cuya detección va a ser lograda mediante FTMS. Por ejemplo, una solución de metanol y agua se utiliza como solvente cuando la detección de moléculas solubles debe ser alcanzada por FTMS, mientras que el hexano puede ser utilizado cuando debe ser lograda la detección de moléculas apolares tales como lípidos. En una realización de la invención, la fuente de la muestra (por ejemplo, tejidos, células) se extrae en diferentes solventes y cada extracción se somete a FTMS para poder llevar a cabo un análisis más completo de las moléculas presentes en la fuente de la muestra.

Las muestras se purifican o se separan opcionalmente antes de comenzar el procedimiento de FTMS. Las técnicas útiles de separación incluyen pero no se limitan a la HPLC usando cromatografía de flujo turbulento, cromatografía líquida, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad, cromatografía de fluido supercrítico, cromatografía de gas (GC, por sus siglas en inglés), la electroforesis (que incluye pero no se limita a la electroforesis capilar, a la electroforesis de gel de poliacrilamida, a la electroforesis de gel de agarosa), la extracción de fase sólida, y la extracción de fase líquida, usando preferiblemente diferentes solventes (por ejemplo, cloroformo/metanol para los lípidos, agua para las moléculas polares). El tubo capilar de la fuente de ion se podría llenar con granos de sílice (derivatizados o no) o de otro material para realizar cromatografía/separación.

Además, se debe anotar que las técnicas de purificación y de separación se pueden correr simultánea o secuencialmente en muestras, en diferentes órdenes y en diferentes combinaciones. Así por ejemplo, una precipitación simple de proteína se puede correr en una porción de la muestra, y luego un paso de la HPLC. De manera similar, las porciones de las muestras (por ejemplo porciones de las poblaciones celulares) se pueden someter a diferentes técnicas en la dilucidación o la identificación de picos.

En una realización preferida, solamente un tipo de biomolécula se evalúa durante una corrida particular de FTMS. Por ejemplo, los esquemas de purificación/separación pueden ser generados tales que solamente las proteínas de una masa dada sean evaluadas. Las corridas subsecuentes de FTMS pueden utilizar diferentes técnicas sobre la misma muestra, para permitir que un subconjunto diferente de biomoléculas sea evaluado.

Alternativamente, y también preferiblemente, más de un tipo de biomolécula se evalúa durante una sola corrida de FTMS. Es decir, las proteínas y los lípidos, las proteínas y los carbohidratos, las proteínas y los metabolitos pequeños, etc. se pueden evaluar simultáneamente en la presente invención.

Como será apreciado por aquellos versados en el arte, cualquier número de biomoléculas se puede analizar usando FTMS. Las biomoléculas pueden ser todas de un tipo (por ejemplo, proteínas), o mezclas. Las biomoléculas adecuadas en este contexto son proteínas como se definieron arriba, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos y metabolitos.

La muestra biológica se ioniza antes de someter la muestra a la espectroscopia de masas. Cualquier método de la ionización que no dañe las moléculas presentes en la muestra biológica puede ser utilizado. Tales métodos son descritos por Barker, 1999, "Espectrometría de masas", 2da edición, John Wiley & Sons, Ltd., Inglaterra.

En una realización, la muestra biológica se puede ionizar mediante ionización química. La ionización química utiliza un ion reactivo, generado mediante el bombardeo de metano con electrones usando una fuente de impacto de electrón, para ionizar las moléculas de la muestra biológica mediante una transferencia de protón o hidruro. Alternativamente, se puede utilizar directamente el impacto del electrón, que utiliza un haz de electrones para ionizar los átomos o las moléculas en fase gaseosa. Generado usualmente de un filamento de tungsteno, el electrón del haz ioniza las moléculas en la muestra biológica sacando a golpes un electrón de los átomos o de las moléculas.

En otra realización, la muestra biológica se puede ionizar por plasma y descarga de llama (glow). El plasma y la descarga de llama exigen el uso de un gas caliente, parcialmente ionizado a baja presión entre dos electrodos para excitar e ionizar átomos.

En otra realización, se emplea bombardeo rápido de átomos de la muestra biológica usando un haz de gran energía de átomos neutrales (típicamente Xe o Ar) para ionizar las moléculas presentes en la muestra biológica. El haz de átomos de alta energía es producido acelerando los iones de una fuente de ion a través de una célula intercambio de carga, las colisiones que resultan dando lugar a la ionización del átomo neutral.

En otra realización, la ionización del campo se emplea para ionizar las moléculas presentes en la muestra biológica. Los campos eléctricos que son suficientemente altos para hacer que las moléculas pierdan electrones se utilizan en la ionización del campo. Tales campos se pueden crear en una fuente de ion aplicando un alto voltaje entre un cátodo y un ánodo llamado emisor del campo. Un emisor del campo consiste en un alambre cubierto con dendritas microscópicas de carbón, que amplifican mucho el campo eficaz en los puntos de carbón.

En otra realización, la ionización de la desorción de plasma se emplea para ionizar las moléculas presentes en la muestra biológica. La ionización de la desorción de plasma explota la descomposición de 252Cf, que produce dos fragmentos de fisión que viajan en direcciones opuestas. Un fragmento golpea la muestra biológica sacando los iones de las moléculas en la muestra, y el otro golpea un detector y acciona el comienzo de la adquisición de
datos.

En otra realización, las moléculas presentes en la muestra biológica son ionizadas por un láser de ionización. Brevemente, un pulso de láser ejerce ablación del material sobre la superficie de una muestra y crea un microplasma que ioniza algunos de los componentes de la muestra. El pulso del láser logra la vaporización y la ionización de la muestra.

En una realización preferida, las moléculas presentes en la muestra biológica se ionizan usando una ionización por desorción de láser soportada en una matriz (MALDI). La muestra biológica se dispersa en una matriz sólida tal como ácido nicotínico y un pulso de láser UV efectúa ablación sobre la matriz. La matriz lleva algunas de las moléculas grandes junto con ella a la fase de gas en una forma ionizada, después de lo cual pueden ser extraídas hacia un espectrómetro de masas.

En una realización preferida, la ionización por electrospray (ESI) se emplea para ionizar las moléculas presentes en la muestra biológica. La fuente de ESI consiste en una aguja muy fina y una serie de espumadores. Una solución de la muestra se rocía en el compartimiento de la fuente para formar gotitas. Las gotitas llevan la carga cuando salen del tubo capilar y, a medida que el solvente se evapora, las gotitas desaparecen dejando moléculas altamente cargadas en la muestra biológica. Se prefiere ESI porque es útil para las moléculas biológicas grandes que son difíciles de vaporizarse o de ionizar. Además, las técnicas y los dispositivos de nanospray se conocen en el arte y encuentran uso en la presente invención.

En la práctica de la invención se pueden utilizar otros métodos de ionización conocidos a aquellos con habilidad en el arte. Tales métodos incluyen pero no se limitan a ionización por resonancia, a ionización secundaria y a fuente de chispa.

Para cada fuente de ion descrita arriba, pueden ser empleados modos positivos o negativos de ionización. En el modo positivo de ionización, a menudo se agrega una traza (o vestigio) de ácido fórmico para ayudar a la protonización de las moléculas de la muestra; en el modo negativo del ionización se agrega una traza o vestigio de solución de amoníaco o una amina volátil para ayudar a la desprotonización de las moléculas de la muestra. Las proteínas y los péptidos usualmente se analizan bajo condiciones positivas de ionización y los sacáridos y los oligonucleótidos bajo condiciones negativas de ionización.

Las muestras se introducen luego a FTMS. La espectrometría de masas por transformadas de Fourier (FTMS) también se conoce como resonancia iónica ciclotrónica por transformadas de Fourier (FTICR). El principio de la determinación de masas moleculares de esta técnica se basa en una relación lineal inversa entre la masa de un ion y su frecuencia de ciclotrón. Un ion (o partícula cargada) sometida a un fuerte campo magnético experimenta un modo de movimiento circular natural al que se refieren como el giro de ciclotrón; los iones de carga opuesta giran en direcciones opuestas. En FTMS, el giro de ciclotrón confina radialmente los iones; la adición de un campo eléctrico perpendicular al eje del campo magnético confina axialmente los iones. Esta configuración comprende lo que comúnmente se conoce como celda de "ion atrapado". La frecuencia del giro de ciclotrón de un ion es inversamente proporcional a su relación masa-a-carga (m/z) y directamente proporcional a la fuerza del campo magnético aplicado. Así, los iones con baja m/z tienen frecuencias de ciclotrón mayores que aquellos de con alta m/z.

Cuando los iones que tienen m/z están presentes en la célula de para atrapar al ion, el conjunto de ion es excitado a órbitas más grandes de ciclotrón aplicando una excitación de radiofrecuencia barrida. La excitación de radiofrecuencia barrida contiene componentes de frecuencia que corresponden al rango de frecuencia ciclotrónica de interés. Las nubes de iones que orbitan -iones en cada órbita de m/z a una frecuencia única de ciclotrón- inducen una corriente de imagen en dos o más de los electrodos de detección del espectrómetro. La corriente de imagen produce ondas sinusoidales que tienen la frecuencia de ciclotrón de cada nube excitada de iones. Esta señal es una superposición de ondas sinusoidales que, cuando se somete transformadas de Fourier, rinde una medida extremadamente exacta de las frecuencias de ciclotrón de cada constituyente del conjunto de iones. En particular, este esquema no destructivo de detección de la corriente de imagen hace único al FTMS y proporciona una ventaja distintiva en la sensibilidad y la versatilidad comparada con los métodos convencionales de detección destructivos. Este esquema no destructivo de detección de FTMS se puede explotar para una nueva medida de iones, dando mejoras en la sensibilidad de las múltiples medidas de la misma población de iones. La relación señal a ruido aumenta inversamente a la raíz cuadrada del número de medidas; por ejemplo, después de cuatro mediciones la relación señal a ruido mejora dos veces. Otra manera de aumentar la señal es "bombear" bastantes iones a la celda para aumentar la señal. Una vez que la celda este "llena", se realiza el análisis. MSn donde n>2, por ejemplo, estudios de espectrometría de masas tándem o multigradual extendida, se puede también realizar en una población de iones en la cual los iones del fragmento de interés se puedan conservar selectivamente en la célula de FTMS, disociados adicionalmente y detectados otra vez. Estos estudios multigraduales proveen de información estructural creciente con un mejoramiento significativo en la sensibilidad total. FTMS es capaz de proporcionar una sensibilidad fentomolar de
detección.

Al realizar la fragmentación del ion, la experiencia de un espectroscopista de masas desempeña un papel importante. Las moléculas que corresponden a los picos de intensidad reducida podrían fragmentarse, pero no todos los fragmentos pueden ser identificados porque la intensidad será demasiado pequeña. Si hay también demasiado fragmentos, algunos se pueden "extinguir" por otros.

HICS-FTMS aplica FTMS para analizar mezclas biológicas extremadamente complejas que pueden proporcionar hasta varios cientos de picos dentro de un rango de masas relativamente estrecho. Inesperadamente, la alta resolución de FTMS es necesaria para distinguir los componentes complejos de una mezcla que se pueden espaciar de cerca en términos de m/z. FTMS proporciona una resolución más alta suministrando "canales" para masa más distinguibles. La mayoría de las moléculas biológicas que corresponden a picos observados en este tipo de análisis no son identificables, por lo menos inicialmente, hasta que las bases de datos de los perfiles de picos de HICS-FTMS y las identidades de las moléculas que corresponden a esos picos individuales se compilen. La alta exactitud de la medición de masa alcanzable con FTMS se puede explotar para identificar las estructuras químicas y/o las secuencias. FTMS es capaz de proporcionar rutinariamente los errores de la medición de masa que son menos que (\pm) -3 PPM y, por lo tanto, se resuelven diferencias de masas extremadamente pequeñas. Por ejemplo, C_{13}H_{20}N_{2}O_{3} y C_{14}H_{24}N_{2}O_{2} tienen la misma masa nominal (MW = 252.1468 y 252.1832, respectivamente), y aún así se pueden resolver usando FTMS en virtud de la diferencia de 0.0364 Da (o error relativo de 144 ppm) en sus masas reales.

Cualquier espectrómetro de masas por transformadas de Fourier comercialmente disponible se puede utilizar en el screening (investigación, tamizado y selección) y/o análisis de HIC. En una realización, el espectrómetro de masas es de marca Ultima FT (suministrado en combinación de ESI y sistemas de ionización MALDI y está disponible con 4.7, 7.0 o 9.4T imanes; IonSpec Corporation, lrvine, California). En otra realización, el espectrómetro de masas usado para practicar la presente invención es FT/MS® 1000, 2000; FT/MS 2001; T30 FT/MS, T70 FT/MS o NewStar (Finnigan San Jose, California). En una realización preferida, el espectrómetro de masas es APEX III (Bruker Daltonics, Inc.; Billerica, Massachusetts), disponibles con un imán 9.4T y fuentes de ESI y de MALDI.

El FTMS se puede conducir en un laboratorio de servicio de FTMS tal como el Laboratorio Nacional de Campo Magnético Alto en Tallahassee, Florida; el Laboratorio de Ciencia Molecular Ambiental (EMSL; el Departamento de Energía, Laboratorio Nacional del Noroeste Pacífico (PNNL), Richland, Washington) proporciona una instalación pública disponible de FTMS (con espectrómetro de masas por transformadas de Fourier con alto rendimiento abertura amplia 11.5T y un espectrómetro de masas por transformadas de Fourier 7T ESI).

