JP2021506286A - 酵母または細菌を識別するための方法 - Google Patents

Abstract

微生物の特徴を明らかにするための方法であって、波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍに自然の電磁応答を有する微生物を前記範囲で照明することと、前記照明した微生物によって反射した（または前記照明した微生物を通じて透過した）光強度を前記範囲内で獲得することと、前記範囲内で獲得した光強度に応じて、酵母または菌株であるものとして微生物を判定することと、を含む方法。【選択図】なし

Description

本発明は、微生物分析の分野に関し、詳細には、微生物の特徴づけ、特に、酵母と細菌の識別、ならびに、後者の背景の中で、これらのグラムタイプおよびこれらの発酵または非発酵特性の識別に関する。

都合のよいことに、本発明は、非発色、非蛍光発生、無着色の培地の中で成長した細菌のコロニーまたは酵母のハイパースペクトルまたはマルチスペクトル画像の分析に適用される。

病原微生物の分野では、微生物の特徴づけは、この微生物に感染した患者に対する処置を決定するために、微生物の種、および抗菌剤に対する微生物の感受性（または「アンチバイオグラム」）を識別することからなるのが好ましい。このために、複雑な微生物学的方法が、実験室において通常用いられ、前記方法は、ほとんどの場合、微生物の他の性質、特に、微生物の界（例えば酵母または細菌）、および、細菌の背景では、細菌のグラムタイプまたは細菌の発酵または非発酵特性、の予備知識を必要とする。実際、この情報は、特に、最終的に、微生物の種または微生物のアンチバイオグラムを判定するために、微生物に適した培地、または抗菌剤の種類を選べるようにする。例えば、出願人によって市販されている微生物ＡＰＩ（登録商標）の識別のためのギャラリーを選ぶことは、微生物の界（例えば酵母対細菌）、または、識別されることになる菌株のグラムタイプの知識に基づく。同様に、出願人によって市販されているＶｉｔｅｋ（登録商標）２システムによって菌株のアンチバイオグラムを判定することは、前記株のグラムタイプおよび発酵または非発酵特性に応じてカードを選ぶことに基づく。また、識別されることになる微生物が酵母であるか細菌であるかに応じて異なるマトリックスを使用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による識別に言及してもよい。したがって、できるだけ早くこの情報を知ることが、特に識別を加速すること、または使用される消耗品の数を減らすことによって、微生物学的方法を最適化できるようにする。

また、これらの性質の知識は、菌株の識別時に偽陽性を減らせるようにする。例として、出願人によって市販されているＣｈｒｏｍＩＤ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ Ｍｅｄｉｕｍの背景では、試験される菌株の発酵特性の知識は、サルモネラ属の識別を強化する。具体的には、サルモネラ属である発酵細菌と、シュードモナス属である非発酵細菌は両方、発色性基質を変化させる。細菌が非発酵性であることが知られている場合、サルモネラ属は、追加の微生物学的アッセイがなくても、単純に排除されることが可能である。

実験室における微生物学的方法を手引きすることを目的とした微生物の特徴づけに加えて、この情報は、臨床的にも有用である。特に、菌株のグラム分類は、例えば、菌のペプチドグリカンの割合といった、菌の細胞壁の特徴を明らかにできるようにし、細菌の分類において、または、第１の近似に対して、抗生物質に対する細菌の感受性を評価するために、使用される。したがって、細菌の２つの種類、すなわち、グラム「陽性」細菌とグラム「陰性」細菌が区分される。同様に、非発酵細菌、すなわちグルコースを異化できない細菌は、病原性細菌の中で特殊な位置を占めるということが観察される。実際、非発酵細菌は、抗生物質に対する高レベルの自然耐性があり、多くの院内感染に関与している。例として、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびアシネトバクター属に言及してもよい。したがって、細菌の発酵または非発酵特性を素早く明らかにすることは、第１線の抗生物質治療をさらに効果的に指図できるようにし、多剤耐性株の拡散の速度を遅くする。

歴史的に、上述の性質（界、グラム、および発酵性）のそれぞれは、専用の技法によって取得されてきた。例えば、菌株のグラムタイプは、「グラム染色」と呼ばれる手動的技法で判定されたが、この技法は、多くの手動工程（固定、染色、媒染、洗浄、過度染色、等）を含み、したがって、時間が長くかかる。したがって、細菌のグラムタイプの検出を自動化するため、特に、多くの試料を扱うために、様々な技法が開発されてきた。しかし、これらの技法は本質的に、細菌のグラムを簡単に観察できるようにするために、細菌の、または細菌の環境の、電磁応答を変化させ続ける。具体的には、第１の種類の技法は、顕微鏡のスライド上で細菌の細胞膜の染色を自動化することからなるが、グラムタイプについての最終判定のための工程は、常に、顕微鏡の下でスライドを観察する技術者によって行われる。したがって、この種類の技法は、完全に自動化されるわけではなく、その上、自動化しにくい。実際、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌との間の色の差は微妙である可能性があり、このことが、実験室の技術者の介入が依然として必要である理由を説明する。第２の種類の技法は、細菌の細胞膜のペプチドグリカンによって開始された酵素反応によって分解される基質と、細菌を接触させることからなる。この反応は、濃縮がグラムの指標である発色団または蛍光物質を生み出す。これは、通常、細菌の発色性または蛍光発生性「ラベリング」と呼ばれる。先行技術からのこの種類の技法は、例えば、適切なデバイス（例えば分光計／蛍光計）を使用して発色団／蛍光物質の光度を測定し、次に、測定した強度を所定の閾値とコンピュータで比較することによって自動化されることが可能であるが、それでも、しばしば高価な、特殊な発色団または蛍光発生性の基質の設計を必要とする。さらに、どのような技法が使用されても、細菌は、その自然状態を変化させられ（例えば、細菌が染料を含む、発色性または蛍光性マーカでラベルを付けられる、等）、したがって、特徴づけのためのその後の試験（例えば、アンチバイオグラムの判定）のために、もはや使用されることが不可能である。

細菌の発酵または非発酵特性の判定について、判定は、通常、試験される菌株の発酵または非発酵特性に応じて色を変化させる発色性媒質を用いる。例えば、「Ｋｌｉｇｌｅｒ−Ｈａｊｎａ」アッセイは、培地上で株を成長させることからなり、ｐＨ、ラクトース、グルコース、チオ硫酸塩、および第一鉄イオンに応じて色を変化させる比色指標を含む。この媒質は、グルコースの異化から細菌の発酵特性を検出し、ｐＨ指標の比色の色変化に反映される。また、菌株のトリブチリンエステラーゼの活動のためのアッセイ媒質に言及してもよく、非発酵性グラム陰性細菌の特徴を明らかにすることができる。

本発明の目的は、微生物の特徴を明らかにするための方法を提案することであり、この方法は、自動的なものであり、微生物または微生物の培地に、これらの特性を判定するためにラベルを付ける、または染色する必要がない。

このために、本発明は、微生物の特徴を明らかにするための方法に関し、
− 波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍに自然の電磁応答を有する微生物を前記範囲で照明することと、
− 前記照明した微生物によって反射した、または前記照明した微生物を通じて透過した光度を前記範囲内で獲得することと、
− 前記範囲内で獲得した光度に応じて、酵母または菌株であるものとして微生物を判定することと、
を含む。

「自然の電磁応答」は、本発明の意味では、関心のある少なくとも波長範囲での照明への微生物の電磁応答を変化させる要素（染料、色素原、フルオロゲン、等）によって、微生物である酵母または菌株が変化しないということを意味する。例えば、微生物のコロニーは、非発色かつ非蛍光培地の中で培養され、照明／獲得は、微生物の媒質の中に依然として存在するコロニーに対して直接的に行われる。

言い換えれば、波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍで、酵母および細菌を区別できる電磁特性を酵母および細菌が「自然に」有するということを、発明者は発見した。したがって、発色性または蛍光発生性の基質または染料を使用する必要はない。さらに、本発明による方法は、照明すること、スペクトルを測定すること、および、このスペクトルの処理、特にコンピュータ処理を実行すること、からなる限りにおいて速い。酵母または細菌レベルで微生物のこの特徴づけは、例えば、上述のような実験室の微生物学的方法を最適化できるようにする。

