CN109060674A - 微生物识别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，为了解决目前的微生物识别不够简单精确的问题，本发明公开了一种微生物识别方法，包括如下步骤：采集国际标准菌株，将所述的国际标准菌株经涂片和固定染色后得到菌株待测样，采集所述的菌株待测样的分子高光谱数据，获取所述的菌株待测样的指纹光谱，建立细菌和分子高光谱数据库，将所述的细菌和分子高光谱数据库用于微生物的识别。本发明为生物识别方法具有简单、快捷、精确的优点。

Description

微生物识别方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种微生物识别方法。
背景技术
本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的内容，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。
微生物的识别对人类健康和生活水平具有重要意义，而随着科学的发展和人们对生活质量要求的不断提高，对微生物识别的精准度和简便程度有着越来越高的要求。
发明内容
本发明实施例的目的是提供一种微生物的识别方法，本发明实施例提供的微生物的识别方法具有快捷、简单、精确的优点。
本发明实施例的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明实施例提供了一种微生物识别方法，包括如下步骤；
采集国际标准菌株，将所述的国际标准菌株经涂片和固定染色后得到菌株待测样，采集所述的菌株待测样的分子高光谱数据，获取所述的菌株待测样的指纹光谱，建立细菌和分子高光谱数据库，将所述的细菌和分子高光谱数据库用于微生物的识别。
进一步的，所述的获取所述的菌株待测样的指纹光谱为：寻找并标记所述的菌株待测样的高光谱微生物特征光谱片段作为指纹光谱和识别靶点。
进一步的，所述的国际标准菌株包括：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的标准株、临床株和自然株。
进一步的，所述的涂片包括如下步骤：
将生理盐水滴在所述的载玻片上，采用灭菌的接种环将所述的国际标准菌株与所述的载玻片上的生理盐水混匀，涂层，风干。
进一步的，所述的固定染色采用革兰氏蓝色，包括如下步骤：
采用草酸铵结晶紫浸泡组织初染后用水冲洗至无色；
加碘液浸泡组织进行媒染后用水冲洗至无色；
加脱水剂脱色后用水冲洗至无色；
加番红液复染后用水冲洗至无色。
进一步的，所述的分子高光谱数据的采集包括如下步骤：
设置采集参数，判断样本是否采集完；
若是，则移动载物台到空白区域，采集空白高光谱图像数据，采集结束；
若否，则移动载物台选取目标，彩色图像采集，高光谱图像数据采集后判断样本是否采集完。
进一步的，所述的用于微生物的识别为用于空气、水、白色家电、医院院感、城市环境监测、医疗、血制品设备中的微生物识别。
进一步的，所述的细菌和分子高光谱数据库用于微生物的识别包括如下步骤：
根据单种纯化的菌株的不同致病能力得到单一光谱图像及数字资料，通过人工和G-SA-SVM、KMNF、CSS-LSSVM三种分割方法和PSO-ELM-BP一种优化分类方法进行图像降维、预处理、分割、分类区分；
采集混合细菌的片子，根据混合菌的片子进行分割，得到各种的标准图像；
获取耐药株单一光谱图像及数字资料，对照所述的标准图像进行超光谱曲线的对比，分析，来确定超光谱在特定菌中的不同耐药的鉴别效果。
进一步的，所述的微生物识别方法采用深度学习AI完成。采用了基于粒子群优化的极限学习机(PSO-ELM-BP)优化分类算法。在该方法中，使用了极限学习机(ELM)来建立微生物区域识别模型，并在极限学习机的参数寻优中，使用了粒子群(PSO)优化算法来寻找ELM参数的更优解，提高了极限学习机的分类精度。
1、KMNF：基于核最小噪声分离(KMNF)的分割方法；
2、CSS-LSSVM算法：基于特征光谱监督的最小二乘支持向量机；是LS-SVM的优化。
