KR20110091717A - 분광법을 이용하여 미생물을 분리하고/하거나 특성규명하고/하거나 동정하는 방법 - Google Patents

분광법을 이용하여 미생물을 분리하고/하거나 특성규명하고/하거나 동정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시험 샘플에서 미생물을 분리, 특성규명 및/또는 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 시험 샘플에 존재할 수 있는 비-미생물 세포를 용해하기 위한 임의적 용해 단계 이후 분리 단계를 포함한다. 본 방법은 혈액 함유 배양 배지와 같은 복잡한 샘플로부터 미생물을 분리, 특성규명 및/또는 동정하기 위해 유용할 수 있다. 본 발명은 또한 미생물의 측정을 수행하기 위한 분리된 미생물 샘플의 분광학적 조사, 및 상기 분광학적 측정을 이용하여 샘플 중의 미생물의 특성규명 및/또는 동정을 제공한다.

Description

분광법을 이용하여 미생물을 분리하고/하거나 특성규명하고/하거나 동정하는 방법{METHODS FOR SEPARATION, CHARACTERIZATION AND/OR IDENTIFICATION OF MICROORGANISMS USING SPECTROSCOPY}
관련 출원의 상호 참조
본원은 2008년 10월 31일에 출원된 발명의 명칭이 "Method and System for Detection and/or Characterization of a Biological Particle in a Sample"인 미국 특허 가출원 번호 61/110,187을 우선권으로 주장하며, 상기 가출원은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 샘플내의 미생물을 검출하고/하거나, 단리하고/하거나 동정하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 분광 기술을 이용하여 미생물을 신속히 특성규명하고/하거나 동정하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
생물학적 유체에서 병원성 미생물을 검출하는 것은 가능한 최단 시간내에 수행되어야 하는데, 특히 의사가 이용할 수 있는 항생제가 풍부함에도 불구하고 사망률이 여전히 높은 패혈증(septicemia)의 경우에 그러하다. 환자의 체액, 특히 혈액내에 미생물과 같은 생물학적 활성 물질이 존재한다는 것은 일반적으로 혈액 배양병을 사용하여 결정된다. 혈류 감염은 높은 이환율 및 사망률과 관련되지만, 배양에 이은 생화학적 동정과 항생제 민감도 시험으로 구성된 현재의 진단 방법은 그 실행에 수 일이 소요될 수 있다. 전형적으로, 임상 증상을 토대로 하여 경험적 치료(empiric therapy)가 시작되고, 시험 결과는 최초 치료가 실패한 경우 임상적 결정에 영향을 미칠 뿐이다. 양성 혈액 배양 결과 후 최초 수 시간 이내에, 바람직하게는 1시간 이내에 혈류 감염을 특성규명하는 능력은, 제공되는 진단 정보의 임상적 타당성을 현저히 증강시킬 것이다. 분자 증폭 방법이 이러한 요구를 충족시키기 위해 제안되었지만, 이러한 방법은 여전히 심각한 문제점을 안고있다. 양성 혈액 배양 브로쓰(broth) 그 자체는 다양한 신속 동정(ID) 시험에 사용될 수 있는 잠재성을 지닌 천연적으로 증폭된 미생물 개체군을 나타낸다.
Vitek®, Phoenix™ 및 Microscan® 시스템과 같은 통상적인 자동 표현형 ID 시험, 또는 API와 같은 수동 표현형 시험은 확실한 결과를 제공하기 위해 미생물이 적절한 증식 시기에 있고 간섭성(interfering) 배지 및 혈액 생성물이 없을 것을 요구한다. 이러한 시스템은 평판 배지상에서 18 내지 24시간 동안 양성 브로쓰로부터 증식된 콜로니를 사용한다. 그러나, 보다 신속한 결과를 얻기 위해, 일부 실험실은 양성 혈액 배양병으로부터 단리된 미생물과 함께 이러한 시스템들을 사용하여 연구를 보고해왔다. 이러한 병으로부터의 직접 시험(direct-from-the-bottle test)은 모든 미생물에 대해 적합하지 않고 (예를 들어, 그람 양성 구균), 시험 업체에 의해 인증되지 않고, 결과가 나오는 데에 일반적으로 3 내지 8시간이 소요된다. 양성 배양 결과 후 최초 수 시간 이내에, 바람직하게는 1시간 이내에 의사에게 임상적으로 타당한 결과를 제공하기 위해 보다 신속하고 더욱 광범위하게 특이적인 시험이 긴급히 필요한 실정이다.
광학 분광법, 예를 들어 고유 형광(intrinsic fluorescence, IF), 적외선 분광법(FTIR) 또는 라만(Raman) 분광법, 그리고 질량 분석법, 예를 들어 MALDI-TOF는 미생물을 매우 신속히 동정할 수 있는 가능성을 지니지만, 액체 미생물 배양 배지 그리고 혈액 또는 이의 배합물과 같은 임상 샘플에 존재하는 다수의 고도로 형광성이고 흡광성(absorptive)인 화합물로부터 간섭을 받을 수 있다. 양성 혈액 배양 브로쓰로부터 직접 미생물을 회수하기 위해 가장 보편적으로 사용되는 방법은 투-스텝(two-step) 분별 원심분리 및 혈청 분리 튜브에서의 원심분리이다.
미생물을 분리하고/하거나, 특성규명하고/하거나 동정하기 위한 다른 방법들이 공지되었고, 그 예는 다음과 같다:
미국 특허 번호 4,847,198에는 UV 여기형(UV excited) 라만 분광법을 이용하여 미생물을 동정하는 방법이 개시되어 있다. 상기 '198 특허에 따르면, 세균 현탁액을 자외선 범위의 단일 파장에 접촉시킨다. 사용되는 광에너지의 일부는 흡수되고, 그러한 광에너지의 일부는 방출된다. 공명 증진 라만 산란(resonance enhanced Raman scattering)인 방출된 광에너지는 후방산란된(backscattered) 에너지로서 측정된다. 이러한 에너지를 프로세싱(processing)하여 세균의 특징을 나타내는 스펙트럼을 생성시킨다.
보-딘(Vo-Dinh)의 미국 특허 번호 5,938,617은 수 가지 파장의 광으로 샘플을 여기시키고 그리고 동기식으로 방출 강도를 샘플링함으로써 샘플내의 생물학적 병원체를 동정하는 시스템에 관한 것이다. 이러한 시스템은 샘플을 여기 방사선에 노출시킴으로써 방출 방사선을 생성시키기 위한 메커니즘을 포함한다. 생물학적 병원체는 바이러스와 세균일 수 있다.
미국 특허 번호 6,177,266에는 세포의 단백질 추출물 또는 전세포(whole cell)의 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행시간 질량 분석법(MALDI-TOF-MS)에 의해 생성된 속, 종 및 균주 특이적 바이오마커(biomarker)를 사용하여 세균을 화학적으로 분류하는 방법이 개시되어 있다.
미국 특허 번호 7,070,739에는 체액 또는 균질화된 조직으로부터 직접적으로 2차원 초원심분리에 의해 바이러스를 포함하는 미생물을 추출하고, 분리하고, 정제하는 방법이 제공되어 있다. 첫 번째 원심분리 단계에서는 동정하고자 하는 미생물의 침강 속도 보다 높은 침강 속도를 지닌 모든 입자를 제거한다. 두 번째 초원심분리 단계에서는 채워진 액체 중에서 등밀도 밴딩(isopycnic banding)을 사용함으로써 특수한 톱니형(serrated) 원심분리 튜브에 의해 광범위한 밀도 구배를 형성한다. 상기 특허에 따르면, 핵산 특이적 염료를 사용하여 광산란 또는 형광에 의해 밴딩된(banded) 입자를 검출하기 위해 그리고 바이러스 단백질 서브유닛과 무손상 바이러스 입자의 질량 분석법에 의한 특성규명 및 제한 효소에 의해 생성된 단편들의 덩어리 및 핵산 덩어리 둘 모두의 형광 유세포 분석 측정에 의한 특성규명을 위해 매우 적은 부피로 밴딩된 입자를 회수하기 위해, 분리 기법이 사용될 수 있다.
미국 특허 출원 공개 번호 2007/0037135에는 액체에 현탁된 생물학적 샘플을 동정하고 정량하기 위한 시스템이 개시되어 있다. 이러한 시스템은 하나 이상의 여기 광원을 지닌 형광 여기 모듈; 상기 하나 이상의 여기 광원으로부터 여기 광을 수용하도록 생물학적 샘플을 위치시키기 위해 상기 형광 여기 모듈에 광학적으로 커플링된 샘플 인터페이스 모듈; 상기 샘플 인터페이스 모듈에 광학적으로 커플링되며 생물학적 샘플의 형광 여기-방출 매트릭스를 검출하기 위한 하나 이상의 검출 장치를 포함하는 형광 방출 모듈; 및 상기 형광 방출 모듈에 작동적으로 커플링된 컴퓨터 모듈을 포함한다. 컴퓨터 모듈은 생물학적 샘플을 동정하고 정량하기 위해 생물학적 샘플의 형광 여기-방출 매트릭스에 대해 다변량 분석(multivariate analysis)을 수행한다. 그러나, 상기 '135 출원에는 혈액과 같은 복잡한 생물학적 샘플로부터 미생물을 동정하고 정량하는 것이 논의되어 있지 않다.
미국 특허 출원 공개 번호 2007/0175278에는, 예를 들어 혈액, 소변, 대변, 정맥내 카테터 등, 산업용 생산 라인, 수도 시설(water system), 식품, 향장품(cosmetic product), 약제 제품 및 법의학 샘플을 포함하는 관심있는 샘플을 배양하기 위해 액체 배양 배지를 사용하는 것이 기재되어 있다. 후속하여, 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어 원심분리에 의해 액체 배지로부터 미생물을 수거할 수있다. 그 후, 진동 스펙트럼을 수득하기 위해, 임의로 건조 후에, 농축된 미생물을 담체 물질에 전달할 수 있다. 상기 특허 출원에는 라만 분광법과 같은 진동 분광법을 포함하는, 미생물을 동정하고 분류하기 위한 다양한 방법이 논의되어 있다.
그러나, 이러한 방법들은 혈액 함유 배양 배지와 같은 복잡한 샘플로부터 미생물을 분리하고 특성규명하려고 하는 경우 여러 결점들을 지닌다. 생성된 미생물 제조물(preparation)은 종종 오염성 적혈구, 혈소판, 지질 입자, 혈장 효소 및 세포 파편(cellular debris)을 함유하는데, 이는 불량한 결과를 초래할 수 있다. 이러한 방법들은 또한 매우 많은 노동력을 필요로 하고 잠재적으로 위험한 병원체를 사용자에게 에어로졸 노출시킬 수 있는 단계들로 인해 안전하지 않다. 이렇게 간섭하는 물질이 없고 신속한 동정 기술에 적합한 임상 샘플 (예를 들어, 혈액 배양 브로쓰) 및 다른 복잡한 샘플로부터 미생물을 단리하기 위한 간단하고 안전하며 신뢰할 수 있는 방법이 필요한 실정이다.
발명의 개요
본 발명은 샘플내의 미생물을 단리하고/하거나, 특성규명하고/하거나 동정하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 종래의 기술에 비해 더욱 신속히 미생물을 특성규명하고/하거나 동정할 수 있게 함으로써, 진단 (예를 들어, 패혈증에 걸렸거나 걸린 것으로 의심되는 피검체의 경우) 그리고 오염된 재료의 확인 (예를 들어, 음식물 및 약제)이 보다 신속히 이루어지게 한다. 샘플을 수득하는 것에서부터 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 것에 이르기까지 본 발명에 포함되는 단계들은 임상적으로 타당한 유용한 정보를 산출하기 위해 매우 짧은 시간 범위내에서, 예를 들어 약 120분 미만의 시간 범위내에서 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 완전 자동화될 수 있어서 감염성 물질을 만지고/거나 샘플을 오염시킬 위험을 감소시킬 수 있다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 시험 샘플로부터 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,
(a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 시험 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 시험 샘플에서 비-미생물 세포(non-microorganism cell)를 선택적으로 용해시켜서 용해된 샘플을 생성시키는 단계;
(c) 상기 용해된 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 분리하여 단리된 미생물 샘플을 형성하는 단계;
(d) 상기 단리된 미생물을 분광학적으로 조사(spectroscopically interrogating)하여 상기 미생물의 분광학적 측정치를 산출하는 단계; 및
(e) 상기 분광학적 측정치를, 공지된 미생물로부터 수득된 분광학적 측정치 또는 공지된 미생물로부터 예측되는 분광학적 특성과 비교함으로써 상기 단리된 샘플내의 상기 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 단계를 포함한다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 혈액 배양물로부터 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,
(a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 혈액 배양물로부터 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 시험 샘플에서 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시켜서 용해된 샘플을 생성시키는 단계;
(c) 밀폐 용기내에서 상기 용해된 샘플을 밀도 쿠션(density cushion)상에 층 형태로 까는 단계;
(d) 상기 용기를 원심분리함으로써 상기 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 분리하여 미생물의 펠릿(pellet)을 형성하는 단계;
(e) 상기 단리된 미생물을 분광학적으로 조사하여 상기 미생물의 분광학적 측정치를 산출하는 단계; 및
(f) 상기 분광학적 측정치를, 공지된 미생물로부터 수득된 분광학적 측정치 또는 공지된 미생물로부터 예측되는 분광학적 특성과 비교함으로써 상기 단리된 샘플내의 상기 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은,
(a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 시험 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 시험 샘플을 밀폐 용기에 넣는 단계;
(c) 상기 시험 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 원위치(in situ)에서 분리하여 상기 밀폐 용기에서 단리된 미생물 샘플을 형성하는 단계;
(d) 상기 단리된 미생물을 원위치에서 분광학적으로 조사하여 상기 미생물의 분광학적 측정치를 산출하는 단계; 및
(e) 상기 분광학적 측정치를, 공지된 미생물로부터 수득된 분광학적 측정치 또는 공지된 미생물로부터 예측되는 분광학적 특성과 비교함으로써 상기 단리된 샘플내의 상기 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 단계를 포함한다.
한 가지 구체예에서, 밀폐 용기 (예를 들어, 기밀 밀봉된(hermetically sealed) 용기)내에서 밀도 쿠션상에 시험 샘플을 층 형태로 깔고 상기 용기를 원심분리하여 미생물을 펠릿화함으로써 분리가 수행되는 동안 시험 샘플 배지는 상기 밀도 쿠션의 상부에 남아 있게 된다. 또 다른 구체예에서, 용기는 미생물 펠릿이 분광학적으로 조사될 수 있도록 저부 및/또는 측부에 광학창(optical window)을 지닌다. 펠릿의 스펙트럼을 공지된 미생물의 스펙트럼(들) 또는 공지된 미생물로부터 예측되는 분광학적 특성과 비교함으로써 미생물이 동정될 수 있다. 추가의 조작없이 펠릿에서 직접 미생물을 동정할 수 있는 능력은 이러한 미생물 동정 방법의 안전성을 크게 개선시킨다.
한 가지 구체예에서, 분광학적 조사는 미생물의 고유한 특성 (예를 들어, 고유 형광)을 토대로 한다. 다른 구체예들에서, 분광학적 조사는 본 발명의 방법 도중에 첨가되어 특정 미생물들 또는 미생물 군들과 상호작용하는 추가의 물질로부터 수득된 신호를 부분적으로 토대로 한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 미생물 펠릿을 회수하고 미생물을 재현탁시키고 추가의 동정 또는 특성규명 시험 (예를 들어, 약물 내성, 독성 인자, 안티바이오그램(antibiogram))을 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 첨부된 도면 및 하기 제시된 기재사항을 통해 보다 상세히 설명된다.
도 1은 스트렙토코쿠스 뉴모니애(S. pneumoniae) 배양물 및 음성 배양 브로쓰에 대해 본 발명의 용해, 분리 단계를 수행한 후의 분리 용기의 사진을 도시한다.
도 2a 내지 2c는 조사(interrogation)에 선행되는 용해 단계에서 용해 완충액 A, B 및 C를 사용한 경우 단리된 미생물의 예시적인 여기/방출 스펙트럼을 도시한다.
도 3은 5개의 상이한 용해 완충액과 2개의 밀도 쿠션을 사용하여 본 발명의 용해 및 분리 단계를 수행한 후의 분리 용기의 사진을 도시한다.
도 4는 용해된 미생물 함유 혈액 배양 브로쓰의 원심분리후의 상태(post-centrifugation)를 도시하는 분리 장치의 사진이다. 사진속에는 용해된 혈액 배양물, 밀도 쿠션 및 미생물 펠릿이 분명히 관찰된다.
도 5 내지 8은 밀봉 분리 용기에서 판독된 다양한 미생물에 대한 여기/방출 스펙트럼의 예를 도시한다.
도 9는 10개의 스트렙토코쿠스 미티스(S. mitis) (원) 그리고 10개의 스트렙토코쿠스 뉴모니애(S. pneumoniae) (삼각형) 배양물로부터 수득된 펠릿의 평균 고유 형광 신호를 그래프로 도시한다.
도 10은 10개의 스트렙토코쿠스 미티스(S. mitis) (원) 그리고 10개의 스트렙토코쿠스 뉴모니애(S. pneumoniae) (삼각형) 배양물로부터 수득된 펠릿에 대한 평균 펠릿 크기를 그래프로 도시한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 다양한 형태로 구체화될 수 있는데, 본원에 제시된 구체예들로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 그 보다는 이러한 구체예들은 본원의 기재내용이 면밀하고 완전해지도록 하기 위해 제공되며, 당업자에게 본 발명의 범위를 충분히 전달해줄 것이다. 예를 들어, 하나의 구체예에 관해 예시되는 특징들은 다른 구체예들에 포함될 수 있고, 특정 구체예에 관해 예시되는 특징들은 그러한 구체예로부터 삭제될 수 있다. 또한, 본 발명을 벗어나지 않는 본원에 제시된 구체예들에 대한 다수의 변화 및 추가사항이 본 기재내용에 비추어 볼 때 당업자에게 명백할 것이다.
달리 규정되지 않는 한 본원에 사용된 모든 과학 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 보편적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 지닌다. 본 발명의 설명에서 사용되는 전문용어는 특정 구체예들을 설명하기 위한 것일 뿐이며 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
정의.
본원에서 단수 형태로 사용되는 경우 1개 또는 1개를 초과함을 의미할 수 있다. 예를 들어 "세포"라는 것은 하나의 세포를 의미하거나 다수의 세포를 의미할 수 있다.
또한, 본원에서 "및/또는" 또는 "하고/하거나"는 열거된 관련 사항들 중 어느 하나 또는 하나 이상의 모든 가능한 조합을 지칭하고 이를 포함하며, 택일적 ("또는")으로 해석되는 경우에는 조합을 포함하지 않는다.
또한, 본 발명의 화합물 또는 물질의 양(amount), 용량(dose), 시간, 온도 등과 같은 측정가능한 값을 지칭하는 경우에 "약"이라는 용어는 규정된 양의 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.5%, 또는 ±0.1% 변동을 포함하고자 한다.