酵母または細菌であるものとして微生物の特徴づけは、獲得した光度から直接的に行われ、微生物の種を事前に判定する必要がないということに留意されたい。特に、種のレベルで識別する必要がないことは、種のレベルが２つのクラスに限定されることが可能なので、予測モデルを大いに単純化するという長所をもたらす。

都合のよいことに、方法は、微生物のコロニーが成長した栄養寒天培地を含むペトリ皿に応用される。例えば、栄養培地は、酵母または細菌を含む、または含むと疑われる生物学的試料、例えば尿、を使用して植え付けられ、次に、コロニーを成長させるために培養される。コロニーが培地で検出されるとすぐ、本発明の方法によって特徴が明らかにされる。したがって、方法は、培地の植え付け後に、いかなる物質移動または試薬追加も必要としない。例えば、コロニーは、一定間隔でペトリ皿の画像を撮影し、コロニー検出アルゴリズムを用いることによって、自動的に検出される。

都合のよいことに、本発明による方法は、微生物の自己蛍光の分析ではなく、微生物の反射または微生物の吸光度の分析に基づく。具体的には、一般に照明は強すぎて、ハイパースペクトル画像またはマルチスペクトル画像で自己蛍光を観察することができない。

１つの実施形態によれば、方法は、菌株のグラムタイプおよび発酵特性の検出をさらに含み、
− 波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍに自然の電磁応答を有する前記株の少なくとも１つの細菌を前記範囲で照明することと、
− 前記照明した細菌によって反射した、または前記照明した細菌を通じて透過した光度を前記範囲内で獲得することと、
− 前記範囲内で獲得した光度に応じて、菌株のグラムタイプおよび発酵特性を判定することと
を含む。

言い換えれば、細菌は、細菌のグラムタイプおよび細菌の発酵または非発酵特性に特徴的な電磁特性を「自然に」有する。したがって、本発明による方法は、この特性を測定し、次に、ここから、細菌のグラムタイプおよび発酵特性を抽出することからなる。具体的には、本発明により、菌株がグラム陽性であるか、グラム陰性かつ発酵性であるか、グラム陰性かつ非発酵性であるかを、範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍにより、判定することができ、この情報を知っていることが、例えば、上述のような実験室の微生物学的方法を最適化できるようにする。

また、本発明は、本発明による方法を実行するためのシステムを較正するための方法に関し、システムは、
− 波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍで微生物を照明するために構成された照明と、
− 前記照明した微生物によって反射した、または前記照明した微生物を通じて透過した光度を範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍで獲得するために構成されたセンサと、
− センサによって獲得した強度を分析するための命令を収めることができるコンピュータメモリ、および、コンピュータメモリに収められた分析命令を実行することができるマイクロプロセッサ、を備えるコンピュータユニットと
を含み、
較正の方法は、
− 範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍで照明された細菌および酵母の前記範囲における光度を含む学習データベースを構築することと、
− 前記データベースに応じて、酵母または細菌の予測モデルの自動学習をコンピュータによって実行することと、
− 学習した予測モデルを実行するための分析命令をシステムのコンピュータメモリに格納することと
という工程を含む。

また、本発明は、治療方法に関し、
− 酵母または細菌による感染症があると疑われる患者から試料を採取することと、
− 都合のよいことに、寒天培地に試料を植え付けること、前記植え付けた媒質を培養して微生物のコロニーを成長させること、および成長した１つまたは複数のコロニーを検出することによって、試料内にある１つまたは複数の微生物を検出することと、
− 前記範囲内で獲得した光度に応じて、酵母または菌株であるものとして微生物を判定することと、
− 前記判定の結果に応じて、１つまたは複数の抗菌物質を選択することと、
− 選択した１つまたは複数の抗菌物質を患者に投与することと
を含む。

本発明は、純粋に例として示された以下の説明を読み、同一の参照番号が同一または類似の要素を示す添付の図面を参照すると、よりよく理解されるであろう。

本発明によるハイパースペクトルシステムの概略図である。 本発明によるマルチスペクトルシステムの概略図である。 図２のシステムで使用される帯域通過フィルタの透過スペクトルの例を示す図である。 図１または図２のシステムを使用して適用されるクラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮを予測するための方法の流れ図である。 「ステップフォワード」法によって特異なスペクトルチャネルを選択するための方法の流れ図である。 クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮを予測するためのモデルを学習するための方法の流れ図である。 クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮについてのフラットな予測モデルを示す図である。 クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮの系統樹による階層式予測モデルを示す図である。 クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮの最適木による階層式予測モデルを示す図である。 クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮの予測モデル学習のために使用される細菌種および酵母種を記述するテーブルである。 予測モデルの較正および交差検証のために使用されるピクセル数、およびしたがってスペクトル数を記述する、ＣＯＳ媒質についてのテーブルである。 予測モデルの較正および交差検証のために使用されるピクセル数、およびしたがってスペクトル数を記述する、ＴＳＡ媒質についてのテーブルである。 重みを付けられた予測レート、または「バランスのよい分類レート」の計算を示す図である。 ＣＯＳ媒質の最適木のための主な特異なスペクトルチャネルの空間分散を示す図である。 ＣＯＳ媒質の最適木のための各モデルの５つの主な特異なスペクトルチャネルの空間分散を示す図である。 ＣＯＳ媒質の最適木の各モデルの５つの主な特異なチャネルを個別に示す図である。 ＴＳＡ媒質の最適木のための主な特異なスペクトルチャネルの空間分散を示す図である。 ＣＯＳ媒質の最適木のための主な特異なスペクトルチャネルの空間分散を示す図である。 ＴＳＡ媒質の最適木の第１、第２、および第３の予測モデルとそれぞれ関連付けられた１２個、８個、および１１個の主な特異なチャネルをそれぞれ示す図である。 系統樹の第１の予測モデルを示す図であり、図の一番上にある図がＴＳＡ媒質に対応し、図の一番下にある図がＣＯＳ媒質に対応する。 系統樹の第２の予測モデルを示す図であり、図の一番上にある図がＴＳＡ媒質に対応し、図の一番下にある図がＣＯＳ媒質に対応する。 系統樹の第３の予測モデルを示す図であり、図の一番上にある図がＴＳＡ媒質に対応し、図の一番下にある図がＣＯＳ媒質に対応する。

以下に、表記法Ａ_ｉ，ｊは、マトリックスＡのｉ行ｊ列の要素に関する。

図１を参照すると、ペトリ皿に注がれた寒天上で成長した酵母または細菌のコロニーの特徴づけのためのハイパースペクトルシステム１０は、
− ハイパースペクトル画像獲得のためのデバイス１２と、
− デバイス１２を制御するため、および、デバイス１２によって獲得された画像を受信して処理するために、（例えば、接続されたリンクまたはワイヤレスによって）デバイス１２に接続されたコンピュータデータ処理ユニット１４と
を備える。

例えば、米国モンタナ州の会社Ｒｅｓｏｎｏｎからの、リファレンス「Ｐｉｋａ ＩＩ」のハイパースペクトルイメージングシステムといった、デバイス１２は、以下を含む。
− 波長範囲［λ_ｍｉｎ；λ_ｍａｘ］＝［３９０；９００］ナノメートルで感度がよい、例えば、ＣＣＤまたはＣＭＯＳタイプのデジタルセンサといった、エレメンタリセンサのアレイを備えるデジタルセンサ、および、センサによって獲得されることになる波長を選択するための光散乱要素またはスペクトルグラフからなる、いわゆる「ハイパースペクトル」カメラ１８。
− ハイパースペクトル画像が獲得されることになるペトリ皿２２の光学画像の焦点を、カメラ１８のデジタルセンサに合わせるための対物レンズ２０。
− 範囲［λ_ｍｉｎ；λ_ｍａｘ］で光を発することができ、ペトリ皿２２の一様な前面照明を提供するための、例えば２つまたは４つのランプといった、例えば１つまたは複数のハロゲンランプからなる前面照明２４。例えば、照明は、白色光のランプを含む。
− 範囲［λ_ｍｉｎ；λ_ｍａｘ］でペトリ皿２２の一様な背面照明を提供するための、例えば白色光ＬＥＤのマトリックスからなる背面照明２６。
− スキャンすることによって皿２２の完全な画像を取得するために、ペトリ皿２２を保持し、対物レンズ２０の前をペトリ皿２２が通ることを可能にするキャリッジ２８。

