BRPI0919895B1 - método para identificação de um microorganismo desconhecido a partir de uma amostra de teste - Google Patents

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Abstract

métodos para a separação, caracterização e/ou identificação de micro-organismos por espectroscopia a presente invenção refere-se a um método para separar, caracterizar e/ou identificar micro-organismos em uma amostra de teste. o método compreende uma etapa de lise óptica para submeter alise células que não sejam de micro-organismos que possam se fazer presentes em uma amostra de teste, seguida por uma etapa de separação subsequente. ademais, o método pode ser particularmente útil na separação, caracterização e/ ou identificação de micro-organismos a partir de amostras complexas, como meios de cultura contendo sangue. a invenção propõe ainda a interrogação espectroscópica da amostra de microorganismos separados para produzir medidas dos microorganismos a fim de caracterizá-los e/ou identificá-los com as referidas medidas espectroscópicas.

Description

“MÉTODO PARA IDENTIFICAÇÃO DE UM MICROORGANISMO DESCONHECIDO A PARTIR DE UMA AMOSTRA DE TESTE”
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [001] O presente pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisório dos Estados Unidos no 61/110.187, intitulado “Method and System for Detection and/or Characterization of a Biological Particle in a Sample” e depositado no dia 31 de outubro de 2008, o qual se encontra anexado ao presente documento.
CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção refere-se a métodos e sistemas para detectar, isolar e/ou identificar micro-organismos em uma amostra. Em especial, a presente invenção refere-se a um método para a rápida caracterização e/ou identificação de micro-organismos por meio de técnicas espectroscópicas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [003] A detecção de micro-organismos patogênicos em fluidos biológicos deve ser realizada o mais rápido possível, principalmente em casos de septicemia, em que o risco de morte continua alto mesmo com a ampla gama de antibióticos disponíveis para os médicos. Por via de regra, determina-se a presença de agentes biologicamente ativos, tal como microorganismos, no fluido corporal do paciente, em especial o sangue, coletando-se frascos de cultura sanguínea. Infecções na corrente sanguínea estão relacionadas a alta morbidade e mortalidade, mas, ainda assim, os métodos de diagnóstico atuais, seguidos por testes de identificação bioquímica e susceptibilidade antibiótica, podem levar vários dias. Na maioria das vezes, o médico inicia a terapia empírica com base nos sintomas clínicos, e os resultados dos testes apenas influenciam nas decisões clínicas quando esta é mal-sucedida. A capacidade de caracterizar infecções na corrente sanguínea nas primeiras horas, de preferência em uma hora, após o resultado de uma cultura sanguínea positiva aumentaria significativamente a relevância clínica
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2/73 das informações do diagnóstico. Foram propostos métodos de amplificação molecular para cumprir essa necessidade, mas, ainda assim, há sérios desafios nessa abordagem. O caldo de cultura sanguínea positiva em si representa uma população naturalmente amplificada de micro-organismos com potencial para uso em vários testes de identificação (ID) rápidos.
[004] Testes de identificação fenotípica automatizados tradicionais, como os sistemas Vitek®, Phoenix™ e Microscan®, ou testes fenotípicos manuais, como o API, exigem que os micro-organismos estejam em uma fase adequada do caldo e livres de meios e produtos sanguíneos interferentes a fim de proporcionar resultados sólidos. Esses sistemas usam colônias cultivadas no caldo positivo por 18 a 24 horas em meios revestidos. No entanto, na tentativa de obter resultados mais rápido, alguns laboratórios relataram usar esses sistemas com micro-organismos isolados dos fracos de cultura sanguínea positiva. Esses testes diretamente do fraco não são adequados a todos os micro-organismos (por exemplo, o coco gram-positivo), não são aprovados pelos fabricantes e, em geral, levam de 3 a 8 horas para produzir resultados. Há uma necessidade urgente por testes específicos mais amplos e rápidos a fim de conferir ao médico resultados clinicamente relevantes nas primeiras horas, de preferência em uma hora, após o resultado de uma cultura positiva.
[005] Os métodos de espectroscopia óptica, tal como a fluorescência intrínseca (IF), a espectroscopia de infravermelho (FTIR) ou a espectroscopia Raman, e os métodos de espectrometria de massa, tal como a MALDI-TOF, têm potencial para permitir a identificação de micro-organismos com bastante rapidez, mas podem sofrer interferência dos vários compostos altamente fluorescentes e absortivos presentes em amostras clínicas ou meios de cultura microbiológica líquidos como o sangue ou combinações dele. Os métodos usados com mais frequência para recuperar micro-organismos diretamente do caldo de cultura sanguínea positiva são a centrifugação diferencial bifásica e a centrifugação em um tubo separador de soro sanguíneo.
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3/73 [006] Foram descritos outros métodos para a separação, caracterização e/ou identificação de micro-organismos, dentre os quais, citamos os abaixo.
[007] A patente dos Estados Unidos no 4.847.198 revela um método para a identificação de micro-organismos por meio de espectrometria Raman estimulada por raios ultravioleta. De acordo com ela, uma suspensão bacteriana entra em contato com um único comprimento de onda na faixa ultravioleta. Parte da energia luminosa usada é absorvida e parte emitida. A energia luminosa emitida, espalhamento Raman aprimorado por ressonância, é medida como energia de difusão retrógrada. A energia é processada para produzir espectros característicos das bactérias.
[008] A patente dos Estados Unidos no 5.938.617 em nome de Vo-Dinh refere-se a um sistema que identifica patógenos biológicos em uma amostra estimulando-a com luz em vários comprimentos de onda e, ao mesmo tempo, colhendo amostras das intensidades da emissão. O sistema inclui mecanismos para expor a amostra à radiação de estímulo e, assim, gerar uma radiação de emissão. Os patógenos biológicos podem ser vírus ou bactérias.
[009] A patente dos Estados Unidos no 6.177.266 revela um método para a classificação quimiotaxonômica de bactérias com biomarcadores específicos de gênero, espécie e linhagem gerados por análise de espectrometria de massa por tempo de voo com dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF-MS) de extratos protéicos celulares ou células inteiras.
[010] Na patente dos Estados Unidos no 7.070.739, é apresentado um método para extrair, separar e purificar micróbios, incluindo vírus, por ultracentrifugação bidimensional diretamente de fluidos corporais ou tecidos homogeneizados. Em uma primeira etapa de centrifugação, todas as partículas são removidas com uma velocidade de sedimentação superior à dos micróbios que serão identificados. Na segunda etapa de ultracentrifugação,
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4/73 utiliza-se a bandagem isopícnica em líquidos despejados para formar um gradiente de densidade de grande largura usando tubos de centrífuga serrilhados especiais. De acordo com a patente, é possível usar a técnica de separação para detectar partículas bandadas por difusão ou fluorescência de luz usando corantes específicos de ácido nucléico e para recuperar as partículas bandadas em volumes muito pequenos para a caracterização por espectrometria de massa de subunidades protéicas virais e partículas virais intactas e por determinação citométrica de fluxo de fluorescência tanto da massa do ácido nucléico quanto das massas dos fragmentos produzidos por enzimas de restrição.
[011] A publicação do pedido de patente dos Estados Unidos no 2007/0037135 revela um sistema para a identificação e quantificação de uma amostra biológica suspensa em líquido. O sistema inclui um módulo de estímulo por fluorescência com ao menos uma fonte de luz de estímulo; um módulo de interface de amostras opticamente conectado ao módulo de estímulo por fluorescência para posicionar uma amostra biológica para receber luz de estímulo a partir da ao menos uma fonte de luz de estímulo; um módulo de emissão de fluorescência opticamente conectado ao módulo de interface da amostra e compreendendo ao menos um dispositivo de detecção para detectar matrizes de estímulo-emissão de fluorescência da amostra biológica; e um módulo computacional operacionalmente conectado ao módulo de emissão de fluorescência. O módulo computacional realiza análises multivariadas nas matrizes de estímulo-emissão de fluorescência da amostra biológica para identificá-la e qualificá-la. No entanto, o pedido não discute a identificação e quantificação de micro-organismos a partir de amostras biológicas complexas como o sangue.
[012] A publicação do pedido de patente dos Estados Unidos no 2007/0175278 descreve o uso de um meio de cultura líquido para cultivar uma amostra de interesse, incluindo, por exemplo, sangue, urina, fezes, catéteres intravenosos etc., linhas de produção industrial, sistemas de água,
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5/73 um produto alimentício, um produto cosmético, um produto farmacêutico e uma amostra forense. Em seguida, os micro-organismos são retirados do meio líquido por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por centrifugação. Os micro-organismos concentrados são, então, transferidos para o material transportador, opcionalmente após a secagem, para a obtenção de um espectro vibracional. O pedido de patente revela vários métodos para identificar e classificar micro-organismos, incluindo espectroscopia vibracional, tal como a espectroscopia Raman.
[013] Todavia, esses métodos apresentam várias desvantagens nas tentativas de separar e caracterizar micro-organismos a partir de amostras complexas como meios de cultura contendo sangue. As preparações microbianas resultantes geralmente contêm glóbulos vermelhos, plaquetas, partículas de lipídios, enzimas plasmáticas e resíduos celulares contagiosos, os quais podem prejudicar os resultados. Esses métodos também exigem bastante trabalho, além de serem inseguros devido a etapas que podem resultar na exposição por aerossol de patógenos potencialmente perigosos ao usuário. Há a necessidade de métodos simples, seguros e confiáveis para isolar micro-organismos de amostras clínicas (por exemplo, caldo de cultura sanguínea) e outras amostras complexas isentas de materiais interferentes e compatíveis com tecnologias de identificação rápida.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [014] A presente invenção refere-se a métodos para isolar, caracterizar e/ou identificar micro-organismos em uma amostra. Os métodos permitem a caracterização e/ou identificação de micro-organismos com mais rapidez do que as técnicas anteriores, levando a diagnósticos (por exemplo, em um paciente que tenha ou que se suspeite que tenha septicemia) e à identificação de materiais contaminados com mais rapidez (por exemplo, gêneros alimentícios e produtos farmacêuticos). As etapas envolvidas nos métodos da invenção, desde a obtenção de uma amostra à caracterização e/ou identificação de micro-organismos, podem ser realizadas em bem menos
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6/73 tempo para produzir informações clinicamente relevantes, por exemplo, em menos de cerca de 120 minutos. Ademais, os métodos da invenção podem ser totalmente automatizados, diminuindo assim o risco inerente de manusear materiais contagiosos e/ou de contaminar as amostras.
[015] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para caracterizar e/ou identificar um micro-organismo a partir de uma amostra de teste, o método sendo caracterizado por compreender:
(a) obter uma amostra de teste que contenha ou acreditese conter micro-organismos;
(b) submeter seletivamente a lise as células de não-microorgânismos da referida amostra de teste a fim de produzir uma amostra submetida a lise;
(c) separar micro-organismos de outros componentes da referida amostra submetida a lise para formar uma amostra de microorganismos isolada;
(d) interrogar espectroscopicamente os referidos microorganismos isolados para produzir medidas espectroscópicas deles; e (e) caracterizar e/ou identificar os referidos microorganismos da referida amostra isolada comparando-se as medidas espectroscópicas com medidas espectroscópicas tiradas, ou propriedades espectroscópicas prognosticadas, de micro-organismos conhecidos.
[016] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para caracterizar e/ou identificar micro-organismos a partir de uma cultura sanguínea, o método sendo caracterizado por compreender:
(a) obter uma amostra de uma cultura sanguínea que contenha ou acredite-se conter micro-organismos;
(b) submeter seletivamente a lise as células de não-microorgânismos da referida amostra a fim de produzir uma amostra submetida a lise;
(c) dispor a referida amostra submetida a lise sobre uma
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7/73 camada de densidade dentro de um recipiente vedado;
(d) centrifugar o recipiente para separar micro-organismos de outros componentes da referida amostra e formar um precipitado de microorganismos;
(e) interrogar espectroscopicamente os referidos microorganismos isolados para produzir medidas espectroscópicas deles; e (f) caracterizar e/ou identificar os referidos microorganismos da referida amostra isolada comparando as medidas espectroscópicas com medidas espectroscópicas tiradas, ou propriedades espectroscópicas prognosticadas, de micro-organismos conhecidos.
[017] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para caracterizar e/ou identificar micro-organismos, o método sendo caracterizado por compreender:
(a) obter uma amostra de teste que contenha ou acreditese conter micro-organismos;
(b) inserir a referida amostra de teste em um recipiente vedado;
(c) separar in situ os micro-organismos de outros componentes da referida amostra de teste para formar uma amostra de microorganismos isolada dentro do referido recipiente vedado;
(d) interrogar espectroscopicamente in situ os referidos micro-organismos isolados para produzir medidas espectroscópicas deles; e (e) caracterizar e/ou identificar os referidos microorganismos da referida amostra isolada comparando-se as medidas espectroscópicas com medidas espectroscópicas tiradas, ou propriedades espectroscópicas prognosticadas, de micro-organismos conhecidos.
[018] Em uma concretização, a separação é realizada dispondo a amostra de teste sobre uma camada de densidade em um recipiente vedado (por exemplo, um recipiente hermeticamente fechado) e centrifugando o recipiente para precipitar os micro-organismos enquanto o
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8/73 meio da amostra de teste permanece sobre a camada de densidade. Em outra concretização, o recipiente possui uma janela óptica embaixo dele e/ou nas laterais para possibilitar a interrogação espectroscópica do precipitado de micro-organismos. É possível identificar os micro-organismos comparando-se o espectro do precipitado a um ou mais espectros, ou propriedades espectroscópicas prognosticadas, de micro-organismos conhecidos. A possibilidade de identificar micro-organismos diretamente no precipitado, sem novos manuseios, melhora significativamente a segurança deste método de identificação microbiana.
[019] Em uma concretização, a interrogação espectroscópica baseia-se em características intrínsecas dos microorganismos (por exemplo, fluorescência intrínseca). Em outras concretizações, a interrogação espectroscópica baseia-se em parte em sinais obtidos por agentes adicionais que são acrescentados durante os métodos da invenção e interagem com micro-organismos ou grupos de micro-organismos específicos.
[020] Em outra concretização, os métodos compreendem ainda a etapa de recuperar o precipitado de micro-organismos, ressuspender o micro-organismo e realizar novos testes de identificação ou caracterização (por exemplo, resistência a fármacos, fatores de virulência, antibiograma).
[021] Explicaremos a presente invenção em mais detalhes por meio das figuras anexas e da descrição estabelecida abaixo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [022] A Fig. 1 ilustra fotografias de recipientes de separação após as etapas de lise e separação da presente invenção em uma cultura de S. pneumoniae e em um caldo de cultura negativa.
[023] As Figs. de 2A a 2C ilustram espectros exemplificativos de estímulo/emissão de micro-organismos isolados usando os tampões de lise A, B e C na etapa de lise antes da interrogação.
[024] A Fig. 3 ilustra fotografias de recipientes de
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9/73 separação após realizar as etapas de lise e separação da presente invenção usando cinco tampões de lise e duas camadas de densidade diferentes.
[025] A Fig. 4 é a fotografia de um dispositivo de separação que ilustra um caldo de cultura sanguínea contendo microorganismos submetido a lise após a centrifugação. É possível ver com clareza na fotografia a cultura sanguínea submetida a lise, a camada de densidade e o precipitado de micro-organismos.
[026] As Figs. de 5 a 8 ilustram exemplos de espectros de estímulo/emissão de vários micro-organismos lidos em um recipiente de separação vedado.
[027] A Fig. 9 é um gráfico que ilustra o sinal de fluorescência intrínseca médio de precipitados obtidos a partir de culturas de dez S. mitis (círculos) e dez S. penumoniae (triângulos).
[028] A Fig. 10 é um gráfico que ilustra o tamanho médio dos precipitados obtidos a partir de culturas de dez S. mitis (círculos) e dez S. penumoniae (triângulos).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [029] A presente invenção pode ser concretizada de diferentes maneiras e não se limita às concretizações estabelecidas neste documento. Em vez disso, essas concretizações são apresentadas de modo que esta revelação seja minuciosa e completa, além de transmitir plenamente o âmbito da invenção aos versados na técnica. Por exemplo, características descritas com referência a uma concretização podem ser incorporadas em outras concretizações, e características ilustradas com referência a uma concretização específica podem ser excluídas dela. Ademais, vários incrementos e variações às concretizações sugeridas no presente documento transparecerão aos versados pela leitura da presente revelação sem divergir da presente invenção.
[030] Salvo indicação em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm os mesmos significados
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10/73 normalmente usados pelos versados na técnica a que pertence esta invenção. A terminologia usada na descrição desta invenção serve apenas ao intuito de descrever concretizações específicas e não visa limitar a presente invenção.
Definições [031] Conforme usados no presente documento, os artigos “um”, “uns”, “uma”, “umas”, “o”, “os”, “a” e “as” podem significar um ou mais. Por exemplo, “uma” célula pode significar uma única célula ou várias.
[032] Conforme usado no presente documento, “e/ou” refere-se a e abrange toda e qualquer combinação possível de um ou mais itens listados relacionados, bem como a falta de combinações quando interpretado de forma alternativa (“ou”).
[033] Ademais, conforme usado no presente documento, os termos “cerca de” e “em torno de” referem-se a um valor mensurável de modo que a quantidade de um composto ou agente da presente invenção, dose, tempo, temperatura ou algo do gênero abranja variações de ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0,5% ou mesmo ±0,1% da quantidade especificada.
