JP6542531B2 - 陽性血液培養物から生存微生物を分離するための処方物およびプロセス - Google Patents
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Description
本出願は、2012年2月29日に出願した米国仮出願第61/604,732号の出願日の利益を主張し、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2011年10月7日に出願した特許文献1の出願日の利益を主張する2012年10月8日に出願した特許文献2に主題が関連し、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の「溶解および洗浄」緩衝液は、あるバランスの微生物を安定させる試薬、ならびに血液細胞を溶解するための溶解試料を含有する。一実施形態では、緩衝液は、微生物を安定させるための塩、ペプトン、他の栄養素を含む基礎液、ならびに、試料中の血液細胞を溶解するための非イオン性界面活性剤、チオール、および任意選択で塩化アンモニウムを含有する。
緩衝液はリン酸緩衝液である。一実施形態では、ペプトンは、カゼインペプトンおよび/または大豆ペプトンを含む。企図される基礎液の追加の構成要素は、例えば、ピルビン酸ナトリウム、酵母エキス、クエン酸ナトリウム、肉ペプトン、および/またはデキストロースを含む。
本明細書に説明される、少なくとも1つの微生物を含有する疑いがある試料から、例えば、PBC試料から、微生物を分離するための方法は、MALDI−TOF/MSによる同定、成長ベースの表現型検査、およびAST試験など種々の下流の試験方法のために使用され得る生存微生物ペレットを迅速に生成することが企図される、種々の「溶解および洗浄」緩衝液を利用することができる。一実施形態では、この方法は、PBC試料の一部分を「溶解および洗浄」緩衝液に加えて、混合物を形成するステップを含む。一実施形態では、PBC試料の「溶解および洗浄」緩衝液に対する容積比は、1:1である。混合物は、PBC試料中の血液細胞を溶解するために、一定期間インキュベートされる。
、本明細書に記載の技法は、開始容積の微生物の数を増大して収量を高めるために展開され得る。加えて、これらの方法は、迅速な試料調製方法を提供するとともに、容易に自動化される。さらに、本明細書に記載の方法および緩衝液は、血液細胞を溶解にさらし、PBC試料から妨害物質を除去し、生存微生物の収量を高める。一実施形態では、PBC試料の開始容積を増大すること、および/または、1つのPBC試料のいくつかの分割量に対して分離方法を実施し得られた微生物ペレットを1つの試料に統合することによって、生存微生物ペレットの収量が増大され得る。
[実施例1]
血液培養ボトルにエンテロバクターアエロゲネス(Enterobacter aerogenes)(ATCC 13048)またはスタフィロコッカスアウレウス(Staphylococcus aureus)(ATCC 43300 MRSA)を接種し、陽性シグナルが示されるまでインキュベートすることによって、血液培養陽性試料が得られた。PBC試料(5ml)の一部分が、ボトルから直接引き出されて15ml円錐管内に置かれた。塩化コリン(0.5mlの20%塩化コリン溶液)がPBC試料に加えられ、室温で20分間インキュベートされ、JS−4.2ロータを有するBeckman J6−MI遠心分離機で5分間にわたって132×gで遠心分離にかけられた。上清は、第2の15ml円錐管に移され、16g/Lの塩化アンモニウム、6.7g/Lのトリトン(商標)X−100、およびBD Bactec Lytic 10(カタログ番号442265)を含有する、5mlの「溶解および洗浄」緩衝液と混合された。混合物は、室温で5分間インキュベートされた。次いで、溶解された試料は、1855×gで10分間遠心分離にかけられた。上清を除去した後、残りの細菌ペレットが、4.5mlのBD Phoenix(商標)IDブロス(カタログ番号246001)において再懸濁された。回収された微生物の一部分が、プレートカウントにより有機体の生存能力を決定するために使用された。プレートカウントによる生存能力試験の結果は、溶解後のエンテロバクターアエロゲネスについて1.85×109cfu/mlを、溶解前のPBC試料の場合の1.65×109cfu/mlと対照して示した。また、生存能力試験は、溶解後の黄色ブドウ球菌(S. aureus)について1.25×108cfu/mlを、溶解前のPBC試料の場合の2.00×108cfu/mlと対照して示した。