La capacidad del campo magnético del espectrómetro de masas es crítica para alcanzar la resolución requerida para el análisis de HIC y tamizarla por FTMS. Preferiblemente, se utiliza un imán de por lo menos 7 Tesla (para un límite superior de detección de masas de 66 kDa, aproximadamente). Más preferiblemente aún, se utiliza imán de 9.4 Tesla (para un límite superior de detección de masas de 120 kDa, aproximadamente).

Las muestras biológicas de la invención se pueden introducir al espectrómetro de masas manualmente (por ejemplo, con una pipeta o una jeringuilla accionada con la mano) o robóticamente. Para un screening a gran escala mediante HICS-FTMS, se prefiere una carga robotizada para una eficacia mejorada.

En una realización ejemplar, las muestras biológicas se introducen al espectrómetro de masas vía un tubo de 64 P. i.d. PEEK que se conecta a un robot automuestreador (GILSON, modelo 215). El robot automuestreador se puede programar para recoger volúmenes pequeños (30 Pl) de aproximadamente 960 pozos de muestra. Si cada muestra se prepara como un extracto 100 Pl, se pueden guardar 70 Pl para uso futuro. Entre cada inyección a la línea de transferencia, la aguja y el inyector se lavan con 500 Pl de solución para evitar la contaminación cruzada. Un caudal constante de una fase móvil (30 Pl/min consistentes de 49:49:2, metanol, agua, y ácido acético v:v) se entrega a la fuente de ESI. Las alícuotas de muestras recuperadas por el automuestreador son inyectadas por un bucle hacia dentro de esta corriente. En estas condiciones se puede lograr una velocidad de aproximadamente 1 muestra en 3 minutos. Una vez se hayan recogido y almacenado digitalmente los espectros para las 960 muestras, se pueden introducir al espectrómetro de masas otras 960 muestras. El robot se puede programar para múltiples corridas.

Además, se puede utilizar una variedad de programas para maximizar y para explotar las técnicas presentes. Por ejemplo, se puede lograr cargar cantidades pequeñas, reproducibles de muestras usando una variedad de técnicas de micro fluidos incluyendo técnicas capilares de electroforesis que cargan muestras usando empalmes o conexiones capilares, formando "T"s. Esto puede dar lugar a muestras partidas, en donde una porción se inyecta al FTMS y una porción o bien se almacena o se utiliza para otros análisis; por ejemplo, las pruebas biológicas se pueden correr en una porción de la muestra. Además, los caudales pueden ser ajustados; por ejemplo, cuando un pico de interés es eluído de la columna de HPLC, el caudal se puede disminuir, por ejemplo para permitir la fragmentación subsecuente.

Opcionalmente, según lo esbozado arriba, el espectrómetro de masas se acopla a un robot de HPLC para una separación previa de la muestra antes de su introducción al espectrómetro de masas. La calibración estándar del sistema se hace adicionalmente.

Como con cualquier otro método de alto rendimiento capaz de recolectar rápidamente un cuerpo grande de información, la gestión de datos es un problema importante. Con la invención descrita en la presente, los tipos principales de información serán relacionados con los perfiles de FTMS en diferentes tipos de células (tratadas con una molécula de prueba vs. una no tratada; una enferma vs. una normal; diferentes tejidos; diferentes muestras de pacientes; células de diferentes estados de diferenciación o tensión, etc.), e indirectamente, las moléculas que difieren entre los diferentes tipos de célula, y por lo tanto, el efecto de una droga dada o de un estado de enfermedad en la molécula.

Como será apreciado por aquellos versados en el arte, hay una variedad amplia de métodos y sistemas que se pueden utilizar para recopilar y para procesar la información.

La adquisición y el análisis básico de los espectros de HICS-FTMS o de HICA-FTMS pueden explotar el software comercial, fácilmente disponible, diseñado para el análisis de datos complejos. En una realización, la versión 7 del software Omega, 32-bit, Windows 98 se utiliza para la adquisición y el análisis de espectros de masas por transformadas de Fourier (IonSpec Corporation, Irvine, California). En otra realización, se emplea MassSpec Calculator (ChemSW, Fairfield, California) que es software optimizado para procesadores de 32-bit (Windows 95, 98 o NT). MassSpec Calculator™ Professional suministra capacidades de dibujo, fragmentación, autofragmentación. El software soporta 79 elementos, incluyendo todos los datos elementales, tales como masa, número de isótopos, y la masa y la abundancia relativa de cada isótopo. En otra realización, se usa software tal como XMASS™ o HYSTAR™ utilizado en la adquisición y el análisis de los espectros de masas por transformadas de Fourier (Bruker Daltonics, Inc.; Billerica, Massachusetts). En otra realización, se emplea Charisma Software (Finnigan San Jose, California).

Los datos obtenidos usando el software básico se pueden manejar de manera conveniente usando formatos de datos relacionales o de hoja de cálculo estandarizados. Además, en muchos casos será útil buscar con cada secuencia molecular obtenida recientemente en bases de datos locales, por ejemplo frente a estructuras identificadas a través de experimentos no públicos, y eventualmente en bases de datos globales.

Se pueden prever herramientas especializadas para visualizar los datos que se obtienen de los presentes métodos para interpretar los patrones de expresión del gen y de la proteína y el espectro de los efectos biológicos, incluyendo metabólicos, producidos por los tratamientos o los estados particulares de la enfermedad en tipos específicos de célula u organismo. Por ejemplo, tales herramientas pueden implicar comparaciones múltiples por parejas, o un método de promediar o sumar que represente resultados acumulativos de varios experimentos, por ejemplo para identificar aquellos picos de HICS-FTMS alterados que o bien son los más frecuentemente alterados por el tratamiento con una clase particular de drogas, o bien con mayor frecuencia asociados a un efecto secundario específico como subproducto de diferentes terapias. Muchas bases de datos, paquetes de análisis, motores de búsqueda, e interfaces gráficas se pueden adaptar a HICS-FTMS o diseñar especialmente para estos propósitos. Así, el ajuste de la línea base, programas de reconocimiento de señal/pico, programas de sumas de picos, un gran número de programas de análisis estadístico incluyendo el cálculo del promedio de picos o media aritmética, el promedio de espectros de masa, desviaciones estándar, prueba de hipótesis, intervalos de confianza, análisis de cluster, etc. Una variedad amplia de análisis estadísticos se describe generalmente en textos tales como Freund y Walpole, Estadística Matemática, Prentice Hall, Inc. New Jersey, 1980.

Un método ejemplar, preferido para identificar componentes celulares cuyos niveles cambian en un tipo diferente de célula comprende los pasos siguientes:

1.

Seleccionar picos que satisfacen criterios dados de cada uno de los espectros de interés y escribir información de picos en archivos (véase fig. 1);

2.

Extraer los picos de diversos directorios de datos de espectros, asociar el tratamiento necesario y las condiciones experimentales y combinar los datos en un solo archivo. Ajustar picos entre espectros usando algoritmos de cluster y re-etiquetar cada pico con el promedio de las masas del cluster correspondiente (véanse figuras 2 y 3);

3.

Analizar los datos resultantes (condiciones de tratamiento, masa promedio del cluster e intensidad relativa) buscando influencia de tratamientos variantes en intensidad relativa (abundancia) por cada cluster (racimo) de masa (entidad química).

Selección del pico: en referencia a la fig. 1, en el paso 110 se obtienen espectros de masas de un espectrómetro de masas Apexce II y se procesan. Una macro escrita para el software XMASS (versión 5.0.10, Bruker Daltonics, Inc..) utiliza una instalación de macro interna de XMASS para abrir un conjunto predeterminado de espectros de masas, uno a la vez (véanse los pasos 115, 135, y 140), en el paso 120 "Spec [i]" significa el espectro i-ésimo entre todos los espectros.

En los parámetros del paso 125 que regulan la sensibilidad (PC), se establecen el número (MaxPks), y el rango (pp) para seleccionar picos. PC es la sensibilidad de selección de picos, relacionada con la relación aceptable señal a ruido. Los valores más altos (>= 10) de PC seleccionan solamente los picos altos sobresalientes de un espectro. Valores más bajos de PC (<= 2,5) toman números mayores de picos que son distinguidos del fondo menos bien, permitiendo la selección de picos de abundancia baja junto con ruido.

Una realización preferida utiliza valores de 2.5, 5, y 10. Estos valores fueron seleccionados con base en observaciones empíricas. MaxPks es el número máximo de picos que serán seleccionados. Si MaxPks = 1, entonces solamente un pico (usualmente el más distinguido) es seleccionado, sin importar el ajuste de los otros parámetros. En una realización preferida, este valor se fija a un número muy alto (por ejemplo, 10.000) de tal modo que todos los picos que satisfacen las restricciones de otros parámetros serán seleccionados.

pp es la función llamada para escoger realmente los picos. Cuando se llama esto, el rango del espectro que debe ser considerado se proporciona como coordenadas de x y y. Puesto que todos los picos en los espectros observados estaban por debajo de 1000 m/z y no había picos mayores de 1.5, en una realización preferida estos valores se fijan para estar: x0 = 0, y0 = 0, x1 = 1000, y y1 = 2.0.

En el paso 130 el algoritmo de selección de pico XMASS (pp) en el espectro se utiliza para seleccionar los picos basados en los parámetros establecidos en el paso 125. Los picos que resultan se ponen por escrito en un archivo de texto ASCII (escribe - picos o writePeaks). Los datos en estos archivos incluyen la masa en cada pico seleccionado y la intensidad relativa a la cual fue medida.

Combinación de datos de picos de todos los espectros: En referencia a la fig. 2, en el paso 210 los picos de cada espectro se almacenan por XMASS como un archivo separado en un subdirectorio con el espectro correspondiente.

Se ordena una breve explicación de cómo el software XMASS organiza los espectros. La organización se basa enteramente en jerarquías de directorios. Se selecciona un directorio donde los datos se deben almacenar a medida que se procesan las muestras. Mientras que se procesan las muestras, se numeran a partir de uno hasta el número total de muestras, y cada resultado de muestra (espectro e información de soporte) se pone en un subdirectorio nombrado según el número de la muestra (XMASS se refiere a esto como la número del experimento). Dentro de estos directorios del número del experimento, hay un subdirectorio llamado el pdata, que tiene subdirectorios numerados, comenzando con 1, para cada vez que se analiza la muestra (cada una tiene su propio espectro). Es dentro de este directorio que los archivos de picos ASCII están escritos. Debido a que el software XMASS no tiene ninguna manera conveniente de seguir condiciones experimentales, se deben tomar notas cuidadosas durante el procesamiento de muestras para relacionar los números generados del experimento con estas condiciones.

En el paso 220 los datos de estos archivos se extraen y se combinan en un solo archivo junto con la información relevante sobre el tratamiento y las condiciones experimentales asociados a la muestra medida que cada espectro representa. Una realización preferida de la invención objeto de la presente comprende un programa (mostrado abajo) en el lenguaje de programación Perl (Perl, versión 5.0.6, copyright 1987-2000, Larry Wall) que mapea las condiciones experimentales con los números de experimento, abre cada archivo de pico, lee el contenido de ese archivo y pone por escrito en un archivo las condiciones experimentales junto con los datos de masa e intensidad relativa. Todas las muestras de interés deben ser hechas al mismo tiempo para que los datos se puedan escribir en un archivo común. Se repite este proceso cada vez que los picos se reprocesen con valores diferentes para los parámetros de sensibilidad.

Programa del Perl

# descripción: Este escrito analiza sintácticamente un sistema de archivos de picos XMASS, agrega

# información de soporte con respecto a las condiciones de tratamiento de la muestra y las

# juntas en un solo fichero de datos delimitado por una coma.

1

2

Los datos de este archivo combinado se importan luego hacia un ambiente de programación estadístico (R, Versión 1.01, Ihaka y Gentleman (1996), "R: Un lenguaje para el análisis de datos y gráficos ", Journal of Computational and Graphical Statistics 5:299-314).

Es muy común que haya allí variaciones pequeñas en las masas máximas divulgadas que representan la misma entidad química entre espectros. Por lo tanto, para permitir una comparación significativa de picos entre espectros, los picos que corresponden probablemente a la misma entidad química deben ser identificados y etiquetados apropiadamente. Se logra esta tarea usando un algoritmo que forme clusters.

En referencia de nuevo a la fig. 2, en el paso 130 se fijan los parámetros de sensibilidad del cluster. Los parámetros del pico en sensibilidad del cluster (racimo), sin importar el algoritmo usado para formar el cluster, preferiblemente se seleccionan con base en experiencia práctica con los datos. La meta es combinar todos los espectros cruzados de masas que, se cree, representan la misma entidad química, y no ninguna otra. En el paso 140, los picos comunes entre espectros se encuentran usando un algoritmo que forma cluster. Para el proceso de formación de cluster de este paso (ilustrado adicionalmente en la fig. 3) y los datos en mano de experimentos múltiples, se ha encontrado que un valor maxDist de 0.0008 se realiza notablemente bien. Los picos colindantes se mezclan raramente y los picos que parecen corresponder se agrupan juntos.

Usando funciones codificadas habituales, los picos comunes entre los espectros de masas se identifican usando el algoritmo que forma cluster relativamente directo, con parámetros especificados de sensibilidad, lo cual se ilustra en la fig. 3.