[034] Conforme usado no presente documento, o termo “micro-organismo” visa abranger organismos geralmente unicelulares, que podem ser multiplicados e manuseados em laboratório, incluindo, entre outros, bactérias gram-positivas ou gram-negativas, leveduras, fungos, parasitas e mollicutes. Exemplos não-limitantes de bactérias gram-negativas da presente invenção incluem bactérias dos gêneros a seguir: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Brevundimonas, Ralstonia, Achromobacter,
Fusobacterium, Prevotella, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Brucella, Pasteurella, Providencia e Legionella. Exemplos não-limitantes de bactérias gram-positivas da presente invenção incluem bactérias dos gêneros a seguir: Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Listeria,
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Peptostreptococcus, Propionibacterium, Clostridium, Bacteroides, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Mycobacteria e Corynebacteria. Exemplos não-limitantes de leveduras e fundos da presente invenção incluem os dos gêneros a seguir: Candida, Cryptococcus, Nocardia, Penicillium, Alternaria, Rhodotorula, Aspergillus, Fusarium, Saccharomyces e Trichosporon. Exemplos não-limitantes de parasitas da presente invenção incluem os dos gêneros a seguir: Trypanosoma, Babesia, Leishmania, Plasmodium, Wucheria, Brugia, Onchocerca e Naegleria. Exemplos nãolimitantes de mollicutes da presente invenção incluem os dos gêneros a seguir: Mycoplasma e Ureaplasma.
[035] Em uma concretização, conforme descrito em mais detalhes neste documento, os micro-organismos de uma amostra ou meio de cultivo podem ser separados e interrogados para caracterizá-los e/ou identificá-los. Conforme usado no presente documento, o termo “separar” abrange qualquer amostra de micro-organismos removida, concentrada ou de alguma outra forma recolhida de seu estado original ou de um meio de cultivo ou cultura. Por exemplo, de acordo com a presente invenção, os microorganismos podem ser separados (por exemplo, como uma amostra separada) de não-micro-organismos ou componentes de não-micro-organismos que, de outro modo, poderiam interferir na caracterização e/ou identificação. O termo pode incluir uma camada de micro-organismos disposta entre duas outras camadas, por exemplo, micro-organismos aglomerados sobre uma camada de alta densidade após a centrifugação, ou uma camada de micro-organismos aglomerada sobre uma superfície sólida (por exemplo, uma membrana de filtragem). O termo pode incluir ainda um conjunto de micro-organismos que atravessou parcialmente uma camada (por exemplo, uma camada de densidade). Como tal, uma amostra separada de micro-organismos pode incluir qualquer conjunto ou camada de micro-organismos ou componentes de microorganismos que seja mais concentrada que ou de alguma outra forma separada da amostra original e pode variar de um denso aglomerado de micro
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12/73 organismos próximos a uma camada difusa de micro-organismos. Os componentes de micro-organismos que podem ser contidos em uma forma ou amostra separada incluem, entre outros, pilli, flagelos, fímbrias e cápsulas em qualquer combinação. Componentes de não-micro-organismos que são separados dos micro-organismos podem incluir células de não-microorganismos (por exemplo, células sanguíneas e/ou outra células epidérmicas) e/ou componentes delas.
[036] Em ainda outra concretização, conforme descrito em mais detalhes no presente documento, os micro-organismos de uma amostra ou meio de cultivo podem ser isolados e interrogados para caracterizálos e/ou identificá-los. Conforme usado no presente documento, o termo “isolado” abrange qualquer amostra de micro-organismos ao menos parcialmente purificada a partir de sua condição original ou de um meio de cultivo ou cultura e quaisquer não-micro-organismos ou componentes de microorganismos contidos nela. Por exemplo, de acordo com a presente invenção, os micro-organismos podem ser isolados (por exemplo, como uma amostra isolada) de não-micro-organismos ou componentes de não-micro-organismos que, caso contrário, poderiam interferir na caracterização e/ou identificação. Componentes de não-micro-organismos que são separados dos microorganismos podem incluir células de não-micro-organismos (por exemplo, células sanguíneas e/ou outra células epidérmicas) e/ou componentes delas.
[037] Em ainda outra concretização, conforme descrito em mais detalhes no presente documento, os micro-organismos de uma amostra ou meio de cultivo podem ser precipitados e interrogados para caracterizá-los e/ou identificá-los. Conforme usado no presente documento, o termo “precipitado” abrange qualquer amostra de micro-organismos comprimida ou depositada em uma massa de micro-organismos. Por exemplo, os micro-organismos de uma amostra podem ser comprimidos ou depositados em uma massa no fundo de um tubo por centrifugação ou outros métodos conhecidos na técnica. O termo inclui um conjunto de micro-organismos (e/ou
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13/73 componentes deles) no fundo e/ou nas laterais de um recipiente após a centrifugação. Os componentes de micro-organismos que podem ser contidos em um precipitado incluem, entre outros, pilli, flagelos, fímbrias e cápsulas em qualquer combinação. De acordo com a presente invenção, os microorganismos podem ser precipitados (por exemplo, como um precipitado de micro-organismos substancialmente purificado) a partir de não-microorganismos ou componentes de não-micro-organismos que, caso contrário, interfeririam na caracterização e/ou identificação. Componentes de não-microorganismos que são separados dos micro-organismos podem incluir células de não-micro-organismos (por exemplo, células sanguíneas e/ou outra células epidérmicas) e/ou componentes delas.
[038] Conforme usado no presente documento, o termo “camada de densidade” refere-se a uma solução de densidade homogênea.
[039] A presente invenção refere-se a métodos para isolar, caracterizar e/ou identificar micro-organismos em uma amostra. Ademais, o método pode ser particularmente útil à separação, caracterização e/ou identificação de micro-organismos de amostras complexas como meios de cultura contendo sangue. Esses métodos rápidos também permitem a caracterização e/ou identificação de micro-organismos com mais rapidez do que as técnicas anteriores, levando a diagnósticos (por exemplo, em um paciente que tenha ou suspeito de ter septicemia) e à caracterização/identificação de materiais contaminados mais rápido (por exemplo, gêneros alimentícios e produtos farmacêuticos). As etapas envolvidas nos métodos da invenção, desde a obtenção de uma amostra à caracterização e/ou identificação de micro-organismos, podem ser realizadas em um espaço de tempo bem curto para produzir informações clinicamente relevantes. Em determinadas concretizações, é possível realizar os métodos da invenção em menos de cerca de 120 minutos, por exemplo, em menos de 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 5, 4, 3, 2 ou 1 minuto. A tremenda rapidez dos métodos da invenção representa um avanço em relação aos métodos
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14/73 anteriores. Os métodos podem ser usados para caracterizar e/ou identificar qualquer micro-organismo conforme descrito no presente documento. Em uma concretização, o micro-organismo é uma bactéria. Em outra, uma levedura. Em outra, um fungo. Em ainda outra, um parasita. Já em outra, um mollicute. Ademais, os métodos da invenção podem ser totalmente automatizados, diminuindo assim o risco de manusear materiais contagiosos e/ou de contaminar as amostras.
[040] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para caracterizar e/ou identificar um micro-organismo a partir de uma amostra de teste, o método sendo caracterizado por compreender:
(a) obter uma amostra de teste que contenha ou acreditese conter micro-organismos;
(b) submeter seletivamente a lise as células de não-microorgânismos da referida amostra de teste a fim de produzir uma amostra submetida a lise;
(c) separar micro-organismos de outros componentes da referida amostra de teste para formar uma amostra de micro-organismos isolada;
(d) interrogar espectroscopicamente os referidos microorganismos isolados para produzir medidas espectroscópicas deles; e (e) caracterizar e/ou identificar os referidos microorganismos da referida amostra isolada comparando-se as medidas espectroscópicas com medidas espectroscópicas tiradas, ou propriedades espectroscópicas prognosticadas, de micro-organismos conhecidos.
[041] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para caracterizar e/ou identificar micro-organismos de culturas sanguíneas, o método sendo caracterizado por compreender:
(a) obter uma amostra de uma cultura sanguínea que contenha ou acredite-se conter micro-organismos;
(b) submeter seletivamente a lise as células de não-micro
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15/73 orgânismos da referida amostra a fim de produzir uma amostra submetida a lise;
(c) dispor a referida amostra submetida a lise sobre uma camada de densidade dentro de um recipiente vedado;
(d) centrifugar o recipiente para separar micro-organismos de outros componentes da referida amostra e formar um precipitado de microorganismos;
(e) interrogar espectroscopicamente os referidos microorganismos isolados para produzir medidas espectroscópicas deles; e (f) caracterizar e/ou identificar os referidos microorganismos da referida amostra isolada comparando as medidas espectroscópicas com medidas espectroscópicas tiradas, ou propriedades espectroscópicas prognosticadas, de micro-organismos conhecidos.
[042] Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para caracterizar e/ou identificar micro-organismos, o método sendo caracterizado por compreender:
(a) obter uma amostra de teste que contenha ou acreditese conter micro-organismos;
(b) inserir a referida amostra de teste em um recipiente vedado (por exemplo um recipiente hermeticamente fechado);
(c) separar in situ os micro-organismos de outros componentes da referida amostra de teste para formar uma amostra de microorganismos isolada dentro do referido recipiente vedado;
(d) interrogar espectroscopicamente in situ os referidos micro-organismos isolados para produzir medidas espectroscópicas deles; e (e) caracterizar e/ou identificar os referidos microorganismos da referida amostra isolada comparando-se as medidas espectroscópicas com medidas espectroscópicas tiradas, ou propriedades espectroscópicas prognosticadas, de micro-organismos conhecidos.
[043] Em outra concretização da invenção, os métodos
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16/73 envolvem recuperar o precipitado de micro-organismos formado durante a etapa de separação, ou parte dele, do recipiente de separação antes da interrogação dos micro-organismos. Por exemplo, depois da formação do precipitado, os fluidos podem ser aspirados dele e o precipitado novamente suspenso em um meio adequado (por exemplo, um meio em que os microorganismos sejam viáveis). Os micro-organismos ressuspensos podem ser removidos do recipiente de separação. Os micro-organismos podem, então, ser interrogados para sua caracterização e/ou identificação, por exemplo, na suspensão ou após serem precipitados. Em outras concretizações, os microorganismos ressuspensos podem ser interrogados no recipiente de separação, por exemplo, na suspensão ou após serem precipitados. Em ainda outra concretização, os micro-organismos recuperados do precipitado podem ser usados diretamente para novas interrogações (por exemplo, espectroscopia Raman, espectroscopia de massa) sem serem ressuspensos.
Amostras [044] As amostras que podem ser testas (isto é, amostras de teste) pelos métodos da invenção incluem amostras clínicas e não-clínicas em que haja ou suspeite-se da presença e/ou cultivo de microorganismos, bem como amostras de materiais que são rotineira ou ocasionalmente testadas quanto à presença de micro-organismos. A quantidade da amostra usada pode variar bastante devido à versatilidade e/ou sensibilidade do método. A preparação das amostras pode ser realizada por qualquer número métodos conhecidos pelos versados na técnica, embora uma das vantagens da presente invenção seja que amostras de tipo complexo, como, por exemplo, o sangue, fluidos corporais e/ou substâncias opacas, podem ser testadas diretamente usando o sistema com pouco ou nenhum prétratamento prolongado. Em uma concretização, a amostra é retirada de uma cultura. Em outra concretização, a amostra é retirada de uma cultura microbiológica (por exemplo, uma cultura sanguínea). Em outra concretização, a amostra é suspeita de conter ou contém micro-organismos nela.
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17/73 [045] Amostras clínicas que podem ser testadas incluem qualquer tipo de amostra tipicamente testada em clínicas ou laboratórios de exame, incluindo, entre outras, sangue, soro sanguíneo, plasma, frações sanguíneas, líquidos sinoviais, urina, sêmen, saliva, fezes, líquido cefalorraquidiano, matérias gástricas, secreções vaginais, homogeneizados de tecido, aspirados da medula óssea, homogeneizados ósseos, escarro, aspirados, zaragatoa e rinçagem de zaragatoa, outros fluidos corporais e seus semelhantes. Em outra concretização, a amostra clínica pode ser cultivada e uma amostra de cultura usada.
[046] A presente invenção encontra aplicação em exames, bem como em aplicações veterinárias e médicas. Pacientes adequados dos quais é possível obter amostras clínicas são geralmente mamíferos, mas podem incluir qualquer animal. Conforme usado no presente documento, o termo “mamífero” inclui, entre outros, humanos, primatas, bois, carneiros, bodes, porcos, cavalos, gatos, cães, coelhos, roedores (por exemplo, ratos ou camundongos) etc. Pacientes humanos incluem pacientes neonatos, infantis, jovens, adultos e geriátricos. Pacientes dos quais é possível obter amostras incluem, entre outros, mamíferos, aves, répteis, anfíbios e peixes.
[047] Amostras não-clínicas que podem ser testadas também incluem substâncias, que abrangem, entre outras, alimentos, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos, água (por exemplo, água potável, água não-potável e água residual), lastros de água do mar, ar, terra, esgoto, plantas (por exemplo, sementes, folhas, caules, raízes, flores, frutos), produtos sanguíneos (por exemplo, plaquetas, soro sanguíneo, frações de glóbulos brancos etc.), amostras de tecido ou órgãos doados, amostras de guerra biológica, entre outros. O método também é particularmente bastante adequado a testes em tempo real para monitorar níveis de contaminação, controle processual, controle de qualidade e seus semelhantes em padrões industriais. Em outra concretização, é possível cultivar uma amostra não-clínica
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18/73 e usar uma amostra de cultura.
[048] Em uma concretização da invenção, as amostras são obtidas de um paciente que tenha ou que seja suspeito de ter uma infecção microbiana. Em outra, ele tem ou é suspeito de ter septicemia, por exemplo, bacteremia ou fungemia. A amostra pode ser uma amostra sanguínea tirada diretamente do paciente. Ela pode ser uma cultura sanguínea desenvolvida a partir de uma amostra do sangue do paciente, por exemplo, uma cultura sanguínea BacT/ALERT®. A amostra pode ser de uma cultura sanguínea positiva, por exemplo, uma cultura sanguínea que indique a presença de micro-organismos. Em determinadas concretizações, a amostra é retirada de uma cultura sanguínea positiva pouco tempo após se tornar positiva, por exemplo, em cerca de 6 horas, por exemplo, em cerca de 5, 4, 3 ou 2 horas, ou em de cerca de 60 minutos, por exemplo, em cerca de 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 ou 1 minuto. Em uma concretização, a amostra é colhida de uma cultura em que os micro-organismos encontram-se na fase de crescimento exponencial. Em outra concretização, a amostra é colhida de uma cultura em que os micro-organismos encontram-se na fase estacionária.
[049] A presente invenção confere alta sensibilidade à detecção, caracterização e/ou identificação de micro-organismos, o que permite a detecção, caracterização e/ou identificação sem ter que, primeiramente, cumprir as etapas de isolar micro-organismos cultivando-os em um meio sólido ou semissólido e coletar amostras das colônias que se desenvolveram. Sendo assim, em uma concretização da presente invenção, a amostra não advém de uma colônia microbiana (por exemplo, de bactérias, leveduras ou fungos) cultivada em uma superfície sólida ou semissólida.
[050] O volume da amostra deve ser grande o bastante para produzir uma amostra de micro-organismos isolada ou um precipitado de micro-organismos que possa ser interrogado após a etapa de separação/isolamento dos métodos da invenção ser realizada. O volume
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19/73 adequado dependerá da fonte da amostra e da quantidade prevista de microorganismos nela. Por exemplo, uma cultura sanguínea positiva conterá mais micro-organismos por volume do que uma amostra de água potável que testada quanto à contaminação de modo que um menor volume do meio de cultura sanguínea seja necessário em comparação à amostra de água potável. Em geral, o tamanho das amostras pode ser inferior a 50 ml, por exemplo, inferior a cerca de 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3 ou 2 ml. Em determinadas concretizações, o tamanho da amostra pode ser de cerca de 1 ml, por exemplo, de cerca de 0,75, 0,5 ou 0,25 ml. Em determinadas concretizações, em que a separação é realizada em microescala, a amostra pode ser inferior a cerca de 200, por exemplo, inferior a cerca de 150, 100, 50, 25, 20, 15, 10 ou 5 pl. Em algumas concretizações (por exemplo, quando espera-se que a amostra contenha poucos micro-organismos), o tamanho da amostra pode ser de cerca de 100 ml ou mais, por exemplo, de cerca de 250, 500, 750, 1.000 ml ou mais.
Etapa de Lise Opcional [051] Em algumas concretizações, após obter uma amostra, a próxima etapa no método da presente invenção é a de submeter seletivamente a lise células indesejadas que possam se fazer presentes na amostra, por exemplos células sanguíneas e/ou de tecido. As células podem ser submetidas a lise para possibilitar a separação dos micro-organismos de outros componentes da amostra. A separação dos micro-organismos de outros componentes evita interferências durante a etapa de interrogação. Caso não se espere a presença de células sem ser de micro-organismos na amostra ou não se espere que elas interfiram na etapa de interrogação, não é necessário realizar a etapa de lise. Em uma concretização, as células submetidas a lise são células sem ser de micro-organismos que se fazem presentes na amostra, e nenhuma célula de micro-organismo presente na amostra é submetida a lise. No entanto, em algumas concretizações, a lise seletiva de classes específicas de micro-organismos pode ser desejada e, portanto, realizada de acordo com os métodos descritos neste documento e conforme de conhecimento geral na
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20/73 técnica. Por exemplo, uma classe de micro-organismos indesejados pode ser seletivamente submetida a lise, por exemplo, as leveduras podem ser submetidas a lise ao passo que as bactérias não ou vice-versa. Em outra concretização, os micro-organismos desejados são submetidos a lise a fim de separar um componente subcelular específico dos micro-organismos, por exemplo, membranas celulares ou organelas. Em uma concretização, todas as células não-microbianas são submetidas a lise. Em outras concretizações, parte das células não-microbianas são submetidas a lise, por exemplo, células o bastante para evitar interferências na etapa de interrogação. É possível realizar a lise das células por qualquer método conhecido na técnica que seja eficaz para submeter seletivamente a lise as células com ou sem microorganismos de lise, incluindo, entre outros, a adição de uma solução de lise, sonicação, choque osmótico, tratamento químico e/ou uma combinação desses.