4つの血液培養陽性試料が、エンテロコッカスフェシウム(Enterococcus faecium)(ATTC 700221)、エンテロコッカスフェカリス(Enterococcus faecalis)(ATCC 51299)、スタフィロコッカスアウレウス(ATCC 43300)、またはプロテウスミラビリス(Proteus mirabilis)(ATCC 29906)のいずれかによって血液培養ボトルに接種することによって得られた。下記の表1に要約される処方物を含む4つの異なる「溶解および洗浄」緩衝液が調製された。
3つの血液培養陽性試料が、エンテロコッカスフェカリス(VRE ATCC 51299)、クレブシエラニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)(ATCC 700603)、またはスタフィロコッカスアウレウス(ATCC 43300)のいずれかによって血液培養ボトルに接種することによって得られた。下記の表3に要約される処方物を含む2つの異なる「溶解および洗浄」緩衝液が調製された。緩衝液#1と緩衝液#2の唯1つの違いは、緩衝液#2には16g/Lの塩化アンモニウムが加えられることである。
本明細書に記載の種々の「溶解および洗浄」緩衝液にさらされたときの肺炎連鎖球菌のいくつかの異なる株の生存能力を決定するために試験が行われた。PBC試料をこれらの種々の「溶解および洗浄」緩衝液で処理することが、微生物の同定を妨害する物質を十分に除去するかどうかを決定するために、追加の試験が行われた。
3つの異なる「溶解および洗浄」緩衝液が下記の表5に要約されるように調製され、それぞれが異なる量のトリトン(商標)X−100、すなわち、6.7g/L、0g/L、または0.335g/Lを有していた。
表5の種々の「溶解および洗浄」緩衝液は、種々の「溶解および洗浄」緩衝液が十分にPBC試料を洗浄して妨害細胞残屑を除いたかどうかを決定するためのMALDI−TOF/MSによる同定に使用するために、PBC試料から細菌ペレットを調製するために使用された。PBC試料は、非ムコイド株POS3092、非ムコイド株POS3996、非ムコイド株POS3999、ムコイド株POS650、およびムコイド株POS532を含む5つの異なる株の肺炎連鎖球菌を用いて、株ごとに好気性ボトルと嫌気性ボトルの両方に接種することによって調製された。表5の「溶解および洗浄」緩衝液の各々を使用して、各PBC試料に1:1の比で「溶解および洗浄」緩衝液の容積を加えることによって、微生物がPBC試料の各々から分離された。混合物が、Nutator(商標)で5分間混合された。混合物が2200×gで10分間遠心分離にかけられ、続いて、上清が移され廃棄される。残留血液細胞残屑のペレットを洗浄するために、同じ「溶解および洗浄」緩衝液の追加の5mlが管へ加えられ、ペレットを再懸濁するためにボルテックスされた。混合物は、2200×gで10分間遠心分離にかけられた。上清が移され、得られた微生物ペレットから余分な液体がコットンアプリケータ綿棒を使用して除去された。微生物ペレットが600μl滅菌脱イオン水で再懸濁されて、約4マクファーランドの微生物懸濁液の接種材料が得られた。
Claims (14)
- 血液培養陽性試料から生存微生物を分離し濃縮するための緩衝液であって、
基礎液、
少なくとも1種の非イオン性界面活性剤、
少なくとも1種のチオール、
および任意選択で塩化アンモニウムを含み、
前記緩衝液中の基礎液、少なくとも1種の非イオン性界面活性剤、および少なくとも1種のチオールの相対量は、肺炎連鎖球菌の生存能力を維持するように選択され、
前記基礎液は、10g/Lから50g/Lの前記緩衝液中の濃度で栄養ブロスを含み、
前記少なくとも1種のチオールは、0.01g/Lから2.5g/Lの前記緩衝液中の濃度でL−システイン、および0.01g/Lから2.5g/Lの前記緩衝液中の濃度でチオグリコール酸ナトリウムを含み、
前記少なくとも1種の非イオン性界面活性剤は、0.01g/Lから10g/Lの前記緩衝液中の濃度でサポニン、および0.01g/Lから1g/Lの前記緩衝液中の濃度でトリトンX−100を含むことを特徴とする緩衝液。 - 塩化アンモニウムをさらに含み、前記緩衝液中の塩化アンモニウムの濃度は、0.01g/Lから80g/Lであることを特徴とする請求項1に記載の緩衝液。
- 前記栄養ブロスは、トリプチケースソイブロスであることを特徴とする請求項1に記載の緩衝液。
- 前記少なくとも1種の非イオン性界面活性剤は、サポニンとトリトンX−100との混合物であり、前記緩衝液は、消泡剤を含有しないことを特徴とする請求項1に記載の緩衝液。
- 血液培養陽性試料から生存微生物を分離し濃縮するための方法であって、