본원에 사용되는 용어 "미생물"은 실험실에서 증식시키고 취급할 수 있는 일반적으로 단세포인 생물체를 포함하도록 의도되는데, 이의 예로는 비제한적으로 그람 양성 또는 그람 음성 세균, 효모, 곰팡이(mold), 기생충 및 몰리큐트(mollicute)가 있다. 본 발명의 그람 음성 세균의 비제한적 예로는 하기 속의 세균이 있다: 슈도모나스(Pseudomonas), 에스케리치아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 엔테로박터(Enterobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 세라티아(Serratia), 프로테우스(Proteus), 캄필로박터(Campylobacter), 헤모필루스(Haemophilus), 모르가넬라(Morganella), 비브리오(Vibrio), 예르시나(Yersinia), 아시네토박터(Acinetobacter), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 브레분디모나스(Brevundimonas), 랄스토니아(Ralstonia), 아크로모박터(Achromobacter), 푸소박테리움(Fusobacterium), 프레보텔라(Prevotella), 브란하멜라(Branhamella), 나이세리아(Neisseria), 부르콜데리아(Burkholderia), 시트로박터(Citrobacter), 하프니아(Hafnia), 에드워드시엘라(Edwardsiella), 에어로모나스(Aeromonas), 모락셀라(Moraxella), 브루셀라(Brucella), 파스퇴렐라(Pasteurella), 프로비덴시아(Providencia) 및 레지오넬라(Legionella). 본 발명의 그람 양성 세균의 비제한적 예로는 하기 속의 세균이 있다: 엔테로코쿠스(Enterococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스태필로코쿠스(Staphylococcus), 바실루스(Bacillus), 페니바실루스(Paenibacillus), 락토바실루스(Lactobacillus), 리스테리아(Listeria), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 클로스트리디움(Clostridium), 박테로이즈(Bacteroides), 가르드네렐라(Gardnerella), 코쿠리아(Kocuria), 락토코쿠스(Lactococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 미크로코쿠스(Micrococcus), 미코박테리아(Mycobacteria) 및 코리네박테리아(Corynebacteria). 본 발명의 효모 및 곰팡이의 비제한적 예로는 하기 속의 것들이 있다: 칸디다(Candida), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 노카르디아(Nocardia), 페니실리움(Penicillium), 알테르나리아(Alternaria), 로도토룰라(Rhodotorula), 아스페르길루스(Aspergillus), 푸사리움(Fusarium), 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 트리코스포론(Trichosporon). 본 발명의 기생충의 비제한적 예로는 하기 속의 것들이 있다: 트리파노소마(Trypanosoma), 바베시아(Babesia), 리슈마니아(Leishmania), 플라스모디움(Plasmodium), 우체리아(Wucheria), 브루기아(Brugia), 온코세르카(Onchocerca) 및 네글레리아(Naegleria). 본 발명의 몰리큐트의 비제한적 예로는 하기 속의 것들이 있다: 미코플라스마(Mycoplasma) 및 우레아플라스마(Ureaplasma).
한 가지 구체예에서, 본원에 추가로 상세히 설명되는 바와 같이, 샘플에 존재하는 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하기 위해 샘플 또는 증식 배지로부터의 미생물이 분리되고 조사될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "분리하다"는 본래의 상태로부터 이동되거나 농축되거나 다른 방식으로 따로 떨어져 있게 된 임의의 미생물 샘플을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 발명에 따르면, 미생물은, 존재하는 경우 특성규명 및/또는 동정을 간섭할 수 있는 비-미생물 또는 비-미생물 성분들로부터 분리될 수 있다 (예를 들어, 분리된 샘플로서). 이러한 용어는 2개의 다른 층들 사이에 샌드위치된 미생물 층, 예를 들어 원심분리 후에 고밀도 쿠션의 상부에 응집된 미생물, 또는 고체 표면 (예를 들어, 필터 막)에 응집된 미생물 층을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 용어는 층 (예를 들어, 밀도 쿠션)을 부분적으로 통과한 미생물들의 응집체(collection)를 포함할 수 있다. 이와 같이, 분리된 미생물 샘플은 본래의 샘플에 비해 더욱 농축된 상태이거나 다른 방식으로 본래의 샘플과 따로 떨어져 있는 미생물들의 임의의 응집체 또는 층 및/또는 이의 성분들을 포함할 수 있고, 이는 미생물들의 단단히 뭉쳐진 조밀한 덩어리에서부터 미생물들의 확산층(diffuse layer)에 이르는 범위로 존재할 수 있다. 분리된 형태 또는 샘플에 포함될 수 있는 미생물 성분들은 비제한적으로 임의의 조합된 형태의 필리(pilli), 플라젤라(flagella), 핌브리애(fimbriae), 및 캡슐(capsule)이 있다. 미생물로부터 분리되는 비-미생물 성분들은 비-미생물 세포 (예를 들어, 혈액 세포 및/또는 다른 조직 세포) 및/또는 이들의 임의의 성분들을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본원에 추가로 상세히 설명되는 바와 같이, 샘플에 존재하는 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하기 위해 샘플 또는 증식 배지로부터의 미생물이 단리되고 조사될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "단리된"은 본래의 상태로부터 또는 증식 또는 배양 배지 및 그 안에 함유된 임의의 비-미생물들 또는 비-미생물 성분들로부터 적어도 부분적으로 정제된 미생물들의 임의의 샘플을 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 본 발명에 따르면, 미생물은, 존재하는 경우 특성규명 및/또는 동정을 간섭할 수 있는 비-미생물 또는 비-미생물 성분으로부터 단리될 수 있다 (예를 들어, 단리된 샘플로서). 미생물로부터 분리되는 비-미생물 성분으로는 비-미생물 세포 (예를 들어, 혈액 세포 및/또는 다른 조직 세포) 및/또는 이의 임의의 성분들이 있을 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본원에 추가로 상세히 설명되는 바와 같이, 샘플에 존재하는 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하기 위해 샘플 또는 증식 배지로부터의 미생물은 펠릿화되고 조사될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "펠릿"은 미생물 덩어리로 압축되거나 침착된 미생물의 임의의 샘플을 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 샘플로부터의 미생물은 원심분리 또는 당 분야에 공지된 다른 방법에 의해 튜브의 저부에서 덩어리로 압축되거나 침착될 수 있다. 이러한 용어는 원심분리 후에 용기의 저부 및/또는 측부상에 있는 미생물 (및/또는 이의 성분)의 응집체를 포함한다. 펠릿에 포함될 수 있는 미생물 성분으로는 비제한적으로 임의의 조합된 형태의 필리, 플라젤라, 핌브리애, 및 캡슐이 있다. 본 발명에 따르면, 미생물은, 존재하는 경우 특성규명 및/또는 동정을 간섭할 수 있는 비-미생물들 또는 비-미생물 성분들로부터 펠릿화될 수 있다 (예를 들어, 실질적으로 정제된 미생물 펠릿으로서). 미생물들로부터 분리된 비-미생물 성분들로는 비-미생물 세포 (예를 들어, 혈액 세포 및/또는 다른 조직 세포) 및/또는 이의 임의의 성분들이 있을 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "밀도 쿠션"은 전체적으로 균질한 밀도를 지닌 용액을 지칭한다.
본 발명은 샘플내의 미생물을 단리하고/하거나, 특성규명하고/하거나 동정하는 방법을 제공한다. 더욱이, 이러한 방법은 혈액을 함유하는 배양 배지와 같은 복잡한 샘플로부터 미생물을 분리하고/하거나, 특성규명하고/하거나 동정하는 데에 특히 유용할 수 있다. 또한, 신속한 방법은 종래의 기법에 비해 보다 빨리 미생물의 특성규명 및/또는 동정을 가능하게 하여 진단 (예를 들어, 패혈증에 걸렸거나 걸린 것으로 의심되는 피검체의 경우) 그리고 오염된 재료의 특성규명/동정 (예를 들어, 음식물 및 약제)이 보다 신속히 이루어지게 한다. 샘플을 수득하는 것으로부터 미생물을 특성규명/동정하는 것에 이르기 까지 본 발명의 방법에 포함되는 단계들은 임상적으로 타당한 유용한 정보를 수득하기 위해 매우 짧은 시간 범위내에서 수행될 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 방법은 약 120분 미만, 예를 들어 약 110분, 100분, 90분, 80분, 70분, 60분, 50분, 40분, 30분, 20분, 15분, 10분, 5분, 4분, 3분, 2분, 또는 1분 미만 이내에 수행될 수 있다. 본 발명의 방법의 놀랄만한 신속함은 종래의 방법에 비해 개선을 나타낸다. 이러한 방법은 본원에 기술된 바와 같이 임의의 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하기 위해 사용될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 미생물은 세균이다. 또 다른 구체예에서, 미생물은 효모이다. 또 다른 구체예에서, 미생물을 곰팡이다. 추가의 구체예에서, 미생물을 기생충이다. 또 다른 구체예에서, 미생물은 몰리큐트이다. 추가로, 본 발명의 방법은 완전 자동화될 수 있어서 감염성 물질을 만지고/거나 샘플을 오염시킬 위험을 감소시킬 수 있다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 시험 샘플로부터 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,
(a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 시험 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 시험 샘플에서 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시켜서 용해된 샘플을 생성시키는 단계;
(c) 상기 시험 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 분리하여 단리된 미생물 샘플을 형성하는 단계;
(d) 상기 단리된 미생물을 분광학적으로 조사하여 상기 미생물의 분광학적 측정치를 산출하는 단계; 및
(e) 상기 분광학적 측정치를, 공지된 미생물로부터 수득된 분광학적 측정치 또는 공지된 미생물로부터 예측되는 분광학적 특성과 비교함으로써 상기 단리된 샘플내의 상기 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 단계를 포함한다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 혈액 배양물로부터 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,
(a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 혈액 배양물로부터 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 시험 샘플에서 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시켜서 용해된 샘플을 생성시키는 단계;
(c) 밀폐 용기내에서 상기 용해된 샘플을 밀도 쿠션상에 층 형태로 까는 단계;
(d) 상기 용기를 원심분리함으로써 상기 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 분리하여 미생물의 펠릿을 형성하는 단계;
(e) 상기 단리된 미생물을 분광학적으로 조사하여 상기 미생물의 분광학적 측정치를 산출하는 단계; 및
(f) 상기 분광학적 측정치를, 공지된 미생물로부터 수득된 분광학적 측정치 또는 공지된 미생물로부터 예측되는 분광학적 특성과 비교함으로써 상기 단리된 샘플내의 상기 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은,
(a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 시험 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 시험 샘플을 밀폐 용기 (예를 들어, 기밀 밀폐 용기)에 넣는 단계;
(c) 상기 시험 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 원위치에서 분리하여 상기 밀폐 용기에서 단리된 미생물 샘플을 형성하는 단계;
(d) 상기 단리된 미생물을 원위치에서 분광학적으로 조사하여 상기 미생물의 분광학적 측정치를 산출하는 단계; 및
(e) 상기 분광학적 측정치를, 공지된 미생물로부터 수득된 분광학적 측정치 또는 공지된 미생물로부터 예측되는 분광학적 특성과 비교함으로써 상기 단리된 샘플내의 상기 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 이러한 방법들은 미생물을 조사하기 전에 분리 단계 동안 형성된 미생물의 펠릿 또는 이의 일부를 분리 용기로부터 회수하는 것을 포함한다. 예를 들어, 펠릿의 형성 후에, 유체가 그러한 펠릿으로부터 흡인될 수 있고, 펠릿은 적절한 배지 (예를 들어, 미생물이 생존할 수 있는 배지)에 재현탁될 수 있다. 재현탁된 미생물은 분리 용기로부터 꺼내어질 수 있다. 그 후, 미생물은, 예를 들어 현탁액 상태로 또는 리펠릿화된(repelleted) 후에, 특성규명 및/또는 동정을 위해 조사될 수 있다. 다른 구체예에서, 재현탁된 미생물은, 예를 들어 현탁액 상태로 또는 리펠릿화된 후에, 분리 용기내에서 조사될 수 있다. 추가의 구체예에서, 펠릿으로부터 회수된 미생물은 추가 조사 (예를 들어, 라만 분광법, 질량 분석법)를 위해 재현탁하지 않고 직접 사용될 수 있다.
샘플
본 발명의 방법에 의해 시험될 수 있는 샘플 (즉, 시험 샘플)은 미생물 존재 및/또는 증식이 의심되거나 의심될 수 있는 임상 및 비임상 샘플 둘 모두 뿐만 아니라 미생물의 존재에 대해 정례적으로 또는 이따금씩 시험되는 재료의 샘플을 포함한다. 사용되는 샘플의 양은 방법의 다능성(versatility) 및/또는 민감도(sensitivity)에 따라 크게 달라질 수 있다. 샘플 준비는 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 수행될 수 있지만, 본 발명의 이점들 중 하나는 혈액, 체액 및/또는 다른 불투명한 물질과 같은 복잡한 샘플 유형이 과도한 전처리를 거의 거치지 않거나 과도한 전처리없이 시스템을 사용하여 직접 시험될 수 있다는 점이다. 한 가지 구체예에서, 샘플은 배양물로부터 취해진다. 또 다른 구체예에서, 샘플은 미생물 배양물 (예를 들어, 혈액 배양물)로부터 취해진다. 또 다른 구체예에서, 샘플은 그 안에 미생물을 함유하는 것으로 의심되거나 미생물을 함유한 것으로 알려져 있다.
시험될 수 있는 임상 샘플은 임상 또는 연구 실험실에서 전형적으로 시험되는 임의의 유형의 샘플을 포함하는데, 이의 예로는 비제한적으로 혈액, 혈청, 혈장, 혈액 분획, 관절액, 소변, 정액, 타액, 대변, 뇌척수액, 위 내용물(gastric content), 질 분비물, 조직 균질물, 골수 흡인물(bone marrow aspirate), 뼈 균질물(bone homogenate), 담(sputum), 흡인물, 스왑(swab) 및 스왑 린세이트(swab rinsate), 다른 체액 등이 있다. 또 다른 구체예에서, 임상 샘플은 배양될 수 있고, 배양 샘플이 사용될 수 있다.
본 발명은 연구 뿐만 아니라 수의학 및 의학 분야에 사용된다. 임상 샘플을 수득할 수 있는 적절한 피검체는 일반적으로 포유동물 피검체이지만, 임의의 동물일 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "포유동물"은 비제한적으로 인간, 인간 이외의 영장류, 소, 양, 염소, 돼지, 말, 고양이, 개, 토끼, 설치류 (예를 들어, 랫트 또는 마우스) 등을 포함한다. 인간 피검체는 신생아, 유아, 청소년, 성인 및 노인 피검체를 포함한다. 샘플을 수득할 수 있는 피검체로는 비제한적으로 포유동물, 조류, 파충류, 양서류 및 어류가 있다.
또한, 시험될 수 있는 비임상 샘플로는 비제한적으로 음식물, 음료, 약제, 향장품, 물 (예를 들어, 음용수, 비음용수 및 폐수), 해수 밸러스트(seawater ballast), 공기, 토양, 오수(sewage), 식물 물질 (예를 들어, 종자, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 열매), 혈액 생성물 (예를 들어, 혈소판, 혈청, 혈장, 백혈구 분획 등), 공여 장기(donor organ) 또는 조직 샘플, 생물전쟁(biowarfare) 샘플 등을 포함하는 물질이 있다. 또한, 본 발명의 방법은 산업 환경에서 오염 수준, 공정 제어, 품질 관리 등을 모니터하기 위한 실시간 시험을 위해 특히 적합하다. 또 다른 구체예에서, 비임상 샘플은 배양될 수 있고, 배양 샘플이 사용될 수 있다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 샘플은 미생물에 감염되었거나 미생물에 감염된 것으로 의심되는 피검체 (예를 들어, 환자)로부터 수득된다. 한 가지 구체예에서, 피검체는 세균혈증 또는 진균혈증과 같은 패혈증에 걸렸거나 패혈증에 걸린 것으로 의심된다. 샘플은 피검체로부터 직접 유래된 혈액 샘플일 수 있다. 샘플은 환자의 혈액 샘플로부터 증식된 혈액 배양물, 예를 들어 BacT/ALERT® 혈액 배양물로부터 유래될 수 있다. 혈액 배양 샘플은 양성 혈액 배양물, 예를 들어 미생물의 존재를 나타내는 혈액 배양물로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예들에서, 샘플은 양성으로 판명된 후 짧은 시간 이내에, 예를 들어 약 6시간 이내, 예를 들어 약 5시간, 4시간, 3시간 또는 2시간 이내이거나 약 60분 이내, 예를 들어 약 55분, 50분, 45분, 40분, 35분, 30분, 25분, 20분, 15분, 10분, 5분, 4분, 3분, 2분 또는 1분 이내에 양성 혈액 배양물로부터 채취된다. 한 가지 구체예에서, 샘플은 미생물이 대수 증식기에 있는 배양물로부터 채취된다. 또 다른 구체에에서, 샘플은 미생물이 정지기에 있는 배양물로부터 채취된다.
본 발명은 미생물의 검출, 특성규명 및/또는 동정을 위한 높은 민감도를 제공한다. 이는 미생물을 고체 또는 반고체 배지상에서 증식시키고 증식하는 콜로니를 샘플링함으로써 미생물을 단리하는 단계를 먼저 거칠 필요없이 검출, 특성규명 및/또는 동정을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 한 가지 구체예에서, 샘플은 고체 또는 반고체 표면상에서 증식시킨 미생물 (예를 들어, 세균, 효모 또는 곰팡이) 콜로니로부터 유래되지 않는다.
샘플의 부피는 본 발명의 분리/단리 단계가 수행된 후에 조사될 수 있는 미생물의 펠릿 또는 단리된 미생물 샘플을 생성시키기에 충분히 커야 한다. 적절한 부피는 샘플의 공급원 및 샘플내의 미생물의 예상 수준에 좌우된다. 예를 들어, 양성 혈액 배양물은 오염에 대해 시험하려는 음용수 샘플 보다 높은 부피 당 미생물 수준을 함유하는데, 따라서 음용수 샘플과 비교하여 보다 적은 부피의 혈액 배양 배지가 필요할 수 있다. 일반적으로, 샘플 크기는 약 50 ml 미만, 예를 들어 약 40 ml, 30 ml, 20 ml, 15 ml, 10 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 또는 2 ml 미만이다. 특정 구체예들에서, 샘플 크기는 약 1 ml 미만, 예를 들어 약 0.75 ml, 0.5 ml, 또는 0.25 ml 일 수 있다. 분리가 미세규모로 수행되는 특정 구체예들에서, 샘플 크기는 약 200 μl 미만, 예를 들어 약 150 μl, 100 μl, 50 μl, 25 μl, 20 μl, 15 μl, 10 μl, 또는 5 μl 미만일 수 있다. 일부 구체예 (예를 들어, 샘플이 적은 수의 미생물을 포함할 것으로 예상되는 경우)에서, 샘플 크기는 약 100 ml 또는 그 초과, 예를 들어 약 250 ml, 500 ml, 750ml, 또는 1000 ml 또는 그 초과일 수 있다.