3、G-SA-SVM：该方法以显微高光谱成像技术为基础,首先对采集的高光谱数据进行光谱维和空间维的空白校正处理,然后对数据进行特征自适应性Gamma校正,最后利用模拟退火优化参数的支持向量机算法(SA-SVM)进行识别处理,有效快速定位微生物。
由上述方案，本发明微生物识别方法至少具备如下有益效果；
本发明申请实施例采用细菌和高光谱识别技术相结合，使微生物识别的更加精确，为空气、水和特殊接触物体等的微生物识别提供了精确的定量检测方案，对于提高人类健康水平和人民生活质量具有重大意义。
附图说明
图1为本发明微生物识别方法实施例中数据采集流程图；
图2为本发明微生物识别方法实施例中.raw文件存储方式示意图：
图3为本发明微生物识别方法实施例中.hdr文件内容示意图；
图4为本发明微生物识别方法实施例中数据立方图；
图5为本发明微生物识别方法实施例中光路效果图；
图6为本发明微生物识别方法实施例中大肠埃希菌的HE涂片效果图；
图7为本发明微生物识别方法实施例中细菌分布效果图；
图8为本发明微生物识别方法实施例中大肠埃希菌高光谱图；
图9为本发明微生物识别方法实施例中基于特征光谱监督的三种分割分割方法流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的详细介绍，应当理解，附图和实施例是为了本领域技术人员更容易理解本发明的技术方案，而不能作为本发明保护范围的限定。
在下述介绍中，术语“第一”、“第二”仅为用于描述的目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。下述介绍提供了本发明的多个实施例，不同实施例之间可以替换或者合并组合，因此本发明也可认为包含所记载的相同和/或不同实施例的所有可能组合。因而，如果一个实施例包含特征A、B、C，另一个实施例包含特征B、D，那么本发明也应视为包括含有A、B、C、D的一个或多个所有其他可能的组合的实施例，尽管该实施例可能并未在以下内容中有明确的文字记载。
本发明实施例的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明实施例提供了一种微生物识别方法，其特征在于，包括如下步骤；
采集国际标准菌株，将所述的国际标准菌株经涂片和固定染色后得到菌株待测样，采集所述的菌株待测样的分子高光谱数据，获取所述的菌株待测样的指纹光谱，建立细菌和分子高光谱数据库，将所述的细菌和分子高光谱数据库用于微生物的识别。
进一步的，所述的获取所述的菌株待测样的指纹光谱为：寻找并标记所述的菌株待测样的高光谱微生物特征光谱片段作为指纹光谱。
进一步的，所述的国际标准菌株包括：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的标准株、临床株和自然株。
进一步的，所述的涂片包括如下步骤：
涂片：取出前一天分别接种在6个平板上的菌种。
(1)放片：打开酒精灯，将标记好的载玻片置于片板上相应的位置。
(2)用10ul移液枪取5ul生理盐水，轻轻滴于载玻片中央。
(3)灭菌：右手持接种环，将接种环于酒精灯外焰穿过，上下3次。自然冷却20s左右。
(4)接种环从平板上挑出少许菌，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。放置，自然风干。
进一步的，所述的固定染色包括如下步骤：手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动3～4次。
下一步：革兰染色：
(1)初染：加草酸铵结晶紫3ml，浸没组织，约10秒，用流水轻轻冲洗，至流水无色。
(2)媒染：加碘液3ml，浸没组织，约10秒，用流水轻轻冲洗，至流水无色。
(3)脱色：加脱水剂3ml，浸没组织，用流水轻轻冲洗，至标本及流水无色。
(4)复染：加番红液3ml，浸没组织，约10秒，用流水轻轻冲洗，至流水无色。
下一步：镜检：载玻片自然风干，干燥后，置显微镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
下一步：封片：将载玻片标本面朝上，放置于片板上，用移液枪取100ul中性树胶，滴在载玻片中央，轻放24*50盖玻片。