このようにして、照明は、範囲［λ_ｍｉｎ；λ_ｍａｘ］全体で提供される。

例えば、デバイス１２は、１６０マイクロメートルのサンプリングステップ（３００マイクロメートルで推定される空間分解能）で、および、範囲［λ_ｍｉｎ；λ_ｍａｘ］にわたる１．７ナノメートルのスペクトル分解能で、縦９０ミリメートル横９０ミリメートルの領域の画像を獲得するために構成される。

したがって、デバイス１２は、ペトリ皿によって反射された光の、Ｎ行Ｍ列のデジタル画像ＨＳＩを生み出し、ペトリ皿２２は開いている（すなわち、ペトリ皿２２のカバーがない）のが好ましい。
ピクセルの放射輝度は、一般に「光度」と呼ばれ、この場合、例えばデジタル写真撮影の分野から本質的に知られているように、露出時間中にカメラのセンサ１８の対応する基本的な高感度部位の表面に入射する光の量に対応する。

各ピクセルＲａｄ_ｉ，ｊ（λ）は、異なる波長［λ_ｍｉｎ；λ_ｍａｘ］におけるピクセルに対応する皿２２の放射輝度のデジタルスペクトルからなり、デジタルスペクトルは、以下の関係によって表現される。
ここで、Δλは、スペクトル分解能であり、ｐは、
に属する正の整数である。獲得波長λ_ｍｉｎ＋ｐ×Δλは、通常、用語「チャネル」によって示される。

データ処理ユニット１４は、例えば、パーソナルコンピュータ、タブレット、スマートフォン、サーバ、スーパーコンピュータ、または、より一般には、獲得デバイス１２によって生み出された画像ＨＳＩを処理するために構成された、特にＤＳＰ（「デジタルシグナルプロセッサ」）タイプのマイクロプロセッサに基づく、ＦＰＧＡタイプの回路に基づく、これらのタイプの技術をミックスした回路に基づく、等のいずれかのシステムである。特に、ユニット１４は、デバイス１２によって生み出された画像、本発明による方法の実行のためのコンピュータ命令、前記実行に役立つパラメータを格納するため、ならびに、中間のおよび最終的な計算の結果を格納するための、メモリのセット（ＲＡＭ、ＲＯＭ、キャッシュ、大容量ストレージ、等）を提供される。ユニット１４は、任意選択として、コロニーの特徴づけの最終的な結果、具体的には、グラムタイプおよび／もしくは発酵特性、ならびに／または、調査されるコロニーの細菌もしくは酵母の特徴の判定、を表示するためのディスプレイ画面を備える。単一の処理ユニットが説明されるが、本発明は、当然、いくつかの処理ユニット（例えば、画像ＨＳＩの事前処理を行うためのカメラ１８の内部にマウントされたユニット、および、他の処理を実行するためのデバイス１２の外部のユニット）によって行われる処理に適用される。さらに、システムは、例えば、オペレータが利用できるキーボード／マウスおよびドロップダウンメニュー、ペトリ皿の上にあり媒質についての情報を含むバーコード／ＱＲコードを読み取るバーコード／ＱＲコードリーダ、等によって、予測が媒質によって決まる場合に使用される試料に関するデータ、特に培地の種類をユニット１４に入力できるようにするインターフェースを追加されてもよい。

図１のハイパースペクトルシステムは、コロニーのクラスを予測するための種々のモデルに適合させることができ、多くのスペクトルチャネルを使用して予測精度を向上させることができるので、獲得波長に関して軽快であるという長所がある。高価格であることに加えて、このようなシステムは一般に、センサに入射する光の強度で画像を単に獲得することが目的の従来のＣＭＯＳまたはＣＣＤカメラより空間分解能が小さい。

図２を参照すると、マルチスペクトルシステム３２は、例えば、対物レンズ２０とカメラのセンサ３２との間の、対物レンズ２０の前に配列されたスペクトルフィルタ３６のセットに連結された、高い空間分解能のＣＭＯＳまたはＣＣＤカメラであることが好都合なカメラ３２の分だけ、ハイパースペクトルシステム１０とは異なる。フィルタ３６のセットは、Ｎ_Ｆ個の別個の帯域通過フィルタからなり、それぞれは、範囲［λ_ｍｉｎ；λ_ｍａｘ］のうちの範囲［λ_１；λ_２］の光だけを透過させるために構成され、スペクトルの半値全幅（ＦＷＨＭ）は５０ｎｍ以下であり、好ましくは２０ｎｍ以下である。例えば、４２０ｎｍに中心を置く、会社Ｅｄｍｕｎｄ Ｏｐｔｉｃｓからのフィルタといった、この種類のフィルタの透過スペクトルが、図３に示される。セット３６は、例えば、２４個までの異なるフィルタを受けることができるフィルタホイールであり、ホイールはユニット１４によって制御され、カメラの前に沿って前記フィルタを移動させ、フィルタのそれぞれに対する画像の撮影を制御するように作動する。

マルチスペクトル画像ＨＳＩ（λ）は、このようにして獲得され、画像の各ピクセルＲａｄ_ｉ，ｊ（λ）は、セット３６によって取り除かれた種々のスペクトル帯域のピクセルに対応する皿２２の放射輝度のデジタルスペクトルからなり、デジタルスペクトルは、以下の関係によって表現される。
ここで、λ_１，λ_２、…、
は、それぞれ、セット３６のスペクトルフィルタの中心波長である。

たった今説明されたシステムによる生物学的試料（例えば、尿、血液、気管支肺胞の試料、等）に含まれる微生物の特徴づけの方法４０が、次に、図４の流れ図に関して詳細に提示される。具体的には、この方法は、都合のよいことに、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（例えば、出願人によって市販されているＶｉｔｅｋ（登録商標）ＭＳ）を使用して、前記試料に含まれる微生物を、および、（例えば、出願人によって市販されているＶｉｔｅｋ（登録商標）２プラットフォームを使用して）前記微生物のアンチバイオグラムを、識別するための、より一般的な方法の背景における応用を見つける。本質的に知られているように、これらの技法のそれぞれは、微生物の種類に関する媒質および／または試薬および／または特定の消耗品を選ぶ必要がある。例として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による酵母の識別は、都合のよいことに、この種類の技術において使用されるマトリックスにおけるギ酸の使用を伴う。さらに、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）２プラットフォームのカードの選択（カードは、アンチバイオグラムにおいて試験される成長培地および１つまたは複数の抗菌物質を含む）は、試験される微生物の細菌の特徴によって決まる。特に、発酵性グラム陰性細菌は、細菌のアンチバイオグラムを生成するための特定のカードを必要とする。

都合のよいことに、以下で説明される特徴づけの方法４０は、ペトリ皿上での最初の成長からスタートして、他の微生物学的方法のために微生物についての必要情報を取得すること、具体的には、成長したコロニーが酵母（「Ｙ」）に相当するか細菌に相当するか、また、細菌の場合、この細菌がグラム陽性タイプ（「ＧＰ」）であるかグラム陰性タイプ（「ＧＮ」）であるか、また、グラム陰性タイプの細菌の背景では、この細菌が発酵性（「ＧＮＦ」）であるか非発酵性（「ＧＮＮ」）であるか、を知ることができるようにする。したがって、方法は、微生物のクラス、すなわち、クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、またはＧＮＮを予測できるようにする。

方法の第１の工程４２において、ペトリ皿は、ペトリ皿に堆積した栄養培地、または「培」地の表面で酵母または細菌のコロニーを成長させるように、例えば患者から採取された生物学的試料を植え付けられる。培地の主な目的は、前記コロニーを成長させること、および任意選択として、光の摂動を限定することによって特徴づけの精度を強化することである。反射した光度に応じたグラムタイプの検出について、培地は不透明であることが好ましく、検出の精度のレベルを向上させる。特に、不透明な媒質は、反射係数ρが１０％以下であり、好ましくは５％以下であり、さらにいっそう好ましくは１％以下である。例えば、いわゆる「ＣＰＳＯ」寒天培地（「ＣＰＳ」寒天は、媒質を不透明にするためにＳ_ｉＯ_２を含む）、「コロンビア」寒天（または「ＣＮＡ」寒天）、ヒツジ血液の５％を含むコロンビア寒天（または「ＣＯＳ」寒天）、Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ寒天（「ＭＲＳＭ」寒天）、チョコレート寒天（「ＰＶＸ」寒天）、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ−Ｓｏｙ寒天（「ＴＳＡ」寒天）、等である。