임의적 용해 단계
일부 구체예에서, 샘플을 수득한 후, 본 발명의 다음 단계는 샘플에 존재할 수 있는 요망되지 않는 세포, 예를 들어 혈액 세포 및/또는 조직 세포를 선택적으로 용해시키는 것이다. 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 분리할 수 있도록 세포가 용해될 수 있다. 다른 성분들로부터 미생물을 분리하면 조사 단계 동안 간섭을 방지할 수 있다. 비-미생물 세포가 샘플에 존재할 것으로 예상되지 않거나 조사 단계를 간섭할 것으로 예상되지 않는 경우, 용해 단계는 수행할 필요가 없을 수 있다. 한 가지 구체예에서, 용해시키려는 세포가 샘플에 존재하는 비-미생물 세포이고, 샘플에 존재할 수 있는 미생물 세포는 용해되지 않는다. 그러나, 일부 구체예에서, 특정 부류의 미생물을 선택적으로 용해시키는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 본원에 기재된 방법 및 당 분야에 널리 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 한 부류의 요망되지 않는 미생물이 선택적으로 용해될 수 있는데, 예를 들어 효모는 용해되는 반면 세균이 용해되지 않거나 그 반대일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 미생물의 특정 세포내 성분, 예를 들어 세포막 또는 소기관을 분리하기 위해 요망되는 미생물이 용해된다. 한 가지 구체예에서, 모든 비-미생물 세포가 용해된다. 다른 구체예들에서, 비-미생물 세포의 일부가 용해되는데, 예를 들어 조사 단계의 간섭을 방지하기에 충분한 수의 세포가 용해된다. 세포의 용해는, 미생물을 용해시키거나 용해시키지 않으며 세포를 선택적으로 용해시키기에 효과적인 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있는데, 이의 예로는 비제한적으로 용해액의 첨가, 초음파처리(sonication), 삼투압 쇼크, 화학적 처리 및/또는 이의 조합이 있다.
용해액은 세포, 예를 들어 비-미생물 세포 (진핵 세포막을 가용화시킴으로써) 및/또는 미생물 세포를 용해시킬 수 있는 것이다. 한 가지 구체예에서, 용해액은 하나 이상의 세정제(detergent), 하나 이상의 효소, 또는 하나 이상의 세정제와 하나 이상의 효소의 조합물을 포함할 수 있고, 추가의 물질을 더 포함할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 세정제는 비변성 용해 세정제, 예를 들어 Triton® X-100, Triton® X-100-R, Triton® X-114, NP-40, Genapol® C-100, Genapol® X-100, Igepal® CA 630, Arlasolve™200, Brij® 96/97, CHAPS, 옥틸 β-D-글루코피라노시드, 사포닌, 및 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 (C12E9, 폴리도세놀)일 수 있다. 임의로, 변성 용해 세정제로는 예를 들어 소듐 도데실 설페이트, N-라우릴사르코신, 소듐 데옥시콜레이트, 담즙산염(bile salt), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드, SB3-10, SB3-12, 아미도설포베타인-14, 및 C7BzO가 있을 수 있다. 임의로, 가용화제로는 또한 예를 들어 Brij® 98, Brij® 58, Brij® 35, Tween® 80, Tween® 20, Pluronic® L64, Pluronic® P84, 비세정제(non-detergent) 설포베타인 (NDSB 201), 암피폴(amphipol) (PMAL-C8), 및 메틸-β-시클로덱스트린이 있을 수 있다. 전형적으로, 비변성 세정제 및 가용화제는 이의 임계 미셀 농도(CMC) 보다 높은 농도로 사용되는 반면, 변성 세정제는 이의 CMC 보다 낮은 농도로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 비변성 용해 세정제는 약 0.010% 내지 약 10%, 예를 들어 약 0.015% 내지 약 1.0%, 예를 들어 약 0.05% 내지 약 0.5%, 예를 들어 약 0.10% 내지 약 0.30% (샘플에 의한 희석 후의 최종 농도)로 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 폴리옥시에틸렌 세정제가 바람직할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 세정제는 C12-18/E9-10 구조를 포함할 수 있는데, 여기서 C12-18은 탄소수 12개 내지 18개의 탄소 사슬 길이를 의미하고, E9-10은 9개 내지 10개의 옥시에틸렌 친수성 헤드기(head group)를 의미한다. 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 세정제는 Brij® 97, Brij® 96V, Genapol® C-100, Genapol® X-100, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 (폴리도카놀), 또는 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
용해액에 사용될 수 있는 효소로는 비제한적으로 핵산 및 다른 막 오염(membrane-fouling) 물질을 분해시키는 효소 (예를 들어, 프로테이나제 XXIII, DNase, 뉴라미니다제, 폴리사카라이다제, Glucanex®, 및 Pectinex®)가 있다. 사용될 수 있는 다른 첨가제로는 비제한적으로 환원제, 예를 들어 2-메르캅토에탄올 (2-Me) 또는 디티오트레이톨(DTT) 및 안정화제, 예를 들어 마그네슘, 피루베이트, 및 습윤제(humectant)가 있다. 용해액은 요망되는 세포를 용해시키기에 적절한 임의의 pH에서 완충될 수 있고, 비제한적으로 샘플 유형, 용해시키려는 세포 및 사용되는 세정제를 포함하는 다수의 인자에 좌우된다. 일부 구체예에서, pH는 약 2 내지 약 13, 예를 들어 약 6 내지 약 13, 예를 들어 약 8 내지 약 13, 예를 들어 약 10 내지 약 13일 수 있다. 적절한 pH 완충액으로는 요망되는 범위, 예를 들어 약 0.05 M 내지 약 1.0 M CAPS로 pH를 유지시킬 수 있는 임의의 완충액이 있다.
한 가지 구체예에서, 샘플과 용해액은 혼합된 후 세포막의 용해 및 가용화가 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션되는데, 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 또는 60초, 또는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20분 또는 그 초과, 예를 들어 약 1초 내지 약 20분, 약 1초 내지 약 5분, 또는 약 1초 내지 약 2분간 인큐베이션된다. 인큐베이션 시간은 용해액의 세기, 예를 들어 세정제 및/또는 효소의 농도에 좌우된다. 일반적으로, 약한 용해 완충액은 비-미생물 세포를 충분히 가용화시키기 위해 보다 긴 시간 및 보다 높은 샘플 희석을 필요로 한다. 용해액의 세기는 샘플에 존재하거나 존재하는 것으로 의심되는 미생물에 따라 선택될 수 있다. 보다 쉽게 용해되는 미생물의 경우, 약한 용해액이 사용될 수 있다. 용해는 약 2℃ 내지 약 45℃, 예를 들어 약 15℃ 내지 약 40℃, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃의 온도에서 일어날 수 있다. 한 가지 구체예에서, 용해액이 시린지(syringe)내로 로딩된 후 샘플이 그러한 시린지내로 흡인되어 혼합과 인큐베이션이 시린지내에서 일어나게 할 수 있다.
일부 구체예에서, 용해 조건 (예를 들어, 용해 또는 인큐베이션 시간) 뿐만 아니라 분리 및/또는 조사 단계는 샘플내의 미생물의 전부 또는 일부를 치사시키기에 충분할 수 있다. 본 발명의 방법은 매우 다능적이며 단리 및 동정이 일어나게 하기 위해 모든 미생물이 살아있어야 할 것을 요구하지 않는다. 특정 구체예들에서, 미생물의 전부 또는 일부가 치사될 수 있는데, 치사는 본 발명의 방법의 단계들이 수행되기 전, 수행되는 동안 및/또는 수행된 후에 일어난다.
분리 단계
본 발명의 방법의 다음 단계 (예를 들어, 용해 단계가 수행되는 경우 샘플이 용해된 후의 단계)는 분리 단계이다. 분리 단계는 샘플의 다른 성분들 (예를 들어, 비-미생물들 또는 이의 성분들)로부터 미생물을 분리하고 미생물을 동정 및 특성규명을 위해 조사될 수 있는 펠릿으로 농축시키기 위해 수행될 수 있다. 분리는 완전할 필요가 없는데, 즉, 100% 분리가 일어날 필요는 없다. 샘플의 다른 성분들로부터 미생물의 분리는 다른 성분들로부터의 실질적인 간섭없이 미생물을 조사할 수 있게 하기에 충분하기만 하면 된다. 예를 들어, 분리는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 순수하거나 그 보다 더 순수한 미생물 펠릿을 생성시킬 수 있다.
한 가지 구체예에서, 분리는 분리 용기내의 밀도 쿠션의 상부에 샘플 (예를 들어, 용해된 샘플) 놓이게 되는 원심분리 단계에 의해 수행되고, 용기는 미생물이 단리될 수 있게 하는 조건하에서 원심분리된다 (예를 들어, 미생물은 용기의 저부 및/또는 측부에서 펠릿을 형성할 수 있다). 이러한 구체예에 따르면, 샘플의 다른 성분들 (예를 들어, 샘플 배지에 존재할 수 있는 비-미생물 또는 이의 성분)은 밀도 쿠션위에 머물러 있거나 밀도 쿠션의 상부 부분 내에 머물러 있는다. 일반적으로, 임의의 공지된 용기가 분리 단계를 위해 사용될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 분리 용기는 2009년 10월 30일에 출원된 발명의 명칭이 "Separation Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms"인 관련 미국 특허 출원 일련 번호 에 기재된 분리 장치이다. 이러한 분리 단계는 샘플내의 물질, 예를 들어 배지, 세포 파편 및/또는 미생물의 조사 (예를 들어, 고유 형광에 의한 조사)를 간섭할 수 있는 다른 성분들로부터 미생물을 단리해낸다. 한 가지 구체예에서, 또한 밀도 쿠션은 살아있는 미생물을 죽은 미생물 (이는 밀도 쿠션을 통과하지 못함)과 분리하는 기능을 한다. 또 다른 구체예에서, 밀도 쿠션은 원심분리 전 또는 후에 밀도 구배를 포함하지 않는다. 바꿔 말하면, 분리 용기는 밀도 쿠션을 구성하는 물질이 밀도 구배를 형성하기에 충분한 시간 동안 및/또는 가속도(acceleration)로 원심분리되지 않는다.
쿠션의 밀도는 샘플내의 미생물은 쿠션을 통과하지만 샘플의 다른 성분들 (예를 들어, 혈액 배양 브로쓰, 세포 파편)은 쿠션위에 남아있거나 밀도 쿠션을 통한 경로의 전부를 통과하지 못하도록 선택된다. 또한, 밀도 쿠션은 살아있는 미생물 (쿠션을 통과함)을 죽은 미생물 (쿠션을 통과하지 못함)과 분리하도록 선택될 수 있다. 적절한 밀도는 밀도 쿠션에 사용되는 물질 및 분리하고자 하는 샘플에 좌우된다. 한 가지 구체예에서, 쿠션의 밀도는 약 1.025 내지 약 1.120 g/ml, 예를 들어 약 1.030 내지 약 1.070 g/ml, 약 1.040 내지 약 1.060 g/ml의 범위 또는 약 1.025 내지 약 1.120 g/ml 사이의 임의의 범위이다. 또 다른 구체예에서, 쿠션의 밀도는 약 1.025, 1.030, 1.035, 1.040, 1.045, 1.050, 1.055, 1.060, 1.065, 1.070, 1.075, 1.080, 1.085, 1.090, 1.095, 1.100, 1.105, 1.110, 1.115, 또는 1.120 g/ml 이다.
밀도 쿠션을 위한 물질은 본 발명의 방법을 위해 적절한 밀도 범위를 지니는 임의의 물질일 수 있다. 한 가지 구체예에서, 그러한 물질은 콜로이드성 실리카이다. 콜로이드성 실리카는 코팅되지 않거나 (예를 들어, Ludox® (W.R. Grace, CT)) 코팅될 수 있는데, 예를 들어 실란 (예를 들어, PureSperm® (Nidacon Int'l, Sweden) 또는 Isolate® (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)) 또는 폴리비닐피롤리돈 (예를 들어, Percoll™, Percoll™ Plus (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO))으로 코팅될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 분광학적 조사에 대해 최소의 간섭을 나타내는 콜로이드성 실리카가 선택되는데, 예를 들어 최저의 고유 형광을 지닌 물질이 선택된다. 콜로이드성 실리카는 알맞은 밀도를 형성하기 위해 임의의 적절한 배지, 예를 들어 균형 염 용액, 생리 식염수 및/또는 0.25 M 수크로스 중에서 희석될 수 있다. 적절한 밀도는 약 15% 내지 약 80% v/v, 예를 들어 약 20% 내지 약 65% v/v 농도의 콜로이드성 실리카를 사용하여 수득될 수 있다. 밀도 쿠션을 위한 또 다른 적절한 물질은 요오드화된 조영제(iodinated contrast agent), 예를 들어 이오헥솔(isohexol) (OmnipaqueTM NycoPrepTM, 또는 Nycodenz®) 및 이오딕사놀(iodixanol) (VisipaqueTM 또는 OptiPrepTM) 이다. 적절한 밀도는 혈액 배양 샘플의 경우 약 10% 내지 약 25% w/v, 예를 들어 약 14% 내지 약 18% w/v 농도의 이오헥솔 또는 이오딕사놀을 사용하여 수득될 수 있다. 수크로스가 혈액 배양 샘플의 경우 약 10% 내지 약 30% w/v, 예를 들어 약 15% 내지 약 20% w/v 농도로 밀도 쿠션으로서 사용될 수 있다. 밀도 쿠션을 제조하기 위해 사용될 수 있는 다른 적절한 물질로는 점도가 낮고 밀도가 높은 오일, 예를 들어 현미경 침지 오일(microscope immersion oil) (예를 들어, Type DF; Cargille Labs, New York), 미네랄 오일 (예를 들어, Drakeol® 5, Draketex 50, Peneteck®; Penreco Co., Pennsylvania), 실리콘 오일 (폴리디메틸실록산), 플루오로실리콘 오일, 실리콘 겔, ㅁ메트리조에이트-Ficoll® (LymphoPrep™) (예를 들어 혈액 배양 샘플의 경우 약 75% 내지 약 100%의 농도로 사용됨), 디아트리조에이트-덱스트란 (PolymorphoPrepTM) (예를 들어 혈액 배양 샘플의 경우 약 25% 내지 약 50%의 농도로 사용됨), 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시메틸 셀룰로스, 폴리에틸렌 옥사이드 (고분자량), Pluronic® F127, Pluronic® F68, Pluronic® 화합물들의 혼합물, 폴리아크릴산, 가교된 폴리비닐 알코올, 가교된 폴리비닐 피롤리딘, PEG 메틸 에테르 메타크릴레이트, 펙틴, 아가로즈, 크산탄, 젤란(gellan), Phytagel®, 소르비톨, Ficoll® (예를 들어, 혈액 배양 샘플의 경우 약 10% 내지 약 15% 농도의 Ficoll® 400), 글리세롤, 덱스트란 (예를 들어, 혈액 배양 샘플의 경우 약 10% 내지 약 15% 농도로 사용됨), 글리코겐, 세슘 클로라이드 (예를 들어, 혈액 배양 샘플의 경우 약 15% 내지 약 25% 농도로 사용됨), 퍼플루오로카본 유체 (예를 들어, 퍼플루오로-n-옥탄), 히드로플루오로카본 유체 (예를 들어, Vertrel XF) 등이 있으며 이들은 당 분야에 널리 알려져 있다. 한 가지 구체예에서, 밀도 쿠션은 임의의 조합된 형태의 콜로이드성 실리카, 이오딕사놀, 이오헥솔, 세슘 클로라이드, 메트리조에이트-Ficoll®, 디아트리조에이트-덱스트란, 수크로스, Ficoll® 400, 및/또는 덱스트란 중 하나 이상으로부터 선택된다. 또한, 밀도 쿠션은 물질들의 조합물로 구성될 수 있는데, 예를 들어 콜로이드성 실리카와 오일의 조합물로 구성될 수 있다. 상기 화합물들의 특정 조합물이 본 발명의 분리 및 판독 단계를 위해 유리할 수 있다. 예를 들어, 상이한 UV-켄칭(UV-quenching) 특성을 지닌 화합물들의 조합물, 예를 들어 세슘 클로라이드와 이오헥솔의 조합물이 그러할 수 있다.
밀도 쿠션의 부피/높이는 다른 샘플 성분으로부터의 미생물의 분리를 달성하기에 충분해야 한다. 부피는 분리 용기의 크기 및 형상에 좌우될 것이다. 일반적으로, 약 0.1 내지 약 5 ㎖, 예를 들어, 약 0.2 내지 약 1 ㎖, 예를 들어, 약 0.2 ㎖ 내지 약 0.5 ㎖의 부피가 사용될 수 있다. 분리가 미소 규모로 수행되는 경우, 밀도 쿠션의 부피는 약 1 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 예를 들어, 약 5 ㎕ 내지 약 50 ㎕일 수 있다. 밀도 쿠션의 상부에 가하거나 적층하는 샘플의 부피는 조사에 적합한 펠릿을 생성하기에 충분한 미생물을 제공하는데 충분해야 한다. 일반적으로, 용기에 적합한 임의의 부피가 사용될 수 있다. 예를 들어, 약 0.1 ㎖ 내지 약 5 ㎖, 예를 들어, 0.2 ㎖ 내지 약 1 ㎖, 예를 들어, 약 0.2 ㎖ 내지 약 0.5㎖의 부피가 사용될 수 있다. 분리가 미소 규모로 수행되는 경우, 샘플의 부피는 약 1 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 예를 들어, 약 5 ㎕ 내지 약 50 ㎕일 수 있다. 용기 내에서 샘플을 위해 이용가능한 공간은 용기의 크기 및 형상에 좌우될 것이다. 일부 구체예에서, 샘플을 상부에 가하거나 적층하기 전에, 중간층(액체 또는 고체)을 밀도 쿠션의 상부에 놓여지게 하여, 밀도 쿠션과 샘플의 임의의 혼합을 방지할 수 있다. 하나의 구체예에서, 중간층은 폴리에틸렌 비드(bead)일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 밀도 쿠션과 샘플 사이에 작은 기포를 정위시켜, 혼합을 방지할 수 있다. 추가의 구체예에서, 고밀도 물질(예컨대, 퍼플루오로카본 유체)의 상부에 밀도 쿠션을 적층하여, 미생물이 분리 중에 밀도 쿠션을 통과하고, 밀도 쿠션과 고밀도 물질 사이의 경계면에서 수집되게 할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 분리 용기를 스윙 아웃 로터(swing out rotor)에서 원심분리하여, 미생물이 용기의 바닥에 직접 펠릿을 형성하게 한다. 미생물이 샘플의 다른 성분으로부터 분리(예컨대, 펠릿 형성)되기에 충분한 시간 동안, 충분한 가속도로 용기를 원심분리한다. 원심분리 가속도는 약 1,000 x g 내지 약 20,000 x g, 예를 들어, 약 2,500 x g 내지 약 15,000 x g, 예를 들어, 약 7,500 x g 내지 약 12,500 x g 등일 수 있다. 원심분리 시간은 약 30초 내지 약 30분, 예를 들어, 약 1분 내지 약 15분, 예를 들어, 약 1분 내지 약 5분일 수 있다. 원심분리를 약 2 ℃ 내지 약 45 ℃, 예를 들어, 약 15 ℃ 내지 약 40 ℃, 예를 들어, 약 20 ℃ 내지 약 30 ℃의 온도에서 수행할 수 있다. 하나의 구체예에서, 분리 용기는 클로저(closure)를 포함하며, 클로저는 원심분리 전에 기밀 밀봉(hermetic seal)을 형성하도록 용기에 적용된다. 클로저의 존재는 감염성 및/또는 유해성이거나 또는 감염성 및/또는 유해성일 수 있는 미생물 취급으로부터의 위험을 감소시킬 뿐 아니라, 샘플의 오염 위험을 감소시킨다. 본 발명의 방법의 이점 중 하나는 밀봉된 용기(예컨대, 기밀 밀봉된 용기) 내에서 미생물을 사용하여 본 발명의 임의의 하나 이상의 단계(예컨대, 용해, 분리, 조사 및/또는 동정)를 수행하는 능력이다. 자동화된 시스템의 사용을 수반하는 본 발명의 방법은 예를 들어, 직접적인 시험을 위하여 샘플로부터 미생물을 회수하면서 발생하는, 매우 독성인 미생물의 취급과 관련된 건강 및 안전성 위험을 예방한다. 하나의 구체예에서, 밀도 쿠션 내에서 밀도 구배가 형성되기에 충분한 시간 및/또는 힘으로 용기를 원심분리하지 않는다. 본 발명은 샘플의 초원심분리, 예를 들어, 약 100,000 x g 초과의 힘에서의 원심분리를 수반하지 않는다. 추가로, 본 발명은 등밀도(평형) 침강 또는 밴딩(banding)을 수반하지 않는다.
