KR20110091718A

KR20110091718A - 질량 분석법을 이용하여 미생물을 분리하고/하거나 특성규명하고/하거나 동정하는 방법

Info

Publication number: KR20110091718A
Application number: KR1020117012421A
Authority: KR
Inventors: 존스 히맨; 브래드포드 클래이; 존 월쉬; 서먼 소프
Original assignee: 바이오메리욱스, 인코포레이티드.
Priority date: 2008-10-31
Filing date: 2009-10-30
Publication date: 2011-08-12
Also published as: BRPI0919896A2; US20140186879A1; CA2741019C; US10415075B2; AU2009320335B2; CA2741019A1; RU2519650C2; JP5509213B2; US9790534B2; WO2010062354A1; RU2011114901A; MX2011004108A; EP2350667B1; US20100120085A1; CN102317789B; CN102317789A; EP2350667A1; AU2009320335A1; ES2538497T3; JP2012507711A

Abstract

본 발명은 시험 샘플에서 미생물을 분리, 특성규명 및/또는 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 시험 샘플에 존재할 수 있는 비-미생물 세포를 용해하기 위한 임의적 용해 단계에 이은 후속 분리 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 혈액 함유 배양 배지와 같은 복잡한 샘플로부터 미생물을 분리, 특성규명 및/또는 동정하기 위해 유용할 수 있다. 또한, 본 발명은 질량 분석법에 의해 분리된 미생물 샘플을 조사하여 미생물의 질량 스펙트럼을 산출하고, 이렇게 수득된 질량 스펙트럼을 이용하여 샘플내의 미생물을 특성규명 및/또는 동정하는 것을 제공한다.

Description

질량 분석법을 이용하여 미생물을 분리하고/하거나 특성규명하고/하거나 동정하는 방법{METHODS FOR SEPARATION, CHARACTERIZATION AND/OR IDENTIFICATION OF MICROORGANISMS USING MASS SPECTROMETRY}

관련 출원의 상호 참조

본원은 2008년 10월 31일에 출원된 발명의 명칭이 "Method and System for Detection and/or Characterization of a Biological Particle in a Sample"인 미국 특허 가출원 번호 61/110,187을 우선권으로 주장하며, 상기 가출원은 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 샘플내의 미생물을 검출하고/하거나, 단리하고/하거나 동정하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 질량 분석법을 이용하여 미생물을 신속히 특성규명하고/하거나 동정하는 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

생물학적 유체에서 병원성 미생물을 검출하는 것은 가능한 최단 시간내에 수행되어야 하는데, 특히 의사가 이용할 수 있는 항생제가 풍부함에도 불구하고 사망률이 여전히 높은 패혈증(septicemia)의 경우에 그러하다. 환자의 체액, 특히 혈액내에 미생물과 같은 생물학적 활성 물질이 존재한다는 것은 일반적으로 혈액 배양병을 사용하여 결정된다. 혈류 감염은 높은 이환율 및 사망률과 관련되지만, 배양에 이은 생화학적 동정과 항생제 민감도 시험으로 구성된 현재의 진단 방법은 그 실행에 수 일이 소요될 수 있다. 전형적으로, 임상 증상을 토대로 하여 경험적 치료(empiric therapy)가 시작되고, 시험 결과는 최초 치료가 실패한 경우 임상적 결정에 영향을 미칠 뿐이다. 양성 혈액 배양 결과 후 최초 수 시간 이내에, 바람직하게는 1시간 이내에 혈류 감염을 특성규명하는 능력은, 제공되는 진단 정보의 임상적 타당성을 현저히 증강시킬 것이다. 분자 증폭 방법이 이러한 요구를 충족시키기 위해 제안되었지만, 이러한 방법은 여전히 심각한 문제점을 안고있다. 양성 혈액 배양 브로쓰(broth) 그 자체는 다양한 신속 동정(ID) 시험에 사용될 수 있는 잠재성을 지닌 천연적으로 증폭된 미생물 개체군을 나타낸다.

Vitek^®, Phoenix™ 및 Microscan^® 시스템과 같은 통상적인 자동 표현형 ID 시험, 또는 API와 같은 수동 표현형 시험은 확실한 결과를 제공하기 위해 미생물이 적절한 증식 시기에 있고 간섭성(interfering) 배지 및 혈액 생성물이 없을 것을 요구한다. 이러한 시스템은 평판 배지상에서 18 내지 24시간 동안 양성 브로쓰로부터 증식된 콜로니를 사용한다. 그러나, 보다 신속한 결과를 얻기 위해, 일부 실험실은 양성 혈액 배양병으로부터 단리된 미생물과 함께 이러한 시스템들을 사용하여 연구를 보고해왔다. 이러한 병으로부터의 직접 시험(direct-from-the-bottle test)은 모든 미생물에 대해 적합하지 않고 (예를 들어, 그람 양성 구균), 시험 업체에 의해 인증되지 않고, 결과가 나오는 데에 일반적으로 3 내지 8시간이 소요된다. 양성 배양 결과 후 최초 수 시간 이내에, 바람직하게는 1시간 이내에 의사에게 임상적으로 타당한 결과를 제공하기 위해 보다 신속하고 더욱 광범위하게 특이적인 시험이 긴급히 필요한 실정이다.

질량 분석 방법은 미생물을 매우 신속히 동정할 수 있는 가능성을 지니지만, 액체 미생물 배양 배지 그리고 혈액 또는 이의 배합물과 같은 임상 샘플에 존재하는 다수의 화합물로부터 간섭을 받을 수 있다. 양성 혈액 배양 브로쓰로부터 직접 미생물을 회수하기 위해 가장 보편적으로 사용되는 방법은 투-스텝(two-step) 분별 원심분리 및 혈청 분리 튜브에서의 원심분리이다.

미생물을 분리하고/하거나, 특성규명하고/하거나 동정하기 위한 다른 방법들이 공지되었고, 그 예는 다음과 같다:

미국 특허 번호 6,177,266에는 세포의 단백질 추출물 또는 전세포(whole cell)의 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행시간 질량 분석법(MALDI-TOF-MS)에 의해 생성된 속, 종 및 균주 특이적 바이오마커(biomarker)를 사용하여 세균을 화학적으로 분류하는 방법이 개시되어 있다.

미국 특허 번호 7,070,739에는 체액 또는 균질화된 조직으로부터 직접적으로 2차원 초원심분리에 의해 바이러스를 포함하는 미생물을 추출하고, 분리하고, 정제하는 방법이 제공되어 있다. 첫 번째 원심분리 단계에서는 동정하고자 하는 미생물의 침강 속도 보다 높은 침강 속도를 지닌 모든 입자를 제거한다. 두 번째 초원심분리 단계에서는 채워진 액체 중에서 등밀도 밴딩(isopycnic banding)을 사용함으로써 특수한 톱니형(serrated) 원심분리 튜브에 의해 광범위한 밀도 구배를 형성한다. 상기 특허에 따르면, 핵산 특이적 염료를 사용하여 광산란 또는 형광에 의해 밴딩된(banded) 입자를 검출하기 위해 그리고 바이러스 단백질 서브유닛과 무손상 바이러스 입자의 질량 분석법에 의한 특성규명 및 제한 효소에 의해 생성된 단편들의 덩어리 및 핵산 덩어리 둘 모두의 형광 유세포 분석 측정에 의한 특성규명을 위해 매우 적은 부피로 밴딩된 입자를 회수하기 위해, 분리 기법이 사용될 수 있다.

미국 특허 출원 공개 번호 2007/0175278에는, 예를 들어 혈액, 소변, 대변, 정맥내 카테터 등, 산업용 생산 라인, 수도 시설(water system), 식품, 향장품(cosmetic product), 약제 제품 및 법의학 샘플을 포함하는 관심있는 샘플을 배양하기 위한 액체 배양 배지를 사용하는 것이 기재되어 있다. 후속하여, 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어 원심분리에 의해 액체 배지로부터 미생물을 수거할 수있다. 그 후, 진동 스펙트럼을 수득하기 위해, 임의로 건조 후에, 농축된 미생물을 담체 물질에 전달할 수 있다. 상기 특허 출원에는 라만 분광법과 같은 진동 분광법을 포함하는, 미생물을 동정하고 분류하기 위한 다양한 방법이 논의되어 있다.

그러나, 이러한 방법들은 혈액 함유 배양 배지와 같은 복잡한 샘플로부터 미생물을 분리하고 특성규명하려고 하는 경우 여러 결점들을 지닌다. 생성된 미생물 제조물(preparation)은 종종 오염성 적혈구, 혈소판, 지질 입자, 혈장 효소 및 세포 파편(cellular debris)을 함유하는데, 이는 불량한 결과를 초래할 수 있다. 이러한 방법들은 또한 매우 많은 노동력을 필요로 하고 잠재적으로 위험한 병원체를 사용자에게 에어로졸 노출시킬 수 있는 단계들로 인해 안전하지 않다. 이렇게 간섭하는 물질이 없고 신속한 동정 기술에 적합한 혈액 배양 브로쓰 및 다른 복잡한 샘플로부터 미생물을 단리하기 위한 간단하고 안전하며 신뢰할 수 있는 방법이 필요한 실정이다.

발명의 개요

본 발명은 샘플내의 미생물을 단리하고/하거나, 특성규명하고/하거나 동정하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 종래의 기술에 비해 더욱 신속히 미생물을 특성규명하고/하거나 동정할 수 있게 함으로써, 진단 (예를 들어, 패혈증에 걸렸거나 걸린 것으로 의심되는 피검체의 경우) 그리고 오염된 재료의 확인 (예를 들어, 음식물 및 약제)이 보다 신속히 이루어지게 한다. 샘플을 수득하는 것에서부터 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 것에 이르기까지 본 발명에 포함되는 단계들은 임상적으로 타당한 유용한 정보를 산출하기 위해 매우 짧은 시간 범위내에서, 예를 들어 약 120분 미만의 시간 범위내에서 수행될 수 있다.

한 가지 양태에서, 본 발명은 시험 샘플로부터 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,

(a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 시험 샘플을 수득하는 단계;

(b) 상기 시험 샘플에서 비-미생물 세포(non-microorganism cell)를 선택적으로 용해시켜서 용해된 샘플을 생성시키는 단계;

(c) 상기 용해된 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 분리하여 단리된 상기 미생물 샘플을 형성하는 단계;

(d) 상기 단리된 상기 미생물 샘플을 질량 분석법에 의해 조사(interrogating)하여 상기 미생물의 질량 스펙트럼을 획득하는 단계; 및

(e) 상기 측정된 질량 스펙트럼을, 공지된 미생물의 세포 성분들의 공지되거나 예측된 질량 및/또는 기준 질량 스펙트럼과 비교함으로써 상기 단리된 샘플내의 상기 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 혈액 배양물로부터 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,

(a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 혈액 배양물로부터 샘플을 수득하는 단계;

(b) 상기 시험 샘플에서 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시켜서 용해된 샘플을 생성시키는 단계;

(c) 밀폐 용기내에서 상기 용해된 샘플을 밀도 쿠션(density cushion)상에 층 형태로 까는 단계;

(d) 상기 용기를 원심분리함으로써 상기 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 분리하여 미생물의 펠릿(pellet)을 형성하는 단계;

(e) 상기 단리된 미생물 샘플을 질량 분석법에 의해 조사하여 상기 미생물의 질량 스펙트럼을 획득하는 단계; 및

(f) 상기 측정된 질량 스펙트럼을, 공지된 미생물의 세포 성분들의 공지되거나 예측된 질량 및/또는 기준 질량 스펙트럼과 비교함으로써 상기 단리된 샘플내의 상기 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은,

(b) 상기 시험 샘플을 용기내의 밀도 쿠션상에 층 형태로 까는 단계;

(c) 상기 용기를 원심분리함으로써 상기 시험 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 분리하여 미생물의 펠릿을 형성하는 단계;

(d) 상기 펠릿을 질량 분석법에 의해 조사하여 상기 미생물의 질량 스펙트럼을 획득하는 단계; 및

한 가지 구체예에서, 용기내에서 밀도 쿠션상에 시험 샘플을 층 형태로 깔고 상기 용기를 원심분리하여 미생물을 펠릿화함으로써 분리가 수행되는 동안 시험 샘플 배지는 상기 밀도 쿠션의 상부에 남아 있게 된다.