En referencia a la fig. 3, en el paso 310 se fija un maxDist variable, la distancia máxima permitida entre las masas máximas dentro de un clúster. En el paso 315, se crea y se clasifica numéricamente massVec, un vector de masas únicas de todos los picos seleccionados de todos los espectros. Una realización preferida utiliza un algoritmo que clasifica provisto por R, aunque los expertos en la materia reconocerán que otros algoritmos de clasificación se podrían utilizar en este contexto. Los picos seleccionados de todos los espectros son los picos en el fichero de datos combinado cuya creación se describe en los pasos 210 y 220 (véase fig. 2). En el paso 220, el contador mCnt que se utiliza para iterar sobre el vector massVec, se fija inicialmente en 2; un vector growClust se fija inicialmente en el valor escalar de massVec[1] y se inicializa una variable clustDict como un arreglo asociativo vacío (también designado como un "hash" o una lista).

En el paso 325, el contador mCnt se compara con la longitud del massVec. Si el mCnt no es mayor que la longitud de (número de elementos adentro) massVec, entonces en el paso 330 el valor del massVec[mCnt] - massVec[mCnt - 1] se compara con el maxDist. Si el valor del massVec[mCnt] - massVec[mCnt - 1] no es mayor que maxdist, entonces se presume que el pico representado por el massVec[mCnt] pertenece al mismo clúster máximo que el massVec[mCnt - 1], de tal manera que en el paso 335 el elemento massVec[mCnt] se empuja sobre el extremo del vector growClust, que contiene ya el massVec[mCnt - 1], incrementando de esa manera la longitud del growClust en un elemento. En el paso 340, el contador mCnt es incrementado en 1, y se repite el paso 325.

Si en el paso 330, el valor del massVec[mCnt] - massVec[mCnt -1] es mayor que maxDist, entonces se presume que el pico representado por massVec[mCnt] pertenece a un cluster máximo nuevo, de modo que en el paso 345 las masas máximas que corresponden al cluster anterior contenido en el vector growClust se agregan al diccionario de cluster clustDict y se da el promedio simple no ponderado de los elementos en growClust como el nombre del cluster. En el paso 350, la variable growClust se asigna al elemento massVec[mCnt], sobreescribiendo el contenido anterior de growClust. En el paso 340, el contador mCnt es incrementado en 1, y se repite el paso 325.

Si en el paso 325 el valor de mCnt es mayor que la longitud de massVec, de modo que todas las masas máximas hayan sido aglomeradas (clustered), entonces en el paso 355 el contenido final de growClust se agrega a clustDict como en el paso 345. En el paso 360, se utiliza el diccionario de cluster clustDict para re-etiquetar cada masa máxima en el conjunto de datos de todos los picos seleccionados creados en el paso 220 (véase fig. 2).

Aquellos versados en la materia reconocerán que los algoritmos que forman clusteres diferentes de aquellos ilustrados en la fig. 3 podrían ser utilizados en la invención objeto de la presente. Una referencia estándar para otros métodos de análisis de cluster es: Kaufman, L. y Rousseeuw, P.J. (1990). Encontrar grupos en datos: Una introducción al análisis de cluster. Wiley, Nueva York. Realizaciones preferidas de manera alterna de la invención objeto de la presente aplican algoritmos de cluster divulgados en la referencia antedicha (u otras referencias conocidas a los versados en la materia), cada uno con su propio conjunto de parámetros de sensibilidad para ajustar, para obtener un nivel aceptable de reproducibilidad no supervisada cuando se aplican a los patrones de los picos resultantes del análisis de diversos experimentos.

En referencia otra vez a la fig. 2, una vez se identifican todos los clusteres de picos, la masa para cada pico en cada espectro se re-etiqueta como el promedio ponderado de las masas dentro del cluster correspondiente. Con la información relevante sobre el tratamiento y la condición experimental (por ejemplo, droga, concentración de la droga, y tipo de la muestra), la masa media de cluster y la intensidad relativa, los datos son suficientemente informativos para el análisis, en el paso 260.

Efectos del tratamiento de análisis sobre las intensidades máximas relativas: En una realización preferida, el análisis primario que se lleva a cabo busca relaciones entre las condiciones experimentales y la intensidad relativa (abundancia química) para el pico de cada entidad (químico) una a la vez y en combinación. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, analizar los efectos de variar las concentraciones de la droga para una droga dada, variar los tiempos de exposición a una droga, las comparaciones de variar las concentraciones de la droga y/o los tiempos de exposición entre muchas drogas, y las comparaciones de la respuesta de la droga entre muchos tipos de muestras biológica y médicamente relevantes y condiciones experimentales. Usando el ambiente de programación R, se utilizan gráficos de alto nivel, modelos lineales generales, y métodos de análisis de cluster y de reconocimiento de patrón para identificar picos y patrones del pico del interés.

Los expertos en la materia reconocerán que hay muchas otras maneras de usar esta clase de datos para tratar cuestiones de interés en la industria farmacéutica y biotecnológica. Los ejemplos de otros contextos en los que el método divulgado sería aplicable se divulgan en la sección 5.6-5.10, infra, e incluyen, pero no se limitan a, usar modelos basados en células biológicamente relevantes y muestras de pacientes para lo siguiente: (1) medición y análisis simultáneos del impacto de la droga sobre rutas metabólicas enteras; (2) asignación de drogas y de compuestos químicos conocidos y/o desconocidos en grupos funcionales basados en su impacto total sobre la actividad metabólica; (3) identificación de nuevos metabolitos o catabolitos o rutas bioquímicas; (4) definiciones de los perfiles de picos metabólicos para drogas y compuestos químicos; y (5) subagrupamiento de paciente con base en perfiles metabólicos basales y/o perfiles en respuesta al tratamiento de la droga para permitir una sensible acomodación a requisitos particulares de los regímenes de tratamiento; y (6) análisis SAR en combinación o no con software, tal como la catálisis (MSI) para realizar data mining (minería de datos) y/o para crear nuevas moléculas activas.

La determinación de la identidad de un pico en el perfil se puede hacer de una variedad de maneras. Las moléculas que pueden estar presentes en una muestra biológica incluyen las moléculas proteicas (que incluyen pero no se limitan a las glicoproteínas, las lipoproteínas, las proteínas, los polipéptidos, los péptidos, los peptoides, y los aminoácidos), los ácidos nucleicos (que incluyen pero no se limitan a los polinucleótidos, los oligonucleotidos, los nucleótidos, los nucleosidos, DNA o un derivado, o RNA o un derivado), los carbohidratos (que incluyen pero no se limitan a los polisacáridos, los oligosacáridos, y los sacáridos), los lípidos (que incluyen pero no se limitan a los fosfolipidos, a los glicolípidos, a los lipopolisacáridos, a las lipoproteínas, al colesterol y a los análogos de los mismos, y a los glicéridos saturados y no saturados) y las moléculas pequeñas (incluyendo moléculas orgánicas y moléculas inorgánicas). Cualesquiera de estas moléculas pueden estar presentes en su estado nativo o en formas químicamente modificadas.

La comparación de espectros de masas de extractos de muestras bajo prueba (por ejemplo, de células potencialmente enfermas o de células tratadas con un compuesto bajo prueba) comparadas con las muestras de control o las de referencia (por ejemplo, de células normales o no tratadas) permite la identificación de los picos que se aumentan o se disminuyen (por ejemplo, con la dosis de las drogas o la severidad de la enfermedad) así como los picos que no varían. Conociendo la masa exacta del pico, podría ser fácil identificar la molécula (ya sea directamente en el caso de una molécula pequeña o dilucidando la fórmula química de uno o más fragmentos en el caso de una molécula grande). El primer paso es determinar los picos para las moléculas pequeñas. Hay por lo menos dos maneras de determinar la fórmula general. La primera, elementos comunes, incluyendo pero sin limitar a C, N, H y O, se utilizan en una combinación lineal para reconstituir la molécula. Como será apreciado por aquellos versados en el arte, en algunos casos la masa molecular tomará en cuenta un protón adicional o un átomo adicional (por ejemplo un átomo de sodio en el caso cuando el compuesto se sodifica). Se evalúan múltiples posibilidades usando probabilidades estadísticas asociadas. Un segundo enfoque es buscar en las bases de datos adecuadas basándose en la masa molecular conocida, tomando en cuenta la abundancia del isótopo. De los candidatos posibles, solamente las entradas o artículos biológicos serán considerados. Para las moléculas grandes, se utiliza un paso de la fragmentación para permitir la identificación de la molécula. Además, será utilizada la consideración de picos cargados de manera múltiple.

Los caminos metabólicos en sistemas biológicos se caracterizan bien la mayoría de las veces y todos los picos identificados (moléculas) se podrían posicionar en la carta que representa caminos o rutas metabólicos. Identificando una molécula en una ruta metabólica que se altera por una droga o está en un estado de enfermedad, es posible sugerir un mecanismo de acción para esto. Si la molécula todavía no se conoce, su identificación podría conducir al descubrimiento de un nuevo metabolito o un nuevo camino bioquímico. Los efectos de Pleiotropic se pueden descubrir también.

Para dilucidar la estructura química de una molécula grande de interés, la molécula preferiblemente se fragmenta y la estructura de uno o más de sus fragmentos se identifica. Sin embargo, antes de la fragmentación, la naturaleza de la molécula se puede determinar por uno de dos enfoques.

Primero está el enfoque bioquímico. La muestra de un pico particular FTMS se puede tratar con una enzima tal como la nucleasa, que hidroliza los ácidos nucleicos. La muestra tratada será sometida otra vez a FTMS. La ausencia o la presencia del pico determinarán si la muestra contiene ácidos nucleicos. La muestra puede tratarse de manera similar con una o más proteasas, glucosidasas y lipasas para determinar la presencia de proteínas, de azúcares o de lípidos en la molécula que da lugar a pico del interés. Preferiblemente, las clases múltiples de enzimas se utilizan de modo que las moléculas que comprenden más de una clase de componentes (por ejemplo, glicolípidos, lipoproteínas) puedan ser identificadas así como proteína y azúcar. Un segundo método que puede ser utilizado ocasionalmente es un enfoque químico. Una muestra se puede identificar por sus características reactivas químicas.

La dilucidación estructural se puede realizar en el instrumento de FTMS mediante fragmentación del ion de interés (ion del precursor). Para hacer esto, un pulso de aislamiento se utiliza primero para "barrer hacia fuera" todos los iones excepto la población precursora del ion. Una vez más la ventaja se toma de la relación de frecuencia del ciclotrón y se aplica un campo rf que está en frecuencia con todos los iones que se expulsarán de la célula (detector). Los iones absorben de manera resonante esta radiación y, con bastante energía, se excitan desde los límites de la célula. Esto permite solo al ion padre atrapado dentro de la célula.

Al siguiente paso se refieren como al proceso de activación del ion (paso de fragmentación). Esto puede realizarse en principio usando varios métodos, pero aquel usado la mayoría de las veces en FTMS es la disociación activada por colisión (CAD) o la disociación infrarroja-multifotón (IRMPD). El proceso CAD es logrado poniendo una frecuencia de rf que esté en resonancia con la del ion del precursor. Al ion se entrega bastante energía para excitar su órbita de ciclotrón. Debido a que la frecuencia del ion se conserva, se aumenta su velocidad angular (es decir gana energía cinética). Una válvula a pulsos se acciona para introducir una explosión de gas de colisión hacia el área de la célula donde se atrapan los iones. Además, como será apreciado por aquellos versados en el arte, pueden ser utilizados gases diferentes (gases más pesados producen generalmente más fragmentos). Los iones precursores excitados tienen colisiones enérgicas con este gas y esto induce a la fragmentación. Después de un breve retraso de bombeo (para que los neutrales sean evacuados) el producto o los iones de fragmento se detectan con todas las capacidades normales según lo descrito en la sección 5.2, supra.

La IRMPD (disociación multifotón infrarrojo) es en principio incluso más simple de poner en ejecución. Los iones aislados se someten a una haz intenso de fotones IR. Se absorben estos fotones y los iones se ponen "calientes" por vibración hasta el punto de activación. Se detectan los productos que resultan de la fragmentación.

Cualquier método produce un espectro de la fragmentación (en referencia al espectro de MS/MS). Esta clase de datos es instrumental en la dilucidación de la estructura. Por ejemplo, si un ion precursor que consiste de un C_{13}H_{20}N_{2}O_{3} o C_{14}H_{24}N_{2}O_{2} se somete a un experimento de MS/MS, puede ser observado un pico que es 46.005 Da más bajo en masa del precursor sugiriendo que la estructura ha perdido C H_{2}O_{2} y contiene por lo menos un grupo carboxilato (es decir ácido carboxílico, azúcar, lípido).

El ciclo del aislamiento y de fragmentación se puede pasar a iones de fragmento siguientes (es decir MSn). FTMS y otros métodos de atrapar iones son capaces de realizar varias etapas de fragmentación.