コロニーのこの種類の成長は従来のものであるので、より詳細に以下で説明されることはない。コロニーの成長は、都合のよいことに、オペレータによって手動で、または、本質的に知られた様式の自動的植え付け機を使用して自動的に、行われてもよい。都合のよいことに、調製は、コロニーに基づいて微生物の特徴づけが行われるコロニーが、間隔を空けられるように、および、デバイス１２によって獲得した画像の複数のピクセルにコロニーのエリアが対応するように、行われる。これは、獲得した画像のピクセルのその後の識別、およびしたがって、画像処理アルゴリズムによるピクセルのセグメント化、または、ユーザによる、画像からのピクセルの抽出、を特に容易にすることができる。

コロニーの成長が終わると、例えば、２４時間、３６時間、または４８時間後、ペトリ皿は開けられ、キャリッジ２８上に配列されるのが好ましく、照明２４および２６が点灯され、ペトリ皿の少なくとも１つのハイパースペクトル（または、マルチスペクトル）画像ＨＳＩが、４４において、獲得デバイス１２（または３２）を使用して獲得され、コロニーを作り上げる微生物の種類を、獲得した画像から判定するためのコンピュータ処理を使用する処理ユニット１４に格納される。

ユニット１４は、任意選択として、４６において、以下の処理動作のうちの１つ、または、これらの処理動作の任意の組合せからなるノイズの事前処理を始める。
ａ． 本質的に知られた様式での、カメラのセンサのノイズ、特に、そのオフセット、その空間ノイズ、等の補正。
ｂ． 画像ＨＳＩに「ハイライト」を形成する特に鏡のような、付随的に発生する好ましくない反射の処理。例えば、例えばピクセルがとることができる最大値の３分の２以上（すなわち、０から２５５の８ビットでエンコードされたピクセルの場合、１７０以上）といった、所定の閾値を超える値をとるピクセルを除去するために使用される閾値化。
ｃ． 細菌の種類、および、使用される寒天の種類で変化しない波長で反射した光度ごとに画像ＨＳＩを分割することによって、照明の変化などの外部変動によって引き起こされる画像の変化を弱めることができるようにするレシオメトリック処理。
ｄ． いくつかの画像ＨＳＩが獲得された場合、異常なピクセル値および／または獲得した画像の平均を見つけて削除すること。

都合のよいことに、処理は、４８において、ペトリ皿単独で生成された信号を抽出するために、ハイパースペクトルまたはマルチスペクトル反射画像における種々の波長の放射輝度の値を格納する事前処理された画像ＨＳＩの変換を続ける。これは、特に、照明２４、２６の光源の発光スペクトルの変動を取り除けるようにする。例えば、「フラットフィールド補正」（ＦＦＣ）という種類の補正が、反射を取得するために使用され、これには、さらに、ピクセルごとのセンサの反応のばらつき（暗電流の分散、利得の分散、等）を補正するという長所がある。
ハイパースペクトル画像の背景において、この変換は、例えば、以下の関係による補正である。
ここで、Υ（λ）は、反射画像であり、Ｗは、例えば、９０％を超える一様な反射率のシート（例えば、いわゆる「白い」シート、または、１０％より小さい灰色のカードを伴う）といった、照明２４、２６によって照明された高反射率の中性オブジェクトの、ユニット１４に格納されたハイパースペクトル画像であり、Ｂは、例えば対物レンズ２０を覆う黒いキャップの画像といった低反射率の、また、ｍ（λ_ｍｉｎ＋ｐ×Δλ）＝１であるか、マトリックスＷ（λ_ｍｉｎ＋ｐ×Δλ）−Ｂ（λ_ｍｉｎ＋ｐ×Δλ）の平均に等しい、中性オブジェクトの、ユニット１４に格納されたハイパースペクトル画像である。

同様に、マルチスペクトル画像の背景において、変換は、例えば、以下の関係による補正である。
ここで、Ｗは、例えば、９０％を超える一様な反射率のシート（例えば、いわゆる「白い」シート、または、１０％より小さい灰色のカードを伴う）といった、照明２４、２６によって照明された高反射率の中性オブジェクトの、ユニット１４に格納されたマルチスペクトル画像であり、Ｂは、例えば対物レンズ２０を覆う黒いキャップの画像といった低反射率の、また、ｍ（λ_ｎ）＝１であるか、または、マトリックスＷ（λ_ｎ）−Ｂ（λ_ｎ）の平均に等しい、中性オブジェクトの、ユニット１４に格納されたマルチスペクトル画像である。

ユニット１４は、５０において、例えば画像ＨＳＩ（λ）またはΥ（λ）から、細菌のコロニーを識別するためのアルゴリズムを、工程３８に続いて、または、前述のステップと並行に、実行する。任意の従来の形状およびオブジェクト認識アルゴリズムが、コロニーに対応する、「Ｃｏｌ（λ）」と呼ばれる画像のゾーンを抽出するために使用されてもよい。変形形態として、この選択はオペレータによって手動で行われ、オペレータは、ディスプレイ画面、および例えばマウスタイプのポインティングデバイスによってこのゾーンを選択する。例として、ゾーンＣｏｌ（λ）は、コロニーに属するピクセルの座標のリストからなる。ピクセルの選択したゾーンは、ユニット１４によって格納される。

方法は、５２において、所定の判定ルールを適用することによって、ゾーンＣｏｌ（λ）の少なくとも１つのスペクトルに応じて、コロニーの微生物のクラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、またはＧＮＮの予測を続けるが、この変形形態が以下で説明される。具体的には、この予測は、ゾーンＣｏｌ（λ）の各ピクセル（ｉ，ｊ）のスペクトルΥ_ｉ，ｊ（λ）に応じて行われる。このために、クラスの最初の予測は、ゾーンＣｏｌ（λ）の各ピクセル（ｉ，ｊ）に対して行われ、次に、クラスの最終的な予測のために多数決が使用される。第１の変形形態では、単純な多数決が使用され、すなわち、ゾーンＣｏｌ（λ）の最大数のピクセルに基づいて予測されたクラスが、最後に保持されるクラスである。第２の変形形態では、クラスの予測の確実性を向上させるために、条件付きの投票が使用され、すなわち、最後に保持されるクラスは、ゾーンＣｏｌ（λ）を作り上げるピクセル数のＸ％より大きいことに基づいて予測されるものであり、Ｘは、完全に５０％より大きく、７０％以上であることが好ましい。クラスがこの条件を満たさない場合、方法は、クラスの予測なしを返す。当然、コロニーのクラスは、例えば、ゾーンＣｏｌ（λ）のスペクトルのセット｛Υ_ｉ，ｊ（λ）｝_{（ｉ，ｊ）∈Ｃｏｌ（λ）}の平均スペクトルΥ_ｃｏｌ（λ）といった、単一の値によって提供されてもよい。

各コロニーのクラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、またはＧＮＮは、所定の予測ルールを適用することによってユニット１４によって見つけられるが、この変形形態が以下で説明される。予測されたクラスはユニット１４に格納され、および／または、ユーザの注目のために画面に表示される。また、この予測は、都合のよいことに、識別のその後の工程、および／または、コロニーを形成した微生物のアンチバイオグラムのために、別の微生物分析器具に送られる。

コロニーのピクセルのスペクトルΥ_ｉ，ｊ（λ）に応じてクラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、またはＧＮＮを予測するための様々なモデル、特に、教師あり自動学習（「ＳＭＬ」：教師あり機械学習（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｍａｃｈｉｎｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ））に基づく予測モデルが次に説明される。使用されるＳＭＬツールは、最初に、図５を参照しながら説明され、次に、図６および図７に示された予測モデルの学習処理を通じて、予測モデルが下記で説明される。