[052] Uma solução de lise é aquela capaz de submeter células a lise, por exemplo, células que não sejam de micro-organismos (por exemplo, solubilizando membranas celulares eucarióticas) e/ou células de micro-organismos. Em uma concretização, a solução de lise pode compreender um ou mais detergentes, uma ou mais enzimas ou uma combinação de um ou mais detergentes e uma ou mais enzimas, além de poder incluir ainda outros agentes. Em uma concretização, o detergente pode ser um detergente lítico não-desnaturalizante, tal como Triton® X-100 Triton® X-100-R, Triton® X-114, NP-40, Genapol® C-100, Genapol® X-100, Igepal® CA 630, Arlasolve™ 200, Brij® 96/97, CHAPS, octil β-D-glicopiranosídeo, saponina e nonaetileno glicol monododecila éter (C12E9, polidocenol). Como opção, é possível incluir detergentes líticos desnaturalizantes como dodecil sulfato de sódio, Nlaurilsarcosina, desoxicolato de sódio, sais biliares, brometo de hexadeciltrimetilamônio, SB3-10, SB3-12, amidossulfobetaína-14, e C7BzO. Como opção, também é possível incluir solubilizantes como Brij® 98, Brij® 58, Brij® 35, Tween® 80, Tween® 20, Pluronic® L64, Pluronic® P84, sulfobetaínas
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21/73 não-detergentes (NDSB 201), anfipóis (PMAL-C8) e metil-p-ciclodextrina. Normalmente, os detergentes não-desnaturalizantes e os solubilizantes são usados em concentrações acima de sua concentração micelar crítica (CMC), ao passo os detergentes desnaturalizantes podem ser acrescentados a concentrações abaixo de sua CMC. Por exemplo, é possível usar detergentes líticos não-desnaturalizantes a uma concentração de cerca de 0,010% a cerca de 10%, por exemplo, de cerca de 0,015% a cerca de 1,0%, por exemplo, de cerca de 0,05% a cerca de 0,5%, por exemplo, de cerca de 0,10% a cerca de 0,30% (concentração final após a diluição com a amostra). Em outra concretização, detergentes de polioxietileno podem ser preferidos. Os detergentes de polioxietileno podem compreender a estrutura Ci2-i8/E9-10, em que C12-18 indica uma cadeia de carbono com 12 a 18 átomos de carbono, e E910 indica de 9 a 10 grupos cabeça hidrófilos de oxietileno. Por exemplo, o detergente de polioxietileno pode ser escolhido dentre o grupo composto por Brij® 97, Brij® 96V, Genapol® C-100, Genapol® X-100, nonaetileno glicol monododecila éter (polidocanol) ou uma combinação desses.
[053] Enzimas que podem ser usadas em soluções de lise incluem, entre outras, enzimas que digerem ácidos nucléicos e outros materiais que incrustam a membrana (por exemplo, protease XXIII, DNase, neuraminidase, polissacaridase, Glucanex® e Pectinex®). Outros aditivos que podem ser usados incluem, entre outros, agentes redutores, como 2mercaptoetanol (2-Me) ou ditiotreitol (DTT), e agentes estabilizantes, como magnésio, piruvato e umectantes. A solução de lise pode ser tamponada a qualquer pH adequado à lise das células desejadas e dependerá de vários fatores, incluindo, entre outros, o tipo da amostra, as células que serão submetidas a lise e o detergente usado. Em algumas concretizações, o pH pode ser na faixa de cerca de 2 a cerca de 13, por exemplo, de cerca de 6 a cerca de 13, por exemplo, de cerca de 8 a cerca de 13, por exemplo, de cerca de 10 a cerca de 13. Tampões de pH adequados incluem qualquer um capaz de manter o pH na faixa desejada, por exemplo, cerca de 0,05 M a cerca de 1,0
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M de CAPS.
[054] Em uma concretização, misturamos a amostra e a solução de lise e, então, incubamos a mistura por tempo o suficiente para que ocorra a lise e a solubilização das membranas celulares, por exemplo, em torno de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ou 60 segundos ou em torno de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 minutos ou mais, por exemplo, em torno de 1 segundo a cerca de 20 minutos, em torno de 1 segundo a cerca de 5 minutos ou em torno de 1 segundo a cerca de 2 minutos. O tempo de incubação dependerá da resistência da solução de lise, por exemplo, da concentração do detergente e/ou das enzimas. Em geral, tampões de lise mais brandos exigirão mais tempo e uma maior diluição da amostra para solubilizar por completo as células não-microbianas. A resistência da solução de lise pode ser selecionada com base nos micro-organismos presentes ou de cuja presença na amostra se suspeita. Para micro-organismos mais suscetíveis a lise, é possível usar uma solução de lise branda. A lise pode ocorrer a uma temperatura de cerca de 2° C a cerca de 45° C, por exemplo, de cerca de 15° C a cerca de 40° C, por exemplo, de cerca de 30° C a cerca de 40° C. Em uma concretização, é possível introduzir a solução de lise em uma seringa e, em seguida, aspirar a amostra para dentro da seringa de modo que a mistura e a incubação ocorram dentro dela.
[055] Em algumas concretizações, as condições de lise (por exemplo, a solução ou o tempo de incubação), bem como as etapas de separação e/ou interrogação, podem ser suficientes para exterminar alguns ou todos os micro-organismos da amostra. Os métodos da presente invenção são amplamente versáteis e não exigem que todos os micro-organismos estejam vivos para que ocorra o isolamento e a identificação. Em certas concretizações, alguns ou todos os micro-organismos podem estar mortos, podendo a morte ocorrer antes, durante e/ou depois das etapas dos métodos sendo realizados.
Etapa de Separação [056] A próxima etapa no método da presente invenção
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23/73 (por exemplo, a etapa após a lise da amostra, se esta for realizada) é a etapa de separação. A etapa de separação pode ser realizada para separar os microorganismos de outros componentes da amostra (por exemplo, não-microorganismos ou componentes deles) e para concentrar os micro-organismos em um precipitado que possa ser interrogado para fins de identificação e caracterização. A separação não precisa ser completa, isto é, não é necessária uma separação 100%. Só é necessário que a separação dos micro-organismos de outros componentes da amostra seja o suficiente para permitir sua interrogação sem interferência substancial de outros componentes. Por exemplo, a separação pode resultar em um precipitado de micro-organismos cerca de ao menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% puro ou mais.
[057] Em uma concretização, a separação é realizada por uma etapa de centrifugação em que a amostra (por exemplo, uma amostra submetida a lise) é disposta sobre uma camada de densidade dentro de um recipiente de separação e o recipiente centrifugado em condições que permitam isolar os micro-organismos (por exemplo, fazendo com que os organismos se aglomerem em um precipitado no fundo e/ou nas laterais do recipiente). De acordo com essa concretização, outros componentes da amostra (por exemplo, não-micro-organismos ou componentes deles que possam se fazer presentes no meio de amostra) permanecem sobre a camada de densidade ou na parte superior da camada de densidade. Em geral, é possível usar qualquer recipiente conhecido na etapa de separação. Em uma concretização, o recipiente de separação é o dispositivo de separação revelado no pedido de patente dos Estados Unidos de no de série _, intitulado “Dispositivo de separação para uso na separação, caracterização e/ou identificação de micro-organismos” e depositado no dia 30 de outubro de 2009. Essa etapa de separação isola os micro-organismos de outros materiais da amostra, tal como o meio, resíduos celulares e/ou outros componentes que possam interferir na interrogação dos micro-organismos (por exemplo, por
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24/73 fluorescência intrínseca). Em uma concretização, a camada de densidade também serve para separar micro-organismos vivos de micro-organismos mortos (que não atravessam a camada de densidade). Em outra concretização, a camada de densidade não compreende um gradiente de densidade, seja antes ou depois da centrifugação. Em outras palavras, o recipiente de separação não é centrifugado por tempo ou aceleração o suficiente para que o material que constitui a camada de densidade forme um gradiente de densidade.
[058] A densidade da camada é escolhida de modo que os micro-organismos da amostra a atravessem, ao passo que outros componentes (por exemplo, o caldo de cultura sanguínea, resíduos celulares etc.) permaneçam sobre ela ou não a atravessem por completo. A camada de densidade também pode ser escolhida para separar micro-organismos vivos (que a atravessam) de micro-organismos mortos (que não a atravessam). A densidade adequada dependerá do material usado na camada de densidade e da amostra que será separada. Em uma concretização, a densidade da camada encontra-se na faixa de cerca de 1,025 g/ml a cerca de 1,120 g/ml, por exemplo, de cerca de 1.030 g/ml a cerca de 1.070 g/ml, de cerca de 1.040 g/ml a cerca de 1.060 g/ml ou qualquer faixa entre cerca de 1.025 g/ml a cerca de 1.120 g/ml. Em outra concretização, a densidade da camada é de cerca de 1,025 g/ml, 1,030 g/ml, 1,035 g/ml, 1,040 g/ml, 1,045 g/ml, 1,050 g/ml, 1,055 g/ml, 1,060 g/ml, 1,065 g/ml, 1,070 g/ml, 1,075 g/ml, 1,080 g/ml, 1,085 g/ml, 1,090 g/ml, 1,095 g/ml, 1,100 g/ml, 1,105 g/ml, 1,110 g/ml, 1,115 ou 1,120 g/ml.
[059] O material da camada de densidade pode ser qualquer um que tenha a faixa de densidade adequada aos métodos desta invenção. Em uma concretização, o material é a sílica coloidal. A sílica coloidal pode ser não-revestida (por exemplo, Ludox®, W. R. Grace, CT) ou revestida, por exemplo, com silano (por exemplo, PureSperm®, Nidacon Int'l, Suécia, ou Isolate®, Irvine Scientific, Santa Ana, CA) ou polivinilpirrolidona (por exemplo, Percoll™, PercoU™ Plus, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Em uma
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25/73 concretização, opta-se pela sílica coloidal que apresenta a menor interferência na interrogação espectroscópica, por exemplo, o material com a menor fluorescência intrínseca. A sílica coloidal pode ser diluída em qualquer meio adequado para adotar a densidade adequada, por exemplo, soluções de sal equilibradas, soro fisiológico e/ou 0,25 M de sacarose. A densidade adequada pode ser obtida com a sílica coloidal a uma concentração de cerca de 15% a cerca de 80% v/v, por exemplo, de cerca de 20% a cerca de 65% v/v. Outro material adequado às camadas de densidade é um agente de contraste iodado, por exemplo, ioexol (Omnipaque™, NycoPrep™ ou Nycodenz®) e iodixanol (Visipaque™ ou OptiPrep™). A densidade adequada pode ser obtida com ioexol ou iodixanol a uma concentração de cerca de 0% a cerca de 25% p/v, por exemplo, de cerca de 14% a cerca de 18% p/v, no caso de amostras de cultura sanguínea. A sacarose pode ser usada como camada de densidade a uma concentração de cerca de 10% a cerca de 30% p/v, por exemplo, de cerca de 15% a cerca de 20% p/v, no caso de amostras de cultura sanguínea. Outros materiais adequados que podem ser usados para preparar a camada de densidade incluem óleos de baixa viscosidade e alta densidade bem conhecidos na técnica como o óleo de imersão para microscopia (por exemplo, Tipo DF; Cargille Labs, Nova Iorque), o óleo mineral (por exemplo, Drakeol® 5, Draketex 50, Peneteck®; Penreco Co., Pensilvânia), o óleo de silicone (polidimetilsiloxano), o óleo de fluorossilicone, gel de silicone, metrizoato-Ficoll® (LymphoPrep™), por exemplo, a uma concentração de cerca de 75% a cerca de 100% no caso de amostras de cultura sanguínea, diatrizoato-dextrano (PolymorphoPrep™), por exemplo, a uma concentração de cerca de 25% a cerca de 50% no caso de amostras de cultura sanguínea, carboximetil celulose, hidroxipropilmetil celulose, óxido de polietileno (peso molecular elevado), Pluronic® F127, Pluronic® F68, misturas de compostos de Pluronic®, ácido poliacrílico, álcool polivinílico reticulado, polivinil pirrolidina reticulada, metil éter metacrilato de PEG, pectina, agarose, xantana, gelana, Phytagel®, sorbitol, Ficoll® (por exemplo, Ficoll® 400 a uma concentração de cerca de 10% a cerca
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26/73 de 15% no caso de amostras de cultura sanguínea), glicerol, dextrano (por exemplo, a uma concentração de cerca de 10% a cerca de 15% no caso de amostras de cultura sanguínea), glicogênio, cloreto de césio (por exemplo, a uma concentração de cerca de 15% a cerca de 25% no caso de amostras de cultura sanguínea), fluidos de perfluorocarbono (por exemplo, perfluoro-noctano), fluidos de hidrofluorocarbono (por exemplo, Vertrel XF) e seus semelhantes. Em uma concretização, a camada de densidade é escolhida dentre um ou mais do grupo composto por sílica coloidal, iodixanol, ioexol, cloreto de césio, metrizoato-Ficoll®, diatrizoato-dextrado, sacarose, Ficoll® 400 e/ou dextrano em qualquer combinação. A camada de densidade também pode ser feita de uma combinação de materiais, por exemplo, uma combinação de sílica coloidal e óleo. Certas concretizações dos compostos acima podem ser vantajosas às etapas de separação e leitura da presente invenção. Por exemplo, combinações de compostos com propriedades de supressão de raios ultravioleta, tal como o cloreto de césio e o ioexol.
[060] O volume/altura da camada de densidade deve ser o bastante para consumar a separação dos micro-organismos de outros componentes da amostra. O volume dependerá do tamanho e do formato do recipiente de separação. Em termos gerais, é possível adotar um volume de cerca de 0,1 a cerca de 5 ml, por exemplo de cerca de 0,2 ml a cerca de 1 ml, de cerca de 0,2 ml a cerca de 0,5 ml. Se a separação for realizada em microescala, o volume da camada de densidade pode ser de cerca de 1 pl a cerca de 100 pl, por exemplo, de cerca de 5 pl a cerca de 50 pl. O volume da amostra disposta ou disposta em camada sobre a camada de densidade deve ser suficiente para que micro-organismos o bastante produzam um precipitado suscetível à interrogação. Em geral, é possível adotar qualquer volume que se caiba no recipiente. Por exemplo, é possível adotar um volume de cerca de 0,1 a cerca de 5 ml, por exemplo de cerca de 0,2 ml a cerca de 1 ml, de cerca de 0,2 ml a cerca de 0,5 ml. Se a separação for realizada em microescala, o volume da amostra pode ser de cerca de 1 pl a cerca de 100 pl, por exemplo,
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27/73 de cerca de 5 μΙ a cerca de 50 μΙ. O espaço disponível no recipiente para a amostra dependerá do tamanho e do formato do recipiente. Em algumas concretizações, uma camada intermediária (líquida ou sólida) pode ser disposta sobre a camada de densidade antes de a amostra ser disposta ou disposta em camada sobre ela a fim de evitar qualquer mistura da camada de densidade com a amostra. Em uma concretização, a camada intermediária pode ser de esferas de polietileno. Em outra concretização, uma pequena bolha de ar pode ser disposta entre a camada de densidade e a amostra para evitar que elas se misturem. Em outra concretização, a camada de densidade pode ser disposta em camada sobre um material de alta densidade (por exemplo, um fluido de perfluorocarbono) de modo que os micro-organismos atravessem a camada de densidade durante a separação e aglomerem-se na interface entre a camada de densidade e o material de alta densidade.
[061] Em uma concretização da invenção, o recipiente de separação é centrifugado em um rotor horizontal para que os microorganismos formem um precipitado diretamente no fundo do recipiente. O recipiente é centrifugado a uma aceleração e por tempo suficiente para que os micro-organismos se separem de outros componentes da amostra (por exemplo, formando um precipitado). A aceleração de centrifugação pode ser de cerca de 1.000 por grama a cerca de 20.000 por grama, por exemplo, de cerca de 2.500 por grama a cerca de 15.000 por grama, por exemplo, de cerca de 7.500 por grama a cerca de 12.500 por grama etc. O tempo de centrifugação pode ser de cerca de 30 segundos a cerca de 30 minutos, por exemplo, de cerca de 1 minuto a cerca de 15 minutos, por exemplo de cerca de 1 minuto a cerca de 5 minutos. A centrifugação pode ocorrer a uma temperatura de cerca de 2° C a cerca de 45° C, por exemplo, de cerca de 15° C a cerca de 40° C, por exemplo, de cerca de 20° C a cerca de 30° C. Em uma concretização, o recipiente de separação compreende uma vedação que é aplicada ao recipiente na forma de uma vedação hermética antes da centrifugação. A presença de uma vedação diminui o risco inerente do manuseio de micro
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28/73 organismos que sejam ou possam ser contagiosos e/ou perigosos, bem como o risco de contaminar a amostra. Uma das vantagens dos métodos da presente invenção é a possibilidade de realizar uma ou mais das etapas dos métodos (por exemplo, lise, separação, interrogação e/ou identificação) com os microorganismos em um recipiente vedado (por exemplo, um recipiente hermeticamente fechado). Os presentes métodos, que envolvem o uso de sistemas automatizados, evitam os riscos à saúde e à segurança inerentes do manuseio de micro-organismos altamente virulentos, como ocorre na recuperação direta de micro-organismos de amostras para testes. Em uma concretização, o recipiente não é centrifugado por tempo e/ou força o suficiente para que se forme um gradiente de densidade na camada de densidade. A presente invenção não envolve a ultracentrifugação das amostras, por exemplo, a centrifugação a forças maiores do que cerca de 100.000 por grama. Ademais, a presente invenção não envolve a sedimentação ou bandagem isopícnica (de equilíbrio).