Una vez que la secuencia entera o parcial del aminoácido de una proteína aislada se haya determinado experimentalmente, se puede utilizar una computadora (ordenador) para buscar en las bases de datos disponibles una secuencia del aminoácido que concuerde o encaje o una secuencia del nucleótido, incluyendo una etiqueta expresada de la secuencia (EST), cuya secuencia predicha de aminoácido concuerda con la secuencia de aminoácido determinada experimentalmente. Si no se encuentra ninguna secuencia del nucleótido que concuerde, se puede producir por ingeniería inversa un conjunto degenerado de secuencias del nucleótido que codifica la secuencia del aminoácido determinada experimentalmente mediante técnicas bien conocidas en el arte; tal conjunto degenerado de secuencias de nucleótido es útil para clonar el gen que codifica la proteína aislada y para expresar el fragmento secuenciado de la proteína o del péptido. Alternativamente, si el pico de FTMS corresponde a un ácido nucleico, el ácido nucleico se fragmenta y se secuencian fragmentos del mismo. Las secuencias del fragmento se pueden utilizar para identificar el gen al cual corresponden, por ejemplo, Genbank. Si la(s) secuencia(s) del fragmento no corresponde(n) al (los) gen(es) conocido(s),
se puede preparar o amplificar sintéticamente un ácido nucleico mediante PCR de acuerdo con métodos que son bien conocidos a aquellos con habilidad en el arte; ver por ejemplo, Métodos de enzimología, volumen 152, "Guía para las técnicas moleculares de la clonación", ed. Berger y Kimmel (prensa académica 1987); Maniatis et al., "Clonación molecular: Un manual de laboratorio" (Cold Spring Harber Laboratory 1982), ambas son incorporadas a la presente por referencia en su totalidad. Los ácidos nucleicos generados así se pueden utilizar para tamizar y seleccionar (screen) una biblioteca de genoma o de DNA para identificar el gen de longitud plena al cual corresponde el fragmento. Alternativamente, la secuencia del gene o por lo menos un marco abierto de lectura del mismo, a la cual corresponde el ácido nucleico puede ser identificada compilando la información obtenida mediante secuenciación de fragmentos traslapados del ácido nucleico del pico original de interés HICS-FTMS.

Las células modificadas por ingeniería genética para expresar tal proteína recombinante se pueden utilizar para producir cantidades grandes de la proteína recombinante, por ejemplo, para administración terapéutica. La posesión del gen clonado permite que la terapia genética substituya o supla una proteína cuya ausencia o expresión disminuida se asocie a una enfermedad. La posesión del gene clonado permite además el uso de terapia antisense o de triple-hélice para suprimir la expresión de una proteína cuya presencia o expresión realzada se asocie a enfermedad o expresión recombinante de explotación de la proteína en suficientes cantidades para la inmunoterapia, por ejemplo, cultivando un anticuerpo monoclonal además, que puede ser quimerizado (Morrison, et del al., 1984, Proc. Nacional. Acad. Sci., 81, 6851-6855; Neuberger, et al., 1984, Nature 312, 604-608; Takeda, et al., 1985, Nature 314, 452-454) o humanizado (véase, por ejemplo, Queen, patente estadounidense No. 5.585.089 y Winter patente estadounidense No. 5,225,539) antes de la administración terapéutica.

Los resultados del análisis de FTMS en un perfil de picos. Un perfil de picos es la representación gráfica de lo que se detecta por el detector del FTMS; el perfil contiene una multiplicidad de picos que corresponden a las diferentes biomoléculas (así como los diferentes picos de la misma molécula con diferentes isótopos) y fragmentos de biomoléculas así como moléculas de cargas múltiples. Un perfil de picos de una muestra particular, tratado de una manera particular, es esencialmente una "huella digital" del estado de la muestra; mientras que dos estados pueden tener presente cualquier biomolécula particular de manera similar, la evaluación de un número de biomoléculas permite simultáneamente la generación de un perfil se picos único al estado de la célula. Esto es análogo al perfil de "huellas digitales" de la expresión del gen hecho en los biochips. Es decir, un tejido normal puede ser distinguido de un tejido canceroso de pecho, y dentro del tejido canceroso de pecho se pueden determinar estados distintos de diagnóstico (perspectivas de supervivencia a largo o corto plazo, por ejemplo) pueden ser determinados. De manera similar, los perfiles de picos del tejido pulmonar se pueden comparar con el tejido del riñón, los perfiles de las muestras de cáncer de pecho de diversos pacientes se pueden comparar, los perfiles de muestras antes, durante o después del tratamiento con una droga, o en diferentes concentraciones de la droga, todo se puede evaluar según lo descrito en la
presente.

Como será apreciado por aquellos versados en el arte, estos tipos de comparaciones se pueden hacer usando un solo perfil de picos de la muestra, o múltiples perfiles de picos; por ejemplo, la muestra se puede preparar o separar de varias maneras y los picos se pueden analizar individualmente, o sobrepuestos y combinados.

Comparando perfiles de picos de muestras en diversos estados, se obtiene la información con respecto a las biomoléculas es importante (incluyendo regulaciones tanto ascendente como descendente) en cada uno de estos estados. La identificación de las biomoléculas presentes de manera diferenciada (incluyendo tanto apariencia o aspecto como desaparición o cambios en intensidad máxima) permite el uso de esta información de un número de maneras según lo esbozado en la presente. Por ejemplo, se puede hacer el diagnóstico y el monitoreo de la enfermedad; puede ser evaluada la evaluación de un régimen particular de tratamiento: si una droga quimioterapéutica actúa para mejorar el pronóstico a largo plazo en un paciente particular. De manera similar, se puede hacer o confirmar el diagnóstico comparando muestras de pacientes con los perfiles de picos conocidos. Además, estos perfiles permiten la investigación, tamizado y selección (screening) de las drogas candidatas con perspectiva hacia imitar o alterar un perfil de picos particular; por ejemplo, el screening se puede hacer para drogas que suprimen el perfil de picos del cáncer de pecho o convierten un mal perfil de pronóstico a un perfil mejor de pronóstico.

Así, la presente invención encuentra utilidad en una variedad amplia de aplicaciones. En una realización preferida, los métodos esbozados en la presente se utilizan para analizar muestras y para construir y tener acceso a bases de datos. En una realización preferida, los métodos permiten la generación de una variedad amplia de bases de datos, particularmente para, pero sin limitarse a, moléculas pequeñas, puesto que el FTMS permite tal alta precisión.

Así, en una realización preferida, la presente invención se utiliza para identificar rápidamente componentes celulares o de una muestra. Usando FTMS conjuntamente con otro software computacional de química, tal como MSI CATALYST, se puede hacer una identificación y caracterización rápidas de moléculas activas nuevas. CATALYST es un programa que explora el aspecto o la forma activa posible de las drogas candidatos. Haciendo correr una biblioteca pequeña de compuestos y buscando atributos deseables del espectro, se puede generar una "descripción del farmacóforo" usando CATALYST o programas similares. Esta "descripción" se puede utilizar entonces para tamizar (screen) bibliotecas virtuales buscando y seleccionando candidatos adicionales generados que pueden luego ser probados o ensayados.

Además, se debe anotar que la cuantificación y la comparación de distintos espectros se pueden hacer de una variedad de maneras. En una realización, la muestra es electroaspergida (prefiriéndose el uso de una fuente doble de aerosol), junto con una aspersión simultánea de una muestra de referencia, para permitir la cuantificación y la comparación. Alternativamente, la referencia se agrega a la muestra. Finalmente, otra alternativa es normalizar usando componentes conocidos que sean aproximadamente iguales a las muestras en cuestión, por ejemplo usando genes o proteínas o metabolitos celulares caseros diferentes que están bajo homeostasis.

Así, haciendo correr una gran cantidad de muestras de una variedad de fuentes diferentes y bajo diferentes condiciones, son generadas bases de datos. Éstas se pueden utilizar de una variedad de maneras. En una realización preferida, las bases de datos se utilizan en otros experimentos para identificar picos. Alternativamente, pueden ser utilizadas para comparar muestras o los efectos de drogas o de agentes candidatos sobre muestras, para identificar señalando caminos o rutas y componentes terapéuticamente relevantes.

Además, cuando se generan las bases de datos, ellas pueden ser visualizadas usando cualquier número de software para representación gráfica, incluyendo software de visualización tal como SPOTFIRE®, mapeo de contorno en 3D, mapeo topológico, técnicas de triangulación, etc.

La presente invención proporciona métodos para analizar una muestra biológica compleja, que comprenden los pasos de someter la muestra a FTMS, lo que proporciona un perfil de picos de la muestra, y para evaluar el perfil de picos de la muestra. En una realización, los métodos además comprenden comparar el perfil de picos de la muestra con un perfil de picos de una muestra de referencia. Por consiguiente, la muestra biológica puede ser una muestra para prueba o ensayo. La muestra de referencia puede ser predeterminada, es decir, es una muestra histórica. El perfil de picos de la muestra de referencia puede ser el perfil de picos de una muestra o un perfil de picos promedio de dos o más muestras. En una realización, la muestra de referencia se deriva de una célula normal y de la muestra bajo prueba de una célula enferma del mismo tipo. En otra realización, la muestra de referencia se deriva de una célula enferma o normal y la muestra bajo prueba se deriva de una célula enferma después de que la célula enferma se haya expuesto a un biomodulador tal como una droga o una hormona.

La presente invención proporciona además métodos para detectar una respuesta de una célula a un biomodulador, que comprenden comparar un perfil de picos de FTMS de una primera muestra biológica derivada de una célula que no se ha expuesto al biomodulator con un perfil de picos de FTMS de una segunda muestra biológica derivada de una célula que se ha expuesto al biomodulador.

La presente invención además proporciona métodos para identificar un marcador de una respuesta de una célula a un biomodulator, que comprenden detectar una respuesta de la célula al biomodulador según el método de las reivindicaciones tal como está descrito en la presente, e identificar un pico que se diferencie en intensidad entre los perfiles de picos para la primera y la segunda muestras biológicas, cuyo pico no corresponde a la masa molecular del dicho biomodulador, en donde un pico identificado así corresponde a un marcador de una respuesta de la célula al biomodulador.

La presente invención además proporciona métodos para caracterizar un marcador de una respuesta de una célula a un biomodulador, que comprenden identificar un marcador de una respuesta de una célula a un biomodulador de acuerdo con los métodos descritos en la presente, aislar un ion del marcador que tiene el cociente m/z de dicho marcador; y obtener la secuencia molecular o la estructura química de dicho ión o de un fragmento del mismo.

La presente invención además proporciona métodos para identificar una molécula cuya concentración en una célula cambia cuando la célula entra en contacto con un biomodulador, que comprenden comparar un perfil de picos de FTMS de una primera muestra biológica derivada de una célula que no se ha expuesto al biomodulador con un perfil de picos de FTMS de una segunda muestra biológica derivada de una célula que se ha expuesto al biomodulador, e identificar un pico que se diferencie en intensidad entre los perfiles de picos para la primera y la segunda muestras biológicas, dicho pico no corresponde a la masa molecular del dicho biomodulador, en donde un pico identificado así corresponde a una molécula cuya concentración en una célula cambia cuando la célula entra en contacto con un biomo-
dulador.

La presente invención además proporciona métodos para identificar por lo menos un marcador de una enfermedad o de una condición, que comprenden comparar un perfil de picos de FTMS de una primera muestra biológica derivada de una célula normal con un perfil de picos de FTMS de una segunda muestra biológica derivada de una célula que tiene la enfermedad o la condición, e identificar un pico que se diferencie en intensidad entre los perfiles de picos para la primera y la segunda muestras biológicas, en donde un pico identificado así corresponde a un marcador de dicha enfermedad o condición.

La presente invención además proporciona métodos para diagnosticar una enfermedad o una condición en un paciente, que comprenden identificar (por lo menos uno) un marcador de dicha enfermedad o condición de acuerdo con los métodos descritos en la presente, y determinar la intensidad del pico que corresponde al marcador dicho en una muestra biológica obtenida de una célula de dicho paciente, en donde la intensidad del pico es indicativa de la presencia o del grado de la enfermedad o de la condición en el paciente dicho.

La presente invención además proporciona métodos para supervisar la eficacia de un tratamiento terapéutico en un paciente que sufre de una enfermedad o de una condición, que comprenden identificar un marcador de dicha enfermedad o condición de acuerdo con los métodos descritos en la presente; y determinar la intensidad del pico que corresponde al marcador dicho en una muestra biológica obtenida de una célula del paciente dicho después de que haber sometido al paciente a tratamiento terapéutico, en donde la intensidad del pico es indicativa de la presencia o el grado de la enfermedad o la condición en el paciente dicho y un reflejo de la eficacia del tratamiento terapéutico dicho.

La presente invención además proporciona métodos para identificar una molécula provocada para el desarrollo de la droga, que comprenden identificar un marcador de una enfermedad o condición de acuerdo con los métodos descritos en la presente, para dicha enfermedad o condición se desea la identificación de una molécula provocada para el desarrollo de la droga; obtener un perfil de picos de FTMS de una muestra derivada de una célula, con una concentración característica de dicho marcador, de la enfermedad o condición, dicha muestra es derivada de la célula dicha después de que la célula se haya expuesto a una molécula bajo prueba; y determinar si la célula con la concentración del marcador dicho es alterada por la molécula bajo prueba; dicha determinación comprende medir la intensidad del pico a la cual el marcador corresponde, en donde un cambio en la concentración del marcador dicho (dicho cambio se aproxima a los niveles normales del marcador dicho) indica que la molécula bajo prueba es una molécula provocada para el desarrollo de la droga para el tratamiento o la prevención de la enfermedad o la condición dicha.

Además, la presente invención se puede utilizar en el desarrollo de compuesto guía o inicial en relaciones de estructura-actividad (SAR). Así, el análisis de los espectros de compuestos relacionados puede servir para correlacionar la estructura del compuesto con su actividad deseada.

