RU2574917C2 - Реагент, позволяющий инактивировать микроорганизмы, экстрагировать и сохранять днк бактерий в форме, пригодной для высокоэффективной молекулярной диагностики - Google Patents
Реагент, позволяющий инактивировать микроорганизмы, экстрагировать и сохранять днк бактерий в форме, пригодной для высокоэффективной молекулярной диагностики Download PDFInfo
- Publication number
- RU2574917C2 RU2574917C2 RU2013138738/15A RU2013138738A RU2574917C2 RU 2574917 C2 RU2574917 C2 RU 2574917C2 RU 2013138738/15 A RU2013138738/15 A RU 2013138738/15A RU 2013138738 A RU2013138738 A RU 2013138738A RU 2574917 C2 RU2574917 C2 RU 2574917C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- reagent
- growth
- samples
- biological sample
- pcr
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title abstract description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 title abstract description 15
- 230000000415 inactivating Effects 0.000 title abstract description 7
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 title description 5
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 title 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 31
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims abstract description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 61
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 55
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 16
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 10
- NYNKJVPRTLBJNQ-UHFFFAOYSA-N N'-(3-aminopropyl)-N'-dodecylpropane-1,3-diamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCN(CCCN)CCCN NYNKJVPRTLBJNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 abstract description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 6
- 238000007865 diluting Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001737 promoting Effects 0.000 abstract 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 48
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 45
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 38
- 210000003802 Sputum Anatomy 0.000 description 38
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 33
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 20
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 15
- 229940010383 Mycobacterium tuberculosis Drugs 0.000 description 15
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 12
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 11
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000004642 transportation engineering Methods 0.000 description 9
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 8
- 230000000249 desinfective Effects 0.000 description 8
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 6
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 6
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 6
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 6
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 6
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 5
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000002683 reaction inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 230000000721 bacterilogical Effects 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001175 Cerebrospinal Fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000036826 Excretion Effects 0.000 description 2
- 208000006572 Human Influenza Diseases 0.000 description 2
- 206010022000 Influenza Diseases 0.000 description 2
- 241001302239 Mycobacterium tuberculosis complex Species 0.000 description 2
- 208000008128 Pulmonary Tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- -1 Tris-Cl, N-lauryl sarcosyl Chemical group 0.000 description 2
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial Effects 0.000 description 2
- 230000003616 anti-epidemic Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 2
- 230000003588 decontaminative Effects 0.000 description 2
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 230000002633 protecting Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- YIKWKLYQRFRGPM-UHFFFAOYSA-N 1-dodecylguanidine acetate Chemical compound CC(O)=O.CCCCCCCCCCCCN=C(N)N YIKWKLYQRFRGPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- XOVFABUBLIKHKL-UHFFFAOYSA-N C(C)(=O)ON(CN(OC(C)=O)OC(C)=O)OC(C)=O.[Na] Chemical compound C(C)(=O)ON(CN(OC(C)=O)OC(C)=O)OC(C)=O.[Na] XOVFABUBLIKHKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOUZRQUOKYMSAU-UHFFFAOYSA-N C(CCCCCCCCCCC)NC=CC Chemical group C(CCCCCCCCCCC)NC=CC LOUZRQUOKYMSAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 Central Nervous System Anatomy 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- RUPBZQFQVRMKDG-UHFFFAOYSA-M Didecyldimethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCC RUPBZQFQVRMKDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000003743 Erythrocytes Anatomy 0.000 description 1
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N Guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940083094 Guanine derivatives acting on arteriolar smooth muscle Drugs 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 210000004915 Pus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003324 RBC Anatomy 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 206010039587 Scarlet fever Diseases 0.000 description 1
- 206010044008 Tonsillitis Diseases 0.000 description 1
- 206010044325 Trachoma Diseases 0.000 description 1