[062] O recipiente de separação pode ser qualquer recipiente com volume o suficiente para reter uma camada de densidade e uma amostra. Conforme mencionado neste documento, o dispositivo de separação revelado no pedido de patente dos Estados Unidos de no de série _, intitulado “Dispositivo de separação para uso na separação, caracterização e/ou identificação de micro-organismos”, depositado no dia 30 de outubro de 2009, pode ser usado na prática desta invenção. Em uma concretização, o recipiente cabe dentro de um rotor de centrífuga. O volume do recipiente pode ser de cerca de 0,1 ml a cerca de 25 ml, por exemplo, de cerca de 1 ml a cerca de 10 ml, por exemplo, de cerca de 2 ml a cerca de 8 ml. Se a separação for realizada em microescala, o volume do recipiente pode ser de cerca de 2 pl a cerca de 100 pl, por exemplo, de cerca de 5 pl a cerca de 50 pl. Em uma concretização, o recipiente tem um diâmetro interno largo na parte superior a fim de armazenar a amostra e a maior parte da camada de densidade, e um diâmetro interno estreito na parte inferior, onde se acumula o precipitado de
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29/73 micro-organismos. A parte estreita pode ter um diâmetro interno de cerca de 0,102 cm a cerca de 0,305 cm, por exemplo, de cerca de 0,152 cm a cerca de 0,254 cm, por exemplo, de cerca de 0,203 cm. A parte larga pode ter um diâmetro interno de cerca de 0,813 cm a cerca de 1,016 cm, por exemplo, de cerca de 0,864 cm a cerca de 9,65 mm, por exemplo, de cerca de 0,914 cm. Quanto a separações em microescala, os diâmetros internos podem ser ainda menores. Por exemplo, o diâmetro interno da parte estreita pode ser de cerca de 0,003 cm a cerca de 0,102 cm, por exemplo, de cerca de 0,005 cm a cerca de 0,025 cm. Uma parte de diâmetro interno afunilado pode conectar as partes superior e inferior. A parte afunilada pode ter um ângulo de cerca de 20° a cerca de 70°, por exemplo, de cerca de 30° a cerca de 60°. Em uma concretização, a parte estreita inferior corresponde a menos da metade da altura total do recipiente, por exemplo, menos de cerca de 40%, 30%, 20% ou 10% da altura total do recipiente. O recipiente pode ter um dispositivo de fechamento conectado a ele ou pode ser roscado para aceitar um dispositivo de fechamento (por exemplo, uma tampa) de modo que seja possível mantê-lo fechado hermeticamente durante a centrifugação. Em certas concretizações, o recipiente é projetado de modo que o precipitado ou amostra de microorganismos possa ser prontamente recuperado ou, de alguma outra forma, obtido ou removido do recipiente após a separação, seja de maneira manual ou automatizada (de modo que os técnicos não sejam expostos ao conteúdo do recipiente). Por exemplo, o recipiente pode compreender uma parte removível ou uma parte retirável que contenha o precipitado e que possa se separar do resto do recipiente. Em outra concretização, o recipiente compreende meios para acessar o precipitado após a separação, tal como uma ou mais portas ou superfícies permeáveis para a introdução de uma seringa ou outro dispositivo de coleta de amostras ou para remover o precipitado. Em uma concretização, o recipiente pode ser um tubo, por exemplo, um tubo de centrífuga. Em outra concretização, o recipiente pode ser um chip ou um cartão. Em uma concretização, o recipiente é um recipiente independente, isto é, um dispositivo
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30/73 para separar uma única amostra. Em outras concretizações, o recipiente faz parte de um dispositivo que compreende dois ou mais recipientes de separação de modo que várias amostras possam ser separadas ao mesmo tempo. Em uma concretização, o dispositivo compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 36, 42, 48, 60, 72, 84, 96 ou mais recipientes de separação.
[063] O recipiente pode compreender uma janela óptica pela qual ocorre a interrogação. A janela óptica pode ser embaixo, em cima e/ou nas laterais do recipiente. A janela pode ser feita de qualquer material permeável à luz, por exemplo, permeável a ao menos parte do espectro de luz infravermelha próxima (NIR; 700 nm a 1.400 nm), ultravioleta (UV; 190 nm a 400 nm) e/ou visível (VIS; 400 nm a 700 nm). Exemplos de materiais adequados incluem, entre outros, acrílico, metacrilato, quartzo, sílica fundida, safira e/ou um copolímero de olefina cíclica (COC). Em uma concretização, todo o recipiente é feito do material da janela óptica. Em outra concretização, o recipiente pode ser preparado (por exemplo, moldado) a partir de duas ou mais partes distintas, tal como um componente óptico permeável à luz ultravioleta, visível ou infravermelha próxima para que a janela óptica e outro material (por exemplo, um plástico de moldagem padrão econômico) formem o resto do recipiente. Em uma concretização, a janela óptica é fina o bastante para permitir a interrogação espectroscópica, que dependerá do material da janela. Em outra concretização, a janela óptica é o mais fina possível para diminuir interferências na interrogação espectroscópica. Por exemplo, a janela pode ter uma espessura inferior a cerca de 0,508 cm, por exemplo, inferior a cerca de 0,381 cm, 0,254 cm ou 0,127 cm.
[064] Em outra concretização, a separação ocorre por uma etapa de filtragem em que a amostra (por exemplo, uma amostra submetida a lise) é disposta em um dispositivo munido de um filtro ou conjunto de filtros seletivos com poros de um tamanho capaz de reter os microorganismos. Os micro-organismos retidos podem ser lavados passando-se com suavidade um tampão adequado através do filtro. Os micro-organismos
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31/73 lavados podem, então, ser interrogados diretamente no filtro e/ou recuperados para a interrogação tirando amostras diretamente da superfície do filtro ou revertendo o fluxo do filtro com um tampão aquoso adequado.
Etapa de Interrogação [065] Depois de separar, isolar e/ou precipitar os microorganismos, a amostra separada, a amostra isolada ou o precipitado pode ser interrogado para identificar e/ou caracterizar os micro-organismos na amostra ou precipitado. Em uma concretização, a interrogação ocorre de maneira nãoinvasiva, ou seja, o precipitado é interrogado ainda dentro do recipiente de separação. Em outra concretização, o recipiente de separação permanece vedado durante toda a interrogação. A possibilidade de identificar os microorganismos de maneira não-invasiva, opcionalmente aliada à manutenção do recipiente vedado durante todo o processo de separação e identificação/caracterização e à automação de parte do procedimento, ou de todo ele, evita o manuseio constante de amostras contaminadas e/ou contagiosas e aumenta bastante a segurança do processo como um todo. Além disso, a possibilidade de caracterizar e/ou identificar os micro-organismos por interrogação direta, sem um novo processamento da amostra ou precipitado (por exemplo, ressuspensão, revestimento e cultivo de colônias), aumenta bastante a velocidade da identificação/caracterização. Em uma concretização, a amostra ou precipitado é recuperado e/ou ressuspenso e, como opção, removido do recipiente de separação antes da interrogação. Em outra concretização, a amostra ou precipitado é recuperado e/ou ressuspenso após interrogação in situ e uma nova interrogação é realizada. Por exemplo, técnicas, como testes de aglutinação de látex ou testes de identificação fenotípica automatizados, que podem ser aplicadas a micro-organismos isolados, mas não a um precipitado de micro-organismos, podem ser realizadas nos micro-organismos recuperados e/ou ressuspensos.
[066] Em algumas concretizações, o precipitado ou amostra isolada pode ser interrogado espectroscopicamente. Em uma
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32/73 concretização, é possível usar métodos espectroscópicos ópticos para analisar uma ou mais propriedades intrínsecas dos micro-organismos, por exemplo, uma propriedade do micro-organismo na ausência de agentes adicionais, tal como linhagens, corantes, agentes de ligação etc. Em outras concretizações, os métodos espectroscópicos ópticos podem ser usados para analisar uma ou mais propriedades extrínsecas dos micro-organismos, por exemplo, uma propriedade que só pode ser detectada com o auxílio de agentes adicionais. A interrogação pode ser realizada, por exemplo, por espectroscopia de fluorescência, espectroscopia de refletância difusa, espectroscopia de infravermelho, espectroscopia por terahertz, espectroscopia de transmissão e absorção, espectroscopia Raman, incluindo Espectroscopia Raman Intensificada por Superfície (SERS), Espectroscopia Raman com Compensação Espacial (SORS), espectroscopia Raman de transmissão e/ou espectroscopia Raman de ressonância. Para aprimorar os sinais Raman (SERS) e de fluorescência, os micro-organismos podem ser revestidos com nanopartículas de ouro e/ou prata antes da centrifugação, e a/ou a superfície óptica interna pode ser pré-revestida com coloides metálicos de tamanho e formato de partículas específicos (referência: Lakowicz, Anal. Biochem., 337: 171 (2005) para fluorescência; Efrima e col., J. Phys. Chem. B. (Letter) 102: 5.947 (1998) para SERS). Em outra concretização, as nanopartículas se fazem presentes na camada de densidade antes da centrifugação e associam-se aos micro-organismos à medida que eles atravessam a camada de densidade. Em outras concretizações, os micro-organismos no precipitado podem ser interrogados usando técnicas de espectrometria de massa, tal como espectrometria de massa MALDI-TOF, espectrometria de massa com dessorção e ionização por eletropulverização (DESI), espectrometria de massa GC, espectrometria de massa LC, espectrometria massa com ionização por eletropulverização (ESI) e espectrometria com tubo de fluxo com seleção de íons (SIFT). Em uma concretização, a amostra ou precipitado isolado é interrogado ainda dentro do recipiente de separação. O recipiente pode ser
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33/73 interrogado por uma janela óptica disposta nele. A janela óptica pode ser embaixo, em cima e/ou na lateral ou nas laterais do recipiente. Em uma concretização, o recipiente de separação cabe dentro de um suporte em um espectrômetro em uma posição adequada à interrogação. A interrogação espectroscópica pode ser realizada por qualquer técnica conhecida pelos versados na técnica que seja eficaz à detecção e/ou identificação de uma ou mais propriedades intrínsecas ou extrínsecas dos micro-organismos. Por exemplo, a fluorescência na face frontal (na qual a luz de estímulo emitida penetra e sai pela mesma superfície óptica e, se a amostra for em geral opticamente fina, a luz de estímulo penetra por uma pequena distância na amostra (vide por exemplo, Eisinger, J. e J. Flores, “Front-face fluorometry of liquid samples” Anal. Biochem., 94:15, 1983)) pode ser usada para a identificação de micro-organismos em precipitados. Outras formas de medição, tal como medições por epifluorescência, refletância, absorvência e/ou dispersão, também podem ser usadas na presente invenção. Em outra concretização, conforme descrito neste documento, o precipitado ou amostra isolada pode ser removido para interrogação (por exemplo, o precipitado ou amostra isolada pode ser removido e preparado para interrogação por espectrometria de massa, como é bem conhecido na técnica). Em ainda outras concretizações, o precipitado ou amostra pode ser interrogado usando-se mais de um meio. Por exemplo, o precipitado ou amostra isolada pode ser interrogado por espectroscopia de fluorescência e espectroscopia Raman. De acordo com essa concretização, essas etapas de interrogação podem ser realizadas em sequência ou ao mesmo tempo.
[067] A fonte de iluminação ou fonte de estímulo da amostra pode ser escolhida dentre várias fontes luminosas adequadas conhecidas pelos versados na técnica. Qualquer parte do espectro eletromagnético que produza dados aproveitáveis pode ser usada. Fontes luminosas capazes de emissão nos espectros ultravioleta, visível e/ou infravermelho próximo, bem como outras partes do espectro eletromagnético,
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34/73 podem ser usadas e são conhecidas pelos versados na técnica. Por exemplos, as fontes luminosas podem ser lâmpadas contínuas, tal como uma lâmpada de arco de xenônio ou deutério, para a geração de iluminação ultravioleta, e/ou uma lâmpada de halogênio de tungstênio, para a geração de estímulo visível/infravermelho próximo. Essas fontes luminosas proporcionam uma faixa de emissão ampla, e a largura de banda espectral para comprimentos de onda de estímulos específicos pode ser reduzida usando-se filtros de interferência óptica, prismas e/ou grades ópticas, conforme bem conhecido na técnica.
[068] Como alternativa, várias fontes luminosas de banda estreita, tal como diodos emissores de luz e/ou lasers, podem ser espacial e/ou temporariamente multiplexadas para proporcionar uma fonte de estímulo de vários comprimentos de onda. Por exemplos, os diodos emissores de luz são disponibilizados de 240 nm a, no máximo, 900 nm, e as fontes têm uma largura de banda espectral de 20 a 40 nm (largura total na metade máxima). Os lasers são disponibilizados em comprimentos de onda discretos do ultravioleta ao infravermelho próximo e podem ser empregados usando-se métodos de multiplexação bem conhecidos pelos versados na técnica.
[069] A seletividade espectral de qualquer uma das fontes luminosas pode ser aprimorada usando-se meios de discriminação espectral como um monocromador de varredura. É possível usar outros métodos de discriminação conhecidos pelos versados na técnica, como um filtro opticoacústico sintonizável, um filtro sintonizável de cristal líquido, um conjunto de filtros de interferência óptica, espectrógrafo prismático etc. em qualquer combinação. Uma consideração na hora de escolher o discriminador espectral leva em conta a faixa de sintonização, bem como o nível de seletividade. A título ilustrativo, por exemplo, um discriminador pode utilizar a faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm com uma seletividade de 10 nm. Esses parâmetros geralmente determinam a tecnologia ideal necessária para atingir a faixa de sintonização, bem como a seletividade.
[070] Normalmente, a fonte luminosa resulta no
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35/73 estímulo da amostra, seguido pela medição da emissão da fluorescência da amostra em momentos predeterminados ou continuamente. De maneira semelhante, a luz refletida pela interação da fonte de estímulo com a amostra pode ser medida para prover dados pertinentes à detecção e/ou caracterização.
[071] A emissão da amostra pode ser medida por qualquer meio de discriminação espectral adequado, mais preferencialmente usando-se um espectrômetro. O espectrômetro pode ser um monocromador de varredura que detecta comprimentos de onda de emissão específicos, em que a saída do monocromador é detectada por um tubo fotomultiplicador, e/ou o espectrômetro pode ser configurado como um espectrógrafo de geração de imagens, em que a saída é detectada por um conjunto detector de geração de imagens tal como um conjunto detector de dispositivos de carga emparelhada (CCD). Em uma concretização, um discriminador permite a observação dos sinais de fluorescência e/ou difusão por um meio de fotodetecção (tal como um tubo fotomultiplicador, fotodiodo de avalanche, conjunto detector CCD e/ou conjunto detector de dispositivos de carga emparelhada com multiplicação de elétrons (EMCCD)).
[072] A técnica espectroscópica é usada para produzir medidas que são, de preferência, proporcionadas como medidas de Matriz de Estímulo-Emissão (EEM). Conforme usado no presente documento, EEM significa a intensidade de emissão espectral luminescente de substâncias fluorescentes em função dos comprimentos de onda de estímulo e emissão e inclui um espectro completo, ou subconjunto dele, em que um subconjunto pode conter um único ou vários pares de estímulo/emissão. Além disso, uma seção transversal da EEM com um comprimento de onda de estímulo fixo pode ser usada para exibir os espectros de emissão de um dado comprimento de estímulo, e uma seção transversal da EEM com um comprimento de onda de emissão fixa pode ser usada para exibir os espectros de estímulo de uma amostra. Em uma concretização, várias EEMs são medidas em mais de um par
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36/73 de comprimento de onda de estímulo-emissão específico, por exemplo, ao menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais pares de comprimento de onda de estímulo-emissão específico.
[073] De acordo com uma concretização da invenção, descobrimos que a espectroscopia de fluorescência na face frontal é vantajosa na medição de propriedades de fluorescência e/ou refletância de amostras altamente dispersas e altamente inibidoras. Em uma concretização, o método na face frontal pode ser particularmente útil. Por exemplo, a fluorescência na face frontal pode ser particularmente útil em amostras altamente absorventes, pois o feixe de estímulo e emissão não precisa atravessar a maior parte da amostra e, portanto, é menos afetado por componentes de interferência que podem se fazer presentes lá dentro (por exemplo, células sanguíneas e meios de cultura microbiológica). A superfície óptica do recipiente pode ser iluminada a determinado ângulo a fim de proporcionar resultados aceitáveis conforme é de conhecido dos versados na técnica (por exemplo, Eisinger, J. e J. Flores, “Front-face fluorometry of liquid samples”, Anal. Biochem., 94:15 a 21, 1983) Em uma concretização, o sistema é projetado de modo que o sistema espectroscópico meça a luz refletida difusa no mínimo a um ângulo fixo em aditamento à medição da fluorescência emitida no mínimo a um ângulo fixo.
[074] De acordo com a invenção, tiram-se medidas de controle de micro-organismos conhecidos, permitindo assim a correlação dos dados de teste medidos na caracterização dos micro-organismos de interesse por meio de vários métodos matemáticos conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, é possível comparar os dados das amostras a parâmetros ou medidas de controle usando-se sistemas de software conhecidos pelos versados na técnica. Mais especificamente, os dados podem ser analisados por vários métodos de análise multivariada, tal como, por exemplo, Análise Discriminante Generalizada (GDA), Análise Discriminante por Quadrados Mínimos Parciais (PLSDA), regressão de Quadrados Mínimos Parciais, Análise dos Componentes Principais (PCA), Análise de Fatores
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Paralelos (PARAFAC), Análise de Rede Neural (NNA) e/ou Máquina de Vetores de Suporte (SVM). Esses métodos podem ser usados para classificar micro-organismos de interesse desconhecidos em grupos relevantes com base em nomenclaturas existentes e/ou em grupos de ocorrência natural com base no metabolismo, na patogenicidade e/ou virulência dos organismos ao projetar o sistema para monitorar, detectar e/ou caracterizar os organismos conforme descrito acima.
[075] Em ainda outra concretização, as medidas nãoespectroscópicas do sistema de detecção, tal como tempos de detecção e taxas de desenvolvimento, podem ser usadas para ajudar na caracterização e/ou identificação de micro-organismos do precipitado ou amostra isolada. Ademais, as medidas tiradas a partir de uma imagem fotográfica da região inferior do dispositivo de separação podem proporcionar informações valiosas na identificação do isolado, tal como o tamanho, o formato, a cor e a densidade do precipitado.
[076] Em algumas concretizações da invenção, a caracterização e/ou identificação dos micro-organismos no precipitado ou amostra isolada não precisam incluir a identificação de uma espécie exata. A caracterização inclui a ampla categorização ou classificação de partículas biológicas, bem como a identificação real de uma única espécie. A classificação de micro-organismos de uma amostra ou precipitado isolado pode compreender a determinação de características fenotípicas e/ou morfológicas do micro-organismo. Por exemplo, a caracterização das partículas biológicas pode ser consumada com base em diferenças observáveis, tal como, composição, formato, tamanho, aglomeração e/ou metabolismo. Em algumas concretizações, a classificação das partículas biológicas de interesse pode não exigir nenhum conhecimento prévio das características de dada partícula biológica, mas, em vez disso, requer apenas correlações consistentes com medidas empíricas, tornando assim este método mais universal e prontamente adaptado do que os métodos com base em eventos específicos de ligação ou
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38/73 reações metabólicas. Conforme usado no presente documento, o termo “identificação” significa determinar a que família, gênero, espécie e/ou linhagem um micro-organismo anteriormente desconhecido pertence. Por exemplo, identificar um micro-organismo anteriormente desconhecido no que se refere à família, ao gênero, à espécie e/ou à linhagem.