Ａ．教師あり機械学習のためのツール
どのような学習が考えられるにしても、これは、学習データベースの構築で始まる。各クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮについて、細菌および酵母が選択され、これらのそれぞれは、ペトリ皿に注がれた寒天に植え付けられ、所定の時間、培養され、図１で説明されたシステムによって、また必然的に、照明の同じ条件の下、および波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍで、皿のハイパースペクトル画像が獲得される。寒天上で成長したコロニーのピクセルは、例えば方法４０の工程４６〜５０で説明された手法で抽出され、これらの関連付けられたスペクトルが学習データベースに格納される。したがって、学習データベースは、クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮそれぞれと関連付けられたスペクトル
、
、
、
の４つのセットを含む。これらのセットのそれぞれは、先行技術から本質的に知られているように、適切な学習のために使用される「較正」と呼ばれる第１の部分、および、計算した予測モデルの性能を評価するために使用される「交差検証」と呼ばれる第２の部分、という、２つに分けられる。

第１の好ましい実施形態によれば、コンピュータによって行われる学習は、「ステップフォワード」と呼ばれ、予測モデルを訓練するために使用される。この種類の学習は、本質的に貧弱であり、図２のシステムによって行われるような、マルチスペクトルアプリケーションを見つけるのに適しているように、最も特異なスペクトルチャネルの段階的選択に基づく。

図５を参照すると、学習６０は、初期化工程６２で始まり、ここで、最大数Ｒ個の特異なチャネルが選択され、この数は、１と、スペクトルの獲得のために使用されるハイパースペクトルカメラのスペクトルチャネルの数Ｐとの間にある。選択された特異なチャネルのリストＬは空にされ、候補チャネルのリストｌは、ハイパースペクトルカメラのチャネルのセット｛λ_１，λ_２，…，λ_Ｐ｝に初期化される。

後続の反復工程６４において、リストｌは、反復工程６６を使用して、リストＬからの最も特異なチャネルＲで段階的に満たされる。より具体的には、工程６４、工程６６の所与の反復ｒの間、以下を行う。
− リストｌから各チャネルλ_ｋを抽出すること。
− ６８において、抽出したチャネルλ_ｋおよびリストＬからのチャネル｛λ_１，λ_２，…，λ_ｒ−１｝について、予測モデル
を判定すること。
− ７０において、例えば、交差検証におけるスペクトルの妥当な分類のレベルといった、予測モデル
の性能尺度
を計算する。

次に、工程６４は、７２において、最善の性能尺度を示す予測モデルの識別、および必然的に、リストＬのチャネルと組み合わせたリストｌの最も特異なチャネルλ_ｒの識別を続ける。７４において、リストＬは、次に、チャネルλ_ｒで完了し、後者は、工程６４の次の反復ｒ＋１の間、リストｌから削除される。Ｒ個の最も特異なチャネルが識別されると、学習方法は、７４において、リストＬの、および、後者、すなわち、工程７２で識別された最後のモデルと関連付けられた予測超平面
の、格納で終わる。

都合のよいことに、工程６８で計算された予測モデルは、線形カーネルを伴い、ソフトマージンを伴う（「サポートベクトルマシン」のための）ＳＶＭタイプである「１対多（ｏｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ａｌｌ）」のものである。この種類の学習は、較正スペクトルに応じて計算することからなり、超平面
は、下記で説明されることになるように、他のクラスの中からの１つ、２つ、または３つから形成されたセット（Ｃｌ）
のクラスＣｌ（Ｃｌ＝Ｙ、ＧＰ、ＧＮＦ、またはＧＮＮ）を区別する。例えば、モデルは、工程６６の反復ｋおよび工程６４の反復ｒの間、
という制約の下、
という関係に従って最適化問題を解決することによって訓練される。上記の式において、
− クラスＣｌに、または、セット
に属する較正スペクトルΥ_ｍ（λ）について、
は、リストＬ＝｛λ_１，λ_２，…，λ_ｒ−１｝の、および、反復ｋの中でリストｌから抽出されたチャネルλ_ｋの、スペクトルチャネルに対応するΥ_ｍ（λ）の成分のベクトル、好ましくは、成分が、チャネルの値に応じて規則正しく配列されたベクトルに等しい。
−
およびβは、スペクトル
の次元に等しい次元の、および必然的に、ｒに等しい次元の、ベクトルである。
− Ｍは、クラスＣｌに、または、１からＭまで番号を付けられたセット
に、属する較正スペクトルΥ_ｍ（λ）の数である。
−
．βは、ベクトル
とベクトルβのスカラ積である。
− ξ_ｍおよび
はスカラである。
− ｑ_ｍ∈｛−１，１｝であり、ｍ番目の学習スペクトルがクラスＣｌと関連付けられる場合、ｑ_ｍ＝１であり、ｍ番目のスペクトルが他のクラスのセット
と関連付けられる場合、ｑ_ｍ＝−１である。
− Ｃは、所定のスカラである。

クラスＣｌにおけるピクセルΥ_ｉ，ｊ（λ）のスペクトルのメンバシップを予測するモデルは、したがって、以下の工程に従って生み出される。
− スペクトルΥ_ｉ，ｊ（λ）の、ベクトル
への変換。
− スペクトル
と超平面
との間の距離
の計算。
− 距離Ｓ_ｃｌに応じてクラスＣｌを予測するためのルールの適用、例えば、スペクトルは、Ｓ_ｃｌの符号が正である場合、クラスＣｌに属し、この符号が負である場合、セット
に属する。

第２の実施形態によれば、学習は貧弱ではなく、チャネル全てを同時に使用することからなり、ここから生じる予測モデルは、図１のシステムによるハイパースペクトルアプリケーションに特に適している。例えば、この学習は、線形カーネルおよびソフトマージンを伴うＳＶＭタイプである「１対多」のものであり、
という制約の下、
という関係に従って最適化問題を解決することによって、他のクラスの中からの１つ、２つ、または３つから形成されたセット
のクラスＣｌ（Ｃｌ＝Ｙ、ＧＰ、ＧＮＦ、またはＧＮＮ）を区別する超平面
を、較正スペクトルに応じて計算することからなる。
これらの式において、
− Υ_ｍ（λ）は、クラスＣｌに、またはセット
に属する較正スペクトルΥ_ｍ（λ）である
−
およびβは、較正スペクトル
の次元に等しい次元の、および必然的に、Ｐに等しい次元の、ベクトルである。
− Ｍは、クラスＣｌに、または、１からＭまで番号を付けられたセット
に、属する較正スペクトルΥ_ｍ（λ）の数である。
− Υ_ｍ（λ）．βは、ベクトルβ倍したベクトルΥ_ｍ（λ）のスカラ積である。
− ξ_ｍおよび
はスカラである。
− ｑ_ｍ∈｛−１，１｝であり、ｍ番目の学習スペクトルがクラスＣｌと関連付けられる場合、ｑ_ｍ＝１であり、ｍ番目のスペクトルが他のクラスのセット
と関連付けられる場合、ｑ_ｍ＝−１である。
− Ｃは、所定のスカラである。

クラスＣｌへのピクセルΥ_ｉ，ｊ（λ）のスペクトルのメンバシップを予測するモデルは、したがって、以下の工程に従って生み出される。
− スペクトルΥ_ｉ，ｊ（λ）と超平面
との間の距離
の計算。
− 距離Ｓ_ｃｌに応じてクラスＣｌを予測するためのルールの適用、例えば、スペクトルは、Ｓ_ｃｌの符号が正である場合、クラスＣｌに属し、この符号が負である場合、セット
に属する。

Ｂ．予測モデルを訓練する方法
図６を参照すると、予測モデルを訓練するための方法８０は、８２において、上述のような、クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮのための学習データベースの構築で始まる。方法８０は、８４において、予測モデルの構造の決定を続ける。具体的には、一方では図７Ａにおいて、また、その一方では図６Ｂおよび図６Ｃにおいて、それぞれ示されたものなど、２種類のモデルが可能である。