进一步的，所述的分子高光谱数据包括：各涂片细菌和背景区域---各种不同细菌的独立高光谱曲线
1、根据格兰染色、细菌大小级别先把这些细菌染色分离成G+和G-和真菌三类。
2、在以上单一菌株的涂片标样中，在一个视野里，全部细菌从背景(包括空白、空气、载玻片的性状)中分割出来的做一个平均光谱曲线，得到全区域的曲线的一个平均(不是特定区域，即涂片中的全部细菌)；显微高光谱成像系统多波段图像数据采集流程如图1所示。
图像采集时，首先将样本固定在载物台上，调节好合适光源，一次连续采集过程中光源强度保持不变，选择合适的放大倍数，打开图像采集软件。其次切换到显微镜视场通道，手动调节载物台找到目标视场；切换到彩色CCD通道，手动上下调节载物台到图像聚焦的位置，通过图像采集软件采集彩色图像数据；切换到灰度CCD通道，在预览的时候，手动上下调节载物台使目标区域聚焦后，设置图像采集软件采集参数(增益、曝光时间、采集波段数)，点击采集按钮自动采集。图像采集软件自动为每个视场生成.raw无损压缩文件格式的数据包和.hdr数据文件存储方式描述文件。最后采集完该样本的目标区域，移动载物台到样本的空白区域，保持目标区域相同的采集环境和参数，采集空白样本数据文件。
系统图像采集软件生成的文件中，.raw文件的图像数据按波段顺序存储(BSQ)，即将K张单波段图像数据连续存储，从低波段到高波段，每个波段按行到列顺序存储，在.raw文件中像元顺序为：
P1(1,1),L,P1(1,m),P2(2,1),L,P2(2,m),L,L,PK(n,1),L,PK(n,m)；
.raw文件存储方式如图2所示。
.hdr文件中列出采集时间、每行采样点数samples、行数lines、波段数bands等信息。.hdr文件内容如图3所示，由图2可知该样本的单行采样点数samples＝1800，行数lines＝1300，波段数bands＝60，在后续图像处理中主要用到这三个参数。
系统采用上述多光谱图像数据BSQ的存储方式的优势是：能根据.hdr文件中的描述信息简单快速地将每个波段对应的二维图像信息提取出来，从而快速定位到某波段的某个像素，方便后续针对波段做图像处理。在此基础上，利用MATLAB快速处理矩阵的特性，结合BSQ的存储方式，将方便快捷地将.raw图像数据分解为n×m×K的数据立方，其中K为采集波段总数，n×m为单波段图像大小。高光谱数据如图4所示，由图4可知，显微高光谱成像系统采集的高光谱数据不仅包含了二维空间信息，还包含了单一像素的光谱曲线特征。
A＝-logT (1)
假设物质的平行单色入射光强度为I0，透射光强度为I，则透光率为：
本文实验数据(包括目标样本数据和空白样本数据)通过HE染色样本采集而成。在目标样本数据采集过程中，平行单色入射光依次通过压片、生物组织、透明玻璃载玻片；空白样本数据采集中，平行单色入射光依次通过压片、透明玻璃载玻片，光路效果如图5所示，其中51为压片，52为生物组织，53为透明玻璃载玻片。
因此，在本文中光谱校正公式为：
则吸光度A表达式为：
其中D(n,m；λ)为目标样本在第λ波段中n行m列的像素值，B(n,m；λ)为空白样本在第λ波段中n行m列的像素值，I(n,m；λ)为该像素点在光源关闭打开之间，物镜获取的图像噪声。因为系统硬件的参数稳定，所以每个像素点位置的图像噪声一致。通过提取数据样本的吸光强度的方法提取样本物质实际的高光谱特性曲线，能够消除系统设备噪声、样本染料不均等因素的影响。
进一步的，所述的用于微生物的识别为用于空气、水、白色家电、医院院感或城市环境监测的微生物识别。
进一步的，所述的细菌和分子高光谱数据库用于微生物的识别包括如下步骤：
根据单种纯化的菌株的不同致病能力得到单一光谱图像及数字资料，通过人工和G-SA-SVM、KMNF、CSS-LSSVM三种分割方法和PSO-ELM-BP一种优化分类方法进行图像降维、预处理、分割、分类区分；
采集混合细菌的片子，根据混合菌的片子进行分割，得到各种的标准图像；
获取耐药株单一光谱图像及数字资料，对照所述的标准图像进行超光谱曲线的对比，分析，来确定超光谱在特定菌中的不同耐药的鉴别效果。
1、KMNF：基于核最小噪声分离(KMNF)的分割方法；