[077] Em alguns casos, a caracterização abrange métodos de classificação que proporcionam informações úteis o suficiente para que se tome uma ação. Conforme usados no presente documento, os modelos de classificação preferidos compreendem o agrupamento em um ou mais dos seguintes grupos: (1) Grupos Gram; (2) Grupos Gram Clínicos; (3) Grupos Terapêuticos; (4) Grupos Funcionais; e (5) Grupos de Fluorescência Intrínseca Natural.
[078] (1) Grupos Gram: Dentro da classificação de
Grupos Gam os micro-organismos podem ser organizados em uma de três categorias de classificação amplas com base em sua reação de coloração de Gram e tamanho geral, os referidos grupos selecionados dentre um ou mais dos grupos a seguir: (a) Micro-organismos gram-positivos, que adquirem uma coloração azul-escura com a coloração de Gram; (a) Micro-organismos gramnegativos, que adquirem uma coloração vermelha com a coloração de Gram; e (c) células de levedura que adquirem uma coloração azul-escura com a coloração de Gram, mas são células redondas muito grandes distintas das bactérias por cauda de suas características morfológicas e de seu tamanho.
[079] (2) Grupos Gram Clínicos: Os Grupos Gram podem ser divididos ainda em várias subcategorias que representam diferentes características morfológicas. Essas subcategorias compreendem todas as informações clínicas relevantes relatadas por um tecnólogo de laboratório experiente e, portanto, proporcionam um maior nível de identificação do que uma reação Gram-positiva ou negativa. Esta classificação específica é de bastante ajuda, pois elimina dúvidas quanto à confiabilidade da qualidade de uma linhagem Gram e/ou quanto à habilidade do técnico que lê o esfregaço
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39/73 proporcionando informações clinicamente relevantes equivalentes por meio de um sistema automatizado. Mais especificamente, as subcategorias de microorganismos com base neste modelo de classificação são selecionadas dentre uma ou mais das subcategorias a seguir: (a) cocos, que são células redondas e pequenas; (b) diplococos, que são duas células redondas e pequenas unidas;
(c) bastonetes, que são retangulares; e (d) bacilos, que têm a forma de bastonetes. Exemplos dessas subcategorias que podem ser determinados por meio de informações morfológicas adicionais incluem: (i) cocos gram-positivos;
(ii) cocos gram-positivos em cadeias; (iii) cocos gram-positivos em cachos (isto é, aglomerados como cachos de uva); (iv) diplococos gram-positivos; (v) bastonetes gram-positivos; (vi) bastonetes gram-positivos com endósporos; (vii) bastonetes gram-negativos; (viii) cocobacilos gram-negativos; (ix) diplococos gram-negativos; (x) leveduras; e (xi) fungos filamentosos.
[080] (3) Grupos Terapêuticos: Os grupos terapêuticos compreendem várias espécies microbianas que, quando isoladas de tipos de espécime específicos, são tratadas com a mesma classe de antibióticos ou mistura de antibióticos (por exemplo, conforme descrito em “Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008) Em diversos casos, a identificação da espécie não é necessária para que o médico passe da terapia inicial empírica a uma terapia mais precisa, pois mais de uma espécie pode ser tratada com as mesmas opções de antibióticos. Esse nível de classificação organiza corretamente esses micro-organismos “de tratamento igual” em categorias terapêuticas individuais. Exemplos desse nível de caracterização incluem a possibilidade de distinguir espécies de Enterobacteriaceae (EB) altamente resistentes de espécies de EB sensíveis (espécies de Enterobacter da E. coli) ou espécies de Cândida resistentes ao fluconazol (C. glabrata e C. kruzei) de espécies de Cândida sensíveis (C. albicans e C. parapsilosis) e assim por diante.
[081] (4) Grupos Funcionais: De acordo com a invenção, os micro-organismos também podem ser organizados em vários
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40/73 grupos com base na combinação de características metabólicas, virulentas e/ou fenotípicas. Organismos não-fermentativos podem ser claramente distinguidos dos fermentativos. Além disso, espécies de micro-organismos que produzem hemolisinas podem ser agrupadas separadamente de espécies nãohemolíticas. Em alguns casos, esses grupos representam categorias mais amplas do que o gênero (por exemplo, coliformes, bastonetes gram-negativos não-fermentativos), algumas em nível de gênero (por exemplo, enterococo, cândida), e algumas mais próximas à discriminação em nível de espécies (por exemplo, estafilococos de coagulase negativa, estreptococos alfa-hemolíticos, estreptococos beta-hemolíticos, estafilococos de coagulase positiva, isto é, o S. aureus).
[082] (5) Grupos de Fluorescência Intrínseca (“IF”)
Natural: Os micro-organismos também podem ser organizados em categorias com base em sua tendência natural de se agruparem por suas características de fluorescência inatas e/ou intrínsecas. Alguns desses grupos podem ser comuns às categorias dos Grupos Terapêutico e Funcional. Esses agrupamentos podem compreender espécies individuais, tal como E. faecalis,
S. pyogenes ou P. aeruginosa, que têm características de IF inconfundíveis e/ou podem conter pequenos grupos de organismos com características de IF relativamente conservadas, tal como grupos K. pneumoniae-K. oxytoca ou E. aerogenes-E. cloacae.
[083] Além de medir as propriedades intrínsecas dos micro-organismos (tal como a fluorescência intrínseca) para fins de identificação, os métodos da presente invenção podem compreender ainda o uso de outros agentes identificadores para ajudar no processo de separação e/ou identificação. Agentes que se ligam a micro-organismos específicos, como ligantes por afinidade, podem ser usados para separar micro-organismos a fim de identificar uma classe ou espécies de micro-organismo (por exemplo, pela ligação a uma proteína ou receptor de superfície específico) e/ou a fim de identificar uma característica dos micro-organismos (por exemplo, resistência à
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41/73 antibióticos). Agentes identificadores que podem ser usados incluem, entre outros, anticorpos monoclonais e policlonais e fragmentos deles (por exemplo, anti-Eap para a identificação do S. aureus), sondas ácidas nucléicas, antibióticos (por exemplo, penicilina, vancomicina, polimixina B), aptâmeros, miméticos de peptídeo, proteínas de ligação derivadas do fago, lectinas, biomarcadores de imunidade inata do hospedeiro (proteínas de fase aguda, proteína de ligação ao LPS, CD 14, laetina de ligação à manose, receptores tipo Toll), peptídeos de defesa do hospedeiro (por exemplo, defensinas, catelicidinas, proteogrinas, magaininas), bacterocinas (por exemplo, lantibióticos, como nisina, mersacidina, epidermina, galidermina e plantaricina C, e peptídeos de classe II), bacteriófagos e tinturas seletivas para ácidos nucléicos, lipídios, carboidratos, polissacarídeos, cápsulas/lodo ou proteínas ou qualquer combinação desses. Se o agente não emitir um sinal detectável, ele pode ser rotulado para emitir um sinal detectável, tal como conjugando o agente a um marcador (por exemplo, visível ou fluorescente). Marcadores incluem, entre outros, compostos fluorescentes, luminescentes, fosforescentes, radioativos e/ou colorimétricos. O agente pode ser acrescentado aos microorganismos em qualquer etapa dos métodos da invenção, por exemplo, quando da obtenção da amostra, durante a lise e/ou durante a separação. Em algumas concretizações, a presença do agente no precipitado pode ser determinada durante a interrogação do precipitado. Outros agentes identificadores que podem ser usados incluem substratos para enzimas microbianas, agentes quelantes, agente fotossensível, agente inibidor, agente redutor, agente oxidante, tampão, ácido, base, solvente, fixador, detergentes, surfactantes, desinfetantes (por exemplo, alcoóis, água sanitária, peróxido de hidrogênio) e compostos tóxicos (por exemplo, azida de sódio, cianeto de potássio) e inibidores metabólicos como ciclohexamida etc. De maneira semelhante, muitos compostos fluorescentes para medir a viabilidade celular microbiana, o metabolismo e/ou o potencial da membrana podem ser usados como agentes identificadores na presente invenção. Conforme os versados na técnica
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42/73 perceberão prontamente, a sensibilidade de um micro-organismos específico a qualquer composto que afete seu estado físico ou metabolismo, como um antibiótico, pode ser rapidamente determinada acrescentando-se o composto à amostra, ao tampão de lise, à camada de densidade ou a qualquer mistura desses.
[084] Em um aspecto da invenção, o método pode compreender ainda uma etapa de recuperar o precipitado de micro-organismos e realizar testes adicionais. Em uma concretização, o precipitado pode ser recuperado aspirando o meio da amostra e a camada de densidade. Em outra concretização, o precipitado pode ser recuperado inserindo-se uma seringa no recipiente e aspirando-o enquanto o meio da amostra e a camada de densidade permanecem intactos. O precipitado recuperado pode, então, ser ressuspenso em um meio adequado, por exemplo, em uma solução salina. Uma vez ressuspensos, os micro-organismos podem ser submetidos a qualquer novo teste desejado de conhecimento dos versados na técnica ou conforme descrito acima. Em particular, qualquer teste que exija amostras de micro-organismos limpas pode ser realizado nos micro-organismos ressupensos. Em algumas concretizações, é possível realizar novos testes de identificação. Exemplos de testes de identificação incluem o Vitek® 2, testes com ácido nucléico amplificado e não-amplificado (NAT), conjuntos de aglutinação de látex e cromogênicos, imunoensaios (por exemplo, usando-se anticorpos rotulados e/ou outros ligantes), espectrometria de massa (por exemplo, espectrometria de massa MALDI-TOF) e/u outras técnicas ópticas como espectroscopia de infravermelho (FTIR) ou espectroscopia Raman. Também é possível realizar outros testes de caracterização, tal como de resistência a antibióticos e/ou a outros fármacos. A nova caracterização pode fazer parte de um teste que teve início durante as etapas iniciais de separação e identificação do método. Por exemplo, a detecção de S. aurei resistentes à meticilina pode ter início acrescentando-se penicilina fluorescentemente rotulada à amostra antes da separação dos micro-organismos. Depois de
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43/73 recuperar e ressuspender o precipitado, é possível determinar a quantidade de penicilina ligada.
[085] Em um aspecto da invenção, algumas ou todas as etapas do método podem ser automatizadas. A automatização das etapas dos métodos permite testar um maior número de amostras com mais eficácia e diminui os riscos de falha humana no manuseio das amostras, que podem conter micro-organismos prejudiciais e/ou contagiosos. Contudo, de maior importância, a automação pode propiciar resultados cruciais a qualquer hora do dia ou da noite sem atraso. Vários estudos demonstraram que a identificação mais rápida dos organismos que causam a sepsia está diretamente ligada a um melhor tratamento do paciente, a menores estadias no hospital e a menores gastos como um todo.
[086] Em certas concretizações da invenção, os métodos também podem ser usados para detectar a presença de microorganismos em uma amostra. Nessas concretizações, os métodos compreendem as etapas de:
(a) obter uma amostra;
(b) opcionalmente submeter a lise as células da referida amostra a fim de produzir uma amostra submetida a lise; e (c) separar micro-organismos de outros componentes da referida amostra para formar um precipitado de micro-organismos;
em que a presença de um precipitado indica que os micro-organismos se fazem presentes na amostra. Em uma concretização, é possível ver o precipitado a olho nu a olho nu. Em outras, o precipitado é detectado por interrogação, por exemplo, por espectroscopia.
[087] Em algumas concretizações, os métodos de detecção podem ser usados para monitorar as amostras quanto à contaminação por micro-organismos, por exemplo, gêneros alimentícios, produtos farmacêuticos, água potável etc. Em uma concretização, os métodos podem ser realizados de maneira repetitiva para o monitoramento constante da
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44/73 contaminação, por exemplo, uma vez por mês, uma vez por semana, uma vez por dia, uma vez a cada hora ou qualquer outro padrão temporal. Em outra concretização, as amostras podem ser testadas conforme necessário, por exemplo, quando se suspeitar de contaminação. Em outras concretizações, os métodos de detecção podem ser usados para procurar pela presença de microorganismos em amostras clínicas, por exemplo, culturas sanguíneas. Por exemplo, uma amostra pode ser removida de uma cultura sanguínea em determinados momentos e o método de detecção realizado na amostra para determinar se a cultura sanguínea é positiva. Em uma concretização, uma amostra pode ser tirada em determinado momento após a inoculação da cultura, por exemplo, 24 horas após a inoculação, para determinar se a cultura sanguínea é positiva. Em outra concretização, é possível retirar amostras da cultura sanguínea com regularidade, por exemplo, a cada 12, 6, 4 ou 2 horas ou a cada 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, ou 5 minutos, para identificar culturas sanguíneas positivas dentro de um breve período após detectavelmente positivas. Em certas concretizações dos métodos de detecção, como opção, a etapa de detecção pode ser seguida por métodos de identificação conforme descritos neste documento. Em outras concretizações, os métodos de detecção são automatizados em parte ou por inteiro, em especial em concretizações que envolvam o monitoramento repetitivo das amostras.
[088] Descreveremos a presente invenção em mais detalhes nos exemplos a seguir, apresentados a título exemplificativo e sem o intuito de limitar a invenção de forma alguma. Técnicas padrão de conhecimento geral na área ou técnicas especificamente descritas abaixo são utilizadas.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1. Método de separação e identificação microbiana rápido
A. Procedimento de separação por lise-centrifugação [089] Acrescentamos uma suspensão de sílica coloidal
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45/73 (0,2 a 0,5 ml; densidade de 1,040 a 1,050 gm/ml) a vários tubos de microcentrífuga cônicos. Dispusemos amostras de caldo de cultura sanguínea BacT/ALERT® SA positivas submetida a lise (0,5 a 1,0 ml) sobre a suspensão de sílica coloidal. Como alternativa, é possível acrescentar a solução de sílica coloidal debaixo do caldo de cultura sanguínea submetido a lise usando-se uma agulha ou cânula.
[090] Caldos positivos de culturas contendo os microorganismos a seguir foram testados:
> E. coli, ATCC 25922 > E. faecalis, ATCC 29212 > S. aureus, ATCC 12600 > P. aeruginosa, ATCC 10145 [091] Em seguida, tampamos os tubos os giramos em uma microcentrífuga por 2 minutos a cerca de 10.000 g à temperatura ambiente (20 a 25° C). Aspiramos os sobrenadantes e, então, ressuspendemos os precipitados microbianos purificados em NaCl a 0,45% p/v a uma densidade a 600 nm de 0,40.
[092] Transferimos parte de cada suspensão a um cadinho de acrílico e a lemos opticamente em um espectrofluorômetro (Fluorolog® 3, HORIBA Jobin Yvon Inc., Nova Jersey) para medir a fluorescência intrínseca microbiana (MIF).
[093] Levamos uma segunda parte a cartões Vitek® 2 ID/AST (bioMerieux Inc., Missouri). Comparamos os resultados “diretos” da Vitek® 2 aos de suspensões de culturas desenvolvidas durante a noite subcultivadas a partir do caldo positivo (método tradicional). Todas as 4 espécies proporcionaram níveis de confiança na identificação excelentes tanto com o método “diretamente da cultura sanguínea” quanto com métodos padrão com a Vitek®, demonstrando que o método de separação com base na densidade proporcionou micro-organismos substancialmente isentos de partículas e proteínas derivadas do sangue e/ou do caldo.
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B. Procedimento rápido para a identificação in situ por fluorescência intrínseca [094] Removemos frascos com culturas sanguíneas positivas do Sistema de Detecção Microbiana BacT/ALERT® (bioMerieux Inc., Missouri) dentro de uma hora de sinalização positiva, de preferência dentro de 10 minutos de sinalização positiva. Acrescentamos uma amostra de 2,0 ml de caldo de cultura sanguínea positiva a 0,5 ml de Solução de Lise (Reduzida de Triton® X-100, Rohm e Haas, Pensilvânia, a 0,75% + Proteinase XXIII a 0,375%) em um tubo estéril com uma tampa roscada. Submetemos o tubo a vórtice brevemente para fazer a mistura e o incubamos por 5 minutos à temperatura ambiente. Acrescentamos a amostra de caldo submetida a lise (0,5 ml) a um tubo de microcentrífuga feito sob medida (com uma janela óptica de quartzo de 0,5 mm de espessura na base) contendo a solução de separação (sílica coloidal Isolate® a 30% em p/v em 0,15 M de NaCl) a uma densidade de 1,045 mg/ml. Giramos o tubo em uma microcentrífuga Eppendorf® 5417R munida de um rotor horizontal A-8-11 (Eppendorf, Nova Iorque) por 2 minutos a cerca de 10.000 rpm à temperatura ambiente (20 a 25° C). Removemos o tubo da centrífuga e o transferimos a um adaptador frontal feito sob medida para o espectrofluorômetro Fluorolog® 3 (HORIBA Jobin Yvon Inc., Nova Jersey). A fluorescência dos micro-organismos precipitados no fundo do tubo foi lida imediatamente de baixo. Os dados foram exportados para os softwares Excel e Statistica para análises multivariadas.
EXEMPLO 2. Avaliação do método de purificação e identificação microbiana rápido [095] Para avaliar o potencial do conceito de identificação rápida descrito no Exemplo 1, foram testados de acordo com o método 24 isolados (6 linhagens de 4 espécies incluindo C. albicans, E. coli, S. aureus e S. epidermidis) recuperados de culturas sanguíneas positivas.