한 가지 구체예에서, 본 발명의 방법은 미생물 펠릿을 회수하고, 미생물을 재현탁시키고, 질량 분석기내로 도입하기 위해 현탁액으로부터 샘플을 분리하고, 샘플에 대해 질량 분석을 수행하는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 미생물 펠릿을 회수하고 미생물을 재현탁시키고 추가의 동정 또는 특성규명 시험 (예를 들어, 약물 내성, 독성 인자, 안티바이오그램(antibiogram))을 수행하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명은 첨부된 도면 및 하기 제시된 기재사항을 통해 보다 상세히 설명된다.

도 1은 혈액 배양물로부터 처리되고 회수된 다양한 미생물의 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 2는 혈액 배양 브로쓰로부터 처리되고 회수된 5개의 스태필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)의 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 3은 본 발명에 따라 아가 플레이트로부터 직접 유래된 대장균과 혈액 배양 브로쓰로부터 처리된 대장균의 질량 스펙트럼을 비교한 도면이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 다양한 형태로 구체화될 수 있는데, 본원에 제시된 구체예들로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 그 보다는 이러한 구체예들은 본원의 기재내용이 면밀하고 완전해지도록 하기 위해 제공되며, 당업자에게 본 발명의 범위를 충분히 전달해줄 것이다. 예를 들어, 하나의 구체예에 관해 예시되는 특징들은 다른 구체예들에 포함될 수 있고, 특정 구체예에 관해 예시되는 특징들은 그러한 구체예로부터 삭제될 수 있다. 또한, 본 발명을 벗어나지 않는 본원에 제시된 구체예들에 대한 다수의 변화 및 추가사항이 본 기재내용에 비추어 볼 때 당업자에게 명백할 것이다.

달리 규정되지 않는 한 본원에 사용된 모든 과학 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 보편적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 지닌다. 본 발명의 설명에서 사용되는 전문용어는 특정 구체예들을 설명하기 위한 것일 뿐이며 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.

정의.

본원에서 단수 형태로 사용되는 경우 1개 또는 1개를 초과함을 의미할 수 있다. 예를 들어 "세포"라는 것은 하나의 세포를 의미하거나 다수의 세포를 의미할 수 있다.

또한, 본원에서 "및/또는" 또는 "하고/하거나"는 열거된 관련 사항들 중 어느 하나 또는 하나 이상의 모든 가능한 조합을 지칭하고 이를 포함하며, 택일적 ("또는")으로 해석되는 경우에는 조합을 포함하지 않는다.

또한, 본 발명의 화합물 또는 물질의 양(amount), 용량(dose), 시간, 온도 등과 같은 측정가능한 값을 지칭하는 경우에 "약"이라는 용어는 규정된 양의 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.5%, 또는 ±0.1% 변동을 포함하고자 한다.

본원에 사용되는 용어 "미생물"은 실험실에서 증식시키고 취급할 수 있는 일반적으로 단세포인 생물체를 포함하도록 의도되는데, 이의 예로는 비제한적으로 그람 양성 또는 그람 음성 세균, 효모, 곰팡이(mold), 기생충 및 몰리큐트(mollicute)가 있다. 본 발명의 그람 음성 세균의 비제한적 예로는 하기 속의 세균이 있다: 슈도모나스(Pseudomonas), 에스케리치아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 엔테로박터(Enterobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 세라티아(Serratia), 프로테우스(Proteus), 캄필로박터(Campylobacter), 헤모필루스(Haemophilus), 모르가넬라(Morganella), 비브리오(Vibrio), 예르시나(Yersinia), 아시네토박터(Acinetobacter), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 브레분디모나스(Brevundimonas), 랄스토니아(Ralstonia), 아크로모박터(Achromobacter), 푸소박테리움(Fusobacterium), 프레보텔라(Prevotella), 브란하멜라(Branhamella), 나이세리아(Neisseria), 부르콜데리아(Burkholderia), 시트로박터(Citrobacter), 하프니아(Hafnia), 에드워드시엘라(Edwardsiella), 에어로모나스(Aeromonas), 모락셀라(Moraxella), 브루셀라(Brucella), 파스퇴렐라(Pasteurella), 프로비덴시아(Providencia) 및 레지오넬라(Legionella). 본 발명의 그람 양성 세균의 비제한적 예로는 하기 속의 세균이 있다: 엔테로코쿠스(Enterococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스태필로코쿠스(Staphylococcus), 바실루스(Bacillus), 페니바실루스(Paenibacillus), 락토바실루스(Lactobacillus), 리스테리아(Listeria), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 클로스트리디움(Clostridium), 박테로이즈(Bacteroides), 가르드네렐라(Gardnerella), 코쿠리아(Kocuria), 락토코쿠스(Lactococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 미크로코쿠스(Micrococcus), 미코박테리아(Mycobacteria) 및 코리네박테리아(Corynebacteria). 본 발명의 효모 및 곰팡이의 비제한적 예로는 하기 속의 것들이 있다: 칸디다(Candida), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 노카르디아(Nocardia), 페니실리움(Penicillium), 알테르나리아(Alternaria), 로도토룰라(Rhodotorula), 아스페르길루스(Aspergillus), 푸사리움(Fusarium), 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 트리코스포론(Trichosporon). 본 발명의 기생충의 비제한적 예로는 하기 속의 것들이 있다: 트리파노소마(Trypanosoma), 바베시아(Babesia), 리슈마니아(Leishmania), 플라스모디움(Plasmodium), 우체리아(Wucheria), 브루기아(Brugia), 온코세르카(Onchocerca) 및 네글레리아(Naegleria). 본 발명의 몰리큐트의 비제한적 예로는 하기 속의 것들이 있다: 미코플라스마(Mycoplasma) 및 우레아플라스마(Ureaplasma).

한 가지 구체예에서, 본원에 추가로 상세히 설명되는 바와 같이, 샘플에 존재하는 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하기 위해 샘플 또는 증식 배지로부터의 미생물이 분리되고 조사될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "분리하다"는 본래의 상태로부터 이동되거나 농축되거나 다른 방식으로 따로 떨어져 있게 된 임의의 미생물 샘플을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 발명에 따르면, 미생물은, 존재하는 경우 특성규명 및/또는 동정을 간섭할 수 있는 비-미생물 또는 비-미생물 성분들로부터 분리될 수 있다 (예를 들어, 분리된 샘플로서). 이러한 용어는 2개의 다른 층들 사이에 샌드위치된 미생물 층, 예를 들어 원심분리 후에 고밀도 쿠션의 상부에 응집된 미생물, 또는 고체 표면 (예를 들어, 필터 막)에 응집된 미생물 층을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 용어는 층 (예를 들어, 밀도 쿠션)을 부분적으로 통과한 미생물들의 응집체(collection)를 포함할 수 있다. 이와 같이, 분리된 미생물 샘플은 본래의 샘플에 비해 더욱 농축된 상태이거나 다른 방식으로 본래의 샘플과 따로 떨어져 있는 미생물들의 임의의 응집체 또는 층 및/또는 이의 성분들을 포함할 수 있고, 이는 미생물들의 단단히 뭉쳐진 조밀한 덩어리에서부터 미생물들의 확산층(diffuse layer)에 이르는 범위로 존재할 수 있다. 분리된 형태 또는 샘플에 포함될 수 있는 미생물 성분들은 비제한적으로 임의의 조합된 형태의 필리(pilli), 플라젤라(flagella), 핌브리애(fimbriae), 및 캡슐(capsule)이 있다. 미생물로부터 분리되는 비-미생물 성분들은 비-미생물 세포 (예를 들어, 혈액 세포 및/또는 다른 조직 세포) 및/또는 이들의 임의의 성분들을 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본원에 추가로 상세히 설명되는 바와 같이, 샘플에 존재하는 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하기 위해 샘플 또는 증식 배지로부터의 미생물이 단리되고 조사될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "단리된"은 본래의 상태로부터 또는 증식 또는 배양 배지 및 그 안에 함유된 임의의 비-미생물들 또는 비-미생물 성분들로부터 적어도 부분적으로 정제된 미생물들의 임의의 샘플을 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 본 발명에 따르면, 미생물은, 존재하는 경우 특성규명 및/또는 동정을 간섭할 수 있는 비-미생물 또는 비-미생물 성분으로부터 단리될 수 있다 (예를 들어, 단리된 샘플로서). 미생물로부터 분리되는 비-미생물 성분으로는 비-미생물 세포 (예를 들어, 혈액 세포 및/또는 다른 조직 세포) 및/또는 이의 임의의 성분들이 있을 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본원에 추가로 상세히 설명되는 바와 같이, 샘플에 존재하는 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하기 위해 샘플 또는 증식 배지로부터의 미생물은 펠릿화되고 조사될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "펠릿"은 미생물 덩어리로 압축되거나 침착된 미생물의 임의의 샘플을 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 샘플로부터의 미생물은 원심분리 또는 당 분야에 공지된 다른 방법에 의해 튜브의 저부에서 덩어리로 압축되거나 침착될 수 있다. 이러한 용어는 원심분리 후에 용기의 저부 및/또는 측부상에 있는 미생물 (및/또는 이의 성분)의 응집체를 포함한다. 펠릿에 포함될 수 있는 미생물 성분으로는 비제한적으로 임의의 조합된 형태의 필리, 플라젤라, 핌브리애, 및 캡슐이 있다. 본 발명에 따르면, 미생물은, 존재하는 경우 특성규명 및/또는 동정을 간섭할 수 있는 비-미생물들 또는 비-미생물 성분들로부터 펠릿화될 수 있다 (예를 들어, 실질적으로 정제된 미생물 펠릿으로서). 미생물들로부터 분리된 비-미생물 성분들로는 비-미생물 세포 (예를 들어, 혈액 세포 및/또는 다른 조직 세포) 및/또는 이의 임의의 성분들이 있을 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "밀도 쿠션"은 전체적으로 균질한 밀도를 지닌 용액을 지칭한다.

본 발명은 샘플내의 미생물을 단리하고/하거나, 특성규명하고/하거나 동정하는 방법을 제공한다. 더욱이, 이러한 방법은 혈액을 함유하는 배양 배지와 같은 복잡한 샘플로부터 미생물을 분리하고/하거나, 특성규명하고/하거나 동정하는 데에 특히 유용할 수 있다. 또한, 신속한 방법은 종래의 기법에 비해 보다 빨리 미생물의 특성규명 및/또는 동정을 가능하게 하여 진단 (예를 들어, 패혈증에 걸렸거나 걸린 것으로 의심되는 피검체의 경우) 그리고 오염된 재료의 특성규명/동정 (예를 들어, 음식물 및 약제)이 보다 신속히 이루어지게 한다. 샘플을 수득하는 것으로부터 미생물을 특성규명/동정하는 것에 이르기 까지 본 발명의 방법에 포함되는 단계들은 임상적으로 타당한 유용한 정보를 수득하기 위해 매우 짧은 시간 범위내에서 수행될 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 방법은 약 120분 미만, 예를 들어 약 110분, 100분, 90분, 80분, 70분, 60분, 50분, 40분, 30분, 20분, 15분, 10분, 5분, 4분, 3분, 2분, 또는 1분 미만 이내에 수행될 수 있다. 본 발명의 방법의 놀랄만한 신속함은 종래의 방법에 비해 개선을 나타낸다. 이러한 방법은 본원에 기술된 바와 같이 임의의 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하기 위해 사용될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 미생물은 세균이다. 또 다른 구체예에서, 미생물은 효모이다. 또 다른 구체예에서, 미생물을 곰팡이다. 추가의 구체예에서, 미생물을 기생충이다. 또 다른 구체예에서, 미생물은 몰리큐트이다. 추가로, 본 발명의 방법은 완전 자동화될 수 있어서 감염성 물질을 만지고/거나 샘플을 오염시킬 위험을 감소시킬 수 있다.