2、CSS-LSSVM算法：基于特征光谱监督的最小二乘支持向量机；是LS-SVM的优化。
3、G-SA-SVM：该方法以显微高光谱成像技术为基础,首先对采集的高光谱数据进行光谱维和空间维的空白校正处理,然后对数据进行特征自适应性Gamma校正,最后利用模拟退火优化参数的支持向量机算法(SA-SVM)进行识别处理,有效快速定位微生物。具体的流程如图9所示。
不同细菌混合后的高光谱的识别的具体方法和步骤：
根据单种纯化的六种菌的不同治病能力---肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的标准株、临床株和自然株首先得到单一光谱图像及数字资料，这个资料可以通过人工和算法的差异，来明显区分它们。
采集混合细菌的片子，根据混合菌的片子进行分割，得到各种的“标准图像(含数据)”。
在两两混合菌株的涂片标样中，在一个视野里，不同细菌从相对对方背景(包括空白、空气、载玻片的性状)中分割出来的做一个平均光谱曲线，得到全区域的曲线的一个平均(不是特定区域，即涂片中的全部细菌)，然后和单种环境下的细菌光谱对比，找到共同部分和差异部分，共同部分是指纹特征固有光谱及数据信息，差异部分是环境因素(混合细菌)光谱干扰信息和数据；组合如表1所示。
表1
这样一次可以通过单一光谱和图像及数字信息及算法建立光谱和数据库。
依次类推，三种细菌混合。在此混合菌株的涂片标样中，在一个视野里，不同细菌从相对对方背景(包括空白、空气、载玻片的性状)中分割出来的做一个平均光谱曲线，得到全区域的曲线的一个平均(不是特定区域，即涂片中的全部细菌)，然后和单种环境、两两混合下的细菌光谱对比，再找到共同部分和差异部分，共同部分是指纹特征固有光谱及数据信息，差异部分是环境因素(混合细菌)光谱干扰信息和数据。组合如表2所示。
表2
依次类推，完成细菌和高光谱图像及数据的原始采集，包括六种细菌的不同环境株：标准株、临床治病株、自然株；以及在不同波段和混合不同环境下的细菌各种光谱数据信息的变化，同时采用不同区段光谱数据加权算法重叠，提高精准程度。
各微生物的致病菌(耐药株)的高光谱的识别；
可以采取临床特定某种上不同药物的耐药株，对照之前制作的六大类细菌“标准图像”进行超光谱曲线的分析的对比，分析，来确定超光谱在特定菌中的不同耐药的鉴别效果的探讨。
进一步的，所述的微生物识别方法采用深度学习AI完成，图片收集和光谱曲线、指纹光谱的数据信息同步，从而不断对比新的数据比对，结合算法，自觉完成深度学习。采用了基于粒子群优化的极限学习机(PSO-ELM-BP)优化分类算法。在该方法中，使用了极限学习机(ELM)来建立微生物区域识别模型，并在极限学习机的参数寻优中，使用了粒子群(PSO)优化算法来寻找ELM参数的更优解，提高了极限学习机的分类精度。
上述实施例采用细菌和高光谱识别技术相结合，使微生物识别的更加精确，为空气、水和特殊接触物体等的微生物识别提供了精确的定量检测方案，对于提高人类健康水平和人民生活质量具有重大意义。下面结合具体实施例来对本发明申请方案作进一步阐述：
实施例1
将6个细菌株(4个标准株：大肠埃希菌(E)、金黄色葡萄球菌(S)、铜绿假单胞菌(P)，一个自然株：枯草芽孢杆菌(B)、白假丝酵母菌(C)，一个临床株：鲍曼不动杆菌(A)扫描入电脑)6个菌，每个菌随机挑选2张玻片。每张玻片在普通显微镜20倍镜下拍摄2张图像，在超光谱下拍摄2张视野图片和1张空白视野图片。
由于不清楚细菌分布稀疏与密集对超光谱是否有影响，故分别扫描细菌分布的稀的视野和密集的视野。
(1)将玻片放置于载物台上，在20倍普通显微镜找到视野，调焦距聚焦，拍摄，保存。曝光时间1ms，增益10-30。标记方式E-5-20x-roi1(E：代表大肠杆菌，5：代表载玻片上的序号，20x：代表20倍镜，roi1(代表该视野下细菌分布较稀))，图6中细菌分布密度合适，可以精确计数和形态识别，从而为数据收集后深度学习提供基础；