La presente invención además proporciona métodos para identificar objetivos toxicológicos de drogas, que comprenden comparar tres perfiles de picos de FTMS, en donde los tres perfiles de picos de FTMS corresponden a una primera muestra biológica obtenida de una célula que se ha expuesto a una primera droga con un efecto secundario tóxico; una segunda muestra biológica obtenida de una célula que se ha expuesto a una segunda droga sin un efecto secundario tóxico, en donde la primera droga y la segunda droga pertenecen a la misma clase de drogas; y una tercera muestra biológica obtenida de una célula que no se ha expuesto a ningún miembro de dicha clase de drogas; e identificar un pico que sea similar en intensidad entre los perfiles de FTMS de la segunda y la tercera muestras pero se diferencia en intensidad en el perfil de FTMS de la primera muestra, en donde un pico identificado así se correlaciona con un efecto tóxico para el desarrollo de la droga.

La presente invención además proporciona otros métodos para identificar los objetivos toxicológicos de drogas, que comprenden comparar tres perfiles de picos de FTMS, en donde los tres perfiles de picos de FTMS corresponden a una primera muestra biológica obtenida de una célula que se ha expuesto a una primera droga con un efecto secundario tóxico; una segunda muestra biológica obtenida de una célula que se ha expuesto a una segunda droga que tiene el mismo efecto secundario tóxico; y una tercera muestra biológica obtenida de una célula que no ha expuesto a ninguna droga que tiene dicho efecto secundario tóxico; e identificar un pico que sea similar en intensidad entre los perfiles de FTMS de la primeras y segunda muestras pero se diferencia en intensidad en el perfil de FTMS de la tercera muestra; en donde un pico identificado así se correlaciona con un efecto tóxico para el desarrollo de la droga.

La presente invención además proporciona los métodos para caracterizar las características tóxicas de un agente de prueba que comprende determinar la intensidad de un pico en un perfil de picos de FTMS de una muestra biológica obtenida de una célula que se ha expuesto al dicho agente de prueba, dicho pico que ha sido identificado como un objetivo toxicológico por uno o más de los métodos descritos en la presente, en donde la intensidad del pico es indicativa de la toxicidad del agente de prueba.

La presente invención proporciona además métodos para análisis de alto contenido de información (HIC) de una muestra biológica compleja, que comprenden someter la muestra a una pluralidad de casos de Espectrometría de masas por transformadas de Fourier (FTMS); y para cada caso de FTMS, generar información de un perfil de picos de FTMS para la muestra; aplicar un algoritmo máximo de recolección de picos a la información de perfil de picos generada para seleccionar los picos que satisfacen criterios dados; y aplicar un algoritmo de formación de clusteres a los picos seleccionados para identificar picos que probablemente correspondan a la misma entidad química.

En una realización, la información de perfil de picos se escribe en un archivo separado para cada caso de FTMS, y además comprende el paso de crear un solo archivo que abarque la información de cada uno de los dichos archivos separados para los picos seleccionados por el algoritmo de recolección de picos. En un modo de la realización, el algoritmo de formación de clusteres se aplica a la información contenida en dicho archivo único que abarca información de cada uno de dichos archivos separados para los picos seleccionados por el algoritmo de recolección de picos.

En otra realización, cada uno de los picos seleccionados se re-etiqueta con el promedio de masas de un cluster correspondiente de picos.

La presente invención proporciona métodos para generar espectros de FTMS de muestras biológicas complejas y analizar los perfiles de pico en los espectros. Las muestras biológicas complejas incluyen muestras derivadas de material biológico que incluye pero no se limita al suero de sangre, células cultivadas, biopsias de tejido. El análisis comparativo de los espectros generados para las células en diferentes estados o de diferentes tipos es útil para las diferencias fenotípicas específicas que existen entre células y/o tejidos del mismo tipo normales y anormales, por ejemplo no-enfermos y enfermos,. Además, una vez se hayan identificado que las diferencias fenotípicas específicas en forma de picos de FTMS de intensidad diferenciada, las moléculas a las cuales corresponden los picos pueden ser identificadas y/o ser utilizadas como biomoléculas provocadas para el desarrollo de diagnóstico y/o farmacéutico.

Los métodos de la presente invención además comprenden identificar un pico o un patrón de picos de HICS-FTMA que son característicos de una patología particular o de una clase particular de patologías. Tales perfiles de picos proporcionan información valiosa, útil para definir y clasificar más completa y exactamente subtipos de patología.

Utilizando los principios de la presente invención, se pueden recoger y someter a HICA-FTMS las muestras de muchos pacientes diferentes que han conocido condiciones de salud. Los perfiles generados se analizan para identificar picos que están presentes o ausentes, de manera única, en las muestras derivadas de células de pacientes que tienen diversas condiciones de la salud, y los datos resultantes se utilizan para crear una base de datos que incorpora todos los picos que se identifican así. Los datos referentes a las muestras obtenidas de los pacientes que exhiben una patología o una enfermedad de interés se pueden extraer luego para el análisis y comparar con los registros restantes en la base de datos para identificar picos o patrones de picos de interés que serían predictivos del estado de la patología o de la enfermedad.

En ciertas realizaciones, HICA-FTMS es por lo tanto una herramienta para generar perfiles de picos y para identificar un patrón de picos moleculares, o picos del marcador, que es característico de una patología o de una clase particular de patologías. Se puede usar la supervisión de las intensidades del marcador que representan la cantidad relativa de las moléculas del marcador a las cuales corresponden los picos, en los perfiles de picos generados de la misma fuente de la muestra bajo diversas condiciones o puntos de tiempo en la progresión de monitoreo de la respuesta a la terapia de una enfermedad y al descubrimiento de una droga, accionada por el objetivo, para la enfer-
medad.

Utilizando los principios de la presente invención, se pueden someter a HICS-FTMS las muestras de tejido o de célula de los animales experimentales que son modelos para una enfermedad tratada con una de las terapias conocidas en la gestión o el tratamiento de la enfermedad, o las muestras biológicas de los seres humanos que experimentan estos tratamientos o un modelo de cultivo de célula de las mismas, y los datos resultantes se usan para crear una base de datos que incorpora todos los picos comunes y únicos que están presentes o ausentes en las muestras de los objetos tratados (el humano o el modelo animal) por comparación con sus contrapartes no tratadas. Las moléculas del marcador que corresponden a los picos del marcador se pueden utilizar como objetivos para el desarrollo de una terapia o un fármaco. De manera similar, los perfiles de picos de las muestras biológicas derivadas de las plantas normales se pueden comparar con los perfiles de picos de las muestras biológicas derivadas de plantas tratadas con drogas fitosanitarias, herbicidas u hormonas, o de plantas infectadas con patógenos tales como virus. Las moléculas del marcador que corresponden a los picos del marcador identificados en estos screenes pueden ser objetivos para el desarrollo de insecticidas. También de manera similar, los perfiles de picos de muestras biológicas derivadas de microorganismos que se han tratado con antibióticos pueden ser comparados con los perfiles de picos de muestras biológicas derivadas de microorganismos no tratados de la misma especie, por ejemplo para identificar moléculas del marcador de resistencia antibiótica que se pueden utilizar como marcadores de screening de la
droga.

Además de supervisar respuestas a droga, HICS-FTMS se puede emplear para supervisar la droga misma. Así, los atributos particulares de una droga objetivo pueden revelarse, como por ejemplo los perfiles de separación, interacciones y modificaciones moleculares, metabolismo de la droga, modo de acción, y la localización subcelular.

La presente invención proporciona métodos para identificar drogas nuevas que son útiles en el tratamiento de una enfermedad o de un desorden para el o la cual se conozca ya una droga actual, por ejemplo identificar una droga con una eficacia creciente, una tolerancia más alta. Los espectros de HICS-FTMS se generan para muestras de extracto de célula, de tejido fino o de cultivo de célula que son (i) no tratadas, (ii) tratadas con la droga conocida, o (iii) tratada con una molécula de prueba. Las moléculas de prueba que obtienen cambios en los picos de FTMS similares a aquellos vistos en extractos de muestras de cultivo celular que han sido tratadas con la droga conocida son entonces compuestos candidatos guías o iniciales para el descubrimiento de la droga. Mientras se utilizan células o tejidos cultivados en la práctica de la presente invención, por ejemplo como sistema modelo para el descubrimiento de la droga, las células se pueden mermar o enriquecer isotópicamente para facilitar la caracterización y la sensibilidad.

Las pruebas de screening (investigación, tamizado y selección) de la presente invención permiten la identificación de los picos que son objetivos o metas de drogas individuales y de los picos comunes presentes en muestras de células han sido expuestas a, o de organismos que han experimentado el tratamiento con diversos miembros de, una clase de drogas de interés, por ejemplo, drogas anti-hiperlipidémicas. Al mismo tiempo, pueden ser observados los picos objetivo que están presentes o ausente en las muestras tratadas solamente con una droga o un subconjunto de la clase de drogas, y estos picos correlacionados con las actividades que son únicas a esa(s) droga(s). Un aumento o una disminución de la intensidad de ese tal pico puede correlacionarse con actividades o características deseables de la(s) droga(s), por ejemplo una actividad que disminuya la glucosa en una droga anti-hiperlipidémica, o una actividad o una propiedad indeseable, tal como la tendencia a inducir náusea o vértigos como efecto secundario del tratamiento. Esta información se puede utilizar en el descubrimiento de drogas que, después de la exposición a los sistemas biológicos, obtienen solamente respuestas deseadas.

Ciertas drogas ejercerán sus efectos a través de un número grande de objetivos o metas celulares, mientras que otras con efectos más limitados influenciarán solamente pocos objetivos. De manera similar, algunas drogas ejercerán sus efectos sobre tipos múltiples de célula mientras que otras afectarán solamente uno o algunos tipos de la célula.

Hay un número de ejemplos esbozados abajo.

El síndrome metabólico o el síndrome X es manifestado por un metabolismo defectuoso de la glucosa (resistencia de insulina), la presión arterial elevada (hipertensión), un desequilibrio del lípido de la sangre (dislipidemia, incluyendo niveles de triglicéridos altamente circulante y niveles bajos de colesterol circulante "bueno", o HDL) y la obesidad central (tejido graso excesivo en la región abdominal) (véase, por ejemplo, Reaven, 1993, Annu. Rev. Med. 44:121-131). Los pacientes del síndrome X son actualmente drogas administradas por separado para tratar los síntomas individuales, porque las drogas comercialmente disponibles se han optimizado para modular un objetivo específico o para regular un parámetro específico de un estado de la enfermedad. El uso de drogas múltiples aumenta el riesgo de efectos secundarios serios y compromete la calidad de vida. HICS-FTMS puede permitir la identificación de drogas nuevas que tienen múltiples efectos terapéuticos simultáneos. Esto es virtualmente imposible usando el enfoque de HTS basado en objetivos sencillos o solos.

El número de los pacientes del síndrome X está aumentando rápidamente y parece estar asociado a la forma de vida occidental; particularmente los factores del alto riesgo son la edad y la dieta. Se necesitan urgentemente drogas para el síndrome X que tienen efectos pleiotropic, es decir, drogas que controlan múltiples o preferiblemente todos los síntomas del síndrome X.

HICS-FTMS también permite la identificación de las moléculas del marcador que son específicas a tejidos que se pueden utilizar como marcadores para el screening subsecuente en drogas específicas a tejidos. Tales drogas tendrían gran utilidad en regímenes terapéuticos. Por ejemplo, a los diabéticos insulina-resistentes les dan drogas de tiazolidinadiona (TZD) para manejar su enfermedad. Las TZDs activan el gamma receptor de proliferadores de peroxisoma activada (PPAR). La sensibilización de la insulina se aumenta después del tratamiento con TZDs, pero también aumenta la deposición de grasa en tejido adiposo. Recientemente, un TZD guía o inicial, Rezulin, fue recordado debido al efecto secundario serio de enfermedad del hígado, marcado por la ictericia, la náusea, el vómito, el dolor abdominal, la fatiga, la carencia del apetito, y la orina oscura, conduciendo a la muerte y/o a la necesidad de trasplantes del hígado. HICS-FTMS es un método opcional para hacer screen para y para identificar drogas que, como TZDs, promueven la sensibilización de la insulina, aunque a diferencia de TZDs no conduce a la enfermedad del hígado.

En otra realización, en la cual una droga ejerce sus efectos a través de blancos u objetivos múltiples, HICS-FTMS permite la caracterización de análogos mejorados. Se pueden identificar moléculas que ejercen esos mismos efectos con más eficacia y/o con efectos no específicos reducidos, una separación más rápida. Esencialmente, los perfiles de picos de HICS-FTMS se generan para muestras expuestas a una droga conocida o a una clase conocida de drogas, y se identifican los picos que se correlacionan con las características terapéuticas de la droga. La química combinatoria se puede utilizar para generar bibliotecas de los análogos de la droga, y estos análogos se pueden utilizar en pruebas de HICS-FTMS usando el modelo experimental como fue utilizado para identificar los picos beneficiosos asociados a la droga parental. Análogos con eficacia mayor que la droga parental, por ejemplo aquellos que afectan los picos del objetivo o blanco en concentraciones menores que lo que afecta la droga parental, se utilizan luego como compuestos guías o iniciales para el desarrollo de la droga.

En ciertas realizaciones de la presente invención, el descubrimiento de la droga se alcanza sin comparación con las drogas conocidas, basados puramente en la capacidad de una molécula de prueba de obtener cambios específicos en los perfiles de picos de FTMS a concentraciones muy bajas (en el rango nanomolar). La identidad de los picos afectados por la molécula de prueba se identifica luego, según lo descrito en la sección 5.5, supra, lo que puede proporcionar una guía en cuanto a qué camino modula la molécula de la prueba, y por lo tanto para cual de las enfermedades la molécula de prueba puede ser probada como droga. Las pruebas in vivo de la molécula bajo prueba pueden ser realizadas inicialmente usando una célula representativa o un estado de la enfermedad (por ejemplo, línea de célula tumoral), o en un animal, preferiblemente en un modelo animal para la enfermedad, preferiblemente en ratas o ratones, antes de proceder a los ensayos clínicos. Las drogas para el uso como antibióticos se pueden probar en cultivos bacterianas. Las drogas de la planta (por ejemplo, antivirales) se pueden probar en una instalación de laboratorio controlado antes de liberarlas al ecosistema.