(d) 단리된 상기 미생물 샘플을 질량 분석법에 의해 조사하여 상기 미생물의 질량 스펙트럼을 획득하는 단계; 및

또 다른 양태에서, 본 발명은 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,

(b) 용기내에서 상기 시험 샘플을 밀도 쿠션상에 층 형태로 까는 단계;

본 발명의 또 다른 구체예에서, 이러한 방법들은 미생물을 조사하기 전에 분리 단계 동안 형성된 미생물의 펠릿 또는 이의 일부를 분리 용기로부터 회수하는 것을 포함한다. 예를 들어, 펠릿의 형성 후에, 유체가 그러한 펠릿으로부터 흡인될 수 있고, 펠릿은 적절한 배지 (예를 들어, 미생물이 생존할 수 있는 배지)에 재현탁될 수 있다. 재현탁된 미생물은 분리 용기로부터 꺼내어질 수 있다. 그 후, 미생물은, 예를 들어 현탁액 상태로 또는 리펠릿화된(repelleted) 후에, 특성규명 및/또는 동정을 위해 조사될 수 있다. 다른 구체예에서, 재현탁된 미생물은, 예를 들어 현탁액 상태로 또는 리펠릿화된 후에, 분리 용기내에서 조사될 수 있다. 추가의 구체예에서, 펠릿으로부터 회수된 미생물은 추가 조사 (예를 들어, 라만 분광법, 질량 분석법)를 위해 재현탁하지 않고 직접 사용될 수 있다.

샘플

본 발명의 방법에 의해 시험될 수 있는 샘플 (즉, 시험 샘플)은 미생물 존재 및/또는 증식이 의심되거나 의심될 수 있는 임상 및 비임상 샘플 둘 모두 뿐만 아니라 미생물의 존재에 대해 정례적으로 또는 이따금씩 시험되는 재료의 샘플을 포함한다. 사용되는 샘플의 양은 방법의 다능성(versatility) 및/또는 민감도(sensitivity)에 따라 크게 달라질 수 있다. 샘플 준비는 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 수행될 수 있지만, 본 발명의 이점들 중 하나는 혈액, 체액 및/또는 다른 불투명한 물질과 같은 복잡한 샘플 유형이 과도한 전처리를 거의 거치지 않거나 과도한 전처리없이 시스템을 사용하여 직접 시험될 수 있다는 점이다. 한 가지 구체예에서, 샘플은 배양물로부터 취해진다. 또 다른 구체예에서, 샘플은 미생물 배양물 (예를 들어, 혈액 배양물)로부터 취해진다. 또 다른 구체예에서, 샘플은 그 안에 미생물을 함유하는 것으로 의심되거나 미생물을 함유한 것으로 알려져 있다.

시험될 수 있는 임상 샘플은 임상 또는 연구 실험실에서 전형적으로 시험되는 임의의 유형의 샘플을 포함하는데, 이의 예로는 비제한적으로 혈액, 혈청, 혈장, 혈액 분획, 관절액, 소변, 정액, 타액, 대변, 뇌척수액, 위 내용물(gastric content), 질 분비물, 조직 균질물, 골수 흡인물(bone marrow aspirate), 뼈 균질물(bone homogenate), 담(sputum), 흡인물, 스왑(swab) 및 스왑 린세이트(swab rinsate), 다른 체액 등이 있다. 또 다른 구체예에서, 임상 샘플은 배양될 수 있고, 배양 샘플이 사용될 수 있다.

본 발명은 연구 뿐만 아니라 수의학 및 의학 분야에 사용된다. 임상 샘플을 수득할 수 있는 적절한 피검체는 일반적으로 포유동물 피검체이지만, 임의의 동물일 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "포유동물"은 비제한적으로 인간, 인간 이외의 영장류, 소, 양, 염소, 돼지, 말, 고양이, 개, 토끼, 설치류 (예를 들어, 랫트 또는 마우스) 등을 포함한다. 인간 피검체는 신생아, 유아, 청소년, 성인 및 노인 피검체를 포함한다. 샘플을 수득할 수 있는 피검체로는 비제한적으로 포유동물, 조류, 파충류, 양서류 및 어류가 있다.

또한, 시험될 수 있는 비임상 샘플로는 비제한적으로 음식물, 음료, 약제, 향장품, 물 (예를 들어, 음용수, 비음용수 및 폐수), 해수 밸러스트(seawater ballast), 공기, 토양, 오수(sewage), 식물 물질 (예를 들어, 종자, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 열매), 혈액 생성물 (예를 들어, 혈소판, 혈청, 혈장, 백혈구 분획 등), 공여 장기(donor organ) 또는 조직 샘플, 생물전쟁(biowarfare) 샘플 등을 포함하는 물질이 있다. 또한, 본 발명의 방법은 산업 환경에서 오염 수준, 공정 제어, 품질 관리 등을 모니터하기 위한 실시간 시험을 위해 특히 적합하다. 또 다른 구체예에서, 비임상 샘플은 배양될 수 있고, 배양 샘플이 사용될 수 있다.

본 발명의 한 가지 구체예에서, 샘플은 미생물에 감염되었거나 미생물에 감염된 것으로 의심되는 피검체 (예를 들어, 환자)로부터 수득된다. 한 가지 구체예에서, 피검체는 세균혈증 또는 진균혈증과 같은 패혈증에 걸렸거나 패혈증에 걸린 것으로 의심된다. 샘플은 피검체로부터 직접 유래된 혈액 샘플일 수 있다. 샘플은 환자의 혈액 샘플로부터 증식된 혈액 배양물, 예를 들어 BacT/ALERT^® 혈액 배양물로부터 유래될 수 있다. 혈액 배양 샘플은 양성 혈액 배양물, 예를 들어 미생물의 존재를 나타내는 혈액 배양물로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예들에서, 샘플은 양성으로 판명된 후 짧은 시간 이내에, 예를 들어 약 6시간 이내, 예를 들어 약 5시간, 4시간, 3시간 또는 2시간 이내이거나 약 60분 이내, 예를 들어 약 55분, 50분, 45분, 40분, 35분, 30분, 25분, 20분, 15분, 10분, 5분, 4분, 3분, 2분 또는 1분 이내에 양성 혈액 배양물로부터 채취된다. 한 가지 구체예에서, 샘플은 미생물이 대수 증식기에 있는 배양물로부터 채취된다. 또 다른 구체에에서, 샘플은 미생물이 정지기에 있는 배양물로부터 채취된다.

본 발명은 미생물의 검출, 특성규명 및/또는 동정을 위한 높은 민감도를 제공한다. 이는 미생물을 고체 또는 반고체 배지상에서 증식시키고 증식하는 콜로니를 샘플링함으로써 미생물을 단리하는 단계를 먼저 거칠 필요없이 검출, 특성규명 및/또는 동정을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 한 가지 구체예에서, 샘플은 고체 또는 반고체 표면상에서 증식시킨 미생물 (예를 들어, 세균, 효모 또는 곰팡이) 콜로니로부터 유래되지 않는다.

샘플의 부피는 본 발명의 분리/단리 단계가 수행된 후에 조사될 수 있는 미생물의 펠릿 또는 단리된 미생물 샘플을 생성시키기에 충분히 커야 한다. 적절한 부피는 샘플의 공급원 및 샘플내의 미생물의 예상 수준에 좌우된다. 예를 들어, 양성 혈액 배양물은 오염에 대해 시험하려는 음용수 샘플 보다 높은 부피 당 미생물 수준을 함유하는데, 따라서 음용수 샘플과 비교하여 보다 적은 부피의 혈액 배양 배지가 필요할 수 있다. 일반적으로, 샘플 크기는 약 50 ml 미만, 예를 들어 약 40 ml, 30 ml, 20 ml, 15 ml, 10 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 또는 2 ml 미만이다. 특정 구체예들에서, 샘플 크기는 약 1 ml 미만, 예를 들어 약 0.75 ml, 0.5 ml, 또는 0.25 ml 일 수 있다. 분리가 미세규모로 수행되는 특정 구체예들에서, 샘플 크기는 약 200 μl 미만, 예를 들어 약 150 μl, 100 μl, 50 μl, 25 μl, 20 μl, 15 μl, 10 μl, 또는 5 μl 미만일 수 있다. 일부 구체예 (예를 들어, 샘플이 적은 수의 미생물을 포함할 것으로 예상되는 경우)에서, 샘플 크기는 약 100 ml 또는 그 초과, 예를 들어 약 250 ml, 500 ml, 750ml, 또는 1000 ml 또는 그 초과일 수 있다.

임의적 용해 단계

일부 구체예에서, 샘플을 수득한 후, 본 발명의 다음 단계는 샘플에 존재할 수 있는 요망되지 않는 세포, 예를 들어 혈액 세포 및/또는 조직 세포를 선택적으로 용해시키는 것이다. 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 분리할 수 있도록 세포가 용해될 수 있다. 다른 성분들로부터 미생물을 분리하면 조사 단계 동안 간섭을 방지할 수 있다. 비-미생물 세포가 샘플에 존재할 것으로 예상되지 않거나 조사 단계를 간섭할 것으로 예상되지 않는 경우, 용해 단계는 수행할 필요가 없을 수 있다. 한 가지 구체예에서, 용해시키려는 세포가 샘플에 존재하는 비-미생물 세포이고, 샘플에 존재할 수 있는 미생물 세포는 용해되지 않는다. 그러나, 일부 구체예에서, 특정 부류의 미생물을 선택적으로 용해시키는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 본원에 기재된 방법 및 당 분야에 널리 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 한 부류의 요망되지 않는 미생물이 선택적으로 용해될 수 있는데, 예를 들어 효모는 용해되는 반면 세균이 용해되지 않거나 그 반대일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 미생물의 특정 세포내 성분, 예를 들어 세포막 또는 소기관을 분리하기 위해 요망되는 미생물이 용해된다. 한 가지 구체예에서, 모든 비-미생물 세포가 용해된다. 다른 구체예들에서, 비-미생물 세포의 일부가 용해되는데, 예를 들어 조사 단계의 간섭을 방지하기에 충분한 수의 세포가 용해된다. 세포의 용해는, 미생물을 용해시키거나 용해시키지 않으며 세포를 선택적으로 용해시키기에 효과적인 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있는데, 이의 예로는 비제한적으로 용해액의 첨가, 초음파처리(sonication), 삼투압 쇼크, 화학적 처리 및/또는 이의 조합이 있다.

용해액은 세포, 예를 들어 비-미생물 세포 (진핵 세포막을 가용화시킴으로써) 및/또는 미생물 세포를 용해시킬 수 있는 것이다. 한 가지 구체예에서, 용해액은 하나 이상의 세정제(detergent), 하나 이상의 효소, 또는 하나 이상의 세정제와 하나 이상의 효소의 조합물을 포함할 수 있고, 추가의 물질을 더 포함할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 세정제는 비변성 용해 세정제, 예를 들어 Triton^® X-100, Triton^® X-100-R, Triton^® X-114, NP-40, Genapol^® C-100, Genapol^® X-100, Igepal^® CA 630, Arlasolve™200, Brij^® 96/97, CHAPS, 옥틸 β-D-글루코피라노시드, 사포닌, 및 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 (C12E9, 폴리도세놀)일 수 있다. 임의로, 변성 용해 세정제로는 예를 들어 소듐 도데실 설페이트, N-라우릴사르코신, 소듐 데옥시콜레이트, 담즙산염(bile salt), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드, SB3-10, SB3-12, 아미도설포베타인-14, 및 C7BzO가 있을 수 있다. 임의로, 가용화제로는 또한 예를 들어 Brij^® 98, Brij^® 58, Brij^® 35, Tween^® 80, Tween^® 20, Pluronic^® L64, Pluronic^® P84, 비세정제(non-detergent) 설포베타인 (NDSB 201), 암피폴(amphipol) (PMAL-C8), 및 메틸-β-시클로덱스트린이 있을 수 있다. 전형적으로, 비변성 세정제 및 가용화제는 이의 임계 미셀 농도(CMC) 보다 높은 농도로 사용되는 반면, 변성 세정제는 이의 CMC 보다 낮은 농도로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 비변성 용해 세정제는 약 0.010% 내지 약 10%, 예를 들어 약 0.015% 내지 약 1.0%, 예를 들어 약 0.05% 내지 약 0.5%, 예를 들어 약 0.10% 내지 약 0.30% (샘플에 의한 희석 후의 최종 농도)로 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 폴리옥시에틸렌 세정제가 바람직할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 세정제는 C_12-18/E_9-10 구조를 포함할 수 있는데, 여기서 C12-18은 탄소수 12개 내지 18개의 탄소 사슬 길이를 의미하고, E9-10은 9개 내지 10개의 옥시에틸렌 친수성 헤드기(head group)를 의미한다. 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 세정제는 Brij^® 97, Brij^® 96V, Genapol^® C-100, Genapol^® X-100, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 (폴리도카놀), 또는 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

용해액에 사용될 수 있는 효소로는 비제한적으로 핵산 및 다른 막 오염(membrane-fouling) 물질을 분해시키는 효소 (예를 들어, 프로테이나제 XXIII, DNase, 뉴라미니다제, 폴리사카라이다제, Glucanex^®, 및 Pectinex^®)가 있다. 사용될 수 있는 다른 첨가제로는 비제한적으로 환원제, 예를 들어 2-메르캅토에탄올 (2-Me) 또는 디티오트레이톨(DTT) 및 안정화제, 예를 들어 마그네슘, 피루베이트, 및 습윤제(humectant)가 있다. 용해액은 요망되는 세포를 용해시키기에 적절한 임의의 pH에서 완충될 수 있고, 비제한적으로 샘플 유형, 용해시키려는 세포 및 사용되는 세정제를 포함하는 다수의 인자에 좌우된다. 일부 구체예에서, pH는 약 2 내지 약 13, 예를 들어 약 6 내지 약 13, 예를 들어 약 8 내지 약 13, 예를 들어 약 10 내지 약 13일 수 있다. 적절한 pH 완충액으로는 요망되는 범위, 예를 들어 약 0.05 M 내지 약 1.0 M CAPS로 pH를 유지시킬 수 있는 임의의 완충액이 있다.