(2)相同视野下，切换光源，至超光谱显微镜，解析度(resolution)：2048X 2044，帧速度(frame speed)：5.06fps，曝光时间(exposure time)：开始1ms，结束500ms。点OK，连续捕获(continous capture)：帧(frame)：60，频率(frequency)：373nm，更多参数(moreparameters)：HDR(高动态范围图像)，调焦距聚焦，点set，点strat。(其中预览图片的数据：曝光时间：开始0ms，结束200ms，频率606，更多参数High Gain)；
(3)拍摄，标记方式E-5-20x-roi1(命名与普通显微镜相同)。
(4)切换光源，至普通显微镜，在20倍普通显微镜再找到视野，调焦距聚焦，拍摄，保存。参数同普通显微镜，标记方式E-5-20x-roi2(roi2：代表该视野下细菌分布较密)；
(5)相同视野下，切换光源，至超光谱显微镜，参数同超光谱显微镜。标记方式E-5-20x-roi2；
(6)超光谱显微镜下，选取空白区域，参数同超光谱显微镜。标记方式E-5-20x-blank(blank：代表空白视野)；
同理获取大肠杆菌另一张切片的，普通显微镜20倍镜2张图片，超光谱显微镜2张视野图片和1张空白视野图片；
(7)同理获取其余5种细菌的图像；
(8)数据处理。李老师用光谱分析软件打开超光谱获取的图像，用将图像与空白视野图像进行处理，获得校正后的光谱曲线和特征光谱，机器深度学习算法不断优化。
图7中细菌涂片分布密度好，计数和形态数据提供了深度学习的基础，这个是机器深度数据学习和图像数据识别的根本，计数和细菌边缘形态均是重要基础数据，图8反映的是照射入光的强度、细菌的高光谱特征曲线，特征指纹光谱、吸光度和透光度和细菌分布关系信息等。
便携式设备工作原理，就是便携式激光发射器发出一束光，照到待测物体表面，这个激光激发的信号通过设备回收上传即时比对细菌数据库，完成图像和数据识别后汇总传递到终端手机app上数分钟内快速显示细菌的结果，指导临床换药。
以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种微生物识别方法，其特征在于，包括如下步骤：
采集国际标准菌株，将所述的国际标准菌株经涂片和固定染色后得到菌株待测样，采集所述的菌株待测样的分子高光谱数据，获取所述的菌株待测样的指纹光谱，建立细菌和分子高光谱数据库，将所述的细菌和分子高光谱数据库用于微生物的识别。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的获取所述的菌株待测样的指纹光谱为：寻找并标记所述的菌株待测样的高光谱微生物特征光谱片段作为指纹光谱和识别靶点。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的国际标准菌株包括：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的标准株、临床株和自然株。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的涂片包括如下步骤：
将生理盐水滴在载玻片上，采用灭菌的接种环将所述的国际标准菌株与所述的载玻片上的生理盐水混匀，涂层，风干。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定染色采用革兰氏蓝色，包括如下步骤：
采用草酸铵结晶紫浸泡组织初染后用水冲洗至无色；
加碘液浸泡组织进行媒染后用水冲洗至无色；
加脱水剂脱色后用水冲洗至无色；
加番红液复染后用水冲洗至无色。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的分子高光谱数据的采集包括如下步骤：
设置采集参数，判断样本是否采集完；
若是，则移动载物台到空白区域，采集空白高光谱图像数据，采集结束；
若否，则移动载物台选取目标，彩色图像采集，高光谱图像数据采集后判断样本是否采集完。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的用于微生物的识别为用于空气、水、白色家电、医院院感、城市环境监测、医疗、血制品设备中的微生物识别。
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