血液培養陽性試料の一部分を請求項1に記載の緩衝液と混合して、混合物を生成するステップであって、血液培養陽性試料に対する前記緩衝液の量は、細胞が溶解され、かつ前記血液培養陽性試料中の微生物の生存能力が維持されるような量になされる、ステップと、
任意選択で、前記混合物をインキュベートするステップと、
前記混合物を遠心分離にかけて、ペレットおよび上清を生成するステップと、
前記ペレットを保持しながら、前記上清を廃棄するステップと、
前記ペレットを前記緩衝液で再懸濁して、再懸濁されたペレットを作成するステップと、
前記再懸濁されたペレットを遠心分離にかけて、第2の上清および第2のペレットを生成するステップと、
生存微生物を含有している前記第2のペレットを保持しながら、前記第2の上清を廃棄するステップと
を含むことを特徴とする方法。 - 前記血液培養陽性試料の前記一部分は、同容積の緩衝液と混合されて、前記混合物を生成することを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記第2のペレットを溶液で再懸濁し、質量分析法による前記微生物の同定、表現型同定、抗菌薬感受性試験、および分子試験からなる群から選択される前記再懸濁された第2のペレットの少なくとも1つの下流の試験を行うステップをさらに含むことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記微生物は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、および酵母からなる群から選択されることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記グラム陽性菌は、ストレプトコッカスニューモニエであることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 血液培養陽性試料から生存ストレプトコッカスニューモニエを分離し濃縮するための方法であって、
少なくとも1つの微生物を含有する疑いがある血液試料の一部分を嫌気性血液培養ボトルに加える一方、前記血液試料の第2の部分を好気性血液培養ボトルに加えるステップと、
嫌気性血液培養陽性ボトルと好気性血液培養陽性ボトルの両方で陽性シグナルを得るステップと、
好気性血液培養陽性試料の一部分を前記請求項1に記載の緩衝液と混ぜ合わせて混合物を形成し、前記混合物をインキュベートして前記血液試料中の血液細胞を溶解し、前記混合物を遠心分離にかけて、前記血液試料中のストレプトコッカスニューモニエの存在の早期表示を提供する緑色のペレットを形成することによって、前記血液試料中のストレプトコッカスニューモニエの存在の早期表示を得るステップと、
下流の分析のために嫌気性血液培養陽性試料の一部分を調製するステップであって、
前記嫌気性血液培養陽性試料の一部分を、前記請求項1に記載の緩衝液と混合して、混合物を生成するステップ、
任意選択で、前記混合物をインキュベートするステップ、
前記混合物を遠心分離にかけて、ペレットおよび上清を生成するステップ、
前記ペレットを保持しながら、前記上清を廃棄するステップ、
前記ペレットを前記緩衝液で再懸濁して、再懸濁されたペレットを作成するステップ、
前記再懸濁されたペレットを遠心分離にかけて、第2の上清および第2のペレットを生成するステップ、および
生存ストレプトコッカスニューモニエを含有している前記第2のペレットを保持しながら、前記第2の上清を廃棄するステップを含む、調製するステップと
を含むことを特徴とする方法。 - 前記嫌気性血液培養陽性試料の前記一部分は、同容積の緩衝液と混合されて、前記混合物を生成することを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記嫌気性血液培養陽性試料の前記一部分は、0.335g/Lの前記緩衝液中の濃度のトリトンX−100を含む前記緩衝液と混合されて、前記混合物を生成することを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記第2のペレットを溶液で再懸濁し、質量分析法による前記微生物の同定、表現型同定、抗菌薬感受性試験、および分子試験からなる群から選択される前記再懸濁された第2のペレットの少なくとも1つの下流の試験を行うステップをさらに含むことを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 請求項1に記載の緩衝液の少なくとも1つの処方物を含むことを特徴とする血液培養陽性試料から微生物を分離し濃縮するためのキット。
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