[096] Coletamos e misturamos sangue anticoagulado com SPS de três doadores. Acrescentamos 10 ml de sangue humano fresco
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47/73 aos frascos de cultura sanguínea BacT/ALERT® (BTA) SA (bioMerieux Inc., Missouri). Preparamos suspensões de cada um dos isolados em caldo triptíco de soja (TSB). Inserimos em cada frasco 0,4 ml de uma suspensão a 103/ml e os incubamos a 36° C em uma cabine BTA. Quatro frascos BacT/ALERT® SA contendo 10 ml de sangue, mas sem nenhum organismo, foram incluídos como padrões de controle negativos.
[097] Removemos os fracos positivos da cabine BTA dentro de 3 horas de sinalização positiva. Removemos um frasco de controle negativo junto com cada conjunto de frascos positivos (por espécie). Removemos um frasco de cada vez da cabine BTA na ordem em que se tornaram positivos. Removemos uma amostra de 2,0 ml do caldo de cultura sanguínea positiva usando uma seringa de 3 ml e uma agulha 18G e a acrescentamos imediatamente a 0,5 ml de Tampão de Lise (Reduzido de Triton® X-100, Fluka, de 0,75% em p/v) em um tubo de vidro estéril com tampa roscada. Submetemos o tubo a vórtice brevemente para fazer a mistura e o incubamos por 5 minutos à temperatura ambiente. Acrescentamos uma parcela de 0,5 ml da amostra de caldo submetida a lise a um tubo capilar de microcentrífuga (com uma janela óptica de quartzo de 0,5 mm na base da seção capilar) previamente preenchido com 55 pl de Solução de Separação (Isolate® a 30% em p/v em 0,15 M de NaCl). Centrifugamos o tubo em uma microcentrífuga Eppendorf® 5417R munida de um rotor horizontal A-8-11 (Eppendorf, Nova Iorque) por 2 minutos a 10.000 rpm a 22° C. Removemos o tubo da centrífuga e o transferimos a um adaptador na face frontal feito sob medida de 30° para o espectrofluorômetro Fluorolog® 3 (HORIBA Jobin Yvon Inc., Nova Jersey). A fluorescência dos micro-organismos precipitados purificados no fundo do tubo foi lida imediatamente usando-se um programa feito sob medida de 5 minutos. Os dados foram exportados para os softwares Excel e Statistica para análises quimiométricas e a classificação dos isolados.
[098] A otimização do modelo de classificação foi realizada nos dados com e sem normalização e com validação cruzada
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48/73 deixando um de fora. Os resultados são apresentados na Tabela 1. Nela, “no de etapas” significa o número de etapas de Análise Discriminante que resultou na mais alta sensibilidade usando uma abordagem de validação cruzada deixando um de fora. Na ausência da normalização de dados, a porcentagem de linhagens identificadas corretamente foi de 82,6%. Os melhores resultados (identificação aproximadamente 96% correta) foram obtidos quando os dados foram normalizados ao ponto de difusão de Rayleigh, à região do colágeno ou ao pico de piridoxamina, embora resultados aprimorados ainda tenham sido obtidos normalizando aos picos de NADH, triptofano e flavina.
Tabela 1
Normalização de dados Princípio / Fluoróforo Porcentagem correta na validação cruzada No de etapas
Não n/a 82,6 2
320_320 Difusão 95,7 2
320_405 Colágeno 95,7 6
300_400 Piridoxamina 95,7 8
345_460 NADH 91,0 10
285_350 Triptofano 87,0 1
465_515 Flavina 87,0 3
EXEMPLO 3. Avaliação de Tampões de Lise [099] Fizemos experimentos para avaliar perfis de eficiência na separação e fluorescência microbiana intrínseca (MIF) de caldos de cultura sanguínea de S. pneumoniae WM-43 recém-positivos tratados com tampões de lise pesados e brandos. Testamos as fórmulas de tampão de lise a seguir: (A) TX100-R a 2,0% em 0,5 M de CAPS com pH de 11,7 (pesado = LBA); (A) TX100-R a 0,75% em 0,5 M de CAPS com pH de 11,7 (brando = LB-B); e (C) TX100-R a 0,45% em 0,3 M de CAPS com pH de 11,7 (brando = LB-C). Inserimos 1,0 ml dos tampões de lise A e B e 2,0 ml do tampão de lise C em tubos de tampa roscada, e levamos os tubos a um cavalete em um banho
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49/73 maria a 37° C. Removemos amostras do caldo (4,0 ml) de um frasco de cultura BacT/ALERT® SA positiva de S. pneumoniae WM43 usando uma seringa de 5 ml e uma agulha 18G dentro de 5 minutos de sinalização positiva no sistema BTA. Despejamos rapidamente o caldo em cada tubo contendo o tampão de lise, tampamos os tubos e os submetidos a vórtice por cerca de 5 segundos. Também recolhemos um caldo de teste de frascos BacT/ALERT® SA de controle negativo bem cheios (15 ml de sangue) para determinar a eficácia das etapas de lise e separação. Levamos os tubos de volta ao banho-maria a 37° C por 1 minuto. Removemos os tubos do banho-maria e os inserimos 0,5 ml de lisado em um tubo de separação pré-carregado com 200 pl de uma camada de densidade de ioexol a 14% em p/v. Centrifugamos os tubos por 2 minutos a 10.000 rpm (cerca de 1.000 por g) a 25° C em uma microcentrífuga Eppendorf® 5417R munida de um rotor horizontal A-8-11 (Eppendorf, Nova Iorque). A Fig. 1 ilustra fotografias das regiões inferiores dos tubos de separação usando LB-B. Podemos observar a ausência de qualquer precipitado quando do processamento de um caldo de controle negativo bem cheio (15 ml de sangue). Logo depois da centrifugação, os tubos foram lidos no espectrofluorômetro Fluorolog® 3 (HORIBA Jobin Yvon Inc., Nova Jersey) usando um adaptador de tubos duplo de 30°, um detector PMT e o arquivo de varredura “EEM Total (varredura de 20,8 min). As Figs. de 2A a 2C ilustram exemplos do espectro de EEM de cada amostra.
[100] Os perfis de fluorescência intrínseca EEM dos precipitados de S. pneumoniae ilustrados nas Figs. de 2A a 2C coincidem bem com os resultados de viabilidade celular. O tratamento do caldo positivo com o tampão de lise contendo TX100 a 0,40% (concentração final) (LB-A; tampão pesado) resultou em uma queda de 30 na viabilidade penumococal e em uma queda de 5 no pico de fluorescência do NADH em comparação ao tratamento com ambos os tampões mais brandos contendo TX100 a 0,15% (concentração final) apesar de sinais de triptofano semelhantes em todos os três precipitados. Outra mudança relacionada à queda na viabilidade microbiana foi o aumento
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50/73 no pico de fluorescência de flavina (Tabela 2). Na Fig. 2A, é possível observar com clareza a queda do NADH e o aumento da fluorescência de flavida.
Tabela 2: Sinais de fluorescência intrínseca de precipitados de S. pneumoniae
Tampã o de lise TX100- R (final) CAPS com pH de 11,7 Diln. do Caldo Pico de triptofano Pico de NADH Pico de flavina Viabilidade
LB-A 0,40 % 0,10 M 1 pt LB: 4 pts Caldo 699.975 52.123 119.622 1,0 X 107 CFU/ml
LB-B 0,15% 0,10 M 1 pt LB: 4 pts Caldo 824.886 245.880 54.594 3,7 X 108 CFU/ml
LB-C 0,15% 0,10 M 1 pt LB: 2 pts Caldo 799.015 283.701 49.548 3,2 X 108 CFU/ml
EXEMPLO 4. Dispositivos e métodos aprimorados para a identificação in situ de precipitados microbianos purificados [101] Para explorar ainda mais o potencial do método rápido de separação e identificação in situ descrito no Exemplo 2, vários dispositivos internos foram projetados e moldados com plástico transparente a raios ultravioleta. Esses dispositivos são revelados no pedido de patente dos Estados Unidos de no de série _, intitulado “Dispositivo de separação para uso na separação, caracterização e/ou identificação de micro-organismos”, depositado no dia 30 de outubro de 2009, cujo conteúdo encontra-se anexado ao presente documento para fins de referência. Esses dispositivos continham várias características comuns, incluindo uma vedação, um reservatório para a amostra e uma região inferior, óptica e afunilada para permitir a interrogação espectroscópica do precipitado microbiano sedimentado por baixo e/ou pelas laterais, além de recursos para facilitar o acoplamento do dispositivo a um espectrofluorômetro. Os dispositivos também devem ser capazes de resistir a forças G relativamente altas durante a etapa de separação. Várias iterações desse tubo foram projetadas para aprimorar a recuperação microbiana e a reprodutibilidade por fluorescência, além de diminuir a contaminação por luz
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51/73 difusa. O tubo também foi projetado para ser hermeticamente fechado.
[102] A interrogação óptica do precipitado microbiano sedimentado foi atingida inserindo-se o dispositivo de separação em um adaptador personalizado disposto dentro do compartimento para amostras do espectrofluorômetro ou acoplando-se o dispositivo de separação diretamente a um cabo de fibra óptica “seis em torno de uma” bifurcado de 300 a 400 mícrons (Ocean Optics, Florida) ligado ao espectrofluorômetro (Fluorolog® 3, HORIBA Jobin Yvon Inc., Nova Jersey). Um adaptador de fibra óptica de três espelhos foi construído para permitir o uso de ambos os detectores de sistema (PMT e CCD). Os espectros da matriz de estímulo-emissão (EEM) total foram coletados em cada precipitado microbiano (faixa de varredura: estímulo de 260 a 800 nm; emissão de 260 a 1.100 nm; incrementos de 5 nm).
[103] Realizamos estudos de reprodutibilidade e confiabilidade na configuração do dispositivo descartável com o cabo de fibra óptica usando soluções purificadas de triptofano e riboflavina. Coeficientes de variação almejados inferiores a 2,5% foram obtidos em ambos os fluoróporos, confirmando a qualidade do produto descartável e da plataforma de exame.
EXEMPLO 5. Identificação de micro-organismos usando medidas de precipitados microbianos e comparação a suspensões microbianas [104] Vários investigadores já descreveram o uso de medidas de fluorescência de ângulo reto de suspensões diluídas de microorganismos a fim de identificá-los. Comparamos a eficácia desse método tradicional com nossa nova abordagem de medição na face frontal de um precipitado microbiano sedimentado dentro da base de um dispositivo de separação transparente a raios ultravioleta interno ou tubo óptico. Ademais, comparamos a eficácia de dois detectores para medições frontais; um detector de tubo fotomultiplicador (PMT) conectado a um espectrômetro de grade duplo, e um detector de dispositivo de carga emparelhada (CCD) conectado a um espectrômetro de grade simples. Esses experimentos foram realizados usando
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52/73 se o modelo de dispositivo de separação em duas peças e colônias microbianas cultivadas em placas de ágar. Um conjunto de 42 linhagens representando 7 espécies (S. aureus, S. epidermidis, E. coli, K. oxytoca, C. albicans, C. tropicalis e E. faecalis) foi testado em cada uma das três configurações ópticas a seguir:
1. Uma suspensão de 0,40 de OD a 660 nm de cada micro-organismo foi preparada em NaCl a 0,45%, acrescentada a um cadinho permeável à luz ultravioleta e EEM's totais foram coletadas em ângulos retos usando-se um detector PMT (método tradicional)
2. Um precipitado microbiano de 2 a 3 mm de espessura foi preparado no dispositivo de separação feito sob medida centrifugando-se uma suspensão. A EEM total do precipitado resultante foi coletada no modo na face frontal usando-se o detector PMT.
3. Um precipitado microbiano de 2 a 3 mm de espessura foi preparado no dispositivo de separação feito sob medida centrifugando-se uma suspensão. A EEM total do precipitado resultante foi coletada no modo na face frontal usando-se o detector CCD.
[105] Os dados de fluorescência intrínseca nas EEM's foram analisados usando-se um software de análise multivariada disponível para comércio (Análise Discriminante Generalizada; Statistica). A Tabela 3 apresenta os resultados das análises.
Tabela 3
Configuração óptica Tipo de detector Porcentagem correta no que se refere à espécie
1. Suspensão em cadinho PMT 83,3% (35/42 linhagens corretas)
2. Precipitado em tubo óptico feito sob medida PMT 97,6% (41/42 linhagens corretas)
3. Precipitado em tubo óptico feito sob medida CCD 97,6% (41/42 linhagens corretas)
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53/73 [106] Para nossa surpresa, a varredura de precipitados microbianos no modo na face frontal melhorou significativamente a capacidade de identificá-los usando-se métodos de análise multivariada conhecidos. Novas análises dos dados da EEM de fluorescência revelaram que a região discriminatória principal para a configuração tradicional de suspensão em cadinho foi dentro da região de triptofano do espectro. Em contrapartida, medidas frontais dos precipitados microbianos resultaram em várias regiões adicionais do espectro de EEM que proporcionaram forte capacidade discriminatória, em especial dentro dos comprimentos de onda de estímulo de 360 a 440. Este experimento também demonstrou a equivalência funcional do PMT e dos detectores CCD.
[107] Outras informações espectrais da fluorescência intrínseca proporcionadas pela interrogação na face frontal dos precipitados microbianos foram um resultado inesperado e vantajoso.
EXEMPLO 6. Desenvolvimento de tampões de lise seletivos [108] Resolvemos projetar Tampões de Lise seletivos capazes de dissolver componentes do sangue humano em fração de segundos deixando a maior parte de micro-organismos que causam a sepsia intactos e metabolicamente ativos. A amostra mais comum usada para esses estudos foi o meio de cultura BacT/ALERT® SA contendo sangue humano. Os frascos receberam de 10 a 15 ml de sangue humano com ou sem um pequeno inóculo de micro-organismos de teste e, em seguida, foram levados a um Sistema de Detecção Microbiana BacT/ALERT®. Os frascos positivos ou negativos de até então foram removidos e uma amostra do caldo tratada conforme descrito abaixo.
[109] As primeiras soluções de lise usadas na presente invenção foram destamponadas (Exemplos 1 e 2) e usadas essencialmente junto com camadas de densidade de sílica coloidal. Uma das propriedades interessantes da sílica coloidal é a habilidade de separar componentes de
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54/73 células sanguíneas não solubilizados por completo, que se aglomeram no topo da camada de densidade, e micro-organismos intactos, que atravessam a camada e formam o precipitado. À medida que camadas de densidade de aplicação mais abrangente foram buscadas (vide o Exemplo 7), muitas foram incapazes de impedir a sedimentação desses resíduos não-microbianos; portanto, fórmulas de tampões de lise melhores eram necessárias. Concluímos que os resíduos não-microbianos foram rapidamente dissolvidos por hidróxido de potássio, mas não por ácido; portanto, vários tampões de pH alcalino foram testados na presença de vários detergentes. Durante esses estudos, descobrimos que uma mistura do detergente Triton X100-R e o tampão CAPS a um pH de 11,7 resulta na completa solubilização de componentes de células sanguíneas a partir de uma amostra de caldo de cultura sanguínea estéril.
[110] Uma avaliação preliminar do efeito da concentração do detergente Triton X100-R e de condições de lise com pH elevado na viabilidade da linhagem de S. penumoniae WM-43 foi descrita no Exemplo 3. Condições que resultaram em menor viabilidade microbiana causaram uma queda significativa na fluorescência do NADH com um aumento concomitante na fluorescência da flavina (vide Tabela 2; LB-A).
[111] Vários detergentes aniônicos, neutros e zwiteriônicos foram filtrados para inclusão em um tampão de lise seletivo. Descobrimos que detergentes aniônicos e zwiteriônicos são desnaturalizantes demais para proteínas sanguíneas; sendo assim, focamos em detergentes neutros não-desnaturalizantes, tal como a seleção apresentada na Tabela 4. Detergentes com atividade de lise em células sanguíneas mais forte no pH alcalino testadas são listadas de 1 a 6. Esses detergentes solubilizaram por completo as células sanguíneas em um caldo de cultura sanguínea de controle negativo dentro de 20 segundos, conforme estimado por um aumento na porcentagem de transmitância a 660 nm. Um segundo grupo de detergentes (de 7 a 10) demonstrou uma lise mais lenta e controlada das células sanguíneas, proporcionando solubilização máxima em 30 a 40 segundos. Um
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55/73 terceiro grupo (de 11 a 12) levou de 8 a 10 minutos até a lise total a concentrações de detergente comparáveis.
[112] Foram preparados tampões de lise contendo detergentes de diferentes estruturas e atividades líticas em uma fórmula de tampão básica de 0,3 M de CAPS a um pH de 11,7. As concentrações dos detergentes são apresentadas na Tabela 4. Esses tampões de lise foram funcionalmente avaliados usando-se um caldo de cultura sanguínea positivo contendo uma linhagem de micro-organismos clínicos conhecida por ser sensível a detergentes e condições de pH alcalino, Streptococcus pneumoniae, linhagem WM-43. Os parâmetros avaliados foram os níveis de fluorescência microbiana intrínseca (espectros da matriz de estímulo-emissão), a eficácia na separação, a aparência do precipitado microbiano isolado, as características Gram da linhagem e a viabilidade de micro-organismos recuperados do precipitado abaixo da camada de densidade.
[113] O procedimento foi realizado conforme o seguinte:
[114] Misturamos 2 porções de caldo positivo com 1 porção de tampão de lise de teste, incubamos em banho-maria a 37° C por 1 minuto para submeter as células sanguíneas a lise e, em seguida, dispomos uma camada 0,5 ml de lisado sobre 0,2 ml de camada de densidade (ioexol a 14% em p/v + NaCl a 1,93% em p/v + 10 nM de Hepes a um pH de 7,4) dispensada em um tubo de separação óptica em 2 peças que foi, então, hermeticamente fechado com uma tampa roscada. Após centrifugar o tubo em uma microcentrífuga Eppendorf® 5417R munida de um rotor horizontal A-8-11 (Eppendorf, Nova Iorque) por 2 minutos a 10.000 rpm, o tubo foi levado a um adaptador feito sob medida que acoplou a base do tubo diretamente a uma sonda de fibra óptica de 400 mícrons conectada a um espectrofluorômetro (Fluorolog® (HORIBA Jobin Yvon Inc. Nova Jersey), e uma varredura de EEM completa foi realizada (Ex 260 a 850 nm; Em 260 a 1.100 nm; a cada 5 nm). Após a varredura, removemos o sobrenadante e ressuspendemos o precipitado microbiano em 0,5 ml de Caldo Tríptico de Soja (TSB). Esfregaços das
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56/73 suspensões foram preparados por coloração de Gram e 20 microlitros de uma diluição 1:100 foram revestidos sobre placas de ágar com sangue de carneiro para estimar a viabilidade em uma escala NG (sem desenvolvimento) a 4+ (desenvolvimento máximo).