한 가지 구체예에서, 샘플과 용해액은 혼합된 후 세포막의 용해 및 가용화가 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션되는데, 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 또는 60초, 또는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20분 또는 그 초과, 예를 들어 약 1초 내지 약 20분, 약 1초 내지 약 5분, 또는 약 1초 내지 약 2분간 인큐베이션된다. 인큐베이션 시간은 용해액의 세기, 예를 들어 세정제 및/또는 효소의 농도에 좌우된다. 일반적으로, 약한 용해 완충액은 비-미생물 세포를 충분히 가용화시키기 위해 보다 긴 시간 및 보다 높은 샘플 희석을 필요로 한다. 용해액의 세기는 샘플에 존재하거나 존재하는 것으로 의심되는 미생물에 따라 선택될 수 있다. 보다 쉽게 용해되는 미생물의 경우, 약한 용해액이 사용될 수 있다. 용해는 약 2℃ 내지 약 45℃, 예를 들어 약 15℃ 내지 약 40℃, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃의 온도에서 일어날 수 있다. 한 가지 구체예에서, 용해액이 시린지(syringe)내로 로딩된 후 샘플이 그러한 시린지내로 흡인되어 혼합과 인큐베이션이 시린지내에서 일어나게 할 수 있다.

일부 구체예에서, 용해 조건 (예를 들어, 용해 또는 인큐베이션 시간) 뿐만 아니라 분리 및/또는 조사 단계는 샘플내의 미생물의 전부 또는 일부를 치사시키기에 충분할 수 있다. 본 발명의 방법은 매우 다능적이며 단리 및 동정이 일어나게 하기 위해 모든 미생물이 살아있어야 할 것을 요구하지 않는다. 특정 구체예들에서, 미생물의 전부 또는 일부가 치사될 수 있는데, 치사는 본 발명의 방법의 단계들이 수행되기 전, 수행되는 동안 및/또는 수행된 후에 일어난다.

본 발명의 실시에서 고려되는 용해 완충액의 추가의 세부 사항 및 설명은 계류중인 2009년 10월 30일에 출원된 발명이 명칭이 "Methods for Isolation and Identification of Microorganisms"인 미국 특허 출원 일련 번호 에 기재되어 있으며, 상기 미국 특허 출원은 본원에 참조로 포함된다.

분리 단계

본 발명의 방법의 다음 단계 (예를 들어, 용해 단계가 수행되는 경우 샘플이 용해된 후의 단계)는 분리 단계이다. 분리 단계는 샘플의 다른 성분들 (예를 들어, 비-미생물들 또는 이의 성분들)로부터 미생물을 분리하고 미생물을 동정 및 특성규명을 위해 조사될 수 있는 펠릿으로 농축시키기 위해 수행될 수 있다. 분리는 완전할 필요가 없는데, 즉, 100% 분리가 일어날 필요는 없다. 샘플의 다른 성분들로부터 미생물의 분리는 다른 성분들로부터의 실질적인 간섭없이 미생물을 조사할 수 있게 하기에 충분하기만 하면 된다. 예를 들어, 분리는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 순수하거나 그 보다 더 순수한 미생물 펠릿을 생성시킬 수 있다.

한 가지 구체예에서, 분리는 분리 용기내의 밀도 쿠션의 상부에 샘플 (예를 들어, 용해된 샘플) 놓이게 되는 원심분리 단계에 의해 수행되고, 용기는 미생물이 단리될 수 있게 하는 조건하에서 원심분리된다 (예를 들어, 미생물은 용기의 저부 및/또는 측부에서 펠릿을 형성할 수 있다). 이러한 구체예에 따르면, 샘플의 다른 성분들 (예를 들어, 샘플 배지에 존재할 수 있는 비-미생물 또는 이의 성분)은 밀도 쿠션위에 머물러 있거나 밀도 쿠션의 상부 부분 내에 머물러 있는다. 일반적으로, 임의의 공지된 용기가 분리 단계를 위해 사용될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 분리 용기는 2009년 10월 30일에 출원된 발명의 명칭이 "Separation Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms"인 관련 미국 특허 출원 일련 번호 에 기재된 분리 장치이다. 이러한 분리 단계는 샘플내의 물질, 예를 들어 배지, 세포 파편 및/또는 미생물의 조사 (예를 들어, 고유 형광에 의한 조사)를 간섭할 수 있는 다른 성분들로부터 미생물을 단리해낸다. 한 가지 구체예에서, 또한 밀도 쿠션은 살아있는 미생물을 죽은 미생물 (이는 밀도 쿠션을 통과하지 못함)과 분리하는 기능을 한다. 또 다른 구체예에서, 밀도 쿠션은 원심분리 전 또는 후에 밀도 구배를 포함하지 않는다. 바꿔 말하면, 분리 용기는 밀도 쿠션을 구성하는 물질이 밀도 구배를 형성하기에 충분한 시간 동안 및/또는 가속도(acceleration)로 원심분리되지 않는다.

쿠션의 밀도는 샘플내의 미생물은 쿠션을 통과하지만 샘플의 다른 성분들 (예를 들어, 혈액 배양 브로쓰, 세포 파편)은 쿠션위에 남아있거나 밀도 쿠션을 통한 경로의 전부를 통과하지 못한다. 또한, 밀도 쿠션은 살아있는 미생물 (쿠션을 통과함)을 죽은 미생물 (쿠션을 통과하지 못함)과 분리하도록 선택될 수 있다. 적절한 밀도는 밀도 쿠션에 사용되는 물질 및 분리하고자 하는 샘플에 좌우된다. 한 가지 구체예에서, 쿠션의 밀도는 약 1.025 내지 약 1.120 g/ml, 예를 들어 약 1.030 내지 약 1.070 g/ml, 약 1.040 내지 약 1.060 g/ml의 범위 또는 약 1.025 내지 약 1.120 g/ml 사이의 임의의 범위이다. 또 다른 구체예에서, 쿠션의 밀도는 약 1.025, 1.030, 1.035, 1.040, 1.045, 1.050, 1.055, 1.060, 1.065, 1.070, 1.075, 1.080, 1.085, 1.090, 1.095, 1.100, 1.105, 1.110, 1.115, 또는 1.120 g/ml 이다.

밀도 쿠션을 위한 물질은 본 발명의 방법을 위해 적절한 밀도 범위를 지니는 임의의 물질일 수 있다. 한 가지 구체예에서, 그러한 물질은 콜로이드성 실리카이다. 콜로이드성 실리카는 코팅되지 않거나 (예를 들어, Ludox^® (W.R. Grace, CT)) 코팅될 수 있는데, 예를 들어 실란 (예를 들어, PureSperm^® (Nidacon Int'l, Sweden) 또는 Isolate^® (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)) 또는 폴리비닐피롤리돈 (예를 들어, Percoll™, Percoll™ Plus (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO))으로 코팅될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 분광학적 조사에 대해 최소의 간섭을 나타내는 콜로이드성 실리카가 선택되는데, 예를 들어 최저의 고유 형광을 지닌 물질이 선택된다. 콜로이드성 실리카는 알맞은 밀도를 형성하기 위해 임의의 적절한 배지, 예를 들어 균형 염 용액, 생리 식염수 및/또는 0.25 M 수크로스 중에서 희석될 수 있다. 적절한 밀도는 약 15% 내지 약 80% v/v, 예를 들어 약 20% 내지 약 65% v/v 농도의 콜로이드성 실리카를 사용하여 수득될 수 있다. 밀도 쿠션을 위한 또 다른 적절한 물질은 요오드화된 조영제(iodinated contrast agent), 예를 들어 이오헥솔(isohexol) (Omnipaque^TM NycoPrep^TM, 또는 Nycodenz^®) 및 이오딕사놀(iodixanol) (Visipaque^TM 또는 OptiPrep^TM) 이다. 적절한 밀도는 혈액 배양 샘플의 경우 약 10% 내지 약 25% w/v, 예를 들어 약 14% 내지 약 18% w/v 농도의 이오헥솔 또는 이오딕사놀을 사용하여 수득될 수 있다. 수크로스가 혈액 배양 샘플의 경우 약 10% 내지 약 30% w/v, 예를 들어 약 15% 내지 약 20% w/v 농도로 밀도 쿠션으로서 사용될 수 있다. 밀도 쿠션을 제조하기 위해 사용될 수 있는 다른 적절한 물질로는 점도가 낮고 밀도가 높은 오일, 예를 들어 현미경 유침 오일(microscope immersion oil) (예를 들어, Type DF; Cargille Labs, New York), 미네랄 오일 (예를 들어, Drakeol^® 5, Draketex 50, Peneteck^®; Penreco Co., Pennsylvania), 실리콘 오일 (폴리디메틸실록산), 플루오로실리콘 오일, 실리콘 겔, metrizoate-Ficoll^® (LymphoPrep™) (예를 들어 혈액 배양 샘플의 경우 약 75% 내지 약 100%의 농도로 사용됨), 디아트리조에이트-덱스트란 (PolymorphoPrep^TM) (예를 들어 혈액 배양 샘플의 경우 약 25% 내지 약 50%의 농도로 사용됨), 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시메틸 셀룰로스, 폴리에틸렌 옥사이드 (고분자량), Pluronic^® F127, Pluronic^® F68, Pluronic^® 화합물들의 혼합물, 폴리아크릴산, 가교된 폴리비닐 알코올, 가교된 폴리비닐 피롤리딘, PEG 메틸 에테르 메타크릴레이트, 펙틴, 아가로스, 잔탄, 겔란(gellan), Phytagel^®, 소르비톨, Ficoll^® (예를 들어, 혈액 배양 샘플의 경우 약 10% 내지 약 15% 농도의 Ficoll^® 400), 글리세롤, 덱스트란 (예를 들어, 혈액 배양 샘플의 경우 약 10% 내지 약 15% 농도로 사용됨), 글리코겐, 세슘 클로라이드 (예를 들어, 혈액 배양 샘플의 경우 약 15% 내지 약 25% 농도로 사용됨), 퍼플루오로카본 유체 (예를 들어, 퍼플루오로-n-옥탄), 히드로플루오로카본 유체 (예를 들어, Vertrel XF) 등이 있으며 이들은 당 분야에 널리 알려져 있다. 한 가지 구체예에서, 밀도 쿠션은 임의의 조합된 형태의 콜로이드성 실리카, 이오딕사놀, 이오헥솔, 세슘 클로라이드, metrizoate-Ficoll^®, 디아트리조에이트-덱스트란, 수크로스, Ficoll^® 400, 및/또는 덱스트란 중 하나 이상으로부터 선택된다. 또한, 밀도 쿠션은 물질들의 조합물로 구성될 수 있는데, 예를 들어 콜로이드성 실리카와 오일의 조합물로 구성될 수 있다. 상기 화합물들의 특정 조합물이 본 발명의 분리 및 판독 단계를 위해 유리할 수 있다.