분리 용기는 밀도 쿠션과 샘플을 보유하는데 충분한 부피를 갖는 임의의 용기일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 미국 특허 출원 제_호(출원일: 2009년 10월 30일, 발명의 명칭: "Separation Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms")에 개시된 분리 장치가 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 용기는 원심분리기 로터에 장착되거나 장착될 수 있다. 용기의 부피는 약 0.1 ㎖ 내지 약 25 ㎖, 예를 들어, 약 1 ㎖ 내지 약 10 ㎖, 예를 들어, 약 2 ㎖ 내지 약 8 ㎖일 수 있다. 분리가 미소 규모로 행해지는 경우, 용기의 부피는 약 2 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 예를 들어, 약 5 ㎕ 내지 약 50 ㎕일 수 있다. 하나의 구체예에서, 용기는 샘플 및 대부분의 밀도 쿠션을 수용하도록 상부에서 넓은 내경을 가지며, 미생물 펠릿이 수집되는 하부에서는 더 좁은 내경을 갖는다. 좁은 부분은 내경이 약 0.04 내지 약 0.12 인치, 예를 들어, 약 0.06 내지 약 0.10 인치, 예를 들어, 약 0.08 인치일 수 있다. 넓은 부분은 내경이 약 0.32 내지 약 0.40 인치, 예를 들어, 약 0.34 내지 약 0.38 인치, 예를 들어, 약 0.36 인치일 수 있다. 내경은 미소 규모 분리를 위해서는 심지어 더 작을 수 있다. 예를 들어, 좁은 부분의 내경은 약 0.001 내지 약 0.04 인치, 예를 들어, 약 0.002 내지 약 0.01 인치일 수 있다. 테이퍼형(tapered) 내경 부분이 상부 및 하부를 연결할 수 있다. 테이퍼형 부분은 각이 약 20 내지 약 70 도, 예를 들어, 약 30 내지 약 60 도일 수 있다. 하나의 구체예에서, 좁은 하부는 용기의 전체 높이의 절반 미만, 예를 들어, 용기의 전체 높이의 약 40%, 30%, 20%, 또는 10% 미만이다. 용기는 부착된 클로저 장치를 가질 수 있거나, 또는 용기가 원심분리 중에 기밀 밀봉될 수 있게 클로저 장치(예를 들어, 캡(cap))를 수용하도록 나사산이 형성(threaded)될 수 있다. 특정 구체예에서, 용기는 수동으로 또는 자동화된 방식(기술자가 용기 내용물에 노출되지 않도록)으로, 분리 후에, 용기로부터 미생물 샘플 또는 펠릿을 용이하게 회수할 수 있거나, 또는 달리 수득할 수 있거나, 또는 꺼낼 수 있도록 설계된다. 예를 들어, 용기는 펠릿을 함유하고, 용기의 나머지로부터 분리될 수 있는 분리가능한 부분 또는 이탈(break-away) 부분을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 용기는 분리 후에 펠릿에 접근하기 위한 수단, 예를 들어, 주사기 또는 다른 샘플링 장치의 삽입을 위한, 또는 펠릿을 빼내기 위한 하나 이상의 포트(port) 또는 투과성 표면을 포함한다. 하나의 구체예에서, 용기는 튜브, 예를 들어, 원심분리기용 튜브일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 용기는 칩 또는 카드일 수 있다. 하나의 구체예에서, 용기는 독립형 용기, 즉 단일의 샘플을 분리하기 위한 장치이다. 다른 구체예에서, 용기는 다수의 샘플이 동시에 분리될 수 있도록, 둘 이상의 분리 용기를 포함하는 장치의 부분이다. 하나의 구체예에서, 장치는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 36, 42, 48, 60, 72, 84, 96개 또는 그 이상의 분리 용기를 포함한다.
용기는 광학창(optical window)을 포함할 수 있으며, 이를 통하여, 조사가 일어날 수 있다. 광학창은 용기의 저부, 상부 및/또는 측부에 있을 수 있다. 창은 투광성(예를 들어, 근적외선(NIR; 700 nm-1400 nm), 자외선(UV; 190 nm-400 nm) 및/또는 가시광선(VIS; 400 nm-700 nm) 광 스펙트럼 중 적어도 한 부분)인 임의의 물질로 구성될 수 있다. 적합한 물질의 예에는 아크릴, 메타크릴레이트, 석영, 용융 실리카, 사파이어 및/또는 사이클릭 올레핀 공중합체(COC)가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 구체예에서, 전체 용기는 광학창 물질로 제조된다. 또 다른 구체예에서, 용기는 둘 이상의 개별 파트, 예를 들어, 광학창에 대해서는 광학적 UV-VIS-NIR 투과 성분 및 용기의 나머지를 구성하는 다른 물질(예를 들어, 더 저렴한 표준 몰딩(molding) 플라스틱)로부터 제조(예를 들어, 몰딩)될 수 있다. 하나의 구체예에서, 광학창은 분광학적 조사를 허용하기에 충분히 얇으며, 이는 창의 물질에 좌우될 것이다. 또 다른 구체예에서, 광학창은 분광 조사의 간섭을 줄이기 위하여 가능한 얇다. 예를 들어, 창은 두께가 약 0.20 인치 미만, 예를 들어, 약 0.15, 0.10, 또는 0.05 인치 미만일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 분리는 여과 단계에 의해 수행되며, 여기서 미생물을 보유하는 기공(pore) 크기를 갖는 선택적 필터 또는 필터 세트를 장착한 장치에 샘플(예를 들어, 용해된 샘플)을 배치한다. 적절한 완충액이 천천히 필터를 통과하여 지나가게 함으로써 보유한 미생물을 세정할 수 있다. 그 다음, 세정한 미생물을 필터 상에서 직접 조사하고/거나 조사를 위하여 필터의 표면을 직접 샘플링하거나, 적절한 수성 완충액으로 필터를 역-플러싱(back-flushing)함으로써 회수할 수 있다.
조사 단계(interrogation step)
미생물이 분리, 단리 및/또는 펠릿화되면, 분리된 샘플, 단리된 샘플 또는 펠릿을 조사하여, 샘플 또는 펠릿 내의 미생물을 동정 및/또는 특성규명할 수 있다. 하나의 구체예에서, 조사는 비-침습적인 방식으로 일어나며, 즉, 펠릿이 분리 용기에 남아 있는 동안 펠릿을 조사한다. 또 다른 구체예에서, 분리 용기는 조사 내내 여전히 밀봉되어 있다. 용기를 분리 및 동정/특성규명 과정 내내 밀봉되게 유지하는 것 및 절차 중 일부 또는 모두를 자동화하는 것과 임의로 결합되는 비-침습적인 방식으로 미생물을 동정하는 능력은 오염성 및/또는 감염성 샘플의 지속적인 취급을 방지하며, 전체 과정의 안전성을 상당히 증가시킨다. 또한, 샘플 또는 펠릿의 추가의 처리(예를 들어, 재현탁화, 플레이팅(plating) 및 콜로니의 성장) 없이, 직접적인 조사에 의하여 미생물을 특성규명 및/또는 동정하는 능력은 동정/특성규명이 이루어질 수 있는 속도를 상당히 증가시킨다. 하나의 구체예에서, 샘플 또는 펠릿을 조사 전에, 분리 용기로부터 회수 및/또는 재현탁화시키며, 임의로 제거한다. 또 다른 구체예에서, 샘플 또는 펠릿을 원위치(in situ)에서의 조사 후에, 회수 및/또는 재현탁화시킨 다음, 추가의 조사를 수행한다. 예를 들어, 단리된 미생물에 적용할 수 있으나 미생물 펠릿에는 적용할 수 없는 라텍스 응집(latex agglutination) 또는 자동화된 표현형 동정 시험과 같은 기술을 회수 및/또는 재현탁화된 미생물 상에서 수행할 수 있다.
일부 구체예에서, 단리된 샘플 또는 펠릿을 분광법으로 조사할 수 있다. 하나의 구체예에서, 광학적 분광 방법을 사용하여, 미생물의 하나 이상의 내재적 특성, 예를 들어 추가의 물질, 예를 들어, 스테인(stain), 염료, 결합제 등의 부재 하에서 미생물에 존재하는 특성을 분석할 수 있다. 다른 구체예에서, 광학적 분광 방법을 사용하여, 미생물의 하나 이상의 외인적 특성, 예를 들어, 추가의 물질의 도움으로만 검출할 수 있는 특성을 분석할 수 있다. 조사는 예를 들어, 형광 분광법, 확산 반사 분광법, 적외선 분광법, 테라헤르쯔 분광법(terahertz spectroscopy), 투과 및 흡수 분광법(transmission and absorbance spectroscopy), 표면 증강 라만 분광법(SERS), 공간적 상쇄 라만 분광법(SORS), 투과 라만 분광법 및/또는 공명 라만 분광법을 비롯한 라만 분광법을 사용하여 수행할 수 있다. 라만법(SERS) 및 형광 신호를 증가시키기 위하여, 미생물을 원심분리 전에, 금 및/또는 은 나노입자로 코팅하고/거나 내부 광학 표면을 특정 크기 및 형태의 금속 콜로이드로 사전-코팅할 수 있다(참조: 형광에 대한 문헌[Lakowicz, Anal. Biochem. 537:171 (2005)]; SERS에 대한 문헌[Efrima et al, J. Phys. Chem. B. (Letter) J02:5947 (1998)]). 또 다른 구체예에서, 나노입자는 원심분리 전에 밀도 쿠션 내에 존재하며, 미생물이 밀도 쿠션을 통과해 지나감에 따라 미생물과 회합한다. 다른 구체예에서, 펠릿 내의 미생물을 질량 분석법 기술, 예를 들어, MALDI-TOF 질량 분석법, 탈착 전기분무 이온화(DESI) 질량 분석법, GC 질량 분석법, LC 질량 분석법, 전기분무 이온화(ESI) 질량 분석법 및 선택 이온 흐름 튜브(SIFT) 분석법을 사용하여 조사할 수 있다. 하나의 구체예에서, 단리된 샘플 또는 펠릿이 여전히 분리 용기 내에 있는 동안 단리된 샘플 또는 펠릿을 조사한다. 용기 내의 광학창을 통하여 용기를 조사할 수 있다. 광학창은 용기의 저부 및/또는 임의의 측부(들) 및/또는 상부에 있을 수 있다. 하나의 구체예에서, 분리 용기는 조사에 적합한 위치에서 분광기 내의 홀더(holder)에 알맞거나 홀더에 알맞게 할 수 있다. 미생물의 하나 이상의 내재적 또는 외인적 특성을 검출 및/또는 동정하는데 유효한 것으로 당업자에게 알려져 있는 임의의 기술에 의하여 분광 조사를 수행할 수 있다. 예를 들어, 전면(front-face) 형광(여기서, 여기 광 및 방출된 광이 동일한 광학 표면으로 유입되고 이를 떠나며, 만일 샘플이 일반적으로 광학적으로 두껍다면, 여기 광은 샘플 내로 매우 짧은 거리를 투과한다)(참조예: 문헌[Eisinger, J., and J. Flores, "Front-face fluorometry of liquid samples," Anal. Biochem. 94:15 (1983)])을 펠릿 내의 미생물의 동정을 위해 사용할 수 있다. 또한, 다른 형태의 측정, 예를 들어 형광 현미경(epifluorescence), 반사율, 흡광도 및/또는 산란 측정을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단리된 샘플 또는 펠릿은 조사를 위해 분리될 수 있다(예를 들어, 단리된 샘플 또는 펠릿은 해당 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이 질량 분석법에 의한 조사를 위해 분리하고 준비될 수 있다). 또 다른 구체예에서, 단리된 샘플 또는 펠릿은 1개 초과의 수단에 의하여 조사할 수 있다. 예를 들어, 단리된 샘플 또는 펠릿은 형광 분광법 및 라만 분광법을 사용하여 조사할 수 있다. 본 구체예에 따라, 이들 조사 단계는 순차적으로 또는 동시에 수행할 수 있다.
샘플 조명원 또는 여기원은 당업자에게 알려져 있는 임의의 수의 적절한 광원으로부터 선택될 수 있다. 사용가능한 데이터를 생성하는 전자기 스펙트럼의 임의의 부분을 사용할 수 있다. 자외선, 가시광선 및/또는 근적외선 스펙트럼뿐 아니라 전자기 스펙트럼의 다른 부분에서 방출할 수 있는 광원이 이용가능하며, 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 광원은 자외선 광의 생성을 위한 중수소 또는 제논 아크(arc) 램프 및/또는 가시광선/근적외선 여기의 생성을 위한 텅스텐 할로겐 램프와 같은 연속 램프일 수 있다. 이들 광원은 넓은 방출 범위를 제공하며, 특정 여기 파장에 대한 스펙트럼 대역폭은 해당 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이 광학 간섭 필터, 프리즘 및/또는 광학 회절격자(grating)를 사용하여 감소시킬 수 있다.
대안적으로, 발광 다이오드 및/또는 레이저와 같은 다수의 협대역(narrowband) 광원을 공간적으로 및/또는 일시적으로 다중화하여, 다중-파장 여기원을 제공할 수 있다. 예를 들어, 발광 다이오드는 240 nm 내지 900 nm를 초과하여 이용가능하며, 광원은 20-40 nm의 스펙트럼 대역폭을 갖는다(최대치의 절반에서의 전폭). 레이져는 자외선 내지 근적외선의 이산 파장에서 이용가능하며, 당업자에게 잘 알려져 있는 다중화 방법을 사용하여 채용할 수 있다.
광원 중 임의의 것의 스펙트럼 선택성은 스캐닝 단색화 장치(scanning monochromator)와 같은 스펙트럼 판별 수단을 사용하여 개선시킬 수 있다. 당업자에게 알려져 있는 다른 판별 방법, 예를 들어, 음향-광학 조정 필터(acousto-optic tunable filter), 액정 조정 필터(liquid crystal tunable filter), 광학 간섭 필터의 어레이, 프리즘 분광사진 등을 임의의 조합으로 사용할 수 있다. 스펙트럼 판별기를 선택하는 것에서의 고려사항은 조정가능성(tunability)의 범위뿐 아니라 선택성의 수준을 감안한다. 예시의 방식으로, 예를 들어, 판별기는 300 - 800 nm의 파장 범위를 10 nm의 선택도로 사용할 수 있다. 이들 파라미터는 일반적으로 조정가능성 범위뿐 아니라 선택성을 달성하는데 필요한 최적의 기술을 결정한다.
전형적으로, 광원은 샘플의 여기를 야기하고, 소정의 시간에, 또는 연속적으로 샘플 형광의 방출의 측정으로 이어진다. 유사하게, 여기원과 샘플의 상호작용으로부터의 반사광을 측정하여, 검출 및/또는 특성규명을 위한 타당한 데이터를 제공할 수 있다.
샘플로부터의 방출은 임의의 적절한 스펙트럼 판별 수단에 의해, 가장 바람직하게는 분광기를 사용하여 측정할 수 있다. 분광기는 특정 방출 파장을 검출하는 스캐닝 단색화 장치일 수 있으며, 여기서 단색화 장치로부터의 출력이 광증배기 튜브에 의해 검출되고/거나 분광기는 이미지화 분광사진으로 구성될 수 있으며, 여기서, 출력은 전하-결합 소자(CCD) 검출기 어레이와 같은 이미지화 검출기에 의해 검출된다. 하나의 구체예에서, 분별기는 광검출 수단(이를 테면, 광증배기 튜브, 애벌란시 포토다이오드(avalanche photodiode), CCD 검출기 어레이 및/또는 전자 다중 전하 결합 소자(EMCCD) 검출기 어레이)에 의한 형광 및/또는 산란 신호의 관찰을 가능하게 한다.
분광 기술을 사용하여 바람직하게는 여기-방출 매트릭스(EEM) 측정치로 제공되는 측정치가 수득된다. 본 명세서에서 사용되는 EEM은 여기 및 방출 파장 둘 모두의 함수로서 형광 물질의 발광 스펙트럼 방출 강도로 정의되며, 전체(full) 스펙트럼 또는 이의 서브셋(subset)을 포함하며, 여기서 서브셋은 단일의 또는 다중의 여기/방출 쌍(들)을 포함할 수 있다. 또한, 고정된 여기 파장을 갖는 EEM의 단면을 사용하여 특정 여기 파장에 대한 방출 스펙트럼을 나타낼 수 있고, 고정된 방출 파장을 갖는 EEM의 단면을 사용하여 샘플에 대한 여기 스펙트럼을 나타낼 수 있다. 하나의 구체예에서, 1개 초과의 특정 여기-방출 파장 쌍, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 특정 여기-방출 파장 쌍에서 다중의 EEM을 측정한다.
본 발명의 하나의 구체예에 따르면, 전면 형광 분광법은 고 산란성 및 고도의 켄칭(quenching) 샘플의 형광 및/또는 반사율 특성을 측정하는데 이점을 제공하는 것으로 관찰되었다. 하나의 구체예에서, 전면 방법이 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 전면 형광이 고 흡수성 샘플에 특히 유용할 수 있는데, 이는 여기 및 방출 빔(beam)이 다량의 샘플을 통과하여 이동할 필요가 없어, 거기(예를 들어, 혈액 세포 및 미생물 배양 배지)에 함유될 수 있는 간섭 성분에 의해 덜 영향을 받을 수 있기 때문이다. 용기의 광학 표면은 당업자에게 알려져 있는 바와 같이 허용가능한 결과를 제공하도록 소정의 각에서 발광될 수 있다(예를 들어, 문헌[Eisinger, J., and J. Flores, "Front-face fluorometry of liquid samples," Anal. Biochem. 94:15- 21 (1983)]). 하나의 구체예에서, 분광 시스템이 최소의 한 고정된 각에서 방출된 형광을 측정하는 것 외에, 최소의 한 고정된 각에서 확산 반사된 광을 측정하도록 시스템을 고안한다.