Hay varias fuentes comunes de los compuestos guías o iniciales (drogas candidatos), incluyendo colecciones del producto natural, las colecciones químicas sintéticas, y las bibliotecas químicas combinatorias sintéticas, tales como nucleótidos, péptidos, u otras moléculas poliméricas.

Las moléculas de prueba de la presente invención se pueden obtener usando cualesquiera de los numerosos enfoques en los métodos combinatorios de biblioteca conocidos en el arte, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas de fase sólida o de fase de solución, paralelas espacialmente accesibles; métodos de biblioteca sintética que requieren deconvolución; el método de biblioteca de "un grano un compuesto"; y métodos de biblioteca sintética que usan selección de cromatografía por afinidad. El enfoque biológico de la biblioteca se limita a las bibliotecas del péptido, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables al péptido, al oligómero no péptido o a las bibliotecas de moléculas pequeñas de compuestos (Lam, 1997, Anticáncer Drug Des.. 12:145).

En el arte se pueden encontrar ejemplos de los métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares, por ejemplo en: DeWitt et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. E.E.U.U. 90:6909; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al.,1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261:1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, Angew. Chem. lnt. Ed. Engl. 33:2061; and Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1233.

Las bibliotecas de compuestos se pueden presentar en solución (por ejemplo, Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412-421), o en granos (Lam, 1991, naturaleza 354:82-84), chips (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), bacterias (Patente de EEUU No. 5.223.409), esporas (Patente de EEUU los Nos. 5.571.698; 5.403.484; y 5,223,409), plasmidas (Cull et al., 1992, Proc. Nacional. Acad. Sci. E.E.U.U. 89:1865-1869) o fagos (Scott y Smith, 1990, Ciencia 249:386-390; Devlin, 1990, Ciencia 249:404-406; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. E.E.U.U. 87:6378-6382; y Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310).

Los métodos de la presente invención se pueden aplicar a la selección de pacientes para el tratamiento mediante una droga.

Las muestras de tales individuos, por ejemplo, se pueden someter a HICS-FTMS para determinar si un pico asociado con una sensibilidad o una resistencia particular a una droga o una alergia a una clase de la droga está presente o ausente de sus perfiles de picos de FTMS. Un pico asociado con una sensibilidad particular a una droga es predeterminado mediante comparación de los espectros de HICS-FTMS de los individuos tratados con la droga o la clase de drogas y mediante identificación de esos picos cuya intensidad relativa se correlaciona con una sensibilidad o una resistencia al tratamiento.

Los métodos presentados aquí se pueden utilizar para determinar la dosis óptima de una droga. Los perfiles de picos de HICS-FTMS de extractos de células tratadas con distintas concentraciones de una droga se comparan en las intensidades de uno o más picos que correspondan a una respuesta favorable a la droga, por ejemplo de una molécula objetivo de la droga. Los mismos perfiles de picos también se analizan para determinar las intensidades de unos o más picos asociados con una respuesta desfavorable a la droga, por ejemplo toxicidad. De esa manera se identifica una dosis o un rango de dosificaciones en las cuales la droga obtiene una respuesta favorable máxima con toxicidad mínima.

La tecnología de HICS-FTMS se puede también utilizar generalmente para caracterizar respuestas celulares o del organismo a las moléculas señalizadoras, tales como hormonas, factores del crecimiento, citoquinas, y neurotransmisores. Así, una comparación de perfiles de picos derivada de muestras que comprenden extractos de célula de células tratadas con un factor particular de crecimiento puede demostrar un patrón asociado al factor del crecimiento. Los estudios del curso del tiempo se pueden conducir, por ejemplo para investigar los picos asociados a respuestas tempranas vs. tardías al factor de crecimiento. La identificación de picos distintivos da lugar a la identificación de marcadores, y la dilucidación química subsecuente de los iones correspondientes puede en últimas ayudar en el diseño farmacéutico.

Similar a la aplicación de HICS-FTMS para el estudio de enfermedades, se pueden determinar respuestas biológicas a la introducción de una perturbación genética a nivel celular o del organismo. Una perturbación genética puede ser una mutación hipomórfica, hipermórfica o neomórfica en un gen nativo, una sobreexpresión recombinante de un gen nativo que se puede expresar o no expresar normalmente en la célula de interés, una expresión recombinante de un gen extranjero, el uso de anticuerpos contra un producto del gen, la introducción del ácido nucleico antisense o la molécula de triple hélice que inhibirían el gen. Las comparaciones de los perfiles de picos de extractos de células que son de tipo silvestre, heterocigótico y/o homocigótico para un gen, y/o sobre-expresión del gen, pueden producir información útil con respecto a la localización (locus) genética, tal como los caminos bioquímicos en los cuales el gene esté involucrado, el grado de perturbación del sistema como resultado de la perturbación del gen, los objetivos celulares del producto mutado del gen (por ejemplo, receptores, complejos enzimáticos, substratos). El gen que sufre la mutación no necesita ser identificado de antemano, de tal manera que el método de HICS-FTMS tamice y seleccione por desconocido aquello que, como resultado de la mutación, afecta una selección de moléculas de interés. El método es igualmente aplicable cuando la mutación es de ocurrencia natural.

En una aplicación particular, se puede utilizar HICS-FTMS para supervisar alimentos o productos alimenticios de fuentes vegetales o animales. Los perfiles de picos de cada producto se pueden obtener para servir como referencia para las pruebas de control de calidad, o para asegurar la integridad de lo almacenado supervisando la variación genética en el tiempo. Similar a las pruebas de screening de droga, HICS-FTMS puede ser utilizado para seleccionar y mantener rasgos favorables, mientras que se identifican los rasgos indeseados.

Esta tecnología también tiene aplicación potencial a nivel sistémico, tal como ecosistemas acuáticos, composiciones del suelo y sistemas atmosféricos. Estos sistemas biológicos complejos se pueden caracterizar mediante HICS-FTMS, y los perfiles de picos se toman en el tiempo para supervisar cualquier cambio natural o cambios debido a la intervención humana.

La presente invención facilita de gran manera el campo del diagnóstico. En una realización, una muestra de suero de un paciente se puede someter a HICS-FTMS, y el perfil de picos o "perfil de picos" generado de tal modo proporcionaría una instantánea de los parámetros del suero del paciente que de otra manera requerirían una prueba individual. Los picos individuales conocidos para representar los parámetros de interés se comparan con un rango correspondiente de picos de individuos normales para determinar su concentración en el suero. Los parámetros que pueden ser probados incluyen pero no se limitan al colesterol, ácidos grasos, lipoproteínas, glucosa, hemoglobina, citoquinas, hormonas (por ejemplo, insulina, TSH, T4, T3), anticuerpos (por ejemplo, para las enfermedades autoinmunes tales como lupus sistémico eritematoso, enfermedad de Hashimoto), antígenos del tumor (por ejemplo, PSA).

En otra realización, el fluido cerebroespinal de un paciente se prueba para la presencia o las intensidades de los marcadores de desórdenes neurodegenerativos tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, enfermedades anteriores, la demencia frontotemporal. Ciertos marcadores para estas enfermedades se conocen ya (por ejemplo, proteína fosforilatada de tau o la forma del aminoácido 42 del péptido A\beta(Amiloide) en la enfermedad de Alzheimer), y los marcadores o los picos adicionales del marcador se pueden identificar por los métodos divulgados en la presente. Un pico del marcador puede ser un pico cuya intensidad aumenta o disminuye con la progresión de un desorden neurodegenerativo.

Los métodos de la presente invención se pueden también aplicar para supervisar el progreso de una enfermedad en el paciente o en la respuesta del paciente al tratamiento. Los perfiles de picos múltiples de HICS-FTMS de las muestras del paciente (suero, biopsia del tejido) se generan siguiendo indicaciones de un alto riesgo de una enfermedad o del diagnóstico del paciente con una enfermedad (con o sin tratamiento). Por ejemplo, una persona con niveles intermedios de uno o más marcadores asociados a desórdenes neurodegenerativos cuyos niveles no son suficientemente altos para señalizar un estado de enfermedad aunque estén por encima del promedio, puede ser supervisada periódicamente para determinar si los picos del marcador se elevan a un nivel indicativo de un estado de la enfermedad para que el tratamiento pueda comenzar. Alternativamente, un paciente que ha sido diagnosticado con una enfermedad puede ser supervisado para determinar la eficacia del medicamento (si está en tratamiento) o la progresión de la enfermedad (si la enfermedad es incurable), por ejemplo supervisando los niveles de antígenos asociados a desórdenes neurodegenerativos después de haberse diagnosticado un desorden neurodegenerativo.

HICS-FTMS se puede utilizar generalmente para caracterizar consecuencias toxicológicas de tratamientos con droga. Por ejemplo, un perfil de picos de HICS-FTMS se puede obtener de un objeto bajo prueba que experimenta un tipo particular de efecto secundario de la droga. Los perfiles de picos de cada droga conocida que produzca un efecto secundario substancialmente similar se pueden comparar para descubrir patrones que pueden probar el diagnóstico o una característica con un efecto secundario toxicológico particular. Este análisis puede ser extendido para caracterizar los efectos secundarios causados por las terapias de combinación cuyos perfiles de picos de HICS-FTMS pueden ser predictivos de combinaciones indeseables de la droga. Además, los perfiles de picos se pueden obtener para muchas diversas dosificaciones de una droga específica, así como para producir la capacidad predictiva con respecto a la dosificación apropiada.

El objeto bajo prueba puede ser seres humanos, animales de laboratorio, cultivos de célula, modelos de levadura, modelos bacterianos, sistemas sin células, u otros sistemas in vitro.

Los perfiles de picos pueden ser obtenidos analizando biopsias, explantes de tejidos, cultivos de célula, o fluídos corporales. Los marcadores toxicológicos no necesitan encontrarse en las células o los tejidos en los cuales la droga ejerce su efecto terapéutico. Por ejemplo, aunque una droga puede tener un efecto localizado, la toxicidad de la droga puede ser debido a sus metabolitos que se podrían encontrar en el hígado, la circulación sanguínea y/o la orina.

Dados los perfiles de picos de HICS-FTMS que caracterizan un efecto secundario particular, los picos específicos se pueden señalar como marcadores toxicológicos para ese efecto secundario. Estos marcadores pueden servir como método de diagnóstico rápido. Además, la identificación de estos marcadores puede dilucidar los caminos toxicológicos y así en últimas ser útil para el diseño de la terapéutica. Ciertos marcadores pueden estar presentes solamente en un subconjunto de temas, reflejando sensibilidades individuales a las medicaciones. Esta variabilidad en la sensibilidad de la droga se puede explotar para definir además los marcadores toxicológicos para diversos subgrupos.

La construcción de los perfiles de picos de HICS-FTMS en puntos de tiempo múltiples a través de un curso del tratamiento puede identificar etapas intermedias en un episodio toxicológico. Así, se pueden encontrar no sólo perfiles de picos característicos de HICS-FTMS para los puntos finales (efecto secundario contra ningún efecto secundario), sino que los perfiles de picos HICS-FTMS pueden permitir la identificación de varias etapas intermedias hacia cualquier punto final. Estas etapas intermedias perceptibles se podrían utilizar luego para supervisar efectos toxicológicos y su desaparición durante un régimen de tratamiento.

Una vez se haya creado una base de datos de espectros generados por HICS-FTMS a partir de las diversas respuestas de la droga, un perfil de picos de HICS-FTMS obtenido de un objeto bajo prueba expuesto a una droga novedosa o un nuevo régimen de tratamiento puede predecir efectos secundarios potencialmente adversos. Así, los tratamientos o las dosificaciones se podrían ajustar ante la administración.

La utilidad práctica de esta tecnología se puede ejemplificar por un curso de tratamiento para bajar el colesterol de suero. Muchas drogas se han utilizado en el tratamiento del colesterol alto de suero, incluyendo resinas enlazantes de ácido biliar (por ejemplo, colestiramina (Questran Light®, Bristol-Myers Squibb), clorhidrato del colestipol (Cotestid®, el Upjohn Company), estatinas (por ejemplo, lovastatina (Mevacor®, Merck & Co., Inc.), pravastatina (Pravachol®, Bristol-Myers Squibb Co.), atovastatina (Lipitor; Parke Davis)), ácido nicotínico, fibrato (por ejemplo, clofibrato (Atromid-S®. Laboratorios de Wyeth-Ayerst)), gemfibrozil (Lopid®, Parke-Davis), estrógeno oral, ácidos carboxícilicos con cadena larga (por ejemplo, ácidos \alpha,\omega-dicarboxílicos de cadena larga, ácidos, \beta,\beta,\beta',\beta'-tetrasubstituidos \alpha,\omega-alkanodioicos). Desafortunadamente, estos medicamentos se han asociado a efectos secundarios numerosos, incluyendo desórdenes gastrointestinales, deficiencias selectivas de vitamina, disfunción del hígado y de riñones, cáncer, enfermedad de la vesícula biliar, enfermedad tromboembólica, adenoma hepático, rabdomiólisis, presión arterial elevada, intolerancia a la glucosa, y hipercalcemia. Muchas otras moléculas que tienen actividad in vivo y/o in vitro, incluyendo los compuestos guías o iniciales para el desarrollo de la droga anti-hipercolesterolémica, nunca no se han explotado en los regímenes terapéuticos para una variedad de razones. Por lo tanto, hay una necesidad clara de desarrollar la terapéutica que carezca de efectos secundarios, y aún así que combate el colesterol alto de suero y las enfermedades que resultan de un metabolismo de lípidos indeseable.