밀도 쿠션의 부피/높이는 다른 샘플 성분으로부터의 미생물의 분리를 달성하기에 충분해야 한다. 부피는 분리 용기의 크기 및 형상에 좌우될 것이다. 일반적으로, 약 0.1 내지 약 5 ㎖, 예를 들어, 약 0.2 내지 약 1 ㎖, 예를 들어, 약 0.2 ㎖ 내지 약 0.5 ㎖의 부피가 사용될 수 있다. 분리가 미소 규모로 수행되는 경우, 밀도 쿠션의 부피는 약 1 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 예를 들어, 약 5 ㎕ 내지 약 50 ㎕일 수 있다. 밀도 쿠션의 상부에 가하거나 적층하는 샘플의 부피는 조사에 적합한 펠릿을 생성하기에 충분한 미생물을 제공하는데 충분해야 한다. 일반적으로, 용기에 적합한 임의의 부피가 사용될 수 있다. 예를 들어, 약 0.1 ㎖ 내지 약 5 ㎖, 예를 들어, 0.2 ㎖ 내지 약 1 ㎖, 예를 들어, 약 0.2 ㎖ 내지 약 0.5㎖의 부피가 사용될 수 있다. 분리가 미소 규모로 수행되는 경우, 샘플의 부피는 약 1 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 예를 들어, 약 5 ㎕ 내지 약 50 ㎕일 수 있다. 용기 내에서 샘플을 위해 이용가능한 공간은 용기의 크기 및 형상에 좌우될 것이다. 일부 구체예에서, 샘플을 상부에 가하거나 적층하기 전에, 중간층(액체 또는 고체)을 밀도 쿠션의 상부에 놓여지게 하여, 밀도 쿠션과 샘플의 임의의 혼합을 방지할 수 있다. 하나의 구체예에서, 중간층은 폴리에틸렌 비드(bead)일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 밀도 쿠션과 샘플 사이에 작은 기포를 정위시켜, 혼합을 방지할 수 있다. 추가의 구체예에서, 고밀도 물질(예컨대, 퍼플루오로카본 유체)의 상부에 밀도 쿠션을 적층하여, 미생물이 분리 중에 밀도 쿠션을 통과하고, 밀도 쿠션과 고밀도 물질 사이의 경계면에서 수집되게 할 수 있다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 분리 용기를 스윙 아웃 로터(swing out rotor)에서 원심분리하여, 미생물이 용기의 바닥에 직접 펠릿을 형성하게 한다. 미생물이 샘플의 다른 성분으로부터 분리(예컨대, 펠릿 형성)되기에 충분한 시간 동안, 충분한 가속도로 용기를 원심분리한다. 원심분리 가속도는 약 1,000 x g 내지 약 20,000 x g, 예를 들어, 약 2,500 x g 내지 약 15,000 x g, 예를 들어, 약 7,500 x g 내지 약 12,500 x g 등일 수 있다. 원심분리 시간은 약 30초 내지 약 30분, 예를 들어, 약 1분 내지 약 15분, 예를 들어, 약 1분 내지 약 5분일 수 있다. 원심분리를 약 2 ℃ 내지 약 45 ℃, 예를 들어, 약 15 ℃ 내지 약 40 ℃, 예를 들어, 약 20 ℃ 내지 약 30 ℃의 온도에서 수행할 수 있다. 하나의 구체예에서, 분리 용기는 클로저(closure)를 포함하며, 클로저는 원심분리 전에 기밀 밀봉(hermetic seal)을 형성하도록 용기에 적용된다. 클로저의 존재는 감염성 및/또는 유해성이거나 또는 감염성 및/또는 유해성일 수 있는 미생물 취급으로부터의 위험을 감소시킬 뿐 아니라, 샘플의 오염 위험을 감소시킨다. 본 발명의 방법의 이점 중 하나는 밀봉된 용기(예컨대, 기밀 밀봉된 용기) 내에서 미생물을 사용하여 본 발명의 임의의 하나 이상의 단계(예컨대, 용해, 분리, 조사 및/또는 동정)를 수행하는 능력이다. 자동화된 시스템의 사용을 수반하는 본 발명의 방법은 예를 들어, 직접적인 시험을 위하여 샘플로부터 미생물을 회수하면서 발생하는, 매우 독성인 미생물의 취급과 관련된 건강 및 안전성 위험을 예방한다. 하나의 구체예에서, 밀도 쿠션 내에서 밀도 구배가 형성되기에 충분한 시간 및/또는 힘으로 용기를 원심분리하지 않는다. 본 발명은 샘플의 초원심분리, 예를 들어, 약 100,000 x g 초과의 힘에서의 원심분리를 수반하지 않는다. 추가로, 본 발명은 등밀도(평형) 침강 또는 밴딩(banding)을 수반하지 않는다.

분리 용기는 밀도 쿠션과 샘플을 보유하는데 충분한 부피를 갖는 임의의 용기일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 미국 특허 출원 제_호(출원일: 2009년 10월 30일, 발명의 명칭: "Separation Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms")에 개시된 분리 장치가 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 용기는 원심분리기 로터에 장착되거나 장착될 수 있다. 용기의 부피는 약 0.1 ㎖ 내지 약 25 ㎖, 예를 들어, 약 1 ㎖ 내지 약 10 ㎖, 예를 들어, 약 2 ㎖ 내지 약 8 ㎖일 수 있다. 분리가 미소 규모로 행해지는 경우, 용기의 부피는 약 2 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 예를 들어, 약 5 ㎕ 내지 약 50 ㎕일 수 있다. 하나의 구체예에서, 용기는 샘플 및 대부분의 밀도 쿠션을 수용하도록 상부에서 넓은 내경을 가지며, 미생물 펠릿이 수집되는 하부에서는 더 좁은 내경을 갖는다. 좁은 부분은 내경이 약 0.04 내지 약 0.12 인치, 예를 들어, 약 0.06 내지 약 0.10 인치, 예를 들어, 약 0.08 인치일 수 있다. 넓은 부분은 내경이 약 0.32 내지 약 0.40 인치, 예를 들어, 약 0.34 내지 약 0.38 인치, 예를 들어, 약 0.36 인치일 수 있다. 내경은 미소 규모 분리를 위해서는 심지어 더 작을 수 있다. 예를 들어, 좁은 부분의 내경은 약 0.001 내지 약 0.04 인치, 예를 들어, 약 0.002 내지 약 0.01 인치일 수 있다. 테이퍼형(tapered) 내경 부분이 상부 및 하부를 연결할 수 있다. 테이퍼형 부분은 각이 약 20 내지 약 70 도, 예를 들어, 약 30 내지 약 60 도일 수 있다. 하나의 구체예에서, 좁은 하부는 용기의 전체 높이의 절반 미만, 예를 들어, 용기의 전체 높이의 약 40%, 30%, 20%, 또는 10% 미만이다. 용기는 부착된 클로저 장치를 가질 수 있거나, 또는 용기가 원심분리 중에 기밀 밀봉될 수 있게 클로저 장치(예를 들어, 캡(cap))를 수용하도록 나사산이 형성(threaded)될 수 있다. 특정 구체예에서, 용기는 수동으로 또는 자동화된 방식(기술자가 용기 내용물에 노출되지 않도록)으로, 분리 후에, 용기로부터 미생물 샘플 또는 펠릿을 용이하게 회수할 수 있거나, 또는 달리 수득할 수 있거나, 또는 꺼낼 수 있도록 설계된다. 예를 들어, 용기는 펠릿을 함유하고, 용기의 나머지로부터 분리될 수 있는 분리가능한 부분 또는 이탈(break-away) 부분을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 용기는 분리 후에 펠릿에 접근하기 위한 수단, 예를 들어, 주사기 또는 다른 샘플링 장치의 삽입을 위한, 또는 펠릿을 빼내기 위한 하나 이상의 포트(port) 또는 투과성 표면을 포함한다. 하나의 구체예에서, 용기는 튜브, 예를 들어, 원심분리기용 튜브일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 용기는 칩 또는 카드일 수 있다. 하나의 구체예에서, 용기는 독립형 용기, 즉 단일의 샘플을 분리하기 위한 장치이다. 다른 구체예에서, 용기는 다수의 샘플이 동시에 분리될 수 있도록, 둘 이상의 분리 용기를 포함하는 장치의 부분이다. 하나의 구체예에서, 장치는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 36, 42, 48, 60, 72, 84, 96개 또는 그 이상의 분리 용기를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 분리는 여과 단계에 의해 수행되며, 여기서 미생물을 보유하는 기공(pore) 크기를 갖는 선택적 필터 또는 필터 세트를 장착한 장치에 샘플(예를 들어, 용해된 샘플)을 배치한다. 적절한 완충액이 천천히 필터를 통과하여 지나가게 함으로써 보유한 미생물을 세정할 수 있다. 그 다음, 세정한 미생물을 필터 상에서 직접 조사하고/거나 조사를 위하여 필터의 표면을 직접 샘플링하거나, 적절한 수성 완충액으로 필터를 역-플러싱(back-flushing)함으로써 회수할 수 있다.

조사 단계(interrogation step)

하나의 구체예에서, 샘플 또는 펠릿을 조사 전에, 분리 용기로부터 회수 및/또는 재현탁시키고, 임의로 분리한다. 또 다른 구체예에서, 샘플 또는 펠릿을 원위치(in situ)에서의 조사 후에, 회수 및/또는 재현탁시킨 다음, 추가의 조사를 수행한다. 예를 들어, 단리된 미생물에 적용할 수 있으나 미생물 펠릿에는 적용할 수 없는 라텍스 응집(latex agglutination) 또는 자동화된 표현형 동정 시험과 같은 기술을 회수 및/또는 재현탁된 미생물 상에서 수행할 수 있다.

샘플을 재현탁시킨 후, 그러한 샘플의 일부를 현탁액으로부터 분리하여 질량 분석기내로 도입하기 위한 플레이트상에 배치한다. 고도로 흡광성인 물질이 샘플 (예를 들어, 매트릭스)의 상부에 침착되는데, 이러한 물질은 샘플을 이온화시키는 데에 사용되는 레이저 주파수에 대해 매우 높은 광흡수 계수를 지닌다 (예를 들어, 질소 레이저의 경우, 방출 파장은 337 nm이어서 그러한 흡광성 물질은 337 nm의 파장에서 큰 흡수 계수를 지닐 것이다). 샘플과 흡광성 물질이 건조된 후, 플레이트를 질량 분석기내로 삽입시킨다. 샘플을 펌프 다운(pump down)시키는 데에 (즉, 샘플로부터 대기 가스(atmospheric gas)를 제거함으로써 샘플이 10^-5 내지 10^-7 토르의 환경에 있게 함) 필요한 시간 후, 샘플을 질량 분석기의 이온화 챔버내로 도입시킨다. 샘플을 시스템과 정렬시킨다. 최적의 정렬이 달성되는 경우, 질소 레이저를 펄싱시킨다. 매트릭스에 의해 레이저 에너지가 흡수되면 침착된 높은 에너지로 인해 플레이트의 표면으로부터 매트릭스의 제거(ablation)가 일어난다. 부작용으로서, 프로세스 도중에서 미생물 세포의 일부가 기화되고 이온화된다. 이러한 이온은, 플레이트와 질량 분석기의 비행 튜브(flight tube) 입구 사이에 정전기장이 생성됨에 따라 공지된 운동 에너지로 가속된다 (즉, 시스템의 이러한 부분은 질량/전하 판별자(discriminator)이다). 질량에 관계없이 모든 1가로 대전된(singly charged) 이온은 비행 튜브 입구에서 동일한 운동 에너지를 지닐 것이지만, 이러한 이온은 이의 질량에 반비례하는 속도를 지닐 것이다. 그 지점으로부터 이온은 비행 튜브를 지나 검출기쪽으로 이동하고, 가벼운 이온이 무거운 이온 보다 먼저 도착할 것이다 (비행 튜브는 질량/전하 판별자이다). 검출기의 출력은 디지털화되고, 이러한 출력이 하나의 축상에는 질량/전하 비를 디스플레이하고 다른 축상에는 충격(impact) 횟수를 디스플레이한다. 다른 구체예에서, 펠릿 내의 미생물을 질량 분석법 기술, 예를 들어, MALDI-TOF 질량 분석법, 탈착 전자분무 이온화(DESI) 질량 분석법, GC 질량 분석법, LC 질량 분석법, 전자분무 이온화(ESI) 질량 분석법 및 선택 이온 흐름 튜브(SIFT) 분석법을 사용하여 조사할 수 있다.