본 발명에 따라서, 알려져 있는 미생물에 대한 대조군 측정치를 취하여, 당업자에게 알려져 있는 다양한 수학적 방법을 사용하여 측정된 시험 데이터와 대상 미생물의 특성규명의 상호관련을 가능하게 한다. 예를 들어, 당업자에게 알려져 있는 소프트웨어 시스템을 사용하여 샘플로부터의 데이터를 기준 선 또는 대조군 측정치와 비교할 수 있다. 더욱 특히, 데이터를 많은 다변량 분석 방법, 예를 들어, 일반적 판별 분석(General Discriminant Analysis; GDA), 부분 최소 제곱 판별 분석(PLSDA), 부분 최소 제곱 회귀, 주성분분석(PCA), 평행 인자 분석(Parallel Factor Analysis; PARAFAC), 신경망 분석(NNA) 및/또는 서포트 벡터 머신(Support Vector Machine; SVM)에 의해 분석할 수 있다. 이들 방법을 사용하여, 이전에 이재된 바와 같이 유기체를 모니터링, 검출 및/또는 특성규명하기 위한 시스템을 고안하는 데에서, 알려져 있지 않은 대상 미생물을 기존의 명명법에 기초하여 관련있는 그룹으로 분류하고/거나 유기체의 대사, 병원성 및/또는 독성에 기초하여 자연 발생 그룹으로 분류할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 검출 시스템으로부터의 비-분광 측정치, 예를 들어 검출 시간 및 성장 속도를 사용하여, 단리된 샘플 또는 펠릿으로부터의 미생물의 특성규명 및/또는 동정에 도움을 줄 수 있다. 또한, 분리 장치의 하부 영역의 사진 이미지로부터 취한 측정치는 펠릿 크기, 형상, 색상 및 밀도와 같은 단리물의 동정에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 단리된 샘플 또는 펠릿 내의 미생물의 특성규명 및/또는 동정은 정확한 종의 동정을 포함할 필요가 없다. 특성규명은 생물학적 입자의 넓은 카테고리화(categorization) 또는 분류뿐 아니라 단일 종의 실제의 동정을 포함한다. 단리된 샘플 또는 펠릿으로부터의 미생물의 분류는 미생물에 대한 표현형 및/또는 형태상 특징의 결정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 입자의 특성규명은 식별가능한 차이점, 이를 테면 조성, 형상, 크기, 클러스터링(clustering) 및/또는 대사에 기초하여 달성할 수 있다. 일부 구체예에서, 대상의 생물학적 입자의 분류는 주어진 생물학적 입자의 특징의 사전의 지식을 필요로 하지 않으나, 오직 실증적인 측정과의 일관된 상호관련을 요구할 수 있어, 이 방법을 특정 결합 사건 또는 대사 반응에 기초한 방법보다 더 일반적이고 용이하게 사용가능하게 한다. 본 명세서에 사용되는 "동정"은 이전에 알려져 있지 않은 미생물이 속하는 과, 속, 종 및/또는 균주를 결정하는 것을 의미하며, 예를 들어, 이전에 알려져 있지 않은 미생물을 과, 속, 종 및/또는 균주 수준으로 동정하는 것이다.
일부 예에서, 특성규명은 취하려는 행위에 대하여 충분히 유용한 정보를 제공하는 분류 모델을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 바람직한 분류 모델은 다음 중 하나 이상으로의 그룹화(grouping)를 포함한다: (1) 그람(Gram) 그룹; (2) 임상적 그람 그룹; (3) 치료적 그룹; (4) 기능적 그룹; 및 (5) 천연 고유 형광 그룹.
(1) 그람 그룹: 그람 그룹 분류 내에서, 미생물을 이들의 그람 염색 반응 및 전체 크기에 기초하여 3개의 넓은 분류 카테고리 중 하나로 배정할 수 있으며, 상기 그룹은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: (a) 그람 염색으로 암청색으로 염색되는 그람 양성 미생물; (b) 그람 염색으로 적색으로 염색되는 그람 음성 미생물; 및 (c) 그람 염색으로 암청색으로 염색되나 이들의 형태학적 특징 및 크기로 박테리아와 구별되는 매우 큰 둥근 세포인 효모 세포.
(2) 임상적 그람 그룹: 그람 그룹을 현저한 형태적 특징을 나타내는 몇몇의 서브-카테고리로 추가로 나눌 수 있다. 이들 서브-카테고리는 숙련된 실험실 기술자가 보고한 모든 유의미한 임상 정보를 포함하여, 양성 또는 음성 그람 반응보다 더 높은 수준의 동정을 제공한다. 이러한 특정한 분류는 매우 유익한데, 이는 자동화된 시스템으로 동등한 임상적으로 유의미한 정보를 제공함으로써, 스미어(smear)를 판독하는 기술자의 기술 수준 및/또는 그람 염색의 품질에 의존하는 것에 대한 염려를 없애기 때문이다. 더욱 자세하게, 이러한 분류 모델에 기초한 미생물의 서브카테고리는 다음 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다: (a) 작고 둥근 세포인 구균(cocci); (b) 함께 연결된 2개의 작고 둥근 세포인 쌍구균(diplococci); (c) 직사각형 형상인 간균(rod); 및 (d) 간균 형상인 바실루스(bacilli). 추가의 형태학적 정보에 의해 확인할 수 있는 이들 서브-카테고리의 예는 다음을 포함한다: (i) 그람 양성 구균; (ii) 사슬 내의 그람 양성 구균; (iii) 클러스터 내의 그람 양성 구균(즉, "포도-유사" 클러스터); (iv) 그람 양성 쌍구균; (v) 그람 양성 간균; (vi) 포자가 있는 그람 양성 간균; (vii) 그람 음성 간균; (viii) 그람 음성 구간균(coccobacilli); (ix) 그람 음성 쌍구균; (x) 효모; 및 (xi) 사상 진균.
(3) 치료적 그룹: 치료적 그룹은 특정 표본 유형으로부터 단리되는 경우, 동일한 분류의 항생제 또는 항생제의 혼합물로 처리되는 다수의 미생물 종을 포함한다(예를 들어, 문헌["Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008"]에 기재된 바와 같은). 많은 경우에, 초기의 경험적인 치료법에서 더욱 표적화된 치료법으로의 변화를 가능하게 하기 위하여 임상의는 종 수준까지 식별하는 것을 필요로 하지 않는데, 이는 1개 초과의 종이 동일한 항생제(들)의 선택으로 처리될 수 있기 때문이다. 이러한 분류 수준은 이들 "동일-치료" 미생물을 정확하게 단일의 치료적 카테고리에 배정한다. 이러한 특성규명 수준의 예에는 민감성 EB 종으로부터 고내성 엔테로박테리아(Enterobacteriacae; EB) 종(대장균(E. coli)로부터 엔테로박터(Enterobacter) 종), 또는 감수성 칸디다(Candida) 종(칸디다 알비칸스(C. albicans) 및 칸디다 파라프실로시스(C. parapsilosis))으로부터 플루코나졸-내성 칸디다 종(칸디다 글라브라타(C. glabrata) 및 칸디다 크루제이(C. kruzei)) 등을 구별하는 능력이 포함된다.
(4) 기능적 그룹: 본 발명에 따라, 미생물을 또한 대사, 독성 및/또는 표현형 특징의 혼합에 기초하여, 몇몇의 그룹으로 배정할 수 있다. 비-발효 유기체는 발효 유기체로부터 명확하게 구별될 수 있다. 또한, 용혈소를 생성하는 미생물을 비-용혈소 종과 따로 그룹화할 수 있다. 일부 경우에, 이들 그룹은 속 수준(예를 들어, 콜라이형(coliform), 그람 음성 비-발효 간균)보다 더 넓은 카테고리를 나타내며, 일부는 속 수준(예를 들어, 엔테로코쿠스(Enterococcus), 칸디다)으로 나타내고, 일부는 종-수준(예를 들어, 코아굴라제-음성 스타필로콕시(coagulase-negative staphylococci), 알파-용혈성 스트렙토콕시(alpha-hemolytic streptococci), 베타-용혈성 스트렙토콕시, 코아굴라제-양성 스타필로콕시, 즉, 스태필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)) 판별에 근접하여 나타낸다.
(5) 천연 고유 형광("IF") 그룹: 미생물을 또한 이들의 선천적 및/또는 고유 형광 특징으로 함께 그룹화하는 이들의 천연의 경향에 기초하여 카테고리로 배정할 수 있다. 이들 그룹 중 일부는 치료적 그룹 및 기능적 그룹 카테고리에 통상적일 수 있다. 이들 그룹화는 특징적인 IF 시그니처를 갖는 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis), 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) 또는 슈도모나스 애루기노사(P. aeruginosa)와 같은 개별 종을 포함할 수 있고/거나 상대적으로 보존된 IF 시그니처를 갖는 소그룹의 유기체, 이를 테면 클레브시엘라 뉴모니애(K. pneumoniae)-클레브시엘라 옥시토카(K. oxytoca) 또는 엔테로박터 아에로지너스(E. aerogenes)-엔테로박터 클로아카(E. cloacae) 그룹을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 동정 목적을 위해 미생물의 내재적 특성을 측정하는 것 외에, 분리 및/또는 동정 과정을 돕기 위한 추가의 식별제(identifier agent)의 사용을 추가로 포함할 수 있다. 친화성 리간드와 같은 특정 미생물에 결합하는 제제를 사용하여 미생물을 분리하고/거나, 미생물의 부류 또는 종을 동정하고/거나(예를 들어, 독특한 표면 단백질 또는 수용체에 대한 결합을 통해), 미생물의 특성(예를 들어, 항생제 내성)을 동정할 수 있다. 유용한 식별제에는 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 이의 단편(예를 들어 스태필로코쿠스 아우레우스 동정을 위한 항-Eap), 핵산 프로브, 항생제(예를 들어, 페니실린, 반코마이신, 폴리믹신 B), 압타머(aptamer), 펩티드 모방체, 파지-유래 결합 단백질, 렉틴, 숙주 선천 면역 바이오마커(biomarker)(급성기 단백질, LPS-결합 단백질, CD14, 만노오스 결합 렉틴, 톨-유사 수용체), 숙주 방어 펩티드(예를 들어, 디펜신, 카텔리시딘, 프로테그린, 마가이닌), 박테로신(예를 들어, 란티바이오틱, 이를 테면, 니신, 머사시딘, 에피더민, 갈리더민 및 플란타리신 C 및 클래스 II 펩티드), 박테리오파지 및 핵산, 지질, 탄수화물, 다당류, 캡슐/슬라임(slime) 또는 단백질에 선택적인 염료 또는 이들의 임의의 조합이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 제제가 그 자체로 검출가능한 신호를 내지 않는 경우, 제제는 예를 들어 제제를 마커(예를 들어, 가시광 또는 형광)에 컨쥬게이트(conjugate)시킴으로써 검출가능한 신호를 제공하도록 표지될 수 있다. 마커에는 형광, 발광, 인광, 방사성 및/또는 비색 화합물이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 제제는 본 발명의 방법에서 임의의 단계에, 예를 들어, 샘플을 수득할 때, 용해 중에 및/또는 분리 중에 미생물에 첨가될 수 있다. 일부 구체예에서, 펠릿 중의 제제의 존재는 펠릿의 조사 중에 결정될 수 있다. 다른 유용한 식별제에는 미생물 효소를 위한 기질, 킬레이팅제(chelating agent), 감광제, 켄칭제(quenching agent), 환원제, 산화제, 완충액, 산, 염기, 용매, 고정제, 세제, 계면활성제, 소독제(예를 들어, 알코올, 표백제, 과산화수소) 및 독성 화합물(예를 들어, 아지드화나트륨, 시안화칼륨) 및 대사 억제제, 이를 테면 사이클로헥사미드 등이 포함된다. 유사하게, 미생물 세포 생존력, 대사 및/또는 막 전위를 측정하기 위한 많은 형광 화합물을 본 발명에서 식별제로 사용할 수 있다. 당업자에게 용이하게 인식될 것처럼, 미생물의 물리적 상태 또는 대사에 영향을 미치는 임의의 화합물, 이를 테면 항생제에 대한 특정 미생물의 감수성은 상기 화합물을 샘플, 용해 완충액, 밀도 쿠션 또는 이들의 임의의 혼합물에 첨가함으로써 신속히 확인할 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 방법은 미생물 펠릿을 회수하는 단계 및 추가의 시험을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 샘플 배지 및 밀도 쿠션을 흡인해 냄으로써 펠릿을 회수할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 주사기를 용기 내로 삽입하고, 샘플 배지 및 밀도 쿠션을 온전하게 남겨놓으면서 펠릿을 흡인해 냄으로써 펠릿을 회수할 수 있다. 그 다음, 회수한 펠릿을 적절한 배지, 예를 들어, 염수에 재현탁화시킬 수 있다. 미생물이 재현탁화되면, 당업자에게 알려져 있을 바와 같이, 그리고 상술된 바와 같이 요망되는 임의의 추가의 시험으로 처리할 수 있다. 특히, 깨끗한 미생물 샘플을 필요로 하는 임의의 시험을 재현탁화된 미생물을 사용하여 수행할 수 있다. 일부 구체예에서, 추가의 동정 시험을 수행할 수 있다. 동정 시험의 예에는 바이텍(Vitek®) 2, 증폭 및 미-증폭 핵산 시험(NAT), 발색 및 라텍스 응집 분석, 면역분석(예를 들어, 표지된 항체 및/또는 다른 리간드를 사용), 질량 분석법(예를 들어, MALDI-TOF 질량 분석법) 및/또는 광학 기술, 이를 테면 적외선 분광법(FTIR) 또는 라만 분광법이 포함된다. 또한, 항생제 및/또는 다른 약물에 대한 내성과 같은 추가의 특성규명 시험을 수행할 수 있다. 추가의 특성규명은 상기 방법의 초기 분리 및 동정 단계 중에 시작된 시험의 일부일 수 있다. 예를 들어, 형광-표지된 페니실린을 미생물의 분리 이전에 샘플에 첨가함으로써, 메티실린 내성 스태필로코쿠스 아우레우스의 검출을 시작할 수 있다. 펠릿이 회수되고 재현탁화되면, 결합 페니실린의 수준을 결정할 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 방법 단계의 일부 또는 모두를 자동화할 수 있다. 상기 방법의 단계를 자동화하는 것은 더 많은 수의 샘플을 더 효율적으로 시험하게 하고, 유해하고/거나 감염성인 미생물을 함유할 수 있는 샘플을 취급하는 데에서 사람 실수의 위험을 줄인다. 그러나, 더욱 중요하게, 자동화는 지체 없이 낮 또는 밤의 어느 시간에도 결정적인 결과를 낼 수 있다. 몇몇의 연구는 패혈증을 유발하는 유기체의 더 빠른 동정이 개선된 환자 관리, 더 짧은 병원 체류 및 더 낮은 전반적인 비용과 상호관련되는 것을 보여주었다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 방법은 또한, 샘플 중의 미생물의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 구체예에서, 상기 방법은
(a) 샘플을 수득하는 단계;
(b) 임의로 상기 샘플 중의 세포를 용해시켜, 용해된 샘플을 생성하는 단계; 및
(c) 미생물을 상기 샘플의 다른 성분으로부터 분리하여, 미생물 펠릿을 형성하는 단계를 포함하며; 여기서, 펠릿의 존재는 미생물이 샘플 중에 존재하는 것을 나타낸다. 하나의 구체예에서, 펠릿을 육안으로 검출한다. 다른 구체예에서, 펠릿을 조사, 예를 들어, 분광법으로 검출한다.
일부 구체예에서, 검출 방법은 미생물에 의한 오염에 대하여 샘플, 예를 들어 식료품, 약제, 음용수 등을 모니터링하기 위하여 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 방법은 오염에 대한 지속적인 모니터링을 위하여 반복적인 방식, 예를 들어, 1달에 1회, 1주에 1회, 1일에 1회, 1시간에 1회, 또는 임의의 다른 시간 패턴으로 수행할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 샘플을 필요에 따라, 예를 들어, 오염이 의심되는 경우에 시험할 수 있다. 추가의 구체예에서, 검출 방법은 임상 샘플, 예를 들어 혈액 배양물 중의 미생물의 존재를 찾기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플을 특정 시간에 혈액 배양물로부터 제거할 수 있으며, 검출 방법을 샘플 상에서 수행하여, 혈액 배양물이 양성인지를 결정한다. 하나의 구체예에서, 샘플을 배양의 접종 이후 설정 시간, 예를 들어, 접종 24 시간 후에, 취하여, 혈액 배양물이 양성인지를 결정할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 샘플을 혈액 배양물로부터 정기적으로, 예를 들어, 매 12, 6, 4 또는 2시간 마다 또는 매 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 또는 5분 마다 취하여, 검출가능하게 양성이 되는 짧은 시간 내에 양성 혈액 배양물을 동정할 수 있다. 검출 방법의 특정 구체예에서, 상기 검출 단계는 임의로 본 명세서에 기재된 동정 방법으로 이어질 수 있다. 다른 구체예에서, 검출 방법은 특히 샘플의 반복적 모니터링을 수반하는 구체예를 위하여 부분적으로 또는 완전히 자동화된다.
본 발명은 하기의 실시예에서 추가로 상술되며, 실시예는 예시의 방식으로 제공되며, 본 발명을 어떤 방식으로도 제한하고자 하지 않는다. 해당 분야에 잘 알려져 있는 표준 기술 또는 특별히 후술되는 기술을 사용한다.
실시예
실시예 1. 신속한 미생물 분리 및 동정방법
A. 용해-원심분리 분리 절차
콜로이드성 실리카의 현탁액(0.2-0.5 ㎖; 1.040-1.050 gm/㎖ 밀도)을 몇개의 코니칼(conical) 미량 원심분리기 튜브에 첨가하였다. 용해된 양성 BacT/ALERT® SA 혈액 배양 브로쓰(broth) 샘플(0.5-1.0 ㎖)을 콜로이드성 실리카 현탁액 상에 더하였다. 대안적으로, 콜로이드성 실리카 용액을 주사바늘 또는 캐뉼라를 사용하여 용해된 혈액 배양 브로쓰 아래에 첨가할 수 있다.
하기의 미생물을 함유하는 배양물로부터의 양성 브로쓰를 시험하였다:
대장균, ATCC 25922
엔테로코커스 패칼리스, ATCC 29212
스태필로코쿠스 아우레우스, ATCC 12600
슈도모나스 애루기노사, ATCC 10145
튜브에 캡을 씌운 다음, 실온(20-25℃)에서, 약 10,000g에서 2분 동안 미량 원심분리기에서 회전시켰다. 상층액을 흡인한 다음, 정제된 미생물 펠릿을 0.45% w/v NaCl에 660 nm에서 0.40의 광학 밀도로 재현탁시켰다.