第１の種類の予測モデルは、図７Ａに示され、「１対多」というタイプ９０、７２、７４、７６の４つの予測モデル、すなわち、クラスＹ対クラスＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮの予測、クラスＧＰ対クラスＹ、ＧＮＦ、ＧＮＮの予測、クラスＧＮＦ対クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＮの予測、およびクラスＧＮＮ対クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦの予測、を訓練することからなる。このために、
− 各予測モデルは、関係（６）または関係（７）について上述された学習ツールのうちの１つを使用して、学習データベースに応じて訓練され、クラスＣｌは、Ｙ、ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＮに等しく、セット
は、他の３つのクラスから作り上げられる。
− ピクセルのグラムタイプおよび発酵特性の予測（図３の工程５２）は、前記ピクセルから超平面
、
、
、
への、または、超平面
、
、
、
への、スペクトルΥ_ｉ，ｊ（λ）の距離Ｓ_Ｙ、Ｓ_ＧＰ、Ｓ_ＧＮＦ、Ｓ_ＧＮＮをそれぞれ計算し（工程９０〜工程９６）、次に、８８において、計算した距離に応じてピクセルのクラスを判定することによって取得される。特に、保持されるクラスは、最大距離に対応するものである。

「フラット」と呼ばれる図７Ａに示された第１の種類の構造によれば、クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮは、等しく重要であるとみなされ、必然的に、識別は同様にエラーとなる。例えば、細菌ＧＮＮの代わりに酵母Ｙを識別することは、細菌ＧＮＮの代わりに細菌ＧＮＦを識別することと同様に深刻である。図７Ｂに示された構造によれば、予測モデルは、系統発生学的分類木に従って編成され、その結果、異なるクラスが、等しく重要であるものとみなされる必要はもはやなく、情報を演繹的に、すなわち、スペクトルの形状に影響を及ぼす可能性のある進化情報を、導入できるようになる。より具体的には、この予測モデル木は、以下を含む。
− 酵母Ｙを細菌ＧＰ、ＧＮＦ、ＧＮＦと区別することからなる第１のモデル１００
− 細菌ＧＰを細菌ＧＮＦおよびＧＮＮと区別することからなる第２のモデル１０２
− 細菌ＧＮＦを細菌ＧＮＮと区別することからなる第３のモデル１０４

モデル１００〜１０４のそれぞれは、関係（６）または関係（７）について上述された手法で取得され、クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮのうちの１つへのピクセルΥ_ｉ，ｊ（λ）のスペクトルのメンバシップの予測は、したがって、第１のモデル１００の超平面への距離Ｓ_Ｙを計算することからなり、この距離の符号が正である場合、クラスＹが予測される。そうでなければ、第２のモデル１０２の超平面への距離Ｓ_ＧＰが計算され、この距離の符号が正である場合、クラスＧＰが予測される。そうでなければ、第３のモデル１０４の超平面への距離Ｓ_ＧＮＦが計算され、次に、クラスＧＮＦが予測される。そうでなければ、クラスＧＮＮが予測される。

表現型モデルは、図７Ａに示されるような、フラットな予測構造に対する予測精度を改善できるようにするが、しかし、表現型木は、必ずしも、より妥当な結果を示す木ではないということに、発明者は気づいた。特に、特徴が明らかにされることになる微生物が成長してきた培地に依存する木が、好ましいことがあり、この媒質は、スペクトルの形状に影響を及ぼす。図７Ｃに示されるような最適な予測構造が、較正スペクトルに応じて決定されるのが好ましい。より具体的には、第１の工程において、４つの予測モデルである、ａ）Ｙ対ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮ、ｂ）ＧＰ対Ｙ、ＧＮＦ、およびＧＮＮ、ｃ）ＧＮＦ対Ｙ、ＧＰ、およびＧＮＮ、ならびに、ｄ）ＧＮＮ対Ｙ、ＧＰ、およびＧＮＦは上述のように計算され、最善の予測性能を有するモデルが、最適木の第１のモデル１１０として保持される。第２の工程において、第１のモデルのクラスは削除され、残りのクラスに対応する３つの予測モデルが計算される。例えば、第１のモデルが、クラスＧＮＮに対応する場合、第２の工程の３つのモデルは、上述のように、ａ）Ｙ対ＧＰおよびＧＮＦ、ｂ）ＧＰ対ＹおよびＧＮＦ、ならびに、ｃ）ＧＮＦ対ＹおよびＧＰである。３つのモデルの最善のものが、次に、最適木の第２のモデル１１２として保持される。第３の工程において、第１および第２のモデル１１０および１１２のクラスは削除され、２つの残りのクラスの間の予測モデルが上述のように計算され、最適木の第３のモデル１１４として保持される。クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮのうちの１つへの、ピクセルΥ_ｉ，ｊ（λ）のスペクトルのメンバシップの予測が、次に、図７Ｂを参照しながら説明されたものと同様に、木を通過することによって取得される。

図６に戻ると、予測モデルの構造が決定されると、学習処理８０は、任意選択として、８４において、予測のために使用されるスペクトルチャネルの数の削減を続け、この削減は、チャネルの選択および／または再グルーピングによって行われる。具体的には、図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃを参照しながら上述された予測モデルが、図５の「ステップフォワード」法に基づいて計算されるとき、使用されるチャネルの数は、パラメータＲによって直接的に固定されてもよい。変形形態として、または追加として、モデルの性能の著しい向上を示さない追加のチャネルは、削除されてもよい。また、チャネルの再グルーピングは、変形形態または追加として、図２および図３について上述されたように、フィルタの幅に幅が対応する間隔に範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍを分割することによって行われてもよい。単一のスペクトルチャネルが、次に、間隔ごとに保持される。λ_１，λ_２、…、
の場合のチャネルの最終的な数は、このようにして選択され、図２のマルチスペクトルシステムのセット３６のスペクトルフィルタの中心波長を定義する。下記で説明されることになるように、２４個のチャネル、およびしたがって、２４個のスペクトルフィルタだけを使用して高精度のクラスの予測を取得することができる。

任意選択として、マルチスペクトルアプリケーションのための最終的なチャネルを選択し、マルチスペクトルシステムを同様に構築すると、図２のシステムによるスペクトルの獲得に基づいて、新しい訓練動作が、予測モデルを洗練するために使用され、この訓練は、図６および図７について説明されたものに似ている。

さらに、所定のＲ個の特異なチャネルの選択が説明されてきた。変形形態として、この数は、演繹的に固定されず、ギャップを見つけるための停止尺度は、チャネルの数に応じた性能の利得の停滞である。例えば、少なくとも１つのチャネルの追加が、Ｘ％を超えるまで、例えば下記で詳述されるＢＣＲといった性能を向上させない場合、チャネルのサーチは停止され、例えばＸは２％以下である。

Ｃ．実施例
次に、たった今説明されたクラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮの予測の応用を説明する。このために、２１個の菌株および酵母株が使用され、これらの微生物種が、図８に記述される。これらの種は、２４時間、ＣＯＳ寒天およびＴＳＡ寒天上で培養され、これらの媒質のそれぞれに対する学習データベースを生じた。種および媒質のそれぞれについてのコロニー数およびピクセル数が、図９（ＣＯＳ）および図１０（ＴＳＡ）にそれぞれ記述され、ブロック１が較正データに対応し、ブロック２が交差検証データに対応する。

クラスの予測の性能は、都合のよいことに、クラスの予測の感度の平均（よく分類されたスペクトルのレート）に等しくなるように計算される。この重みを付けられた尺度は、「バランス分類レート」すなわち「ＢＣＲ：ｂａｌａｎｃｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｅ」とも呼ばれ、コロニーのサイズによるケースであり、種に応じて変化する、不安定なピクセルのセットを考慮できるようにする。ＢＣＲの計算は、図１１において思い出される。

Ｃ．１．ＣＯＳ結果
Ｃ．１．１．フラットなモデル
下記のテーブル１は、図７Ａに示されたフラットな予測モデルに対する、および、関係（７）を使用して取得された予測モデルに対する、ＢＣＲを示す。