[115] Os resultados deste experimento demonstraram que, mediante as condições de lise desejadas descritas acima, os detergentes de teste se classificaram em três categorias diretamente relacionadas às suas propriedades líticas:
1. Detergentes líticos rápidos (de 1 a 6), que tiverem certo efeito na reação de Gram do isolado de S. pneumoniae. Os dois últimos detergentes deste grupo (Genapol® X-080, Hoechst AG, Frankfurt, Alemanha, e polidocenol) tiveram um efeito relativamente menor, ao passo que os primeiros três alteraram por completo a reatividade de gram e diminuíram a viabilidade.
2. Um grupo de detergentes líticos mais brandos (de 7 a 10), que solubilizou células sanguíneas com eficácia dentro do período de lise de 60 segundos e não alteraram a reatividade de Gram ou a viabilidade do isolado de S. pneumoniae.
3. Um grupo de detergentes (11 e 12) que também não alterou a reatividade de Gram ou a viabilidade do isolado de S. penumoniae, mas teve menor atividade lítica.
Tabela 4: Efeito dos tipos de detergente na reatividade de
Gram e na viabilidade da S. pneumoniae
No Detergente Fórmula ou Classe Linhagem Gram do Precipitado Viabilida-de do precipitado
Bactérias (cocos) Resíduos
1 n-octil glicosídeo a 3,0% Alquil glicosídeo Sem percepção de organismos 3+ Sem crescimento
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No Detergente Fórmula ou Classe Linhagem Gram do Precipitado Viabilida-de do precipitado
Bactérias (cocos) Resíduos
2 CHAPS a 3,0% À semelhança do ácido biliar Gram negativo raro 3+ Crescimento restrito
3 Triton X100-R a 0,45% Éter PEO Gram negativo 2+ 2+ 2+
4 Igepal CA-630 a 0,45% Éter PEO Gram positivo 2+ e gram negativo 2+ 1 + 3+
5 Genapor X-080 a 0,45% C13E8 Gram positivo 4+ e gram negativo 1+ 1 + 3+
6 Polidocenol a 0,45% C12E9 Gram positivo 4+ e gram negativo +/- <1 + 4+
7 Genapol® C-100 a 0,45% C12E10 Gram positivo 3+ 1 + 3+
8 Genapol® X-100 a 0,45% C13E10 Gram positivo 3+ 1 + 4+
9 Brij® 96V a 0,45% C18E10 Gram positivo 3+ 1 + 3+
10 Brij® 97 a 0,45% C18E10 Gram positivo 3+ 1 + 4+
11 Arlasolve 200 a 1,5% Isoceteth-20 Gram positivo 3+ 2+ 3+
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No Detergente Fórmula ou Classe Linhagem Gram do Precipitado Viabilida-de do precipitado
Bactérias (cocos) Resíduos
12 a Brij® 98 a 1,5% C18E20 Gram positivo 3+ 1 + 3+
a Necessária uma etapa de lise de 5 min para a solubilização total das células sanguíneas.
[116] O efeito dos detergentes de teste no que se refere aos fluoróforos intrínsecos presentes no precipitado celular de S. penumoniae é apresentado na Tabela 5. Conforme demonstram os resultados apresentados no Exemplo 3, a razão de fluorescência da Flavina para o NADH é um ótimo indicador da saúde deste micróbio sensitivo. Razões baixas estão diretamente ligadas à menor viabilidade microbiana, tal como observado nos detergentes de n-octil-glicosídeo e CHAPS. Os quatro grupos representados na Tabela 5 podem ser divididos em categorias diretamente ligadas às alterações observadas na reatividade de Gram das células de S. pneumoniae recuperadas do precipitado (Tabela 4). Os dados demonstram que os detergentes 7, 8, 9 10 e 12 apresentam uma melhora significativa no marcador substituto de Flavina/NADH para a viabilidade.
[117] Curiosamente, esses cinco detergentes são todos da classe do polioxietileno. Para nossa surpresa, dos quatro detergentes mais brandos que solubilizaram as células sanguíneas prontamente (de 7 a 10), que têm níveis de fluoróforos intrínsecos ideais que sugerem uma viabilidade inalterada e têm uma reatividade de Gram esperada, todos compartilham uma natureza química comum. Cada um tem um grupo cabeça hidrófilo de polioxietileno com um comprimento de cadeia médio de 10 (E) e comprimentos de cadeia de hidrocarbonetos médios de 12 a 18 (C).
[118] Propomos que este grupo específico de detergentes represente candidatos excelentes para inclusão em tampões de lises projetados para solubilizar seletivamente células sanguíneas de
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59/73 mamíferos ao mesmo tempo em que se mantém a viabilidade de microorganismos próximos.
Tabela 5: Efeito dos tipos de detergente no que se refere aos fluoróforos intrínsecos da S. pneumoniae
No Detergente Fórmula ou classe Triptofano NADH Flavina NADH/ Flavina
1 n-octil glicosídeo a 3,0% Alquil glicosídeo 606.171 33.268 71.678 0,5
2 CHAPS a 3,0% À semelhança do ácido biliar 607.343 55.976 77.403 0,7
3 Triton X-100-R a 0,45% Éter PEG 895.915 593.178 48.262 12,3
4 Igepal CA-630 a 0,45% Éter PEG 1.019.649 1.300.81 5 38.703 33,6
5 Genapor® X- 080 a 0,45% C13E8 985.085 1.469.24 0 36.361 40,4
6 Polidocenol a 0,45% C12E9 825.892 1.295.95 6 37.611 34,5
7 Genapol® C- 100 a 0,45% C12E10 974.429 1.571.41 6 26.537 59,2
8 Genapol® X- 100 a 0,45% C13E10 926.102 1.604.78 9 28.109 57,1
9 Brij® 96V a 0,45% C18-1E10 1.075.022 1.235.05 1 23.306 53,0
10 Brij® 97 a 0,45% C18E10 1.054.839 1.310.61 2 25.383 51,6
11 Arlasolve 200 a 1,5% Isoceteth-20 1.079.990 1.178.95 4 37.115 31,8
12 Brij® 98 a 1,5% C18E20 1.047.866 1.703.22 1 29.781 57,2
[119] Um modelo de filtragem foi desenvolvido para permitir testar a sensibilidade de um maior número de isolados microbianos para vários detergentes. Em suma, suspensões de micro-organismos de teste bastante fastidiosos foram inseridas em meios de cultura BacT/ALERT® SA contendo sangue a 103 a 105 CFU/ml. As amostras foram tratadas com
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Tampões de Lise de teste por 1 a 5 minutos a 37° C e, então, se necessário, diluídas a 1:100 no TSB e revestidas para contagens viáveis.
[120] Um resumo da contagem das colônias, dado na Tabela 6, demonstra que o Brij® 97 demonstrou uma toxicidade mínima; contudo, as condições alcalinas do tampão de CAPS sozinho rapidamente exterminaram a N. meningitidis, a H. influenzae e a A. actinomycetemcomitans. O Genapol® C-100 teve atividade semelhante à do Brij® 97, mas foi levemente tóxico quanto à H. parainfluenzae e à C. hominis neste modelo. Em um experimento posterior, a viabilidade da S. pneumoniae, S. pyogenes, S. agalactiae, S. mitis, P. mirabilis, K. pneumoniae e E. coli permaneceu inafetada após 5 minutos de contato com o Brij® 97 e o Genapol® C-100 (dados não apresentados).
Tabela 6: Contagens viáveis de organismos fastidiosos após tratamento com tampão de lise
Micro-organismo Água Tampão de CAPS Brij® 97 Genapol® C100
1 min 1 min 5 min 1 min 5 min 1 min 5 min
S.pneumoniae WM43 37 39 38 18 7 30 19
S.pneumoniae WM48 19 29 17 14 11 17 12
N. meningitidis 249 2 0 0 0 0 0
H. influenzae > 200 1 0 0 0 0 0
A. actinomycetecomitans > 200 0 0 0 0 0 0
H. parainfluenzae 183 117 6 124 19 0 0
C. hominis 50 92 91 74 28 0 0
[121] Muitos tampões de lise, particularmente os usados em métodos moleculares, contêm agentes quelantes como o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para ajudar na etapa de solubilização. Avaliamos o impacto do acréscimo de EDTA à base do tampão de lise TX100CAPS usando um grupo de micro-organismos gram-negativos e grampositivos. A Tabela 7 demonstra o rápido efeito tóxico do EDTA na P. aeruginosa e na A. baumanii, mas não em outros bastonetes gram-negativos,
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61/73 na B. cepacia e na K. pneumoniae, ou na S. aureus gram-positiva. Pode-se observar que, enquanto o EDTA foi inibitório à P. aeruginosa e à A. baumanii, as mudanças em fluoróforos intrínsecos importantes foi bastante diferente entre essas espécies. A P. aeruginosa foi o único organismo testado que teve uma queda significativa na fluorescência tanto do NADH quanto do triptofano após o tratamento com EDTA.
[122] Esses experimentos representam um bom exemplo de como certos compostos ou identificadores podem ser acrescentados ao tampão de lise para alterar rapidamente o perfil básico de fluorescência microbiana intrínseca de um micro-organismo específico e traz a oportunidade de melhorar a identificação e novas caracterizações do isolado. Conforme os versados na técnica perceberão prontamente, a sensibilidade de um micro-organismos específico a qualquer composto que afete seu estado físico ou metabolismo pode ser rapidamente determinada acrescentando-se o composto à amostra, ao tampão de lise, à camada de densidade ou a qualquer mistura desses. De maneira semelhante, alterações às condições de lise ou à formulação do tampão de lise seletivo (por exemplo, o pH do tampão, o tipo do detergente e sua concentração) podem produzir mudanças características na fluorescência microbiana intrínseca, conforme exemplificado nas Figs. 2A e 2B. (Vide, pode exemplo, o pedido de patente dos Estados Unidos de cessão comum de no de série _, intitulado “Método para a separação e a caracterização de micro-organismos por agentes identificadores”, depositado no dia 30 de outubro de 2009 e que se encontra anexado ao presente documento para fins de referência.
Tabela 7: EDTA no tampão de lise como “agente identificador” da P. aeruginosa
No Micro-organismo + 20 mM de EDTA Triptofano NADH Flavina NADH/ Flavina
1 P. aeruginosa Não 2.266.444 4.483.691 62.491 72
2 P. aeruginosa Sim 802.291 132.304 29.964 4
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3 A. baumanii Não 1.274.164 2.157.065 47.163 46
4 A. baumanii Sim 1.204.811 207.628 120.395 2
5 B. cepacia Não 2.199.711 2.577.516 42.135 61
6 B. cepacia Sim 1.945.836 1.639.781 48.185 34
7 K. pneumoniae Não 2.770.779 2.691.451 151.112 18
8 K. pneumoniae Sim 2.840.377 3.326.047 126.217 26
9 S. aureus Não 1.422.810 6.173.521 80.550 77
10 S. aureus Sim 1.279.566 5.396.721 93.038 58
EXEMPLO 7. Desenvolvimento de tampões de separação com base na densidade [123] O propósito dos tampões de separação, também conhecidos como camadas de densidade, foi o de separar e dividir metabolicamente com confiabilidade micro-organismos ativos a partir de componentes sanguíneos e meios de cultura submetidos a lise dentro de alguns minutos. O material de camada foi selecionado para ter uma densidade entre a dos micro-organismos intactos e a da amostra do caldo de cultura sanguínea positiva submetido a lise. A separação foi realizada por força centrífuga.
[124] Determinamos inicialmente (Exemplos 1 e 2) que a sílica coloidal possui propriedades satisfatórias para isolar rapidamente micro-organismos do sangue altamente fluorescente e de componentes de meio encontrados no caldo de cultura sanguínea positiva. No entanto, algumas espécies microbianas, tal como a S. pneumoniae, não sedimentaram de maneira satisfatória por meio da sílica coloidal na densidade necessária para formar uma barreira fásica eficaz entre micro-organismos sedimentados e o sangue e componentes contagiosos do meio. Sendo assim, realizamos uma pesquisa buscando camadas de densidade de maior eficácia.
[125] Vários compostos foram filtrados para inclusão em um tampão de separação. Os compostos preferidos para a camada de densidade têm as seguintes características:
1. Baixa viscosidade para permitirem a rápida sedimentação de micro-organismos através da camada
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2. Baixa fluorescência para minimizarem a interferência com a fluorescência intrínseca derivada de micróbios
3. De preferência, serem opticamente claros ao longo dos comprimentos de onda de luz quando interrogados
4. Não serem tóxicos a micro-organismos
5. Serem baratos e prontamente disponíveis
6. Serem amplamente aplicáveis em uma ampla gama de bactérias e amostras
Tabela 8: Lista de compostos testados para a camada de densidade
Composto Nomes comerciais/Comentário Concentração útil Concentração preferível
Sílica coloidal Percoll®, Percoll Plus®, Isolate® 15 a 80% do material 20 a 65% do material
Ioexol Omnipaque®, NycoPrep®, Nycodenz® 10 a 30% em p/v 12 a 22% em p/v
MetrizoatoFicoll LymphoPrep® 70 a 100% do material 75 a 90% do material
DiatrizoatoDextrano PolymorphoPrep® 20 a 60% do material 30 a 50% do material
Cloreto de césio 10 a 30% em p/v 15 a 25% em p/v
Sacarose 10 a 30% em p/v 15 a 20 em p/v
Álcool polivinílico Tipo 4 a 88 10 a 20% em p/v 12 a 18% em p/v
Ficoll 400 5 a 13% em p/v 10 a 12% em p/v
Dextrano 70 5 a 12% em p/v 10 a 12% em p/v
Iodixanol Visipaque®, Opti-Prep® propriedades semelhantes às do ioexol
Fluido de perfluorocarbo neto Útil como leito de fluido de alta densidade
Óleos minerais Podem ser misturados a óleos mais densos
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Óleos de silicone Podem ser misturados a óleos mais densos
Óleos de imersão em microscópio Tipo DF = baixa fluorescência e alta densidade
Pluronic F127 Agente gelificante sensível à temperatura
Óxido de polietileno
Hidroxipropilm etil celulose
Goma Xantana
[126] Compostos de densidade potenciais foram filtrados usando-se caldos de cultura sanguínea positiva contendo S. pneumoniae (um micro-organismo capsulado de baixa densidade), E. coli (um micro-organismo de média densidade) e S. aureus (um micro-organismo de alta densidade). As amostras do caldo foram submetidas a lise de acordo com as condições descritas no Exemplo 6 misturando-se parte do tampão de lise (Triton X100-R a 0,45% + 0,3M de CAPS a um pH de 11,7) a duas partes da amostra e incubando por 1 minuto em banho-maria a 37 °C. Em seguida, despejamos com cuidado 0,7 ml do lisado sobre 0,5 ml da camada de densidade de teste em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Os tubos foram girados por 2 minutos a cerca de 10.000 g e os resultados da separação registrados. Observamos uma ótima separação nos casos em que havia um precipitado microbiano sólido sedimentado na base de duas camadas líquidas distintas sem nenhuma contaminação visual de hemoglobinas presente na camada inferior.
[127] Os ótimos resultados da separação foram obtidos usando-se sílica coloidal, ioexol, cloreto de césio, LymphoPrep® e PolymorphoPrep® como a camada de densidade. Obtivemos resultados satisfatórios com dextrose T80, Ficoll 400, sacarose e álcool polivinílico. Espera-se que o iodixanol tenha propriedades semelhantes às do ioexol. Também descobrimos que o ato de tornar as camadas de densidade
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65/73 hiperosmóticas, por exemplo, pelo acréscimo de cloreto de sódio, melhora a sedimentação de micro-organismos de baixa densidade como o S. pneumoniae e o K. pneumoniae.
[128] Foram realizados outros testes com ioexol a 14% em p/v, cloreto de césio a 18% em p/v e material de PolymorphoPrep® a 30% junto com tampões de lise preparados com Triton X100-R, Polidocenol, Brij® 97, Genapol® C-100 e Genapol® X-100 usando-se um caldo positivo contendo uma linhagem sensível à linhagem S. pneumoniae, WM43. A combinação de cinco tampões de lise e quatro camadas de densidade proporcionou a ótima separação esperada. Os resultados para as camadas de densidade de ioexol e cloreto de césio são apresentados na Figura 3. Conforme discutido em mais detalhes no Exemplo 6, a viabilidade das células de S. pneumoniae recuperadas não foi tão alta com tampões contendo Triton X100-R e polidocenol, independentemente da composição da camada de densidade.
EXEMPLO 8. Avaliação de vários tampões de lise e camadas de densidade [129] Para determinar a ampla aplicabilidade do conceito da presente invenção, comparamos a eficácia de duas fórmulas de tampão de lise seletivo e duas fórmulas de camada de densidade usando um estudo de cultura sanguínea semeada para desenvolver um mini-modelo de classificação. Os micro-organismos usados no modelo foram K. pneumoniae, K. oxytoca, S. aureus, S. epidermidis, C. tropicalis e S. pneumoniae (6 linhagens de cada) Testamos as combinações de tampões de lise e camadas de densidade a seguir:
Conjunto A = tampão de lise Brij® 97 + camada de CsCl a 24% contendo Pluronic F-108
Conjunto B = tampão de lise Genapol® 97 + camada de CsCl a 24% contendo Pluronic F-108
Conjunto C = tampão de lise Brij® 97 + camada de ioexol a 14% contendo Pluronic F-108
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66/73
Conjunto D = tampão de lise Brij® 97 + camada de CsCl a 24% (sem Pluronic F-108) [130] Amostras de caldo positivo foram tratadas de acordo com cada uma das quatro condições descritas abaixo:
1. Uma amostra de 2,0 ml de caldo positivo foi misturada a 1,0 ml de tampão de lise seletivo e, então, submetida a banho-maria a 37° C por 1 minuto.