본 발명에 따라서, 알려져 있는 미생물에 대한 대조군 측정치를 취하여, 당업자에게 알려져 있는 다양한 수학적 방법을 사용하여 측정된 시험 데이터와 대상 미생물의 특성규명의 상호관련을 가능하게 한다. 예를 들어, 당업자에게 알려져 있는 소프트웨어 시스템을 사용하여 샘플로부터의 데이터를 기준 선 또는 대조군 측정치와 비교할 수 있다. 더욱 특히, 데이터를 많은 다변량 분석 방법, 예를 들어, 일반적 판별 분석(General Discriminant Analysis; GDA), 부분 최소 제곱 판별 분석(PLSDA), 부분 최소 제곱 회귀, 주성분분석(PCA), 평행 인자 분석(Parallel Factor Analysis; PARAFAC), 신경망 분석(NNA) 및/또는 서포트 벡터 머신(Support Vector Machine; SVM)에 의해 분석할 수 있다. 이들 방법을 사용하여, 이전에 이재된 바와 같이 유기체를 모니터링, 검출 및/또는 특성규명하기 위한 시스템을 고안하는 데에서, 알려져 있지 않은 대상 미생물을 기존의 명명법에 기초하여 관련있는 그룹으로 분류하고/거나 유기체의 대사, 병원성 및/또는 독성에 기초하여 자연 발생 그룹으로 분류할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 검출 시스템으로부터의 비-분광 측정치, 예를 들어 검출 시간 및 성장 속도를 사용하여, 단리된 샘플 또는 펠릿으로부터의 미생물의 특성규명 및/또는 동정에 도움을 줄 수 있다. 또한, 분리 장치의 하부 영역의 사진 이미지로부터 취한 측정치는 펠릿 크기, 형상, 색상 및 밀도와 같은 단리물의 동정에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, 단리된 샘플 또는 펠릿 내의 미생물의 특성규명 및/또는 동정은 정확한 종의 동정을 포함할 필요가 없다. 특성규명은 생물학적 입자의 넓은 카테고리화(categorization) 또는 분류뿐 아니라 단일 종의 실제의 동정을 포함한다. 단리된 샘플 또는 펠릿으로부터의 미생물의 분류는 미생물에 대한 표현형 및/또는 형태상 특징의 결정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 입자의 특성규명은 식별가능한 차이점, 이를 테면 조성, 형상, 크기, 클러스터링(clustering) 및/또는 대사에 기초하여 달성할 수 있다. 일부 구체예에서, 대상의 생물학적 입자의 분류는 주어진 생물학적 입자의 특징의 사전의 지식을 필요로 하지 않으나, 오직 실증적인 측정과의 일관된 상호관련을 요구할 수 있어, 이 방법을 특정 결합 사건 또는 대사 반응에 기초한 방법보다 더 일반적이고 용이하게 사용가능하게 한다. 본 명세서에 사용되는 "동정"은 이전에 알려져 있지 않은 미생물이 속하는 과, 속, 종 및/또는 균주를 결정하는 것을 의미하며, 예를 들어, 이전에 알려져 있지 않은 미생물을 과, 속, 종 및/또는 균주 수준으로 동정하는 것이다.

일부 예에서, 특성규명은 취하려는 행위에 대하여 충분히 유용한 정보를 제공하는 분류 모델을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 바람직한 분류 모델은 다음 중 하나 이상으로의 그룹화(grouping)를 포함한다: (1) 그람(Gram) 그룹; (2) 임상적 그람 그룹; (3) 치료적 그룹; 및 (4) 기능적 그룹.

(1) 그람 그룹: 그람 그룹 분류 내에서, 미생물을 이들의 그람 염색 반응 및 전체 크기에 기초하여 3개의 넓은 분류 카테고리 중 하나로 배정할 수 있으며, 상기 그룹은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: (a) 그람 염색으로 암청색으로 염색되는 그람 양성 미생물; (b) 그람 염색으로 적색으로 염색되는 그람 음성 미생물; 및 (c) 그람 염색으로 암청색으로 염색되나 이들의 형태학적 특징 및 크기로 박테리아와 구별되는 매우 큰 둥근 세포인 효모 세포.

(2) 임상적 그람 그룹: 그람 그룹을 현저한 형태적 특징을 나타내는 몇몇의 서브-카테고리로 추가로 나눌 수 있다. 이들 서브-카테고리는 숙련된 실험실 기술자가 보고한 모든 유의미한 임상 정보를 포함하여, 양성 또는 음성 그람 반응보다 더 높은 수준의 동정을 제공한다. 이러한 특정한 분류는 매우 유익한데, 이는 자동화된 시스템으로 동등한 임상적으로 유의미한 정보를 제공함으로써, 스미어(smear)를 판독하는 기술자의 기술 수준 및/또는 그람 염색의 품질에 의존하는 것에 대한 염려를 없애기 때문이다. 더욱 자세하게, 이러한 분류 모델에 기초한 미생물의 서브카테고리는 다음 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다: (a) 작고 둥근 세포인 구균(cocci); (b) 함께 연결된 2개의 작고 둥근 세포인 쌍구균(diplococci); (c) 직사각형 형상인 간균(rod); 및 (d) 간균 형상인 바실루스(bacilli). 추가의 형태학적 정보에 의해 확인할 수 있는 이들 서브-카테고리의 예는 다음을 포함한다: (i) 그람 양성 구균; (ii) 사슬 내의 그람 양성 구균; (iii) 클러스터 내의 그람 양성 구균(즉, "포도-유사" 클러스터); (iv) 그람 양성 쌍구균; (v) 그람 양성 간균; (vi) 포자가 있는 그람 양성 간균; (vii) 그람 음성 간균; (viii) 그람 음성 구간균(coccobacilli); (ix) 그람 음성 쌍구균; (x) 효모; 및 (xi) 사상 진균.

(3) 치료적 그룹: 치료적 그룹은 특정 표본 유형으로부터 단리되는 경우, 동일한 분류의 항생제 또는 항생제의 혼합물로 처리되는 다수의 미생물 종을 포함한다(예를 들어, 문헌["Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008"]에 기재된 바와 같은). 많은 경우에, 초기의 경험적인 치료법에서 더욱 표적화된 치료법으로의 변화를 가능하게 하기 위하여 임상의는 종 수준까지 식별하는 것을 필요로 하지 않는데, 이는 1개 초과의 종이 동일한 항생제(들)의 선택으로 처리될 수 있기 때문이다. 이러한 분류 수준은 이들 "동일-치료" 미생물을 정확하게 단일의 치료적 카테고리에 배정한다. 이러한 특성규명 수준의 예에는 민감성 EB 종으로부터 고내성 엔테로박테리아(Enterobacteriacae; EB) 종(대장균(E. coli)로부터 엔테로박터(Enterobacter) 종), 또는 감수성 칸디다(Candida) 종(칸디다 알비칸스(C. albicans) 및 칸디다 파라프실로시스(C. parapsilosis))으로부터 플루코나졸-내성 칸디다 종(칸디다 글라브라타(C. glabrata) 및 칸디다 크루제이(C. kruzei)) 등을 구별하는 능력이 포함된다.

(4) 기능적 그룹: 본 발명에 따라, 미생물을 또한 대사, 독성 및/또는 표현형 특징의 혼합에 기초하여, 몇몇의 그룹으로 배정할 수 있다. 비-발효 유기체는 발효 유기체로부터 명확하게 구별될 수 있다. 또한, 용혈소를 생성하는 미생물을 비-용혈소 종과 따로 그룹화할 수 있다. 일부 경우에, 이들 그룹은 속 수준(예를 들어, 콜라이형(coliform), 그람 음성 비-발효 간균)보다 더 넓은 카테고리를 나타내며, 일부는 속 수준(예를 들어, 엔테로코쿠스(Enterococcus), 칸디다)으로 나타내고, 일부는 종-수준(예를 들어, 코아굴라제-음성 스타필로콕시(coagulase-negative staphylococci), 알파-용혈성 스트렙토콕시(alpha-hemolytic streptococci), 베타-용혈성 스트렙토콕시, 코아굴라제-양성 스타필로콕시, 즉, 스태필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)) 판별에 근접하여 나타낸다.

본 발명의 방법은 동정 목적을 위해 미생물의 내재적 특성을 측정하는 것 외에, 분리 및/또는 동정 과정을 돕기 위한 추가의 식별제(identifier agent)의 사용을 추가로 포함할 수 있다. 친화성 리간드와 같은 특정 미생물에 결합하는 제제(agent)를 사용하여 미생물을 분리하고/거나, 미생물의 부류 또는 종을 동정하고/거나(예를 들어, 독특한 표면 단백질 또는 수용체에 대한 결합을 통해), 미생물의 특성(예를 들어, 항생제 내성)을 동정할 수 있다. 유용한 식별제에는 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 이의 단편(예를 들어 스태필로코쿠스 아우레우스 동정을 위한 항-Eap), 핵산 프로브, 항생제(예를 들어, 페니실린, 반코마이신, 폴리믹신 B), 압타머(aptamer), 펩티드 모방체, 파지-유래 결합 단백질, 렉틴, 숙주 선천 면역 바이오마커(biomarker)(급성기 단백질, LPS-결합 단백질, CD14, 만노오스 결합 렉틴, 톨-유사 수용체), 숙주 방어 펩티드(예를 들어, 디펜신, 카텔리시딘, 프로테그린, 마가이닌), 박테로신(예를 들어, 란티바이오틱, 이를 테면, 니신, 머사시딘, 에피더민, 갈리더민 및 플란타리신 C 및 클래스 II 펩티드), 박테리오파지 및 핵산, 지질, 탄수화물, 다당류, 캡슐/슬라임(slime) 또는 단백질에 선택적인 염료 또는 이들의 임의의 조합이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 제제가 그 자체로 검출가능한 신호를 내지 않는 경우, 제제는 예를 들어 제제를 매트릭스 양립성(matrix-compatible) 화합물에 컨쥬게이트(conjugate)시킴으로써 검출가능한 신호를 제공하도록 표지될 수 있다. 제제는 본 발명의 방법에서 임의의 단계에, 예를 들어, 샘플을 수득할 때, 용해 중에 및/또는 분리 중에 미생물에 첨가될 수 있다. 일부 구체예에서, 펠릿 중의 제제의 존재는 펠릿의 조사 중에 결정될 수 있다. 다른 유용한 식별제에는 미생물 효소를 위한 기질, 킬레이팅제(chelating agent) 및 독성 화합물이 있다.

본 발명의 하나의 양태에서, 상기 방법은 미생물 펠릿을 회수하는 단계 및 추가의 시험을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 샘플 배지 및 밀도 쿠션을 흡인해 냄으로써 펠릿을 회수할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 주사기를 용기 내로 삽입하고, 샘플 배지 및 밀도 쿠션을 온전하게 남겨놓으면서 펠릿을 흡인해 냄으로써 펠릿을 회수할 수 있다. 그 다음, 회수한 펠릿을 적절한 배지, 예를 들어, 염수에 재현탁시킬 수 있다. 미생물이 재현탁되면, 당업자에게 알려져 있을 바와 같이, 그리고 상술된 바와 같이 요망되는 임의의 추가의 시험으로 처리할 수 있다. 특히, 깨끗한 미생물 샘플을 필요로 하는 임의의 시험을 재현탁된 미생물을 사용하여 수행할 수 있다. 일부 구체예에서, 추가의 동정 시험을 수행할 수 있다. 동정 시험의 예에는 바이텍(Vitek^®) 2, 증폭 및 미-증폭 핵산 시험(NAT), 발색 및 라텍스 응집 분석, 면역분석(예를 들어, 표지된 항체 및/또는 다른 리간드를 사용), 질량 분석법(예를 들어, MALDI-TOF 질량 분석법) 및/또는 광학 기술, 이를 테면 적외선 분광법(FTIR) 또는 라만 분광법이 포함된다. 또한, 항생제 및/또는 다른 약물에 대한 내성과 같은 추가의 특성규명 시험을 수행할 수 있다. 추가의 특성규명은 상기 방법의 초기 분리 및 동정 단계 중에 시작된 시험의 일부일 수 있다. 예를 들어, 표지된 페니실린을 미생물의 분리 이전에 샘플에 첨가함으로써, 메티실린 내성 스태필로코쿠스 아우레우스의 검출을 시작할 수 있다. 펠릿이 회수되고 재현탁되면, 결합된 표지의 수준을 결정할 수 있다.