種々の菌株が正確に予測されるということに、テーブル１を読むとすぐに気づくであろう。特に、特徴が明らかにされることになる微生物が細菌であると知っていると、第１の予測ＧＰ対ＧＮＮおよびＧＮＦ、ならびに第２の予測ＧＮＮ対ＧＰおよびＧＮＦを使用して、細菌のグラムタイプ、および細菌の発酵または非発酵特性を予測することができる。この種類の予測は、出願人によって市販されているＶｉｔｅｋ（登録商標）２プラットフォームでアンチバイオグラムを生成するための消耗品を選択するのに特に有用である。

Ｃ．１．２．最適木
図７Ｃに示され、関係（７）によって取得されたモデル１１０、１１２、１１４のＢＣＲが、テーブル２に概説される。

最適木は、系統樹とは著しく異なり、ＣＯＳ媒質の影響はおそらく、系統発生学上の差の影響より大きいということがわかる。

図７Ｃに示され、図４の「ステップフォワード」法、および、モデルのそれぞれに対してＲ＝２４である関係（６）によって取得されたモデル１１０、１１２、１１４のＢＣＲが、テーブル３に概説される。

性能の利得は、第１のモデルのための８番目のチャネルから、および、第３のモデルのための４番目のチャネルからスタートすることに限定されるということが、テーブル３を読むとわかる。市販のフィルタシステムに対応する２４個のスペクトルフィルタを使用してマルチスペクトルアプリケーションを取得するために、都合のよいことに、第１、第２、および第３のモデル１１０、１１２、１１４のために８個のチャネル、１４個のチャネル、および４個のチャネルがそれぞれ選択される。本実施形態のための性能値が、テーブル４に概説される。

当然、図２のシステムが利用できるスペクトルフィルタの数に応じて、他のチャネル数が選択されてもよい。

「ステップフォワード」法は、クラスを予測するのに必要な情報を含むスペクトル範囲を決定できるようにするということにさらに留意されたい。各モデルの最初の５つのチャネルに限定すると、９０％に近いまたは９０％を超えるＢＣＲが、それぞれ取得される。これらのチャネルのスペクトル分散が、図１２から図１４に示される。このようにして、５０ｎｍより大きく離れた異なるスペクトル帯域が、区別されることが可能である。具体的には、
Ａ． ４つのクラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮは、第１の範囲４１５ｎｍ〜５００ｎｍおよび第２の範囲５３５ｎｍ〜６７５ｎｍにあるスペクトルデータだけを使用して効率的に予測されることが可能である。これらの範囲だけを使用すると、ＢＣＲは９０％以上になる。５７５ｎｍ〜６７５ｎｍに第１の範囲を限定することによって、９０％に近いまたは９０％を超えるＢＣＲについてモデルあたり４つのチャネルだけが使用される。任意選択として、第２のモデルのランク５のチャネルに対応する第３の範囲８５０ｎｍ〜８７５ｎｍが使用される。より具体的には、第１の範囲４１５ｎｍ〜５００ｎｍでの予測は、単に、範囲４１５ｎｍ〜４４０ｎｍおよび４７０ｎｍ〜４９５ｎｍに基づいてもよい。したがって、本発明は、前記範囲のスペクトルを獲得し、前記範囲の前記スペクトルのみに応じてクラスを予測することからなるクラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮを予測するためのいずれかの方法を含む。本発明が、クラスＹ、ＧＰ、ＧＮＦ、およびＧＮＮの間で区別できるようにすると、したがって、前述の範囲に含まれるスペクトルデータに基づいて酵母と細菌を区別できるようにするということにさらに留意されたい。したがって、本発明は、特徴が明らかにされることになる微生物の酵母または細菌の特徴を予測するための方法も含む。
Ｂ． クラスＧＮＦ対Ｙ＋ＧＰ＋ＧＮＮの予測は、第１の範囲４７０ｎｍ〜５００ｎｍおよび第２の範囲５７５ｎｍ〜６４５ｎｍに対してのみ効率的に行われてもよい。したがって、本発明は、前記範囲のスペクトルを獲得し、前記範囲の前記スペクトルのみに応じてクラスＧＮＦを予測することからなるクラスＧＮＦを予測するためのいずれかの方法を含む。特徴が明らかにされることになる微生物の細菌の特徴が既に知られているとき、予測は、クラスＧＮＦ対ＧＰおよびＧＮＮを予測することからなるということに留意されたい。したがって、本発明は、範囲４７０ｎｍ〜５００ｎｍおよび５７５ｎｍ〜６４５ｎｍだけに基づくこの種類の予測も含む。
Ｃ． クラスＧＰ対Ｙ＋ＧＮＮの予測は、第１の範囲５３５ｎｍ〜６７５ｎｍ、および、より具体的には、範囲５８５ｎｍ〜６７５ｎｍ、ならびに第２の範囲８５０ｎｍ〜８７５ｎｍだけに対して効率的に行われてもよい。したがって、本発明は、前記範囲のスペクトルを獲得し、前記範囲の前記スペクトルだけに応じてクラスＧＰを予測することからなるクラスＧＰを予測するためのいずれかの方法を含む。特徴が明らかにされることになる微生物の細菌の特徴が既に知られているとき、予測は、クラスＧＰ対クラスＧＮＦおよびＧＮＮを、ならびに必然的に、クラスＧＰ対グラム陰性細菌（ＧＮ）のクラスによって、予測することからなるということに留意されたい。したがって、本発明は、範囲５３５ｎｍ〜６７５ｎｍ、およびより具体的には範囲５８５ｎｍ〜６７５ｎｍ、ならびに範囲８５０ｎｍ〜８７５ｎｍだけに基づくこの種類の予測も含む。
Ｄ． 下記のポイントＢおよびＣに記述された予測を組み合わせると、したがって、３つの範囲と共に、また、特徴が明らかにされることになる微生物の細菌の特徴を知っていると、細菌のコロニーがＧＰであるか、ＧＮＦであるか、ＧＮＮであるかを判定することができるということがわかる。この種類の予測は、出願人によって市販されているＶｉｔｅｋ（登録商標）２プラットフォームでアンチバイオグラムを生成するための消耗品を選択するのに特に有用である。

Ｃ．１．３．系統樹
図７Ｂに示され、関係（７）によって取得されたモデル１００、１０２、１０４のＢＣＲが、テーブル５に概説される。

Ｃ．２．ＴＳＡ結果
Ｃ．２．１．フラットなモデル
下記のテーブル１は、図７Ａに示されたフラットな予測モデルに対する、および、関係（７）によって取得された予測モデルに対する、ＢＣＲを示す。

Ｃ．２．２．最適木
図７Ｃに示され、関係（７）によって取得されたモデル１１０、１１２、１１４に対するＢＣＲが、テーブル７に概説される。

最適木は、系統樹とは著しく異なり、ＣＯＳ媒質の影響はおそらく、系統発生学上の差の影響より大きいということがわかる。

図７Ｃに示され、図５の「ステップフォワード」法、および、モデルのそれぞれに対してＲ＝２４である関係（６）によって取得されたモデル１１０、１１２、１１４に対するＢＣＲが、テーブル８に概説される。

図１５から図１７は、第１、第２、および第３のモデル１１０、１１２および１１４（図１６）に対する、ならびにモデル（図１７）ごとの、１２個、８個、および１１個のチャネルによる貧弱な手法での、全く同一の図（図１５）におけるブランチの主要なチャネルのスペクトル分散を示す。

Ｃ．２．３．系統樹
図７Ｂに示され、関係（７）によって取得されたモデル１００、１０２、１０４のＢＣＲが、テーブル９に概説される。

図７Ｂに示され、図４の「ステップフォワード」法、および、モデルのそれぞれに対してＲ＝２４である関係（６）によって取得されたモデル１００、１０２、１０４のＢＣＲが、テーブル１０に概説される。

図１８から図２０は、これらの図のそれぞれの一番上にＴＳＡ媒質があり、図のそれぞれの一番下にあるＣＯＳ媒質と比較して、モデルごとに主要なスペクトルチャネルのスペクトル分散を示す。

Claims (25)