각 현탁액의 일부분을 아크릴 큐벳(cuvette)에 옮기고, 분광형광계(플루오로로그(Fluorolog®) 3(HORIBA Jobin Yvon Inc., New Jersey))에서 스캐닝하여, 미생물의 고유 형광(MIF)을 측정하였다.
제2부분을 바이텍® 2 ID/AST 카드(bioMerieux Inc., Missouri) 내로 로딩하였다. "직접적인" 바이텍® 2 결과를 양성 브로쓰로부터 계대 배양한(sub-cultured) 밤샘 성장시킨 콜로니의 현탁액으로부터의 결과(종래 방법)와 비교하였다. 모든 4개의 종이 혈액 배양물로부터의 직접적인 방법 및 표준 바이텍 방법 둘 모두에서 뛰어난 동정 신뢰성 수준을 제공하였으며, 이는 밀도-기반의 분리 방법이 실질적으로 혈액 및/또는 브로쓰-유래의 입자 및 단백질이 없는 미생물을 제공하였음을 나타낸다.
B. 고유 형광에 의한 원위치 동정을 위한 신속한 절차
양성의 혈액 배양 병을 양성의 플래깅(flagging) 1시간 내에, 바람직하게는 양성의 플래깅 10분 내에, BacT/ALERT® 미생물 검출 시스템(bioMerieux Inc., Missouri)으로부터 분리하였다. 양성의 혈액 배양 브로쓰의 2.0 ㎖ 샘플을 멸균, 스크류-캡(screw-capped) 튜브 내의 0.5 ㎖의 용해액(0.75% 트리톤(Triton®) X-100-환원형(Rohm and Haas, Pennsylvania) + 0.375% 프로테이나제(Proteinase) XXIII에 첨가하였다. 상기 튜브를 혼합되도록 간단히 와류시키고(vortexed), 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 용해된 브로쓰 샘플(0.5 ㎖)을 1.045 ㎎/㎖의 밀도로 분리 용액(0.15 M NaCl 중에 아이솔레이트(Isolate®) 콜로이드성 실리카 30 v/v%)을 함유하는 주문 제작한 미량 원심분리기 튜브(기부에 0.5 mm 두께의 석영 광학창을 가짐)에 첨가하였다. 상기 튜브를 실온(20-25℃)에서, 약 10,000 rpm에서, 2분 동안 A-8-11 스윙 아웃 로터(Eppendorf, New York)를 장착한 에펜도르프(Eppendorf®) 5417R 미량 원심분리기에서 회전시켰다. 상기 튜브를 원심분리기에서 제거하고, 플루오로로그® 3(HORIBA Jobin Yvon Inc., New Jersey) 분광형광계를 위한 주문 제작한 전면 어댑터(adapter)로 옮겼다. 튜브의 바닥에서 펠릿화된 미생물의 형광을 하부에서 즉시 판독하였다. 데이터를 엑셀(Excel) 및 스태티스티카(Statistica) 소프트웨어로 익스포트(export)하였다.
실시예 2. 신속한 미생물 정제 및 동정방법의 평가
실시예 1에 기재된 신속한 동정 개념의 잠재력을 평가하기 위하여, 양성의 혈액 배양으로부터 회수된 24개의 단리물(칸디다 알비칸스, 대장균, 스태필로코쿠스 아우레우스 및 스태필로코쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis)를 포함하는 4종 중 6개의 균주)을 상기 방법에서 시험하였다.
SPS-항 응고 혈액을 3명의 공여자로부터 수집하고, 풀링(pooled)하였다. 새로운 인간 혈액 10 ㎖을 BacT/ALERT®(BTA) SA 혈액 배양 병(bioMerieux Inc., Missouri)에 첨가하였다. 단리물 각각의 현탁액을 트립틱 소이 브로쓰(tryptic soy broth) 중에서 제조하였다. 각각의 병에 0.4 ㎖의 103/㎖ 현탁액을 접종하고, 상기 병을 BTA 캐비넷에서 36 ℃에서 인큐베이션하였다. 10 ㎖의 혈액을 함유하나, 유기체를 함유하지 않는 4개의 BacT/ALERT® SA 병을 음성 대조군으로 포함시켰다.
양성의 병을 양성의 플래깅 3시간 내에 BTA 캐비넷으로부터 분리하였다. 음성 대조군 병을 각각의 세트의 양성 대조군과 함께 분리하였다(종에 의해). 한번에 1개의 병을 이들이 양성이 되는 순서로, BTA 캐비넷으로부터 분리하였다. 양성 혈액 배양 브로쓰의 샘플 2.0 ㎖을 3 ㎖ 주사기 및 18G 주사바늘을 사용하여 분리하고, 멸균 스크류 캡 유리 튜브 내의 0.5 ㎖ 용해 완충액(0.75 w/v% 트리톤® X-100-환원형(Fluka))에 즉시 첨가하였다. 상기 튜브를 혼합되도록 간단히 와류시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 용해된 브로쓰 샘플 0.5 ㎖ 부분을 55 ㎕의 분리 용액(0.15 M NaCl 중의 30 v/v% 아이솔레이트®)이 사전에 로딩된 주문 제작한 모세관 미량 원심분리기 튜브(모세관 섹션(section)의 기부에 0.5 mm의 석영 광학창을 포함)에 첨가하였다. 상기 미량 원심분리 튜브를 22℃에서, 10,000 rpm에서, 2분 동안 A-8-11 스윙 아웃 로터(Eppendorf, New York)를 장착한 에펜도르프® 5417R 미량 원심분리기에서 원심분리하였다. 상기 튜브를 원심분리기에서 제거하고, 플루오로로그® 3(HORIBA Jobin Yvon Inc., New Jersey) 분광형광계를 위한 주문 제작한 30도 전면 어댑터로 옮겼다. 튜브의 바닥에서 펠릿화된 미생물의 형광을 5-분 주문 제작 프로그램을 사용하여 즉시 판독하였다. 데이터를 단리물의 화학측정(chemometric) 분석 및 분류를 위하여 엑셀 및 스태티스티카로 익스포트하였다.
정규화와 함께, 그리고 이것 없이, "단일 잔류(leave-one-out)" 교차-검증과 함께, 데이터 상에서 분류 모델의 최적화를 수행하였다. 결과를 표 1에 나타내었다. 표에서, "단계 번호"는 "단일 잔류" 교차-검출 접근법을 사용하여 가장 높은 민감성을 야기한 판별 분석 단계의 번호를 지칭한다. 데이터 정규화의 부재 하에서, 정확하게 동정된 균주의 백분율은 82.6%였다. 레일리 산란 지점(Rayleigh scattering point), 콜라겐 영역 또는 피리독사민 피크에 대하여 데이터를 정규화한 경우에 최적의 결과(대략 96%의 정확한 동정)를 얻었지만, NADH, 트립토판 및 플라빈 피크에 대하여 정규화함으로써 여전히 개선된 결과를 수득하였다.
표 1
Figure pct00001
실시예 3: 용해 완충액의 평가
강력한 용해 완충액 및 순한 용해 완충액으로 처리한 새로운 양성 스트렙토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) WM-43 혈액 배양 브로쓰의 분리 효능 및 미생물의 고유 형광(MIF) 프로파일(profile)을 평가하기 위하여 실험을 수행하였다. 하기의 용해 완충액 제제를 시험하였다: (A) 0.5M CAPS(pH 11.7) 중의 2.0% TXlOO-R(강력함 = LB-A); (B) 0.5M CAPS(pH 11.7) 중의 0.75% TX1OO-R(순함 = LB-B); 및 (C) 0.3M CAPS(pH 11.7) 중의 0.45% TX1OO-R(순한 = LB-C). 1.0 ㎖의 용해 완충액 A 및 B, 및 2.0 ㎖의 용해 완충액 C를 스크류 캡 튜브 내에 넣고, 튜브를 37 ℃ 워터 배스(water bath) 내의 랙(rack)에 두었다. 브로쓰의 샘플(4.0 ㎖)을 BTA 시스템에서 양성의 플래깅 5분 이내에 5 ㎖ 주사기 및 18G 주사바늘을 사용하여 스트렙토코커스 뉴모니애 WM43-양성 BacT/ALERT SA 배양 병으로부터 분리하였다. 브로쓰를 각각의 용해 완충액-함유 튜브에 재빨리 분배하고, 튜브에 캡을 씌우고, 대략 5초 동안 와류시켰다. 또한, 과충전한(15 ㎖ 혈액) 음성 대조군 BacT/ALERT® SA 병으로부터의 시험 브로쓰를 샘플링하여, 용해 및 분리 단계의 효능을 결정하였다. 튜브를 1분 동안 37 ℃ 수조로 돌려보냈다. 상기 튜브를 수조에서 제거하고, 0.5 ㎖의 용해물을 200 ㎕의 14 w/v% 아이오헥솔 밀도 쿠션을 함유하는 사전 로딩된 분리 튜브에 더하였다. 상기 튜브를 25 ℃에서, 10,000 rpm(대략 10,000 x g)에서, 2분 동안 A-8-11 스윙 아웃 로터(Eppendorf, New York)를 장착한 에펜도르프® 5417R 미량 원심분리기에서 원심분리하였다. LB-B를 사용한 분리 튜브의 하부 영역의 사진을 도 1에 나타내었다. 과충전한(15 ㎖ 혈액) 음성 대조군 브로쓰를 처리한 경우, 어떤 펠릿도 없는 것이 주목된다. 원심분리의 완료 직후에, 이중 30-도 튜브 어댑터, PMT 검출기 및 "전체(Full) EEM" 스캔 파일(20.8 분 스캔)을 사용하여 플루오로로그® 3(HORIBA Jobin Yvon Inc., New Jersey)에서 튜브를 판독하였다. 개별 샘플로부터의 EEM 스펙트럼의 예를 도 2A-2C에 나타내었다.
도 2A-2C에 나타낸 스트렙토코커스 뉴모니애 펠릿의 고유 형광 EEM 프로파일은 세포 생존력 결과와 충분히 상호 관련되었다. 양성 브로쓰의 0.40% TX1OO-함유(최종 농도) 용해 완충액(LB-A; 가혹한 완충액)으로의 처리는 모든 3개의 펠릿에서의 유사한 트립토판 신호에도 불구하고, 0.15% TX1OO(최종 농도)을 함유하는 더 순한 완충액으로의 처리에 비하여, 폐렴구균 생존력에서의 30-배 하강 및 피크 NADH 형광에서의 5-배 감소를 야기하였다. 감소된 미생물 생존력과 관련된 또 다른 변화는 피크 플라빈 형광에서의 증가였다(표 2). 감소된 NADH 및 증가된 플라빈 형광은 도 2A에 명확하게 분명히 나타난다.
표 2: 스트렙토코커스 뉴모니애 펠릿 고유 형광 신호
Figure pct00002
실시예 4. 정제된 미생물 펠릿의 원위치 동정을 위한 개선된 장치 및 방법
실시예 2에 기재된 신속한 원위치 분리 및 동정 방법의 잠재력을 추가로 조사하기 위하여, 몇몇의 독점적인 장치를 고안하고, UV-투과성 플라스틱으로 몰딩하였다. 이들 장치는 본 명세서에 참고로 포함되는 관련 미국 특허 출원 제_호(발명의 명칭: "Separation Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms", 출원일: 2009년 10월 30일)에 개시되어 있다. 이들 장치는 저부 및/또는 측부으로부터 침강된 미생물 펠릿의 분광기 조사를 가능하게 하는 클로저, 샘플 저장소(reservoir) 및 테이퍼형 광학 품조사 저부 영역을 비롯한 몇몇의 통상적인 특징부 및 장치의 분광형광계로의 결합을 용이하게 하는 특징부를 포함한다. 또한, 상기 장치는 분리 단계 동안의 상대적으로 높은 관성력(g-force)을 견딜 수 있어야 한다. 이러한 튜브의 몇몇의 반복을 고안하여, 미생물 회수, 형광 재현성을 개선시켰으며, 산란된 미광(stray scattered light)에 의한 오염을 줄였다. 또한, 기밀 밀봉되도록 상기 튜브를 고안하였다.
분리 장치를 분광형광계의 샘플 구획 내에 배치된 주문 제작된 어댑터 내로 삽입함으로써, 또는 분리 장치를 분광형광계(Fluorolog® 3 (HORIBA Jobin Yvon Inc., New Jersey))에 장착된 분기형(bifurcated) 6-어라운드(around)-1의 300-400 미크론 섬유 광케이블(Ocean Optics, Florida)에 직접 결합시킴으로써, 침강된 미생물 펠릿의 광학 조사를 달성하였다. 3-거울 섬유 광학 어댑터를 만들어, 둘 모두의 시스템 검출기(PMT 및 CCD)의 사용을 가능하게 하였다. 전 여기-방출 매트릭스(EEM) 스펙트럼을 각 미생물 펠릿 상에서 수집하였다(스캔 범위: 여기 260-800 nm; 방출 260-1100 nm; 5 nm의 증분).
정제된 트립토판 및 리보플라빈 용액을 사용하여 일회용 장치-섬유 광케이블 구성 상에서 게이지(gage) 재현성 및 신뢰성 연구를 수행하였다. 형광단 둘 모두에 대하여 2.5% 미만의 표적 CV를 얻었으며, 이는 일회용 및 연구 플랫폼의 품질을 확증하는 것이다.
실시예 5. 미생물 펠릿의 측정 및 미생물 현탁액에 대한 비교를 사용한 미생물의 동정
몇몇의 연구자가 미생물을 동정하기 위하여 미생물의 희석된 현탁액의 직각 형광 측정을 사용하는 것을 기재하였다. 본 발명자들은 이러한 통상적인 방식과, 독점적인 UV-투과성 분리 장치 또는 광학 튜브의 기반에서 침강된 미생물 펠릿을 전면 측정하는 본 발명자들의 신규한 접근법의 유효성을 비교하였다. 또한, 본 발명자들은 전면 측정에 대한 2개의 검출기의 유효성을 비교하였다; 이중 회절격자 분광기에 연결된 광증배기 튜브(PMT) 검출기 및 단일 회절격자 분광기에 연결된 전하-결합 소자(CCD) 검출기. 2-피스(piece) 분리 장치 고안 및 한천 플레이트 상에 성장시킨 미생물 콜로니를 사용하여 이들 실험을 수행하였다. 7종(스태필로코쿠스 아우레우스, 스태필로코쿠스 에피데르미디스, 대장균, 클레브시엘라 옥시토카, 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스(C. tropicalis) 및 엔테로코커스 패칼리스)을 나타내는 42개의 균주의 패널을 후술되는 3개의 광학적 구성 각각에서 시험하였다:
1. 660 nm에서 0.40 OD의 각 미생물의 현탁액을 0.45% NaCl 중에 제조하고, UV-투과성 큐벳에 첨가하고, PMT 검출기를 사용하여 직각에서 전체 EEM을 수집하였다(통상적인 방법).
2. 현탁액을 원심분리함으로써, 2-3 mm 두께의 미생물 펠릿을 주문 제작된 분리 장치에서 제조하였다. 생성된 펠릿의 전체 EEM을 PMT 검출기를 사용하여 전면 방식으로 수집하였다.
3. 현탁액을 원심분리함으로써, 2-3 mm 두께의 미생물 펠릿을 주문 제작된 분리 장치에서 제조하였다. 생성된 펠릿의 전체 EEM을 CCD 검출기를 사용하여 전면 방식으로 수집하였다. EEM의 고유 형광 데이터를 상업적으로 입수할 수 있는 다변량 분석 소프트웨어(일반적 판별 분석; 스태티스티카)를 사용하여 분석하였다. 분석 결과는 표 3에 제시되어 있다.
표 3
Figure pct00003
놀랍게도, 전면 방식에서 미생물 펠릿을 스캐닝하는 것은 공지된 다변량 분석 방법을 사용하여 이들을 동정하는 능력을 유의미하게 개선시켰다. 형광 EEM 데이터의 추가의 분석으로, EEM 데이터는 통상적인 큐벳 내 현탁액 구성에 대한 주요 식별 영역이 트립토판 범위의 스펙트럼 내에 있었다. 반면, 미생물 펠릿의 전면 측정은 특히 360-440 nm 여기 파장 내에서 강한 분별력을 제공하는 몇몇의 추가의 EEM 스펙트럼의 영역을 야기하였다. 또한, 이러한 실험은 PMT 및 CCD 검출기의 기능적 등가를 증명하였다.
미생물 펠릿의 전면 조사에 의해 제공되는 추가의 고유 형광 스펙트럼 정보는 예기치 못한 결과이면서 유리한 결과이다.
실시예 6. 선택적 용해 완충액의 개발
본 발명자들은 수 초내에 인간 혈액 성분들을 용해시키면서 패혈증을 야기시키는 대부분의 미생물은 다수의 손상되지 않고 대사적으로 활성인 상태로 남아있게 하는 선택적 용해 완충액을 디자인하기 위해 착수하였다. 이러한 연구를 위해 사용된 가장 일반적인 샘플은 인간 혈액을 함유한 BacT/ALERT® SA 배양 배지였다. 병에 소량 접종량의 시험 미생물과 함께 및 이러한 미생물 없이 10-15 ml의 인간 혈액을 시딩한 후에 BacT/ALERT® 미생물 검출 시스템에 로딩하였다. 그 시점까지 양성 또는 음성인 병(postivie or negative-to-date bottle)을 분리하고, 브로쓰의 샘플을 하기에 기술된 바와 같이 처리하였다.
본 발명에서 사용된 최초 용해액을 완충액 처리하지 않고(실시예 1-2), 주로 콜로이드성 실리카 밀도 쿠션과 조합하여 사용하였다. 콜로이드성 실리카의 관심을 끄는 성질들 중 하나는 이러한 밀도 쿠션의 상부에 수집되는 불완전하게 용해된 혈액 세포 성분들과, 쿠션을 통과하여 펠릿을 형성시키는 무손상 미생물을 분리시키는 이의 능력이다. 더욱 광범위하게 적용가능한 밀도 쿠션을 얻고자 하였지만(실시예 7 참조), 다수의 쿠션이 이러한 비-미생물 파편의 침강을 막지 못하였고, 이에 따라 개선된 용해 완충액 포뮬레이션이 요구되었다. 본 발명자들은 비-미생물 파편이 산이 아닌 칼륨 히드록사이드에 의해 신속하게 용해되는 것으로 결론지었고, 이에 따라 여러 알칼리 pH 완충액을 다양한 세정제의 존재하에 시험하였다. 이러한 연구 동안에, 본 발명자들은 트리톤 X100-R 세정제 및 pH 11.7에서의 CAPS 완충액의 혼합물이 멸균 혈액 브로쓰 샘플로부터의 혈액 세포 성분들의 완전한 가용화를 일으킨다는 것을 발견하였다.
S. 뉴모니애 균주 WM-43의 생존력에 대한 트리톤 X100-R 세정제 농도 및 높은 pH 용해 조건의 효과의 예비 평가는 실시예 3에 기술되었다. 보다 낮은 미생물 생존력을 야기시키는 조건들은 플라빈 형광의 증가를 수반하면서 NADH 형광의 현저한 감소를 야기시켰다[참조, 표 2; LB-A].