Los perfiles de picos de HICS-FTMS se podrían obtener para cada régimen de tratamiento y para cada compuesto pre-clínico que tenga la actividad deseada. La comparación de los perfiles de picos entre tratamientos puede distinguir ciertos picos asociados a los efectos deletéreos de la droga. Estos picos distintivos pueden proporcionar una prueba para screening (investigación, tamizado o cribado y selección) de los compuestos ofrecidos para uso en el tratamiento del colesterol alto de suero que tienen efectos secundarios indeseados. Por otra parte, la identificación de los compuestos representados por estos picos puede proporcionar pistas para el diseño de la droga que evitaría efectos secundarios. La investigación adicional mediante HICS-FTMS del curso del tiempo del tratamiento de la droga puede revelar el modo de la acción o indicar puntos novedosos para una intervención.

Una estrategia similar a ésa propuesta para estudiar la toxicología de la droga se podría adaptar para las respuestas biológicas deletéreas a los agentes carcinógenos, a los venenos, y a la radiación. Los perfiles de picos característicos de respuestas a estos agentes se pueden determinar, comparar con las muestras no tratadas para identificar picos de marcador, y después usados para supervisar respuestas biológicas o tamizar o cribar desconocidos para agentes potencialmente adversos. Una vez que se identifiquen los picos característicos, un agente de prueba de características desconocidas se puede probar, por ejemplo para su carcinogenidad, determinando su grado, si hay alguno, al cual el agente puede aumentar o inhibir el o los picos de interés.

HICS-FTMS tiene la capacidad de caracterizar virtualmente todas las diferencias moleculares que ocurren entre las células y/o los tejidos normales y enfermos del mismo tipo, o entre las células tratadas con una molécula de prueba tal como una droga y sus contrapartes no tratadas. Los métodos de HICS-FTMS de la presente invención proporcionan mucha más información que los métodos para descubrimiento objetivos existentes tales como técnicas de la expresión del genoma o diferencial que se enfocan en la detección de cambios genotípicos y detectan cambios solamente de DNA o mRNA; por otra parte, proteómica no detecta droga o enfermedad objetivos no proteínicos, y por lo tanto se relaciona solamente con las proteínas codificadas por las secuencias particulares. No hay actualmente métodos disponibles por los cuales se pueden evaluar las diferencias en el contenido de metabolito de células. Por el contrario, los métodos de la presente invención permiten la detección de todos los tipos de droga o de enfermedad objetivos (target), en los cuales los objetivos podrían ser proteínas, péptidos pequeños, carbohidratos, ácidos nucleicos, metabolitos, o cualquier molécula que tenga una masa o una estructura capaz de ser detectada mediante FTMS. La información producida por HICS-FTMS se puede compilar en bases de datos, para usar como puntos de referencia en tamizajes o cribados futuros de HICS-FTMS, para comparaciones complejas de una gran cantidad de perfiles de picos.

Los métodos de la presente invención se pueden utilizar además para supervisar respuestas celulares o de organismos a la tensión y para identificar componentes clave que se pueden utilizar como objetivos para el descubrimiento de agentes que imitan o inhiban las respuestas de tensión. Según lo utilizado en la presente, por tensión se entiende cualquier tipo de efecto sobre el ambiente o sobre la integridad de una célula o de un organismo. Tales efectos incluyen pero no se limitan a temperaturas extremas, a tensión emocional (terror, choque), heridas, privación de nutrientes, respuestas metabólicas, infección con patógenos intracelulares y radicales del oxígeno.

Brevemente, los perfiles de picos de FTMS se obtienen para células u organismos en sus estados normales y en varios puntos de tiempo después de la exposición a una lesión. Los picos que están presentes en niveles significativamente más altos en las células dañadas son potenciales generadores de efectos de la respuesta celular o del organismo a la lesión. Una vez se ha identificado un generador de efectos, HICS-FTMS o el diseño racional de la droga se puede utilizar además en el descubrimiento de análogos/agonistas y antagonistas del generador de efectos. Si la respuesta es beneficiosa (por ejemplo, insecticidas naturales de vegetales producidos en respuesta al ataque de una peste), los análogos o agonistas del generador de efectos se pueden desarrollar para tratar o prevenir los efectos futuros. Si la respuesta es deletérea (por ejemplo, choque anafiláctico en respuesta a la mordedura de un insecto), los antagonistas del generador de efectos pueden ser desarrollados para prevenir la respuesta adversa después de los efectos futuros. Las drogas así identificadas se pueden probar en su eficacia para la modulación las respuestas de modelos animales que se exponen a los mismos efectos.

Ejemplos Métodos e instrumentación Aislamiento y prueba de las células primarias de Hepatocito de rata con Lovastatina

Una rata macho Sprague-Dawley fue anestesiada mediante administración de pentobarbitol de sodio en dosis de 50 mg/kg de la masa corporal con inyección intraperitoneal. La perfusión in situ del hígado fue realizada como sigue. El abdomen del animal fue abierto, la vena porta fue canulada y el hígado inundado con solución de WOSH (149 mM de NaCl, 9.2 mM de Na HEPES, 1.7 mM de fructosa, 0.5 mM de EGTA, 10 U/ml heparina, pH 7.5) en un caudal de 30 ml/min por 6 minutos. Para hacer digestión del hígado, la solución de DSC (6.7 mM de KCl, 143 mM de NaCl, 9.2 mM de Na HEPES, 5 mM de CaCl_{2}-2H_{2}O, 1.7 mM de fructosa, 0.2% BSA, 100 U/ml de colagenas tipo 1,80 U/ml, 160 BAEE/ml, de inhibidor de tripsina, pH 7.5) fue difundida a través del hígado en un caudal de 30 ml/min durante 6 minutos a una temperatura de 37ºC. Después de la digestión, las células fueron dispersadas en una solución de DMEM-(DMEM que contenía 2 mM de GlutMax-1, 0.2% BSA, el 5% FBS, 12 nM de insulina, 1.2 PM de hidrocortisona.) para parar el proceso de la digestión. La suspensión de la célula cruda fue filtrada a través de tres capas de un tamiz de acero inoxidable con tamaños de poro de 250, 106, y 75 \mum respectivamente. Las células filtradas fueron centrifugadas 50 x g durante minutos y se desechó el flotante. La bolita de la célula fue suspendida de nuevo en DMEM- y centrifugada otra vez. Esta bolita final de la célula fue suspendida de nuevo en la solución de DMEM+HS (DMEM que contenía 2 mM de GlutMax-1, 20 nM de ácido delta-aminolevulínico, 17.4 mM MEM de aminoácidos no esenciales, 20% FBS, 12 nM de insulina, 1.2 uM de hidrocortisona) y chapado para formar cultivos monocapas a una densidad de 100 x 103 células/cm^{2} sobre platos de cultivo recubiertos de colágeno. Cuatro horas después del chapado inicial, los medios fueron cambiados a SF-DMEM+ (DMEM que contiene 2 mM de GlutMax-1, 20 nM de ácido delta-aminolevulínico, 17.4 mM MEM de aminoácidos no esenciales, 12 nM de insulina, 1.2 PM de hidrocortisona) y dejados sobre células durante la noche.

Para evaluar los efectos de la lovastatina en las células de hepatocito, las células fueron expuestas a concentraciones crecientes que se extendían desde 0.03 a 30 PM durante 4 horas. Fueron expuestas células de control a los mismos medios que carecían lovastatina. Para preparar los medios que contenían lovastatina, una solución de lovastatina de 30 mM en dimetilsulfoxido fue preparada bajo condiciones asépticas. En un gabinete de seguridad biológica y estéril fue preparada la concentración de 30 PM diluyendo 1:1000 la formulación de solución de DMSO en SF-DMEM+. Fueron preparadas concentraciones más bajas mediante dilución de la solución de 30 PM con 0.1% de DMSO en SF-DMEM+. Para tratar las células, fueron quitados los medios y fueron agregados 100 PL por pozo de lovastatina formulada. Las células fueron incubadas por 4 horas a 37ºC en aire humedecido al 95% y 5% de ambiente de CO_{2}. Al terminar la incubación, los medios fueron retirados y extraídos sobre hielo con 2 volúmenes de metanol: agua: ácido acético (MeOH:DIW:HAc;49:49:2). Las células fueron extraídas 3 veces con 200 PL de cada uno de MeOH:DIW:HAc. Las sales fueron retiradas de ambos medios y de los extractos de célula con la resina catiónica AG® 50W-X9 (Bio-Bio-Rad laboratorios, Hércules, CA). Para retirar la resina, las muestras fueron centrifugadas a 1000 RPM y los flotantes fueron transferidos a los frascos de la muestra de HPLC.

FTMS de extractos de Hepatocitos de rata tratados con Lovastatina

Todas las mediciones fueron realizadas en un Bruker APEX II FTMS equipado con un magneto o imán de 7.0 Tesla. Los medios de cultivo y las células fueron extraídos por diversos solventes, transferidos a los frascos individuales de la muestra y puestos en una bandeja para automuestreo. Se usó un manejador de líquidos Gilson 215 para automuestreo de los 200 pozos. El control del Gilson 215 fue manejado a través del paquete XMAS S, que también actúa como la plataforma principal del software para controlar el espectrómetro FTMS. La detección total exacta fue realizada con el uso de calibración externa. El espectrómetro de masas fue calibrado antes de la corrida del automuestreo usando una mezcla de péptidos estándares. Los datos de masas exactos fueron luego analizados usando rutinas de Tcl/Tk, que buscan en serie los espectros de masas de cada pozo para la composición química de los productos metabólicos.

Resultados

Después de que los espectros exactos de FTMS fueran recogidos y analizados, el software de análisis de datos de HlCS-FTMS (descrito en la sección 5.3.1, supra) fue utilizado para seleccionar, comparar y analizar picos de los espectros. Las porciones de la muestra de los espectros generados se muestran en la fig. 4, con las puntas de flecha indicando los picos ejemplares cuyas intensidades fueron amplificadas con el tratamiento de lovastatina.

El software de análisis de datos de HICS-FTMS fue utilizado para analizar datos de los espectros de FTMS de muestras de los hepatocitos tratados con diversas concentraciones de lovastatina. 82 picos de baja masa molecular fueron seleccionados y además analizados en el formato gráfico, el cual se representa como la intensidad relativa del pico en cada concentración de lovastatina (normalizada frente a mediciones obtenidas de animales no tratados vs. la concentración en PM (véase fig. 5a-5h). LOWESS, un procedimiento robusto de ajuste local, fue utilizado para realizar el ajuste lineal y no lineal de la curva. La regresión logística también fue utilizada para refinar el ajuste de curva y para proporcionar medidas estadísticas exactas; la regresión linear también se puede utilizar para este propósito.

Algunos gráficos mostraron una buena correlación entre la concentración de lovastatina y la intensidad relativa, mientras que otros mostraron poca correlación. Los gráficos que muestran poca o ninguna correlación pueden ser artifactuales y son de poco interés en este punto. Las moléculas de significancia práctica son aquellas que muestran una correlación fuerte entre la concentración de la droga y la intensidad relativa. Tales picos de interés pueden aumentar o disminuir linealmente o sigmoidalmente con la concentración de la droga. Estos picos se pueden considerar los más relevantes para la actividad terapéutica, los efectos tóxicos y/u otros efectos biológicos en ese contexto.

Un aspecto del resultado digno de observación es la sensibilidad de FTMS en la separación de picos en este sistema celular complejo. Por ejemplo, fueron identificados dos picos en las masas moleculares de 85.02815 y 85.64405, una diferencia en masa de 0.7%. Mientras que el pico en la masa molecular 85.02815 mostró una tendencia decreciente al aumentar las concentraciones de lovastatina, el pico en la masa molecular 85.64405 mostró una tendencia creciente. Claramente y de dos diversas maneras fueron afectadas por la droga dos moléculas de masas moleculares distintas pero cercanas y estas diferencias fueron resueltas con éxito por HICS-FTMS.

Discusión

Los datos demuestran la detección de cambios tanto dependientes del tratamiento como independientes del tratamiento en componentes intracelulares y extracelulares. La abundancia de compuesto parental y de varios metabolitos se correlaciona con las variaciones en la abundancia de otras moléculas pequeñas presentes en los pozos. Además, la exactitud de masa demostrada para cada una de las muestras (< 2 ppm) proporciona información inequívoca sobre la estructura y las fórmulas de los productos metabólicos.