본 발명의 하나의 양태에서, 상기 방법 단계의 일부 또는 모두를 자동화할 수 있다. 방법의 단계들을 자동화하는 것은 더 많은 샘플이 더욱 신속히 시험될 수 있게 할 뿐만 아니라 유해하고/하거나 감염성인 미생물을 함유할 수 있는 샘플을 취급하는 데에 있어서 사람 실수의 위험을 줄인다.

본 발명의 특정 구체예에서, 상기 방법은 또한, 샘플 중의 미생물의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 구체예에서, 상기 방법은

(a) 샘플을 수득하는 단계;

(b) 임의로 상기 시험 샘플 중의 세포를 용해시켜, 용해된 샘플을 생성하는 단계; 및

(c) 미생물을 상기 용해된 샘플의 다른 성분으로부터 분리하여, 미생물 펠릿을 형성하는 단계를 포함하며; 여기서, 펠릿의 존재는 미생물이 시험 샘플 중에 존재하는 것을 나타낸다. 하나의 구체예에서, 펠릿을 육안으로 검출한다. 다른 구체예에서, 펠릿을 재현탁시키고, 분리하고, 질량 분석법에 의해 조사한다.

일부 구체예에서, 검출 방법은 미생물에 의한 오염에 대하여 샘플, 예를 들어 식료품, 약제, 음용수 등을 모니터링하기 위하여 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 방법은 오염에 대한 지속적인 모니터링을 위하여 반복적인 방식, 예를 들어, 1달에 1회, 1주에 1회, 1일에 1회, 1시간에 1회, 또는 임의의 다른 시간 패턴으로 수행할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 샘플을 필요에 따라, 예를 들어, 오염이 의심되는 경우에 시험할 수 있다. 추가의 구체예에서, 검출 방법은 임상 샘플, 예를 들어 혈액 배양물 중의 미생물의 존재를 찾기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플을 특정 시간에 혈액 배양물로부터 제거할 수 있으며, 검출 방법을 샘플 상에서 수행하여, 혈액 배양물이 양성인지를 결정한다. 하나의 구체예에서, 샘플을 배양의 접종 이후 설정 시간, 예를 들어, 접종 24 시간 후에, 취하여, 혈액 배양물이 양성인지를 결정할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 샘플을 혈액 배양물로부터 정기적으로, 예를 들어, 매 12, 6, 4 또는 2시간 마다 또는 매 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 또는 5분 마다 취하여, 검출가능하게 양성이 되는 짧은 시간 내에 양성 혈액 배양물을 동정할 수 있다. 검출 방법의 특정 구체예에서, 상기 검출 단계는 임의로 본 명세서에 기재된 동정 방법으로 이어질 수 있다.

본 발명의 하나의 양태에서, 상기 방법 단계의 일부 또는 모두를 자동화할 수 있다. 상기 방법의 단계를 자동화하는 것은 더 많은 수의 샘플을 더 효율적으로 시험하게 하고, 유해하고/거나 감염성인 미생물을 함유할 수 있는 샘플을 취급하는 데에서 사람 실수의 위험을 줄인다. 그러나, 더욱 중요하게, 자동화는 지체 없이 낮 또는 밤의 어느 시간에도 결정적인 결과를 낼 수 있다. 몇몇의 연구는 패혈증을 유발하는 유기체의 더 빠른 동정이 개선된 환자 관리, 더 짧은 병원 체류 및 더 낮은 전반적인 비용과 상호관련되는 것을 보여주었다.

본 발명에 따라서 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법에 대한 추가의 세부 사항 및 설명은 둘 모두 2009년 10월 30일에 출원된 발명의 명칭이 각각 "Method for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Spectroscopy" 및 "Method for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Raman Spectroscopy"인 계류중인 미국 특허 출원 일련번호 에 기재되어 있으며, 상기 미국 출원들은 그 내용이 본원에 참조로 포함된다.

본 발명은 하기의 실시예에서 추가로 상술되며, 실시예는 예시의 방식으로 제공되며, 본 발명을 어떤 방식으로도 제한하고자 하지 않는다. 해당 분야에 잘 알려져 있는 표준 기술 또는 특별히 후술되는 기술을 사용한다.

실시예

실시예 1. MALDI-TOF 질량 분광법에 의해 혈액 배양물로부터 미생물을 동정하기 위한 용해-원심분리 방법

미생물을 10 ml의 인간 혈액을 함유한 BacT/ALERT^® SA 병에 소량의 접종량으로 "시딩"하였다. 혈액 배양 브로쓰 샘플을 BacT/ALERT^® 3D 미생물 검출 시스템에 의해 양성으로 플래깅되는 수 분내에 병으로부터 분리하였다. 브로쓰 샘플을 다음과 같이 처리하여, 후속 분석을 간섭할 수 있는 혈액 및 배지 성분들로부터 미생물을 분리하였다:

새로운 양성 혈액 배양물로부터의 브로쓰 4.0 ㎖를 2.0 ㎖ 용해 완충액 (0.3M CAPS 중의 0.45% Brij^®97, pH 11.7)와 배합하고, 5초간 와류 혼합시킨 후, 37℃ 워터 배쓰(water bath)에서 90초간 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 0.95 ㎖의 용해물을 4개의 1.5 ㎖ 원뿔형 원심분리 튜브 각각에서 0.5 ㎖의 밀도 쿠션 (10mM Hepes 중의 14% w/v 이오헥솔, 0.005% 플루로닉 F-108, pH 7.4)의 상부에 층 형태로 깔았다. 그 후, 4개의 튜브 모두를 25℃에서 10,000 g에서 2분간 원심분리하여 밀도 쿠션을 통해 미생물을 침강(펠릿화)시켰다. 용해된 혈액 및 배지는 쿠션 위에 남아 있었다.

원심분리 사이클의 완료시에, 상청액을 제거하고, 각각의 튜브에서 침강(펠릿화)된 미생물을 10㎕의 정제수로 재현탁시켰다. 4개의 튜브 모두로부터의 재현탁된 미생물을 깨끗한 튜브내로 풀링(pooling)시키고, 천천히 혼합시켰다. 그 후, 660 nm에서의 최종 현탁액의 광학 밀도 (A₆₆₀)이 20/cm가 되도록, 각각의 처리된 표본의 부피를 조정하였다. 처리된 표본을 동일자 시험을 위해 2 내지 8℃에서 저장하거나 후일에 시험하기 위해 분취하고 -70℃에서 동결시켰다.

실시예 2. MALDI-TOF MS에 의해 용해-원심분리를 이용한 양성 혈액 배양물로부터 처리된 미생물 표본의 분석

실시예 1의 절차에 따라 처리된 표본을 37℃에서 신속히 해동시키고 (이미 동결된 경우), 천천히 혼합시킨 후, 정제수 중에서 사용 농도(use-strength) (1:4, 1:8 및 1:16)로 희석시켰다. 각각의 희석된 표본 1.0 ㎕을 MALDI-TOF 표적 플레이트에 2중식으로 적용하였다. 2중식 각각의 하나에 1.0 ㎕의 50% 포름산을 첨가하였다. 모든 적용된 표본을 주위 온도에서 건조시킨 후, 1.0 ㎕의 매트릭스 용액을 적용하였다. 매트릭스는 Alpha-Cyano (알파-시아노-4-히드록시신남산 용액, AnagnosTec GmbH, Germany)와 DHB (2,5-디히드록시벤조산, AnagnosTec GmbH, Germany)의 50:50 혼합물로 구성되었다.

비교를 위해, 상응하는 미생물 단리물을 그러한 종에 적합한 아가 배지에서 증식시켰고, MALDI-TOF 표적 플레이트상에 직접 2중식으로 도말하였다. 2중 스폿(spot) 중 하나에 있는 미생물을 1.0 ㎕의 정제수에 이어 1.0 ㎕의 50% 포름산으로 원위치에서 재현탁시켰다. 소정의 단리물로부터의 둘 모두의 스폿을 건조시킨 후, 1.0 ㎕의 매트릭스 혼합물을 각각의 스폿에 첨가하였다.

모든 미생물 표본이 완전히 건조된 후, Axima Assurance MALDI-TOF 질량 분석기 (Shimadzu Biotech North America, Maryland)로 2,000 내지 34,000의 질량/전하 범위에 걸쳐 각각에 대해 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 획득하였다.

양성 혈액 배양물로부터 회수된 선별된 미생물의 대표적인 질량 스펙트럼이 도 1 내지 3에 도시되어 있다. 도면상의 질량/전하 비는 명확성을 위해 축소되었지만, 이러한 도면에 예시된 동일한 결과는 모든 질량 범위에 대해 적용된다.

도 1은 4개의 종 각각에 대해, 예시의 명확성을 위해 평균화된, 5개의 임상 단리물의 시딩된 혈액 배양물로부터 처리된 미생물의 스펙트럼을 도시한다. 소정의 질량/전하 비에서의 피크의 존재 또는 부재에 있어서 두드러진 차이를 쉽게 알 수 있고, 이는 이러한 생물체들에 대해 특징적이다. 질량/전하 피크는 모든 스펙트럼에 대해 공통되지 않는데, 이는 본 발명에 따른 처리 후에 혈액 또는 배양 배지로부터의 이월효과(carryover)의 결과로써 존재하는 경우 잠재적으로 질량을 불명료하게 하는 물질이 거의 존재하지 않음을 나타낸다.

도 2는 도 1에서 평균화되어 도시된 스태필로코쿠스 아우레우스 단리물의 개개의 질량 스펙트럼을 도시한다. 5개의 스펙트럼은 혈액 공여자가 상이한 다양한 혈액 배양물에서 증식된 경우에도 상이한 임상 단리물들 사이의 상기 미생물에 대한 질량 스펙트럼의 일관성을 도시한다.

도 3은 도 1에 도시된 5개의 대장균 단리물의 평균화된 스펙트럼을, 아가 배지 (5% 양 혈액이 함유된 트립틱 소이 아가(Tryptic Soy Agar), bioMerieux Inc.)상에서 증식시킨 콜로니로부터 직접 샘플링된 동일한 5개의 단리물의 스펙트럼과 비교한 도면이다. 질량 스펙트럼의 유사성은 혈액 배양물의 처리가 미생물 기원이 아닌 물질을 효율적으로 제거하며 미생물에 대해 특이적인 질량을 보존함을 나타낸다.

실시예 3. MALDI-TOF MS에 의한 용해-원심분리을 이용한 양성 혈액 배양물로부터 처리된 미생물 표본의 동정 및 상업적으로 이용가능한 미생물 동정 데이터베이스

실시예 1과 2에 기재된 바와 같이 123개의 미생물 단리물을 증식시키고, 처리하고, 질량 분석하였다. 미생물은 임상 혈액 배양물에서 통상적으로 검출되는 14종의 세균 및 효모를 포함하였다.

각각의 질량 스펙트럼을 획득한 후, 분석을 위해 질량 피크의 목록을 "사라미스(Saramis)" 미생물 동정 소프트웨어 (AnagnosTec GmbH, Germany)에 입력하였다. 이러한 소프트웨어는 아가 증식된 미생물로부터 수집된 MALDI-TOF 질량 스펙트럼의 데이터베이스를 기반으로 만들어진 것이다.