2. Uma amostra de 1,0 ml de lisado foi disposta sobre 0,5 ml de camada de densidade contido em um tubo de separação óptica feito sob medida. Uma esfera de polipropileno se fez presente na superfície da camada de densidade para facilitar o carregamento sem perturbar as duas fases aquosas.
3. O tubo de separação óptica foi fechado com uma tampa roscada e centrifugado por 2 minutos a 10.000 rpm (centrífuga Eppendorf® 5417R munida de um rotor horizontal A-8-11, Eppendorf, Nova Iorque; Figura 4).
4. O tubo vedado foi então transferido a um adaptador feito sob medida que acoplou a base do tubo diretamente a uma sonda de fibra óptica de 300 mícrons conectada a um espectrofluorômetro (Fluorolog® 3 da HORIBA Jobin Yvon Inc., Nova Jersey).
5. Uma varredura de EEM total foi realizada usando-se a configuração de detector CCD (Ex 260 a 850 nm, a cada 5 nm; Em 260 a 1.100 nm)
6. Os dados de EEM foram exportados para o Excel e um mini-modelo de classificação construído para cada conjunto de reagentes usando a Análise Discriminante Generalizada (Statistica).
[131] Os resultados da separação foram equivalentes em todos os quatro conjuntos de reagentes, com uma exceção. O conjunto D, que não continha o surfactante brando Pluronic F-108 na camada de densidade, reduziu significativamente biomassa de várias linhagens de C.
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67/73 tropicalis devido à forte aderência desses organismos à parede lateral do tubo de separação. Esse fenômeno também ocorreu quando do uso da camada de ioexol (dados não apresentados). A análise posterior dos dados demonstrou que, embora a presença de um surfactante brando na camada de densidade seja preferível, ela não é essencial. Na verdade, os resultados da GDA de todas as quatro combinações de reagentes revelaram um desempenho de classificação satisfatório (Tabela 9). Qualquer diferença entre os quatro conjuntos de reagentes foi relativamente mínima. As classificações errôneas mais comuns ocorreram entre duas espécies bem próximas no conjunto, K. pneumoniae e K. oxytoca.
Tabela 9
Detergente de tampão de lise Camada de densidade Porcentagem correta no que se refere à espécie
A. Brij® 97 Cloreto de césio > 90%
B. Genapol® C-100 Cloreto de césio > 90%
C. Brij® 97 Ioexol > 90%
D. Brij® 97 Cloreto de césio (sem F108) > 90%
[132] Uma das possíveis desvantagens da camada de
densidade contendo ioexol em relação à bolsa contendo cloreto de césio são as fortes propriedades adsorvivas do ioexol, um agente de contraste usado para fins médicos, que resultam na inibição significativa da fluorescência a comprimentos de onda de estímulo abaixo de cerca de 380 nm. Contudo, para nossa surpresa, a diferenciação analítica do K. pneumoniae e do K. oxytoca melhorou quando a camada de ioexol foi usada, sugerindo que a inibição parcial dos fluoróforos mais proeminentes, como o NADH e o triptofano, pode descobrir diferenças em fluoróforos de baixo nível celular com diferentes propriedades de inibição.
[133] Os tampões de lise contendo Brij® 97 e Genapol® C-100 apresentaram resultados de classificação semelhantes para esse grupo limitado de micro-organismos. As camadas de densidade de cloreto de césio e
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68/73 ioexol também tiveram desempenho parecido. Para nossa surpresa, o ioexol pode ser usado para ajudar seletivamente na diferenciação de algumas espécies microbianas.
EXEMPLO 9. Método aprimorado para a rápida identificação de isolados de cultura por fluorescência intrínseca [134] O auge dos avanços feitos no projeto e na validação dos tubos de separação óptica e das plataformas ópticas relacionadas, a capacidade de classificação aprimorada da interrogação na face frontal de precipitados microbianos e a otimização de tampões de lise seletivos rápidos e de uma etapa de separação com base na densidade resultaram em um novo método com potencial para identificar microorganismos em alguns minutos a partir de amostras complexas como o caldo de cultura sanguínea.
[135] O método possui vantagens na simplicidade e segurança já que as etapas de separação e leitura ocorrem dentro de um dispositivo fechado. Para estabelecer melhor a utilidade deste método, construímos um banco de dados de 373 linhagens de micro-organismos representando as 29 espécies mais prevalentes que causam a sepsia. Esses organismos foram “semeados” em um inóculo baixo dentro de frascos BacT/ALERT® SA contendo 10 ml de sangue humano. Amostras de caldo de cultura sanguínea foram removidas dos frascos dentro de alguns minutos após serem sinalizadas como positivas pelo Sistema de Detecção Microbiana BacT/ALERT® 3D. As amostras foram tratadas conforme o seguinte:
1. Uma amostra de 2,0 ml de caldo positivo foi misturada a 1,0 ml de tampão de lise seletivo (Brij® 97 a 0,45% em p/v + 0,3 M de CAPS a um pH de 11,7) e, então, submetida a banho-maria a 37° C por 1 minuto.
2. Uma amostra de 1,0 ml de lisado foi disposta sobre 0,5 ml de camada de densidade (cloreto de césio a 24% em p/v em 10 mM de Hepes a um pH de 7,4 + Pluronic F-108 a 0,005%) contido em um tubo de separação óptica feito sob medida. Uma esfera de polipropileno se fez presente
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69/73 na superfície da camada de densidade para facilitar o carregamento sem perturbar as duas fases aquosas.
3. O tubo de separação óptica foi fechado com uma tampa roscada e centrifugado por 2 minutos a 10.000 rpm (centrífuga Eppendorf® 5417R munida de um rotor horizontal A-8-11, Eppendorf, Nova Iorque; Figura 4).
4. O tubo vedado foi então transferido a um adaptador feito sob medida que acoplou a base do tubo diretamente a uma sonda de fibra óptica de 300 mícrons conectada a um espectrofluorômetro (Fluorolog® 3 da HORIBA Jobin Yvon Inc., Nova Jersey).
5. Uma varredura de EEM total do precipitado microbiano purificado foi realizada usando-se a configuração de detector CCD (Ex 260 a 850 nm, a cada 5 nm; Em 260 a 1.100 nm)
6. Os dados EEM foram exportados para o Excel.
7. Todo o processo, que levou menos de 20 minutos desde a sinalização do frasco, foi repetido usando o caldo positivo que fora armazenado de 2 a 8° C por 4 a 5 horas. O caldo armazenado foi aquecido por 5 minutos antes do processo.
[136] Algumas amostras representativas dos espectros EEM de precipitados microbianos isolados do caldo de cultura sanguínea positiva são apresentadas nas Figuras de 5 a 8. As diferenças são visualmente evidentes entre as espécies apresentadas, tanto na grandeza quanto nos formatos dos vários fluoróforos celulares presentes.
[137] Os dados foram analisados por vários métodos de análise multivariada com o intuito de construir um banco de dados de classificação microbiana. Cada arquivo de varredura conteve mais de 9.000 leituras de fluorescência individual de modo que várias abordagens foram usadas para minimizar e normalizar os dados antes da análise. Por exemplo, a Tabela 10 apresenta alguns resultados preliminares usando uma ferramenta de Análise Discriminante Generalizada (Statistica). Outras variáveis de entrada, tal
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70/73 como taxas de Tempo-para-Detecção e de desenvolvimento obtidas pelo Sistema de Detecção Microbiana BacT/ALERT®, e a quantidade de biomassa presente no precipitado celular, podem ser usadas para ajudar na identificação e/ou caracterização do isolado que causa a sepsia (vide Exemplo 10).
[138] Embora os dados da Tabela 10 apresentem resultados de identificação quanto à espécie, qualquer nível de agrupamento que proporcione ao médico encarregado informações clinicamente relevantes pode ser apresentado. Um exemplo disso seriam os grupos “terapêuticos”, em que as espécies microbianas são agrupadas de acordo com os antibióticos usados para tratá-las.
[139] O método descrito na presente invenção satisfaz a necessidade urgente de se identificar com rapidez micro-organismos a partir de um frasco de cultura sanguínea positiva de maneira segura e confiável. Os resultados exemplificados na Tabela 10 se equiparam aos de outros métodos de identificação que contam com características de cultivo ou moleculares dos micro-organismos, mas sem o longo tempo de espera ou os grandes gastos inerentes. Ademais, o método pode ser totalmente automatizado de modo que o resultado da identificação possa ser enviado diretamente ao médio por um dispositivo eletrônico a qualquer hora do dia ou da noite.
[140] O método da presente invenção também é compatível com várias técnicas diagnósticas devido às seções de separação e leitura embutidas do dispositivo descartável feito sob medida com microorganismos intactos representando a “fase sólida” (Figura 4). Exemplos de testes complementares em desenvolvimento usando o conceito da presente invenção incluem, entre outros, medição de enzimas microbianas, marcadores de superfícies celulares, sondas de ácido nucléico e inibidores do metabolismo microbiano. O método é passível de automatização e miniaturização. Esse potencial é descrito em detalhes no pedido de patente copendente dos Estados Unidos de no de série _, intitulado “Método para a separação e caracterização de micro-organismos por agentes identificadores”, depositado no dia 30 de
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71/73 outubro de 2009 e que se encontra anexado ao presente documento para fins de referência.
Tabela 10: Método de rápida identificação microbiana [141] Banco de dados construído com dados de amostras frescas e armazenadas combinados (746 varreduras; 373 linhagens; 29 espécies) [142] Resultados de validação cruzada deixando um de fora somente de amostras frescas
Melhor Escolha a Baixa discrim. Dentro dos dois melhores Classificada erroneamente como:
C.albicans 10/10 10/10 10/10
C. tropicalis 11/11 11/11 11/11
C. parapsilosis 11/11 11/11 11/11
C. krusei 12/12 12/12 12/12
C. glabrata 10/10 10/10 10/10
Todas as leveduras: 54/54 54/54 54/54
Porcentagem correta: 100,0 100,0 100,0
S. aureus *29/30 *29/30 30/30 * S. epidermidis
S. epidermidis 23/23 23/23 23/23
S.mitis 10/10 10/10 10/10
S. pneumoniae *9/10 *9/10 10/10 * S. mitis
S. pyogenes 11/11 11/11 11/11
S. agalactiae 10/10 10/10 10/10
E. faecalis 14/14 14/14 14/14
E. faecium *12/13 *12/13 12/13 * S. mitis
Todos os GPC: 118/121 118/121 120/121
Porcentagem correta: 97,5 97,5 99,2
A. baumanii 10/10 10/10 10/10
P. aeruginosa 20/20 20/20 20/20
S. maltophilia 9/9 9/9 9/9
Todos os GNNF: 39/39 39/39 39/39
Porcentagem correta: 100,0 100,0 100,0
H. influenzae 12/12 12/12 12/12
N. meningitidis *11/12 11/12 11/12 * P. aeruginosa
Todos os 23/24 23/24 23/24
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72/73
Melhor Escolha a Baixa discrim. Dentro dos dois melhores Classificada erroneamente como:
fastidiosos:
Porcentagem correta: 95,8 95,8 95,8
E. aerogenes *8/10 10/10 10/10 * E. cloacae e K. pneumoniae
E. cloacaeCpx *8/10 9/10 9/10 * E. aerogenes (2)
C. freundii 10/10 10/10 10/10
E.coli *23/24 23/24 23/24 * K. oxytoca
S. enteritidis 11/11 11/11 11/11
K. oxytoca *11/12 11/12 11/12 * K. pneumoniae
K. pneumoniae *13/16 13/16 15/16 * K. oxytoca e E. aerogenes (2)
S. marcescens 9/9 9/9 9/9
M. morganii 11/11 11/11 11/11
P. mirabilis *8/11 8/11 10/11 * P. vulgaris (3)
P. vulgaris 11/11 11/11 11/11
Todos os GNR: 123/135 126/135 130/135
Porcentagem correta: 91.1 93.3 96.3
Todas as 29 espécies 357/373 360/373 366/373
n = 373 linhagens 95,7 96,5 98,1
a = dentro das 2 me hores esco has e com uma
probabilidade posterior superior a 0,10
EXEMPLO 10. Medidas não-espectroscópicas para ajudar na caracterização e/ou identificação de micro-organismos [143] Medidas não-espectroscópicas como o tempo de detecção e as taxas de desenvolvimento microbiano obtidas pelos algoritmos do sistema de detecção, e o tamanho, formato, cor e densidade do precipitado microbiano isolado podem ser usados como variáveis adicionais para a caracterização e/ou identificação de um micro-organismo.
[144] Os exemplos dados nas Figs. 9 e 10 demonstram que a medição do tamanho dos precipitados, do tempo de detecção e da fluorescência intrínseca média pode ser usada para ajudar na diferenciação ou
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73/73 para confirmar a identificação de duas espécies relativamente parecidas, a S. pneumoniae e a S. mitis. Cada símbolo representa um isolado clínico separado recuperado do caldo de cultura sanguínea positivo pelo método da presente invenção. O isolado de S. pneumoniae circulado nas Figs. 9 e 10 foi identificado incorretamente como S. mitis nos resultados preliminares dados na Tabela 10 (Exemplo 9).
[145] O supramencionado exemplifica a presente invenção e não deve ser interpretado de modo a limitá-la. A invenção é definida pelas reivindicações a seguir, incluindo seus equivalentes. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, publicações de patente e qualquer outra referência citada no presente documento encontram-se anexadas na íntegra para fins de referência a ensinamentos relevantes à oração e/ou parágrafo em que a referência foi apresentada.

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para identificação de um micro-organismo desconhecido a partir de uma amostra de teste, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) fornecer uma amostra de teste que contenha ou acredite-se conter um micro-organismo desconhecido;
    (b) submeter seletivamente à lise as células de não-microorganismos da referida amostra de teste a fim de produzir uma amostra submetida a lise;
    (c) dispor a referida amostra submetida à lise sobre uma camada de densidade dentro de um recipiente; em que a referida camada de densidade possui uma densidade homogênea de 1,025 a 1,120 g/ml;
    (d) centrifugar o referido recipiente para separar o referido micro-organismo desconhecido de outros componente da referida amostra submetida à lise, referido micro-organismo desconhecido passando através da referida camada de densidade para formar um precipitado de micro-organismo no fundo do referido recipiente;
    (e) interrogar espectroscopicamente os referidos precipitados in situ para produzir uma matriz de estímulo-emissão (EEM) do referido micro-organismo desconhecido, em que a referida interrogação espectroscópica compreende fluorescência intrínseca e em que a referida fluorescência intrínseca é medida em modo na face frontal; e (f) Identificar o referido micro-organismo desconhecido no referido precipitado comparando-se as medidas espectroscópicas com medidas espectroscópicas realizadas, ou propriedades espectroscópicas prognosticadas, de micro-organismos desconhecidos, em que o referido micro-organismo
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  2. 2/3 desconhecido é identificado ao nível de família, nível de gênero, nível de espécie e/ou nível de linhagem.
    2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de teste é uma cultura sanguínea.
  3. 3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as etapas (d) e (e) são realizadas em um recipiente fechado e em que a referida etapa de interrogação (e) não é invasiva.
  4. 4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a referida interrogação espectroscópica compreende adicionalmente espectroscopia selecionada a partir do grupo consistindo em espectroscopia de fluorescência, espectroscopia de refletância difusa, espectroscopia de infravermelho, espectroscopia por terahertz, espectroscopia Raman e qualquer combinação das mesmas.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida EEM é comparada com uma base de dados de EEMs de micro-oganismos conhecidos.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida identificação compreende adicionalmente a caracterização do referido micro-organismo com base em uma ou mais características fenotípicas e/ou morfológicas ou com base em uma ou mais medidas de tempo de detecção, taxa de desenvolvimento e tamanho, forma, cor e/ou densidade de precipitado de micro-organismo.
  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida etapa (b) de lise seletiva é realizada usando sonicação, choque osmótico, tratamento químico, usando uma solução de lise compreendendo um ou mais detergentes ou mais combinação dos mesmos.
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    3/3
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os referidos um ou mais detergentes são escolhidos dentre o grupo composto por Triton® X-100, Triton® X-100-R, Triton® X114, NP-40, Genapol® C-100, Genapol® X-100, Igepal® CA 630, Arlasolve™ 200, Brij® 96/97, CHAPS, octil β-D-glicopiranosídeo, saponina, nonaetileno glicol monododecil éter (C12E9, polidocenol), sulfato de sódio dodecil, N-laurilsarcosina, desoxicolato de sódio, sais biliares, brometo de hexadeciltrimetilamônio, SB3-10, SB3-12, amidossulfobetaína-14, C7BzO, Brij® 98, Brij® 58, Brij® 35, Tween® 80, Tween® 20, Pluronic® L64, Pluronic® P84, sulfobetaínas não-detergentes (NDSB 201), anfipóis (PMAL-C8), um detergente de polioxietileno compreendendo a estrutura C12-18/E9-10 ou e metil-p-ciclodextrina.
  9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a solução de lise compreende adicionalmente uma ou mais enzimas, referidas uma ou mais enzimas compreendendo uma mistura de uma ou mais proteinases e uma ou mais nucleases e/ou um ou mais agentes de tampão.
  10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida camada de densidade compreende um ou mais dentre sílica coloidal, agentes de contraste iodados, sacarose, óleo de imersão em microscopia, óleo mineral, óleo de silicone, óleo de fluorossilicone, gel de silicone, metrizoato-Ficoll®, diatrizoato-dextrano, carboximetil celulose, hidroxipropilmetil celulose, óxido de polietileno (peso molecular elevado), Pruronic® F127, Pluronic® F68, ácido poliacrílico, álcool polivinílico reticulado, pirrolidina polivinílica reticulada, metil éter metacrilato de PEG, pectina, agarose, xantana, gelana, Phytagel®, sorbitol, Ficoll®, glicerol, dextrano, glicogênio, cloreto de césio, fluidos de perfluorocarbono e/ou fluido de hidrofluorocarbono.
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