Aplicaciones de HICS-FTMS para la supervisión de respuestas biológicas en suero

Tres ratas fueron tratadas diariamente con 100 mg/kg de 6-(6-hidroxi-5,5-dimetilhexiloxi)-2,2-dimetilhexan-1-ol mediante alimento forzado oral, en el curso de una semana. El 6-(6-hidroxi-5,5-dimetilhexiloxi)-2,2-dimetilhexan-1-ol aumenta el colesterol HDL y mejora la utilización de la glucosa en ratas experimentales (véase la solicitud estadounidense con número de serie 09/540.738, presentada marzo 31.2000). Al final de la semana, se sacó la sangre de cada una de las tres ratas, como también de las tres ratas (no tratadas) de control. Se dejo coagular la sangre y se preparó el plasma para FTMS agregando una solución de agua y metanol (49:49:2, agua:metanol:ácido acético v:v:v) para cada una de las preparaciones del plasma. La mezcla fue enfriada para precipitar las proteínas al fondo del tubo. Cada tubo fue centrifugado, decantado el flotante y la muestra desalinizada agregando aproximadamente 100 mg de resina de intercambio iónico DOWEX a cada frasco e incubando la muestra con la resina durante aproximadamente 10 minutos. La muestra fue centrifugada luego y el flotante retirada. Esta solución fue introducida luego al espectrómetro de masas FT.

Una región seleccionada de perfil de picos para las muestras se muestra en la fig. 6. La FIG. 6A-C muestra espectros de las muestras derivadas del plasma de ratas no tratadas, mientras que la FIG. 6D-F muestra espectros de las muestras derivadas del plasma de las ratas tratadas con 6-(6-hidroxi-5,5-dimetilhexiloxi)-2,2-dimetilhexan-1-ol. Por lo menos dos picos correspondientes a las moléculas de masa molecular de aproximadamente 766.4 y 766.8 Daltons tienen intensidades reproducibles más altas en los espectros de las muestras derivadas del plasma de las ratas tratadas con 6-(6-hidroxi-5,5-dimetilhexiloxi)-2,2-dimetilhexan-1-ol.

Este experimento demuestra la utilidad de los métodos de la invención en screening (tamizado o cribado y selección) para marcadores de respuestas biológicas a las drogas en el material biológico obtenido de tejido mamífero.

Identificación de novedosas drogas antidiabéticas

a Resistencia a la insulina y la prevalencia del síndrome X está aumentando en la población. El agrupamiento de la resistencia a la insulina, la hipertensión, la hipertrigliceridemia y el colesterol HDL de plasma bajo son sellos del Síndrome X (Comicelli, 1997, Atherosclerosis 2(2):43-49).

Varias drogas están disponibles para tratar pacientes con síndrome X, incluyendo drogas de sulfonilurea, biguanidas y derivados de TZD. Las drogas de sulfonilurea son toleradas razonablemente bien, pero después de varios años de tratamiento la capacidad de las drogas para controlar la glucosa disminuye notablemente. Las biguanidas se utilizan ampliamente pero pueden inducir efectos secundarios serios, por ejemplo, acidosis láctica y desórdenes gastrointestinales. Los derivados de TZD inducen aumento del peso corporal y falla del hígado. Las drogas que están actualmente en desarrollo para el tratamiento de los desórdenes relacionados con el síndrome X son, por prevalencia, ligandos receptores/activadores nucleares. Varios estudios in vitro e in vivo han demostrado que los agonistas PPAR\gamma reducen los triglicéridos y aumenta la sensibilización a la insulina.

Los TZDs y los activadores PPAR\gamma

Otras drogas útiles para tratar el síndrome X -mediante la regulación del colesterol y de la bilis, de la función de adipocita y el metabolismo de la glucosa activan otros receptores nucleares, por ejemplo, RXR (receptor de ácido retinoico), FXR (receptor del ácido biliar), LXR (receptor del oxisterol).

Los cultivos de hepatocita, enterocita, adipocita y de células humanas de músculo se tratan independientemente con (i) compuestos útiles para manejar por lo menos un aspecto del síndrome X en seres humanos (por ejemplo, drogas eficaces en disminuir triglicéridos y colesterol LDL así como también aumentar el HDL, por ejemplo, fenofibrato, bezafibrato y gemfibrozil); (ii) compuestos conocidos por ser activos in vitro y por haber sido validados en un modelo animal pero no han sido desarrollados para el uso humano (FMOC-L-Leucine, descrito por ser un activador de PPAR\gamma en el XII simposio internacional de Estocolmo sobre ateroesclerosis; ácido retinoico y 6-(6-hidroxi-5.5-dimetilhexiloxi)-2.2-6-(6-hidroxi-5,5-dimetilhexiloxi)-2,2-dimetil-hexan-1-ol); y (iii) compuestos cuya actividad se ha establecido in vitro pero para los cuales todavía no se han desarrollado modelos animales.

Usando los screens (cribado o tamizaje) de HICS-FTMS múltiples descritos en la presente, los perfiles de picos son de muestras derivadas de contenidos de células y de flotantes celulares, de células expuestas individualmente; arriba se han descrito miembros múltiples de cada clase de los compuestos, preferiblemente en triplicado, preferiblemente usando diferentes tipos de célula y preferiblemente cada uno en un rango de concentraciones y un rango de períodos de incubación para cada compuesto. Los perfiles de pico dentro de cada clase de compuestos y entre las clases de compuestos se comparan para cada tipo de la célula.

Se identifican y se caracterizan los picos que están comúnmente presentes en muestras preparadas de células en contactadas para fibratos, glitazonas y biguanidas.

Se identifican y se caracterizan los picos que son comunes para el ácido retinoico, especialmente 24232, FMOC-L-fMOC-L-Leucine.

Preferiblemente, se identifican los picos que están comúnmente presentes o ausentes en perfiles de picos de muestras derivadas de células tratadas con todas las tres clases de drogas.

Después de que se identifican los picos comunes, los animales modelo experimentales (las ratas de Zucker, el modelo de rata diabética (inyección de estreptozotocina), los ratones ob/ob, hámster sirios tratados con estreptozotocina (que tienen proteína de transferencia del éster de colesterol de CETP, esencial para el metabolismo de HDL, presente en el hombre y ausente en ratas y ratones)) se tratan durante 2 a 4 semanas con drogas diferentes, y muestras de sangre se toman en diversos puntos de tiempo y se analizan mediante FTMS según lo descrito en la sección 7, supra. Los picos en los diversos espectros de masas se comparan. Una vez más los picos comunes a todas las drogas se caracterizan.

Una colección de compuestos (de bibliotecas combinatorias y de bibliotecas comercialmente disponibles) se incuba con diferentes líneas celulares humanas (adipocitos, hepatocitos, enterocitos, células de los músculos).

El contenido y los sobreflotantes de la célula son analizados mediante FT-MS. Se comparan los compuestos que aumentan picos similares como moléculas de referencia en células y animales y se determinan las relaciones de la estructura con la actividad. Las moléculas se comparan usando software de cómputo químico tal como Catalyst (MSI). Se identifican los farmacóforos y se generan las hipótesis.

Las hipótesis se utilizan luego para screen (tamizado o cribado y selección) de la biblioteca virtual de compuestos. Los más activos son probados luego en animales en un proceso iterativo.

Pruebas de farmacóforos/generación de hipótesis, síntesis de nuevas entidades químicas, identificación de los compuestos más activos. Los compuestos novedosos identificados de este modo son compuestos guía o iniciales para el desarrollo de la droga.

Claims (39)

1. Un método para identificar unas o más moléculas que se diferencian en abundancia entre una primera población de células y una segunda población de células, que comprende: (a) comparar un primer perfil de picos de Espectrometría de Masas por Transformadas de Fourier (FTMS, por sus siglas en inglés) obtenido de la primera población de células con un segundo perfil de picos de FTMS obtenido de la segunda población de células, en donde el primer perfil de picos y el segundo perfil de picos no se obtienen de manera concurrente y en donde la primera y la segunda poblaciones de células no contienen una etiqueta; y (b) identificar uno o más picos que se diferencian en intensidad en el primer perfil de picos de FTMS con relación al segundo perfil de picos de FTMS, en el cual uno o más picos corresponden a una o más moléculas que se diferencian en abundancia entre una primera población de células y una segunda población de células, identificando así una o más moléculas que se diferencian en abundancia entre una primera población de células y una segunda población de células.

2. Un método para identificar unas o más moléculas que se diferencian en abundancia entre una primera población de células y una segunda población de células, que comprende: (a) comparar un primer perfil de picos de Espectrometría de Masas por Transformadas de Fourier (FTMS, por sus siglas en inglés) obtenido de la primera población de células con un segundo perfil de picos de FTMS obtenido de la segunda población de células, en donde el primer perfil de picos y el segundo perfil de picos se obtienen independientemente; y (b) identificar uno o más picos que se diferencian en intensidad en el primer perfil de picos de FTMS con relación al segundo perfil de picos de FTMS, en el que uno o más picos corresponden a una o más moléculas que se diferencian en abundancia entre una primera población de células, en donde las moléculas que se diferencian en abundancia se seleccionan del grupo de lípidos, de ácidos nucleicos, de carbohidratos, de metabolitos o de moléculas pequeñas.

3. El método de la reivindicación 2, en el cual las moléculas que se diferencian en abundancia son moléculas pequeñas de menos de 2500 Daltons.

4. El método de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además: (c) antes del paso (a), obtener el primer perfil de picos de FTMS de la primera población de células sometiendo dicha primera población de células a FTMS.

5. El método de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además: (c) antes del paso (a), obtener el segundo perfil de picos de FTMS de la segunda población de células sometiendo dicha segunda población de células a FTMS.

6. El método de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la primera población de células es una población de células de referencia y la segunda población de células es una población de células bajo prueba.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la primera y la segunda población de células son de diferentes tipos de células.

8. El método de la reivindicación 7, en donde la primera y la segunda poblaciones de células son de diferentes tipos de tejido del mismo organismo.

9. El método de la reivindicación 7, en donde la primera y la segunda poblaciones de células son del mismo tipo de tejido de organismos diferentes.

10. El método de la reivindicación 6, en donde la primera y la segunda poblaciones de células son del mismo tipo de células.

11. El método de la reivindicación 10, en donde la primera población de células es una población normal de células y la segunda población de células es una población enferma de células.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la población enferma de células es una población de células cancerosas.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la población de células cancerosas es una población de células de melanoma, leucemia mieloide o carcinoma.

14. El método de la reivindicación 13, en donde el carcinoma es de pulmón, pecho, ovarios, colon, riñón, próstata, páncreas, estómago, cerebro, del sistema linfático, timo, tiroides, suprarrenales o testículo.

15. El método de la reivindicación 11, en donde la población de células enfermas es de un individuo con enfermedad cardiovascular.

16. El método de la reivindicación 15, en donde la población de células enfermas es una población de cardiomiocitos, de células endoteliales, de macrófagos, de hepatocitos, de adipocitos, de células de músculo liso o de células intestinales.

17. El método de la reivindicación 11, en donde la población de células enfermas es de un individuo con diabetes.

18. El método de la reivindicación 17, en donde la población de células enfermas es una población de cardiomiocitos, de células endoteliales, de macrófagos, de células pancreáticas, de hepatocitos, de adipocitos, de células del músculo liso o de células intestinales.

19. El método de la reivindicación 11, en donde la población de células enfermas es de un individuo obeso.

20. El método de la reivindicación 19, en donde la población de células enfermas es una población de cardiomiocitos, de células endoteliales, de macrófagos, de células pancreáticas, de hepatocitos, de adipocitos, de células del músculo liso o de células intestinales.

21. El método de la reivindicación 10, en donde la primera población de células no se ha sometido a un agente de prueba y la segunda población de células se ha sometido al agente de prueba.

22. El método de la reivindicación 21, en donde el agente de prueba es una droga conocida.

23. El método de la reivindicación 21, en donde el agente de prueba es un candidato a droga.

24. El método de la reivindicación 22 o 23, en donde el agente de prueba es una molécula pequeña.

25. El método de la reivindicación 22 o 23, en donde el agente de prueba es una proteína.

26. El método de la reivindicación 25, en donde la proteína es una hormona, un factor de crecimiento, una citoquina, un ligando o un anticuerpo.

27. El método de la reivindicación 22 o 23, en donde el agente de prueba es un ácido nucleico.

28. El método de la reivindicación 27, en donde el ácido nucleico es un ácido nucleico de antisense, un ácido nucleico de triple hélice, o una ribozima.

29. El método de la reivindicación 27, en donde el ácido nucleico es un DNA, un RNA, o un híbrido de DNA-RNA.

30. El método de la reivindicación 6, en donde el primer perfil de picos de FTMS es un control histórico.

31. El método de la reivindicación 6, en donde el primer perfil de picos de FTMS es un control concurrente.

32. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la primera y la segunda poblaciones de la célula son poblaciones de células primarias de un tejido o de un órgano.

33. El método de la reivindicación 32, en donde en las células primarias son células del cerebro, de la piel, del pulmón, endoteliales, epiteliales, adiposas, del músculo, del hueso, del estómago, del colon, del bazo, del páncreas, del riñón, de la vejiga, del corazón, del sistema linfático, de la sangre o del hígado.

34. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en donde el primer perfil de picos y el segundo perfil de picos se obtienen de extractos enteros de células.

35. El método de la reivindicación 34, en donde el extracto entero de células es un extracto de células extraído con solventes.

36. El método de la reivindicación 34, en donde el extracto entero de la célula es desalinizado.

37. El método de la reivindicación 34, que abarca adicionalmente: (c) antes del paso (a), obtener el primer perfil de picos de FTMS de la primera población de células sometiendo dicha primera población de células a FTMS.

38. El método de la reivindicación 34, que comprende además: (c) antes del paso (a), obtener el segundo perfil de picos de FTMS de la segunda población de células sometiendo dicha segunda población de células a FTMS.

39. El método de la reivindicación 34, en donde la primera población de células es una población de células de referencia y la segunda población de células es una población de células bajo prueba.