표 1은 동일한 시드 배양물로부터 병렬적으로 혈액 배양물내에서 그리고 아가 배지상에서 증식시킨 모든 단리물의 결과를 도시한다. 표 1의 결과는 모든 배양물에 대해 작성된 것이지만, 일부 단리물에 대한 최종 현탁액 중의 세포 농도는 실시예 1에 제시된 표적 농도 미만이었다. 세포 농도가 표적 값의 20% 미만인 경우, 그러한 단리물을 표 작성으로부터 배제시키고, 나머지 단리물들의 결과를 표 2로 다시 편집하였다. 실제로, 세포 수가 적은 배양물은 펠릿 재현탁 부피를 감소시키거나 보다 큰 부피의 배양 브로쓰를 처리함으로써 보상될 수 있다.

표 1 및 2의 "종에 대한 정확성" 컬럼은 소정의 단리물에 대한 표적 스폿 세트로부터의 스펙트럼 중 적어도 하나 그리고 통상적으로 하나 이상이 90% 이상의 신뢰 수준에서 하나의 종으로서 또는 2개 내지 3개의 밀접하게 관련된 종의 그룹으로서 정확하게 동정되는 단리물의 갯수를 의미한다. 마찬가지로, 스펙트럼이 정확한 속 또는 과에 대해 90% 이상의 신뢰도를 나타내지만 종을 표시하지 않으며 데이터베이스와 매칭되는 경우, 단리물은 속 또는 과 수준에 대해 정확하게 동정된 것으로 간주된다. "ID 없음/틀린 ID" 컬럼은 적절한 ID를 위해 전반적으로 품질이 너무 낮아서 신뢰할 만한 동정을 하지 못하거나 드물게는 잘못된 동정을 초래하는 질량 스펙트럼을 산출하는 단리물이다. 이러한 기준은 본 연구를 위해 합리적인 것으로 여겨지지만, 상기 소프트웨어는 숙련된 사용자로 하여금 위도(latitude)를 조정하여 개인적 요구에 대해 적절한 동정 신뢰도 기준을 설정할 수 있게 해준다.

종 수준에 대해 거의 95% 정확성인 본 발명에 의한 미생물 동정의 성공은 76% 미만의 동정 정확성이 보고된 이미 공지된 처리 방법으로 수행된 이전 연구에비해 분명히 우수하다 (참조: MAIER, T. et. al,. "Rapid Identification of Bacteria from Blood Cultures Using MALDI-TOF MS", Poster ICAAC 48^th Annual Meeting, 2008; Drake et al., "MALDI-TOF Mass Spectrometry Based Identification of Clinically Important Microorganisms", ASMS Poster, Philadelphia 2009). 임의의 갯수의 수학적 모델 또는 스펙트럼 데이터베이스가 혈액 배양물로부터 미생물을 동정하기 위해 사용될 수 있지만, 상업용 데이터베이스에 의한 이러한 결과는 본 발명에 의해 혈액 배양물로부터 처리된 미생물이 "순수한" 콜로니로부터의 아가 증식형(agar-grown) 스펙트럼의 데이터베이스와 매칭되기에 충분할 만큼 오염성 질량 피크를 함유하지 않음을 가장 잘 보여준다

표 1: 모든 단리물

표 2: 세포 질량 기준을 충족시키는 단리물

상기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 이를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 본 발명은 하기 특허청구범위에 의해 규정되며, 이러한 특허청구범위의 균등물이 거기에 포함될 것이다. 모든 간행물, 특허출원, 특허, 특허 공개문헌, 및 본원에 인용된 임의의 다른 참고문헌은 참고문헌이 기술되는 문장 및/또는 문단과 관련된 교시에 대해 그 전체가 참조로 포함된다.

Claims

(a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 시험 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 시험 샘플에서 비-미생물 세포(non-microorganism cell)를 선택적으로 용해시켜서 용해된 샘플을 생성시키는 단계;
(c) 상기 용해된 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 분리하여 상기 미생물의 단리된 샘플을 형성하는 단계;
(d) 상기 단리된 미생물 샘플을 질량 분석법에 의해 조사(interrogating)하여 상기 미생물의 질량 스펙트럼을 획득하는 단계; 및
(e) 상기 측정된 질량 스펙트럼을, 공지된 미생물의 세포 성분들의 공지되거나 예측된 질량 및/또는 기준 질량 스펙트럼과 비교함으로써 상기 단리된 샘플내의 상기 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 단계를 포함하는, 시험 샘플로부터 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 (c)로부터의 상기 단리된 미생물 샘플의 일부 또는 전부가 회수되어 상기 조사 단계 (d)에 앞서 담체 기질(carrier substrate)상에 배치되는, 방법.
제 1항에 있어서, 단계 (c)에서 분리 수단이 원심분리인, 방법.
제 1항에 있어서, 단계 (c)에서 분리 수단이 여과인, 방법.
제 1항에 있어서, 단계 (c)로부터의 상기 단리된 미생물 샘플의 일부 또는 전부가 상기 조사 단계 (d)에 앞서 분리 도중에 담체 기질상에 직접 침착되는(deposited), 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분석법이 MALDI-TOF 질량 분석법, 탈착 전자분무 이온화(DESI) 질량 분석법, GC 질량 분석법, LC 질량 분석법, 전자분무 이온화(ESI) 질량 분석법 및 선택 이온 흐름 튜브(SIFT) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제 6항에 있어서, 상기 미생물이 하나 이상의 표현형 및/또는 형태상 특징을 기반으로 특성규명되는, 방법.
제 1항에 있어서, 상기 미생물이 그람 그룹, 임상적 그람 그룹, 치료적 그룹 및 기능적 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 분류 모델로 특성규명되는, 방법.
제 1항에 있어서, 상기 미생물이 속 수준, 종 수준, 또는 균주 수준으로 동정되는, 방법.
제 1항에 있어서, 상기 선택적 용해 단계(b)가 하나 이상의 세정제를 포함하는 용해액을 사용하여 수행되는, 방법.
제 10항에 있어서, 상기 하나 이상의 세정제가 Triton^® X-100, Triton^® X-100-R, Triton^® X-114, NP-40, Genapol^® C-100, Genapol^® X-100, Igepal^® CA 630, Arlasolve™200, Brij^® 96/97, CHAPS, 옥틸 β-D-글루코피라노시드, 사포닌, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 (C12E9, 폴리도세놀), 소듐 도데실 설페이트, N-라우릴사르코신, 소듐 데옥시콜레이트, 담즙산염(bile salt), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드, SB3-10, SB3-12, 아미도설포베타인-14, C7BzO, Brij^® 98, Brij^® 58, Brij^® 35, Tween^® 80, Tween^® 20, Pluronic^® L64, Pluronic^® P84, 비세정제(non-detergent) 설포베타인 (NDSB 201), 암피폴(amphipol) (PMAL-C8), 및 메틸-β-시클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제 10항에 있어서, 상기 세정제가 구조 C₁₂ _-18/E₉ _-10을 포함하는 폴리옥시에틸렌 세정제인, 방법.
제 10항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌 세정제가 Brij^® 97, Brij^®96V, Genapol^® C-100, Genapol^® X-1OO, 및 폴리도세놀로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제 10항에 있어서, 상기 용해액이 하나 이상의 단백질분해효소와 하나 이상의 누클레아제의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 효소를 추가로 포함하는, 방법.
제 10항에 있어서, 상기 용해액이 하나 이상의 완충제를 포함하는, 방법.
제 1항에 있어서, 상기 용해된 샘플이 용기내에서 밀도 쿠션(density cushion)상에 층 형태로 깔려지며, 상기 용기가 원심분리되어 미생물 펠릿을 형성시키는, 방법.
제 16항에 있어서, 상기 밀도 쿠션이 콜로이드성 실리카, 아이오드화된 조영제, 수크로즈, 현미경 침지 오일, 미네랄 오일, 실리콘 오일, 플루오로실리콘 오일, 실리콘 겔, 메트리조에이트-Ficoll^®, 디아트리조에이트-덱스트란, 카르복시메틸 셀룰로즈, 히드록시프로필메틸 셀룰로즈, 폴리에틸렌 옥사이드 (고분자량), Pluronic^® F127, Pluronic^® F68, 폴리아크릴산, 가교된 폴리비닐 알코올, 가교된 폴리비닐 피롤리딘, PEG 메틸 에테르 메타크릴레이트, 펙틴, 아가로즈, 크산탄, 젤란, Phytagel^®, 소르비톨, Ficoll^®, 글리세롤, 덱스트란, 글리코겐, 세슘 클로라이드, 퍼플루오로카본 유체, 및/또는 히드로플루오로카본 유체 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
제 1항에 있어서, 상기 시험 샘플이 미생물을 함유하는 것으로 알려진 배양 샘플인, 방법.
(a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 혈액 배양물로부터 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 시험 샘플에서 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시켜서 용해된 샘플을 생성시키는 단계;
(c) 밀폐 용기내에서 상기 용해된 샘플을 밀도 쿠션상에 층 형태로 까는 단계;
(d) 상기 용기를 원심분리함으로써 상기 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 분리하여 미생물의 펠릿(pellet)을 형성하는 단계;
(e) 상기 단리된 미생물 샘플을 질량 분석법에 의해 조사하여 상기 미생물의 질량 스펙트럼을 획득하는 단계; 및
(f) 상기 측정된 질량 스펙트럼을, 공지된 미생물의 세포 성분들의 공지되거나 예측된 질량 및/또는 기준 질량 스펙트럼과 비교함으로써 상기 단리된 샘플내의 상기 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 단계를 포함하는, 혈액 배양물로부터 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법.
(a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 시험 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 시험 샘플을 밀폐 용기내에서 밀도 쿠션상에 층 형태로 까는 단계;
(c) 상기 용기를 원심분리함으로써 시험 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 분리하여 미생물의 펠릿을 형성하는 단계;
(d) 상기 펠릿을 질량 분석법에 의해 조사하여 상기 미생물의 질량 스펙트럼을 획득하는 단계; 및
(e) 상기 측정된 질량 스펙트럼을, 공지된 미생물의 세포 성분들의 공지되거나 예측된 질량 및/또는 기준 질량 스펙트럼과 비교함으로써 상기 단리된 샘플내의 상기 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 단계를 포함하는, 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법.
제 20항에 있어서, 단계 (c)로부터의 상기 미생물 펠릿의 일부 또는 전부가 회수되어 상기 조사 단계 (d)에 앞서 담체 기질상에 배치되는, 방법.
제 20항에 있어서, 상기 질량 분석법이 MALDI-TOF 질량 분석법, 탈착 전자분무 이온화(DESI) 질량 분석법, GC 질량 분석법, LC 질량 분석법, 전자분무 이온화(ESI) 질량 분석법 및 선택 이온 흐름 튜브(SIFT) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제 20항에 있어서, 상기 밀도 쿠션이 콜로이드성 실리카, 아이오드화된 조영제, 수크로즈, 현미경 침지 오일, 미네랄 오일, 실리콘 오일, 플루오로실리콘 오일, 실리콘 겔, 메트리조에이트-Ficoll^®, 디아트리조에이트-덱스트란, 카르복시메틸 셀룰로즈, 히드록시프로필메틸 셀룰로즈, 폴리에틸렌 옥사이드 (고분자량), Pluronic^® F127, Pluronic^® F68, 폴리아크릴산, 가교된 폴리비닐 알코올, 가교된 폴리비닐 피롤리딘, PEG 메틸 에테르 메타크릴레이트, 펙틴, 아가로즈, 크산탄, 젤란, Phytagel^®, 소르비톨, Ficoll^®, 글리세롤, 덱스트란, 글리코겐, 세슘 클로라이드, 퍼플루오로카본 유체, 히드로플루오로카본 유체 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제 20항에 있어서, 상기 미생물이 하나 이상의 표현형 및/또는 형태상 특징을 기반으로 특성규명되는, 방법.
제 20항에 있어서, 상기 미생물이 그람 그룹, 임상적 그람 그룹, 치료적 그룹 및 기능적 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 분류 모델로 특성규명되는, 방법.
제 20항에 있어서, 상기 미생물이 속 수준, 종 수준, 또는 균주 수준으로 동정되는, 방법.
제 20항에 있어서, 상기 시험 샘플이 미생물을 함유하는 것으로 알려진 배양 샘플인, 방법.