일련의 음이온성, 중성, 및 쯔비터이온성 세정제를 선택적 용해 완충액에 포함시키는 것에 대해 스크리닝하였다. 음이온성 및 쯔비터이온성 세정제는 혈액 단백질에 대해 너무 변성을 일으키는 것으로 밝혀졌으며, 이에 따라 본 발명자들은 표 4에 제공된 선택 물질과 같은 비-변성 중성 세정제에 초점을 맞추었다. 시험된 알칼리 pH에서 가장 강력한 혈액 세포 용해 활성을 갖는 세정제는 #1-6으로서 기술되어 있다. 이러한 세정제는 660 nm에서 %투과율의 증가에 의해 평가되는 바와 같이, 20초 내에 음성 대조 혈액 배양 브로쓰에서 혈액 세포를 완전히 가용화시켰다. 제 2 그룹의 세정제(#7-10)는 혈액 세포의 보다 느리고 더욱 조절된 용해를 나타내었는데, 30-40초 내에 최대 가용화를 제공하였다. 제 3 그룹(#11-12)은 유사한 세정제 농도에서 완전한 용해를 위해 8 내지 10분이 소요되었다.
0.3M CAPS, pH 11.7의 기본 완충액 포뮬레이션에 구조 및 용해 활성이 상이한 세정제를 함유한 용해 완충액을 제조하였다. 세정제 농도는 표 4에 제공된 바와 같다. 이러한 용해 완충액을 세정제 및 알킬리 pH 조건에 대해 민감한 것으로 알려진 임상의 미생물 균주인 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 WM-43을 함유한 양성 혈액 배양 브로쓰를 이용하여 기능적으로 평가하였다. 평가된 파라미터는 미생물 고유 형광 수준 (여기-방출 매트릭스 스펙트럼), 분리 효율, 단리된 미생물 펠릿의 외형, 및 밀도 쿠션 아래 펠릿으로부터 회수된 미생물의 그람 염색 특성 및 생존력이었다.
절차를 하기와 같이 수행하였다:
2부의 양성 브로쓰를 1부의 시험 용해 완충액과 혼합하고, 37℃ 수욕에서 1분 동안 인큐베이션시켜 혈액 세포를 용해시킨 후에, 2-부분의 광학적 분리 튜브에 분배된 0.2 ml의 밀도 쿠션(14% w/v 이오헥솔 + 1.93% w/v NaCl + 10 mM Hepes, pH 7.4) 위에 0.5 ml의 용해물을 층 형태로 깐 후에, 스크류 캡으로 기밀 밀봉시켰다. A-8-11 스윙 아웃 로터(swing out rotor)가 장착된 Eppendorf® 5417R 마이크로원심분리기(Eppendorf, New York)에서 튜브를 10,000 rpm에서 2분 동안 원심분리한 후에, 튜브를 형광분광계(Fluorolog® 3 (HORIBA Jobin Yvon Inc., New Jersey))에 연결된 400 마이크론 섬유 옵틱 프로브에 직접적으로 튜브의 베이스를 결합시킨 주문 제작 어댑터에 배치시키고, 완전한 EEM 스캔을 수행하였다 (Ex 260-850 nm; Em 260-11OO nm; 5 nm 마다). 스캔 이후에, 상청액을 제거하고, 미생물 펠릿을 0.5 ml의 트립틱 소이 브로쓰(Tryptic Soy Broth (TSB))에 다시 현탁시켰다. 현탁액의 도말 표본(Smear)을 그람 염색을 위해 제조하고, 20 마이크로리터의 1:100 희석액을 NG (성장하지 않음) 내지 4+(최대 성장)의 스케일로의 생존력 평가를 위해 양 혈액 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다.
이러한 실험의 결과는, 상술된 소정의 용해 조건 하에서, 시험 세정제가 이들의 용해 성질에 대해 광범위하게 상응하는 3개의 카테고리에 속한다는 것을 나타내었다:
1. 신속한 용해 세정제 (#1-6)는 이러한 S. 뉴모니애 단리물의 그람 반응에 대해 일부 효과를 가졌다. 이러한 그룹에서 마지막 2개의 세정제 (Genapol® X-080 (Hoechst AG, Frankfurt, Germany) 및 폴리도세놀)는 비교적 낮은 효과를 갖는 반면, 앞의 3개의 세정제는 완전히 변경된 그람 반응성 및 감소된 생존력을 가졌다.
2. 순한 용해 세정제의 그룹 (#7-10)은 60초 용해 시간 내에 혈액 세포를 효과적으로 용해시키고 S. 뉴모니애 단리물의 그람 반응성 또는 생존력을 변경시키지 않았다.
3. 세정제의 그룹 (#11-12)은 S. 뉴모니애 단리물의 그람 반응성 또는 생존력을 변경시키지 않았고 보다 느린 용해 활성을 가졌다.
표 4: S. 뉴모니애의 그람 반응성 및 생존력에 대한 세정제 타입의 효과
Figure pct00004
S. 뉴모니애 세포 펠릿 내에 존재하는 고유 형광단의 수준에 대한 시험 세정제의 효과는 표 5에 기술되어 있다. 실시예 3에서 기술된 결과에 의해 교시되는 바와 같이, 플라빈 대 NADH 형광의 비는 이러한 민감한 미생물의 건강 상태의 우수한 척도이다. 낮은 비는 n-옥틸 글루코사이드 및 CHAPS 세정제에서 관찰되는 바와 같이 미생물 생존력의 감소와 관련되어 있다. 표 5에 기술된 4개의 그룹은 펠릿으로부터 회수된 S. 뉴모니애 세포의 그람 반응성에서 관찰된 변경(표 4)과 직접적으로 상호관련이 있는 카테고리에 속한다. 이러한 데이타는 세정제 7, 8, 9, 10 및 12가 생존력에 대한 플라빈/NADH 대용 마커에서 현저한 개선을 보임을 나타낸다.
흥미롭게도, 이러한 5개의 세정제는 모두 폴리옥시에틸렌 클래스이다. 놀랍게도, 비변경된 생존력을 시사하는 최적의 고유 형광단을 가지고 예상되는 그람 반응성을 갖는, 혈액 세포를 용이하게 가용화시키는 4개의 순한 세정제(#7-10) 모두는 공통된 화학적 특성을 공유한다. 각각은 10개의 평균 사슬 길이(E) 및 12-18개 범위의 평균 탄화수소 사슬 길이(C)를 갖는 폴리옥시에틸렌 친수성 헤드 기를 갖는다.
본 발명자들은 이러한 특정 그룹의 세정제가 이웃하는 미생물의 생존력을 유지시키면서 포유동물 혈액 세포를 선택적으로 가용화시키도록 디자인된 용해 완충액 중에 함유시키기 위한 우수한 후보물질임을 제안한다.
표 5: S. 뉴모니애의 고유 형광단의 수준에 대한 세정제 타입의 효과
Figure pct00005
여러 세정제에 대한 보다 많은 수의 미생물 단리물의 민감성을 시험하기 위한 스크리닝 모델을 개발하였다. 간단하게, 배양조건이 까다로운 시험 미생물의 현탁액을 103-105 CFU/mL로 인간 혈액-함유 BacT/ALERT® SA 배양 배지에 첨가하였다. 샘플을 시험 용해 완충액으로 37℃에서 1-5분 동안 처리한 후에, 요망되는 경우에 TSB에 1:100으로 희석시키고 생균수 측정을 위해 플레이팅하였다.
표 6에 제공된 콜로니 수 측정의 개요는 Brij® 97이 최소 독성을 나타냈지만 CAPS 완충액의 알칼리 조건만이 N. 메닌지티디스(N. meningitidis), H. 인플루엔자(H. influenzae) 및 A. 액티노마이세템코미탄스(A. actinomycetemcomitans)를 신속하게 사멸시킴을 나타내고 있다. Genapol® C-100은 Brij® 97과 유사한 활성을 가지지만, 이러한 모델에서 H. 파라인플루엔자 및 C. 호미니스(C. hominis)에 대해 약간 독성을 나타낸다. 후속 실험에서, S. 뉴모니애, S. 피오게네스(S. pyogenes), S. 아갈락티애(S. agalactiae), S. 미티스(S. mitis), P. 미라빌리스(P. mirabilis), K. 뉴모니애 및 E. 콜라이의 생존력은 Brij® 97 및 Genapol® C-100 둘 모두와의 5분 접촉 시간 후에 영향을 받지 않은 채로 남아있었다 (데이타 미기재됨).
표 6: 용해 완충액 처리 후 배양 조건이 까다로운 생물체의 생균수 측정
Figure pct00006
많은 용해 완충액, 특히 분자적 방법을 위해 사용되는 용해 완충액은 가용화 단계를 돕기 위해 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)와 같은 킬레이트제를 함유한다. 본 발명자들은 그람-음성 및 그람-양성 미생물 패널을 이용하여 TX100-CAPS 용해 완충액 베이스에 EDTA를 첨가하는 효과를 평가하였다. 표 7은 P. 애루기노사(P. aeruginosa) 및 A. 바우마니이(A. baumanii)에 대한 EDTA의 신속한 독성 효과를 나타내지만, 2개의 다른 그람-음성 간균인 B. 세파시아(B. cepacia) 및 K. 뉴모니애, 또는 그럼-양성 S. 아우레우스에 대해서는 독성 효과를 나타내지 않는다. EDTA가 P. 애루기노사 및 A. 바우마니이 둘 모두에 대해 억제성을 나타내지만, 주요 고유 형광단의 변경은 이러한 2가지 종들 간에 매우 상이하였음이 주목된다. P. 애루기노사는 EDTA 처리 후에 NADH 및 트립토판 형광 둘 모두에서 상당한 감소를 갖는 것으로 시험된 유일한 생물체이었다.
이러한 실험은 특정 미생물의 베이스 미생물 고유 형광 프로파일을 신속하게 변경시키기 위해 특정 화합물 또는 식별체(identifier)가 어떻게 용해 완충액에 첨가될 수 있는지의 좋은 예를 나타내는 것으로서, 단리물의 향상된 동정 및 추가 특성규명을 위한 기회를 나타낸다. 당업자에 의해 용이하게 인식되는 바와 같이, 이의 물리적 상태 또는 대사에 영향을 미치는 임의의 화합물에 대한 특정 미생물의 민감성은 상기 화합물을 샘플, 용해 완충액, 밀도 쿠션 또는 이들의 임의의 혼합물에 첨가함으로써 신속하게 확인될 수 있다. 유사하게, 선택적 용해 완충액의 용해 조건 또는 포뮬레이션의 변경 (예를 들어, 완충액 pH, 세정제 타입 및 이의 농도)은 도 2a 및 2b에 예시된 바와 같이 미생물 고유 형광의 특징적 변경을 형성시킬 수 있다 [참조, 공동-양도된 미국특허출원번호 호, 발명의 명칭 ""Method for the Separation and Characterization of Microorganisms Using Identifier Agents", 2009년 10월 30일 출원, 이는 본원에 참고문헌으로 포함됨].
표 7: P. 애루기노사에 대한 "식별체"로서의 용해 완충액 중의 EDTA
Figure pct00007
실시예 7. 밀도-기반 분리 완충액의 개발
밀도 쿠션으로 공지된 분리 완충액의 목적은 용해된 혈액 성분 및 배양 배지로부터 수 분 내에 대사활성 미생물을 신뢰성 있게 분리하고 분별하기 위한 것이다. 무손상 미생물과 용해된 양성 혈액 배양 브로쓰 샘플의 미생물 사이에 밀도를 가지게 하기 위한 쿠션 물질을 선택하였다. 원심력으로 분리하였다.
본 발명자들은 초기에 (실시예 1-2) 콜로이드성 실리카가 양성 혈액 배양 브로쓰에서 발견된 배지 성분 및 고도의 형광 혈액으로부터 미생물을 신속하게 단리하기 위한 만족스러운 성질들을 갖는다고 결정하였다. 그러나, 일부 미생물 종, 예를 들어 S. 뉴모니애는 침강된 미생물과 오염 혈액 및 배지 성분들 사이에 효과적인 상 장벽을 형성시키기 위해 요구되는 밀도에서 콜로이드성 실리카를 통해 만족스럽게 침강되지 않았다. 이에 따라, 추가적인 더욱 광범위한 효과적인 밀도 쿠션에 대한 조사가 수행되었다.
분리 완충액 중에 함유하기 위한 일련의 화합물들을 스크리닝하였다. 밀도 쿠션을 위한 바람직한 화합물들은 하기 특징들을 갖는다:
1. 쿠션을 통해 미생물의 신속한 침강을 가능하게 하기 위한 저점도
2. 미생물 유도 고유 형광의 간섭을 최소화하기 위한 낮은 형광
3. 바람직하게 조사되는 빛의 파장 전반에 걸쳐 광학적으로 투명함.
4. 미생물에 대해 비독성적.
5. 값싸고 용이하게 입수가능.
6. 광범위한 박테리아 및 샘플에 대해 널리 적용가능함
표 8: 밀도 쿠션에 대해 시험된 화합물의 리스트
Figure pct00008
잠재적인 밀도 화합물을 S. 뉴모니애 (저밀도 캡슐화된 미생물), E. 콜라이드 (중간 밀도 미생물) 및 S. 아우레우스 (고밀도 미생물)를 함유한 양성 혈액 배양 브로쓰를 이용하여 스크리닝하였다. 1부의 용해 완충액 (0.45% Triton X1OO-R + 0.3M CAPS, pH 11.7)을 2부의 샘플과 혼합하고 37℃ 수욕에서 1분 동안 인큐베이션함으로써 실시예 6에 기술된 조건하에서 브로쓰 샘플을 용해하였다. 0.7 ml의 용해물을 이후에 표준 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브의 0.5 ml의 시험 밀도 쿠션 상에 조심스럽게 층 형태로 깔았다. 튜브를 대략 10,000 g에서 2분 동안 회전시키고, 분리 결과를 기록하였다. 하부 층에 눈에 보이는 헤모글로빈 오염이 없는 두개의 별도의 액체 층의 베이스에 침강된 고체 미생물 펠릿이 존재할 때 우수한 분리가 이루어졌다.
밀도 쿠션으로서 콜로이드성 실리카, 이오헥솔, 세슘 클로라이드, LymphoPrep® 및 PolymorphoPrep®를 이용하여 우수한 분리 결과를 얻었다. 덱스트로즈 T70, 피콜 400, 수크로즈 및 폴리비닐 알코올에서 만족스러운 결과를 얻었다. 이오딕산올은 이오헥솔과 유사한 성질을 가질 것으로 기대된다. 본 발명자들은 또한 예를 들어 소듐 클로라이드 첨가에 의한 밀도 쿠션 고삼투성의 형성이 S. 뉴모니애 및 K. 뉴모니애과 같은 저밀도 미생물의 침강을 개선시킨다는 것을 발견하였다.
민감한 S. 뉴모니애 균주, WM43을 함유한 양성 브로쓰를 이용하여 트리톤 X1OO-R, 폴리도세놀, Brij® 97, Genapol® C-100 및 Genapol® X-100으로 제조된 용해 완충액과 조합하여 14% w/v 이오헥솔, 18% w/v 세슘 클로라이드 및 30% PolymorphoPrep® 모액으로 추가 시험을 수행하였다. 5개의 용해 완충액 및 4개의 밀도 쿠션의 조합은 예상되는 우수한 분리를 제공하였다. 이오헥솔 및 세슐 클로라이드 밀도 쿠션에 대한 결과는 도 3에 도시되어 있다. 실시예 6에서 더욱 상세히 논의된 바와 같이, 회수된 S. 뉴모니애 세포의 생존력은 밀도 쿠션의 구성과 무관하게 트리톤 X100-R 및 폴리도세놀을 함유한 완충액에서 높지 않았다.
실시예 8. 수 개의 용해 완충액 및 밀도 쿠션의 평가
본 발명의 개념의 광범위한 적용가능성을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 미니 분류 모델을 개발하기 위해 시딩된 혈액 배양 연구를 이용하여 2개의 선택적 용해 완충액 및 2개의 밀도 쿠션 포뮬레이션의 효능을 비교하였다. 이러한 모델에서 사용되는 미생물은 K. 뉴모니애, K. 옥시토카, S. 아우레우스, S. 에피데르미디스(S. epidermidis), C. 트로피칼리스(C. tropicalis) 및 S. 뉴모니애 (각 6개의 균주)이었다. 용해 완충액 및 밀도 쿠션의 하기 조합을 시험하였다:
세트 A = Brij®-97 용해 완충액 + 플루로닉 F-108을 함유한 24% CsCl 쿠션
세트 B = Genapol® C-100 용해 완충액 + 플루로닉 F-108을 함유한 24% CsCl 쿠션
세트 C = Brij®-97 용해 완충액 + 플루로닉 F-108을 함유한 14% 이오헥솔 쿠션
세트 D = Brij®-97 용해 완충액 + 24% CsCl 쿠션 (플루로닉 F-108 함유하지 않음)
양성 브로쓰의 샘플을 상술된 4개의 각 조건 하에서 하기와 같이 처리되었다:
1. 2.0 ml의 양성 브로쓰 샘플을 1.0 ml의 선택적 용해 완충액과 혼합한 후에, 37℃ 수욕에 1분 동안 넣었다.
2. 1.0 ml의 용해물 샘플을 주문 제작된 광학적 분리 튜브에 함유된 0.5 ml의 밀도 쿠션 상에 층 형태로 깔았다. 2개의 수성상을 교란시키지 않으면서 로딩을 촉진시키기 위해 폴리프로필렌 볼이 밀도 쿠션의 표면 상에 존재하였다.
3. 광학적 분리 튜브를 스크류-캡으로 밀봉하고, 10,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다 (A-8-11 스윙 아웃 로터가 장착된 Eppendorf® 5417R 마이크로원심분리기 (Eppendorf, New York); 도 4).
4. 밀봉된 튜브를 형광분광계 (Fluorolog® 3, HORIBA Jobin Yvon Inc., New Jersey)에 연결된 300 마이크론 섬유 옵틱 프로브에 직접적으로 튜브의 베이스를 결합시킨 주문 제작된 어댑터로 옮겼다.
5. 전체 EEM 스캔을 CCD 검출기 배열을 이용하여 획득하였다 (Ex 260-850 nm, 매 5 nm 마다; Em 260-1100 nm).
6. EEM 데이타를 엑셀로 익스포트하였으며, 미니 분류 모델을 일반 판별 분석 (General Discriminant Analysis; Statistica)을 이용하여 각 시약 세트에 대해 확립하였다.
분리 결과는 하나를 제외하고 모두 4개의 시약 세트에 대해 동일하였다. 밀도 쿠션에 순한 계면활성제 플루로닉 F-108을 함유하지 않는 세트 D는 분리 튜브의 측벽에 이러한 생물체의 강력한 접착으로 인하여 수 개의 C. 트로피칼리스(C. tropicalis) 균주의 바이오매스(biomass)를 상당히 감소시켰다. 이러한 현상은 또한 이오헥솔 쿠션이 사용될 때 발생하였다 (데이타 미기재됨). 후속 데이타 분석은 밀도 쿠션에 순한 계면활성제의 존재가 바람직하지만, 이는 필수적이지 않은 것으로 나타냈다. 실제로, 모두 4개의 제제 조합물의 GDA 결과는 만족스러운 분류 성능을 나타냈다 (표 9). 4개의 시약 세트들 간의 임의의 차이는 비교적 적었다. 가장 흔한 오분류(mis-classification)가 패널 상의 2개의 밀접하게 관련된 종, K. 뉴모니애 및 K. 옥시토카 간에 발생하였다.