1. 微生物の特徴を明らかにするための方法であって、
   − 波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍに自然の電磁応答を有する微生物を前記範囲で照明することと、
   − 前記照明した微生物によって反射した、または前記照明した微生物を通じて透過した光度を前記範囲内で獲得することと、
   − 前記範囲内で獲得した光度に応じて、酵母または菌株であるものとして微生物を判定することと
   を含む方法。
2. 菌株のグラムタイプおよび発酵特性の検出をさらに含み、
   − 波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍに自然の電磁応答を有する前記株の少なくとも１つの細菌を前記範囲で照明することと、
   − 前記照明した細菌によって反射した、または前記照明した細菌を通じて透過した光度を前記範囲内で獲得することと、
   前記範囲内で獲得した光度に応じて、菌株のグラムタイプおよび発酵特性を判定することと
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. グラムタイプおよび発酵特性の判定が、獲得した光度がグラム陰性タイプかつ発酵性の菌株の光度であるかどうかを予測する分類の適用を含む、請求項２に記載の方法。
4. グラムタイプおよび発酵特性の判定が、獲得した光度がグラム陽性タイプの菌株の光度であるかどうかを予測する分類の適用、または、獲得した光度がグラム陰性タイプの菌株の光度であるかどうかを予測する分類の適用を含む、請求項２または３に記載の方法。
5. − 照明および獲得が、菌株のコロニーと、具体的にはヒツジ血液コロンビアといった、血液寒天である前記コロニーが成長した培地とを含む試料に対して直接的に行われ、
   − 獲得した光度がグラム陰性タイプかつ発酵性の菌株の光度ではない場合、グラムタイプおよび発酵特性の判定が、獲得した光度がグラム陽性タイプの菌株の光度であるかどうかを予測する分類の適用をさらに含む、
   請求項３に記載の方法。
6. 獲得した光度がグラム陽性タイプの菌株の光度ではない場合、グラムタイプおよび発酵特性の判定が、獲得した光度が酵母の光度であるかどうかを予測する分類の適用をさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. − 獲得した光度がグラム陰性タイプかつ発酵性の菌株の光度であるかどうかを予測する分類が、グラム陰性タイプかつ発酵性の菌株の光度を、陰性タイプかつ非発酵性の菌株、グラム陽性タイプの菌株、および酵母から作り上げられたセットの光度と区別する分類であり、
   − 獲得した光度がグラム陽性タイプの菌株の光度であるかどうかを予測する分類が、グラム陽性タイプの菌株の光度を、陰性タイプかつ非発酵性の菌株、および酵母から作り上げられたセットの光度と区別する分類であり、
   − 獲得した光度が酵母の光度であるかどうかを予測する分類が、酵母の光度を、グラム陰性タイプかつ非発酵性の菌株から作り上げられたセットの光度と区別する分類である、
   請求項６に記載の方法。
8. 獲得した光度が酵母の光度ではない場合、グラムタイプおよび発酵特性の判定が、獲得した光度がグラム陽性タイプの菌株の光度であるかどうかを予測する分類の適用をさらに含む、請求項２に記載の方法。
9. 獲得した光度がグラム陽性タイプの菌株の光度ではない場合、グラムタイプおよび発酵特性の判定が、光度がグラム陰性タイプかつ発酵性の菌株の光度であるか、グラム陰性タイプかつ非発酵性の菌株の光度であるかどうかを予測する分類の適用をさらに含む、請求項８に記載の方法。
10. − 獲得した光度が酵母の光度であるかどうかを予測する分類が、酵母の光度を、グラム陽性タイプの菌株、グラム陰性タイプかつ非発酵性の菌株、およびグラム陰性タイプかつ発酵性の菌株から作り上げられたセットの光度と区別する分類であり、
    − 光度がグラム陽性タイプの菌株の光度であるかどうかを予測する分類が、グラム陽性タイプの菌株の光度を、グラム陰性タイプかつ非発酵性の菌株、およびグラム陰性タイプかつ発酵性の菌株から作り上げられたセットの光度と区別する分類であり、
    − 光度がグラム陰性タイプかつ発酵性の菌株の光度であるか、グラム陰性タイプかつ非発酵性の菌株の光度であるかについての分類が、グラム陰性タイプかつ非発酵性の菌株の光度を、グラム陰性タイプかつ発酵性の菌株で作り上げられたグループの光度と区別する分類である、
    請求項９に記載の方法。
11. − 照明および獲得が、菌株のコロニーと、ｔｒｙｐｔｏｎｅ−ｓｏｙ寒天である、前記コロニーが成長した培地とを含む試料に対して直接的に行われ、
    − 獲得した光度がグラム陽性タイプの菌株の光度ではない場合、グラムタイプおよび発酵特性の判定が、獲得した光度が酵母の光度であるかどうかを予測する分類の適用をさらに含む、
    請求項４に記載の方法。
12. 獲得した光度が酵母の光度ではない場合、グラムタイプおよび発酵特性の判定が、光度がグラム陰性タイプかつ発酵性の菌株の光度であるかどうか、グラム陰性タイプかつ非発酵性の菌株の光度であるかどうかを予測する分類の適用をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. − 光度がグラム陽性タイプの菌株の光度であるかどうかを予測する分類が、グラム陽性タイプの菌株の光度を、グラム陰性タイプかつ非発酵性の菌株、グラム陰性タイプかつ発酵性の菌株、および酵母から作り上げられたセットの光度と区別する分類であり、
    − 獲得した光度が酵母の光度であるかどうかを予測する分類が、酵母の光度を、陰性タイプかつ非発酵性の菌株、および陰性タイプかつ発酵性の菌株から作り上げられたセットの強度と区別する分類であり、
    − 光度がグラム陰性タイプかつ発酵性の菌株の光度であるか、グラム陰性タイプかつ非発酵性の菌株の光度であるかについての分類が、グラム陰性タイプかつ非発酵性の菌株の光度を、グラム陰性タイプかつ発酵性の菌株から作り上げられたグループの光度と区別する分類である、
    請求項１２に記載の方法。
14. 各分類が、範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍのハイパースペクトル画像に対して、および、所定の精度の閾値、または所定の最大数のチャネルが取得されるまで、分類に使用されるスペクトルチャネルのセットを段階的に増加させることからなる手法に従って、訓練される、請求項３から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 第１の分類が、波長範囲４７０ｎｍ〜５００ｎｍおよび波長範囲５７５ｎｍ〜６４５ｎｍだけに応じて光度を区別する、請求項３に記載の方法。
16. 第２の分類が、波長範囲５３５ｎｍ〜６７５ｎｍおよび波長範囲８５０ｎｍ〜８７５ｎｍだけに応じて光度を区別する、請求項４に記載の方法。
17. 第２の分類が、波長範囲４１５ｎｍ〜５００ｎｍおよび波長範囲５３５ｎｍ〜６７５ｎｍだけに応じて光度を区別する、請求項５から７のいずれか一項に記載の方法。
18. 光度が、２４個以下の複数のスペクトルチャネルに対して獲得される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 光度が、第１および第２の分類のそれぞれに対して５以下、および好ましくは４以下の、複数のスペクトルチャネルに対して獲得される、請求項５から７のいずれか一項に記載の方法。
20. 光度の獲得が、株の細菌のコロニーのハイパースペクトルまたはマルチスペクトル画像の獲得を含み、光度が、コロニーに対応する前記画像の少なくとも１つのピクセルに応じて判定される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. グラムタイプおよび発酵特性の判定が、コロニーのピクセルのセットの各ピクセルの光度に応じて行われ、グラムタイプおよび発酵特性が、前記第１の検出の結果の多数決によって判定される、請求項２０に記載の方法。
22. 多数決が、ピクセルの７０％以上の投票、または単純な多数決である、請求項２１に記載の方法。
23. 微生物の特徴づけのためのシステムであって、
    − 波長範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍで微生物を照明するために構成された照明と、
    − 前記照明した微生物によって反射した、または前記照明した微生物を通じて透過した光度を範囲３９０ｎｍ〜９００ｎｍで獲得するために構成されたセンサと、
    − 前記範囲内で獲得した光度に依存して、酵母または菌株であるものとして微生物を判定するために構成されたコンピュータユニットと
    を備えるシステム。
24. 請求項２から２２のいずれか一項に記載の方法を実行するために構成された、請求項２３に記載のシステム。
25. 微生物のコロニー含む試料、および前記コロニーが成長した培地、具体的にはペトリ皿を照明して画像を獲得するために構成された、請求項２３または２４に記載のシステム。