표 9
Figure pct00009
세슘 클로라이드-함유 쿠션에 비해 이오헥솔-함유 밀도 쿠션의 잠재적인 단점들 중 하나는 약 380 nm 미만의 여기 파장에서 형광의 상당한 켄칭을 초래하는 의학적으로 사용되는 조영제인 이오헥솔의 강력한 흡착 성질이다. 그러나, 놀라운 발견으로, K. 뉴모니애 및 K. 옥시토카의 분석적 구분은 이오헥솔 쿠션이 사용될 때 개선되었으며, 이는 NADH 및 트립토판과 같은 보다 현저한 형광단의 일부 켄칭이 상이한 켄칭 성질들을 갖는 보다 낮은 수준의 세포 형광단들에 있어서의 차이를 밝혀낼 수 있음을 시사하는 것이다.
Brij® 97 및 Genapol® C-100 함유 용해 완충액은 미생물의 이러한 제한된 패널에 대한 유사한 분류 결과를 제공하였다. 세슘 클로라이드 및 이오헥솔 밀도 쿠션은 또한 유사하게 성능을 발휘하였다. 흥미로운 발견으로, 이오헥솔은 일부 미생물 종의 구분을 선택적으로 보조하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 9. 고유 형광에 의한 혈액 배양 분리물의 신속한 동정을 위한 개선된 방법
미생물 펠릿의 전면 조사의 분류화 능력 및 신속한 선택적 용해 완충액 및 밀도-계열 분리 단계의 최적화가 개선된 광학적 분리 및 관련된 광학적 플랫폼의 디자인 및 검증에서 이루어진 진보의 완성은 혈액 배양 브로쓰와 같은 복잡한 샘플로부터 수 분 내에 미생물을 동정할 가능성을 갖는 새로운 방법을 초래한다.
이러한 방법은 분리 및 판독 단계가 밀봉된 디바이스 내에서 수행되는 바 단순하고 안전하다는 장점을 갖는다. 이러한 방법의 유용성을 추가로 확립하기 위하여, 본 발명자들은 패혈증을 야기시키는 것으로 알려진 가장 유행하는 29개의 종을 나타내는 미생물의 373개의 균주의 데이타베이스를 만들었다. 이러한 생물체을 10 ml의 인간 혈액을 함유한 BacT/ALERT® SA 병에 소량의 접종량으로 "시딩"하였다. 혈액 배양 브로쓰 샘플을 BacT/ALERT® 3D 미생물 검출 시스템에 의해 양성으로 플래깅되는 수 분내에 병으로부터 분리하였다. 샘플을 하기와 같이 처리하였다:
1. 20 ml의 양성 브로쓰 샘플을 1.0 ml의 선택적 용해 완충액 (0.45% w/v Brij® 97 + 0.3M CAPS, pH 11.7)과 혼합한 후에, 37℃ 수욕에서 1분 동안 배치시켰다.
2. 1.0 ml의 용해물 샘플을 주문 제작된 광학적 분리 튜브 중에 함유된 0.5 ml의 밀도 쿠션 (10 mM Hepes ph 7.4 중의 24% w/v 세슘 클로라이드 + 0.005% 플루로닉 F-108) 상에 배치시켰다. 두개의 수성상으로 분배되지 않고 로딩을 촉진시키기 위하여 폴리프로필렌 볼이 밀도 쿠션의 표면 상에 존재하였다.
3. 광학적 분리 튜브를 스크류 캡으로 밀봉시키고 10,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다 (A-8-11 스윙 아웃 로터가 장착된 Eppendorf® 5417R 마이크로원심분리기 (Eppendorf, New York); 도 4).
4. 이후에 밀봉된 튜브를 형광분광계 (Fluorolog® 3, HORIBA Jobin Yvon Inc., New Jersey)에 결합된 300 마이크론 섬유 광학 프로브에 튜브의 베이스를 직접적으로 결합시킨 주문 제작된 어댑터로 옮겼다.
5. 정제된 미생물 펠릿의 전체 EEM 스캔을 CCD 검출기 배열을 이용하여 수행하였다 (Ex 260-850 nm, 5 nm 마다; Em 260-1100 nm)
6. EEM 데이타를 엑셀로 익스포트하였다.
7. 병 플래깅 사건으로부터 20분 미만 소요되는 전체 공정을 2-8℃에서 4-5 시간 동안 저장된 양성 브로쓰를 이용하여 반복하였다. 저장된 브로쓰를 가공 전에 5분 동안 가온시켰다.
양성 혈액 배양 브로쓰로부터 분리된 미생물 펠릿의 EEM 스펙트럼의 일부 대표적인 예는 도 5 내지 도 8에 제공된다. 존재하는 다양한 세포 형광단의 크기 및 외형 모두에 있어서, 도시된 종들 간에 차이가 시각적으로 분명하였다.
데이타를 미생물 분류 데이타베이스를 만들기 위한 목적으로 다양한 다변량 분석법으로 분석하였다. 각 스캔 파일은 9,000개 이상의 개개 형광 판독치를 포함하였으며, 이에 따라 분석 이전에 데이타를 최소화하고 일반화하기 위해 여러 방법들을 사용하였다. 일 예로서, 표 10은 일반 판별 분석 (Statistica)을 이용한 일부 예비 결과를 나타낸 것이다. 추가적인 입력 변수, 예를 들어 BacT/ALERT® 미생물 검출 시스템으로부터 획득된 시간-대-검출 및 성장속도, 및 세포 펠릿에 존재하는 바이오매스의 양을 패혈증-야기 분리물의 동정 및/또는 특정규명에서 도움을 주기 위해 사용하였다 (참조, 실시예 10).
표 10에서의 데이타가 종 수준에 대한 동정 결과를 나타내는 것이지만, 전문의에게 임상적으로 관련된 실질적인 정보를 제공하는 임의의 그룹핑 수준을 전달할 수 있다. 이러한 것의 예에는 "치료학적" 그룹이 있는데, 이의 미생물 종은 이러한 것들을 처리하기 위해 사용되는 항생제에 따라 그룹핑된 것이다.
본 발명에 기술된 방법은 안전성 및 신뢰성 있는 방식으로 양성 혈액 배양 병으로부터 미생물을 신속하게 동정하기 위한 긴급한 필요성을 만족시킨다. 표 10에 예시된 결과는 시간 지연 또는 비용 없이 미생물의 성장 또는 분자 특성에 의존적인 다른 동정의 결과에 필적한다. 또한, 이러한 방법은 완전 자동화될 수 있어 ID 결과가 밤낮으로 언제든지 전자 디바이스를 통해 전문의에게 바로 전달될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 주문 제작된 1회용(disposable) 디바이스의 인빌트 분리(inbuilt separation) 및 판독 섹션으로 인하여 다수의 진단 기술들과 양립가능하며, 온전한 미생물은 "고체상"으로서 표시된다(도 4). 본 발명의 개념을 이용하여 개발되는 보충 시험의 예는 미생물 효소, 세포-표면 마커, 핵산 프로브 및 미생물 대사의 억제제의 측정을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 방법은 자동화 및 소형화에 적용가능하다. 이러한 가능성은 2009년 10월 30일에 출원된 공동 계류중인 미국특허출원번호 호 [발명의 명칭: "Methods for Separation and Characterization of Microoragnisms Using Identifier Agents"]에 상세히 기술되어 있으며, 이는 본원에 참고문헌으로 포함된다.
표 10: 신속한 미생물 ID 방법
데이타베이스는 조합된 새로운 및 저장된 샘플 데이타로 만들어졌다 (746 스캔; 373개 균주; 29개 종) 오로지 새로운 샘플들의 리브-원-아웃(leave-one-out) 교차-타당성 결과
Figure pct00010
실시예 10. 미생물의 특성규명 및/또는 동정에 있어 도움을 주는 비-분광학적 측정
검출 시스템 알고리즘으로부터 획득되는 검출 시간 및 미생물 성장 속도, 및 분리된 미생물 펠릿의 크기, 모양, 칼라 및 밀도와 같은 비-분광학적 측정을 미생물의 특성규명 및/또는 동정을 위한 추가 변수로서 사용할 수 있다.
도 9 및 도 10에 제공된 예는 펠릿 크기, 검출 시간 및 평균 고유 형광의 측정이 두개의 밀접하게 관련된 종, 즉 S. 뉴모니애 및 S. 미티스의 구별에 도움을 주고 이의 동정을 확인하기 위해 사용할 수 있다. 각 심볼은 본 발명의 방법에 의해 양성 혈액 배양 브로쓰로부터 회수된 별도의 임상적 단리물을 나타낸 것이다. 도 9 및 도 10에서 원형으로 표시된 S. 뉴모니애 단리물은 표 10에 제공된 예비 결과에서 S. 미티스로서 부정확하게 동정된 것이다 (실시예 9).
상기 서술은 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 이를 제한하는 것으로서 해석되지 않는다. 본 발명은 하기 청구항들에 의해 규정되며, 이러한 청구항들의 균등물은 본원에 포함될 것이다. 모든 간행물, 특허출원, 특허, 특허 공개문헌, 및 본원에 인용된 임의의 다른 참고문헌은 참고문헌이 기술되는 문장 및/또는 문단과 관련된 교시에 대해 그 전체가 참조로 포함된다.

Claims (37)

  1. (a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 시험 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 상기 시험 샘플에서 비-미생물 세포(non-microorganism cell)를 선택적으로 용해시켜서 용해된 샘플을 생성시키는 단계;
    (c) 상기 용해된 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 분리하여 단리된 미생물 샘플을 형성하는 단계;
    (d) 상기 단리된 미생물을 분광학적으로 조사(spectroscopically interrogating)하여 상기 미생물의 분광학적 측정치를 산출하는 단계; 및
    (e) 상기 분광학적 측정치를, 공지된 미생물로부터 수득된 분광학적 측정치 또는 공지된 미생물로부터 예측되는 분광학적 특성과 비교함으로써 상기 단리된 샘플내의 상기 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 단계를 포함하는, 시험 샘플로부터 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 단계 (c) 및 (d)가 밀봉된 용기에서 수행되며, 상기 조사 단계 (d)가 비침습적인 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 분광학적 측정치가 형광 분광법 및 라만 분광법으로부터의 측정치인 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 분광법이 형광 분광법, 확산 반사 분광법, 흡수 및 투과 분광법, 적외선 분광법, 테라헤르쯔 분광법(terahertz spectroscopy) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 형광 분광법이 전면 모드(front face mode)로 측정되는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 동정이 상기 미생물의 고유 형광을 기반으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 분광법이 여기-방출 매트릭스 (EEM)를 결정함을 포함하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 EEM이 공지된 미생물의 EEM의 데이타베이스와 비교되는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 미생물이 하나 이상의 표현형 및/또는 형태상 특징을 기반으로 특성규명되는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 미생물이 검출 시간, 성장 속도, 및 미생물 펠릿 크기, 형상, 색상 및/또는 밀도 중의 하나 이상의 측정치를 기반으로 하여 특성규명되는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 미생물이 그람 그룹, 임상적 그람 그룹, 치료적 그룹, 기능적 그룹 및 천연 고유 형광 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 분류 모델로 특성규명되는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 미생물이 속 수준, 종 수준, 또는 균주 수준으로 동정되는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 선택적 용해 단계(b)가 초음파처리, 삼투압 쇼크, 화학적 처리, 또는 이들의 조합에 의해 수행되는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 선택적 용해 단계(b)가 하나 이상의 세정제를 포함하는 용해액을 이용하여 수행되는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 하나 이상의 세정제가 Triton® X-100, Triton® X-100-R, Triton® X-114, NP-40, Genapol® C-100, Genapol® X-100, Igepal® CA 630, Arlasolve™200, Brij® 96/97, CHAPS, 옥틸 β-D-글루코피라노시드, 사포닌, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 (C12E9, 폴리도세놀), 소듐 도데실 설페이트, N-라우릴사르코신, 소듐 데옥시콜레이트, 담즙산염(bile salt), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드, SB3-10, SB3-12, 아미도설포베타인-14, C7BzO, Brij® 98, Brij® 58, Brij® 35, Tween® 80, Tween® 20, Pluronic® L64, Pluronic® P84, 비세정제(non-detergent) 설포베타인 (NDSB 201), 암피폴(amphipol) (PMAL-C8), 및 메틸-β-시클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 세정제가 구조 C12 -18/E9 -10을 포함하는 폴리옥시에틸렌 세정제인 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌 세정제가 Brij® 97, Brij® 96V, Genapol® C-100, Genapol® X-1OO, 및 폴리도세놀로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  18. 제 14항에 있어서, 상기 용해액이 하나 이상의 프로테이나제 및 하나 이상의 누클레아제의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 효소를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제 14항에 있어서, 상기 용해액이 하나 이상의 완충제를 포함하는 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 상기 분리 단계(c)가 여과에 의해 수행되며, 상기 여과가 단리된 미생물 샘플을 생성시키는 방법.
  21. 제 1항에 있어서, 상기 용해된 샘플이 상기 용기의 밀도 쿠션 상에 층 형태로 깔려지며, 상기 용기가 원심분리되어 미생물 펠릿을 형성시키는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 밀도 쿠션이 콜로이드성 실리카, 아이오드화된 조영제, 수크로즈, 현미경 침지 오일, 미네랄 오일, 실리콘 오일, 플루오로실리콘 오일, 실리콘 겔, 메트리조에이트-Ficoll®, 디아트리조에이트-덱스트란, 카르복시메틸 셀룰로즈, 히드록시프로필메틸 셀룰로즈, 폴리에틸렌 옥사이드 (고분자량), Pluronic® F127, Pluronic® F68, 폴리아크릴산, 가교된 폴리비닐 알코올, 가교된 폴리비닐 피롤리딘, PEG 메틸 에테르 메타크릴레이트, 펙틴, 아가로즈, 크산탄, 젤란, Phytagel®, 소르비톨, Ficoll®, 글리세롤, 덱스트란, 글리코겐, 세슘 클로라이드, 퍼플루오로카본 유체, 및/또는 히드로플루오로카본 유체 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  23. 제 1항에 있어서, 상기 시험 샘플이 미생물을 함유하는 것으로 알려진 배양 샘플인 방법.
  24. (a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 혈액 배양물로부터 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 상기 시험 샘플에서 비-미생물 세포를 선택적으로 용해시켜서 용해된 샘플을 생성시키는 단계;
    (c) 밀폐 용기내에서 상기 용해된 샘플을 밀도 쿠션(density cushion)상에 층 형태로 까는 단계;
    (d) 상기 용기를 원심분리함으로써 상기 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 분리하여 미생물의 펠릿(pellet)을 형성하는 단계;
    (e) 상기 단리된 미생물을 분광학적으로 조사하여 상기 미생물의 분광학적 측정치를 산출하는 단계; 및
    (f) 상기 분광학적 측정치를, 공지된 미생물로부터 수득된 분광학적 측정치 또는 공지된 미생물로부터 예측되는 분광학적 특성과 비교함으로써 상기 단리된 샘플내의 상기 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 단계를 포함하는, 혈액 배양물로부터 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법.
  25. (a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 시험 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 상기 시험 샘플을 밀폐 용기에 넣는 단계;
    (c) 상기 시험 샘플의 다른 성분들로부터 미생물을 원위치(in situ)에서 분리하여 상기 밀폐 용기에서 단리된 미생물 샘플을 형성하는 단계;
    (d) 상기 단리된 미생물을 원위치에서 분광학적으로 조사하여 상기 미생물의 분광학적 측정치를 산출하는 단계; 및
    (e) 상기 분광학적 측정치를, 공지된 미생물로부터 수득된 분광학적 측정치 또는 공지된 미생물로부터 예측되는 분광학적 특성과 비교함으로써 상기 단리된 샘플내의 상기 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 단계를 포함하는, 미생물을 특성규명하고/하거나 동정하는 방법.
  26. 제 1항에 있어서, 상기 분광학적 측정치가 형광 분광법 및 라만 분광법으로부터의 측정치인 방법.
  27. 제 25항에 있어서, 상기 분광법이 형광 분광법, 확산 반사 분광법, 흡수 및 투과 분광법, 적외선 분광법, 테라헤르쯔 분광법 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 동정이 상기 미생물의 고유 형광을 기반으로 하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 분광법이 여기-방출 매트릭스 (EEM)을 결정함을 포함하며, 상기 EEM이 공지된 미생물의 EEM의 데이타베이스와 비교되는 방법.
  30. 제 25항에 있어서, 상기 분리 단계(c)가 원심분리 또는 여과에 의해 수행되는 방법.
  31. 제 25항에 있어서, 상기 샘플이 상기 용기의 밀도 쿠션 상에 층 형태로 깔려지며, 상기 용기가 원심분리되어 미생물 펠릿을 형성시키는 방법.
  32. 제 25항에 있어서, 상기 밀도 쿠션이 콜로이드성 실리카, 아이오드화된 조영제, 수크로즈, 현미경 침지 오일, 미네랄 오일, 실리콘 오일, 플루오로실리콘 오일, 실리콘 겔, 메트리조에이트-Ficoll®, 디아트리조에이트-덱스트란, 카르복시메틸 셀룰로즈, 히드록시프로필메틸 셀룰로즈, 폴리에틸렌 옥사이드 (고분자량), Pluronic® F127, Pluronic® F68, 폴리아크릴산, 가교된 폴리비닐 알코올, 가교된 폴리비닐 피롤리딘, PEG 메틸 에테르 메타크릴레이트, 펙틴, 아가로즈, 크산탄, 젤란, Phytagel®, 소르비톨, Ficoll®, 글리세롤, 덱스트란, 글리코겐, 세슘 클로라이드, 퍼플루오로카본 유체, 및/또는 히드로플루오로카본 유체 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  33. 제 25항에 있어서, 상기 미생물이 하나 이상의 표현형 및/또는 형태상 특징을 기반으로 특성규명되는 방법.
  34. 제 25항에 있어서, 상기 미생물이 검출 시간, 성장 속도, 및 미생물 펠릿 크기, 형상, 색상 및/또는 밀도의 하나 이상의 측정치를 기반으로 하여 특성규명되는 방법.
  35. 제 25항에 있어서, 상기 미생물이 그람 그룹, 임상적 그람 그룹, 치료적 그룹, 기능적 그룹 및 천연 고유 형광 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 분류 모델로 특성규명되는 방법.
  36. 제 25항에 있어서, 상기 미생물이 속 수준, 종 수준, 또는 균주 수준으로 동정되는 방법.
  37. 제 25항에 있어서, 상기 시험 샘플이 미생물을 함유하는 것으로 알려진 배양 샘플인 방법.
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