- 241000390203 Trachoma Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001464 adherent Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003926 antimycobacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940027983 antiseptics and disinfectants Quaternary ammonium compounds Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 1
- JBIROUFYLSSYDX-UHFFFAOYSA-M benzyl-dodecyl-dimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 JBIROUFYLSSYDX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structures Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 231100000078 corrosive Toxicity 0.000 description 1
- 231100001010 corrosive Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- KVGOXGQSTGQXDD-UHFFFAOYSA-M decane-1-sulfonate Chemical compound CCCCCCCCCCS([O-])(=O)=O KVGOXGQSTGQXDD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive Effects 0.000 description 1
- 229960004670 didecyldimethylammonium chloride Drugs 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 201000000297 erysipelas Diseases 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000003172 expectorant agent Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 1
- 238000009114 investigational therapy Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 load Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940083145 peripherally acting antiadrenergic agents Guanine derivatives Drugs 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 1
- 150000003856 quaternary ammonium compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004805 robotic Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области медицины, а именно к реагенту для предварительной подготовки биологического образца in vitro диагностике инфекционного заболевания. Реагент для предварительной подготовки биологического образца к in vitro диагностике инфекционного заболевания методом ПЦР представляет собой водный раствор, содержащий спирт, щелочь и третичный амин в концентрациях, обеспечивающих повышение эффективности амплификации не менее чем на 2 цикла. Способ предварительной подготовки биологического образца. Способ хранения биологического образца. Применение реагента для предварительной подготовки биологического образца. Использование заявленного реагента позволяет эффективно очистить клетки от ингибиторов ПЦР-реакции, инактивировать микроорганизмы в биологических образцах, осуществить их разжижение с сохранением стабильности ДНК, обеспечив повышение амплификации не менее чем на 2 цикла. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 8 табл., 1 пр.
Description
Область изобретения
Изобретение относится к области биохимии, химии и медицины и касается разработки реагента для предварительной подготовки биологических образцов к in vitro диагностике инфекционных заболеваний молекулярно-генетическим методом.
Предпосылки изобретения
В настоящее время заболеваемость инфекционными заболеваниями остается очень высокой, а их распространенность - глобальной. До сих пор в мире ежегодно регистрируется свыше 1 миллиарда случаев инфекционных болезней желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей. Например, заболеваемость гриппом в отдельные годы составляет свыше 10-15% населения только в странах Европы и Америки. Еще 75 млн человек переносят другие острые респираторные инфекции (ОРЗ). Во время пандемий грипп приобретает характер стихийного бедствия, нанося странам огромный экономический ущерб.
Каждый год в мире регистрируется несколько десятков миллионов случаев заболеваний, вызванных стрептококками (ангины, скарлатина, рожа и другие). Широко распространена холера, которая в последние годы регистрируется более чем в 30 странах мира. В мире насчитывается более 400 млн больных трахомой и 11 млн больных проказой. Продолжает расти заболеваемость вирусными гепатитами.
В условиях, когда отступили самые массовые и тяжелые инфекции, в структуре инфекционной патологии стали более заметными болезни, которые вызываются условно-патогенными микроорганизмами и даже обычными «нормальными» обитателями организма человека.
В последние годы в разряд инфекционных перешли болезни, ранее к таковым не относившиеся. Имеется в виду почти неизвестная ранее группа очень своеобразных «медленных» инфекций. Так, отечественными исследователями М.С. Маргулисом, В.Д. Соловьевым, А.К. Шубладзе, Е.Н. Бычковой была доказана вирусная природа тяжелых болезней центральной нервной системы - острого энцефаломиелита человека и рассеянного склероза.
В соответствии с информацией ВОЗ, около 2 миллиардов людей, треть общего населения Земли, инфицировано M. tuberculosis. В настоящее время туберкулезом ежегодно заболевает 9 миллионов человек во всем мире, из них 3 миллиона умирают от его осложнений.
Проблемы борьбы с туберкулезом прежде всего заключаются в ранней диагностике этого заболевания, своевременно начатом лечении и проведении комплекса профилактических мероприятий в «очаге туберкулезной инфекции».
Существующие методы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний не отвечают потребностям клинической практики.
Быстрый метод бактериоскопии обладает низкой чувствительностью, так для обнаружения микобактерий туберкулеза (МБТ) в 1 мл патологического материала должно содержаться не менее 100000 клеток возбудителя. Люминесцентная микроскопия увеличивает чувствительность бактериоскопии на 10-30% и позволяет обнаружить 3000-10000 клеток возбудителя. Чувствительность бактериологического посева на плотные питательное среды в настоящее время остается золотым стандартом и составляет 50-100 МБТ. Однако по продолжительности это исследование составляет не менее 2 месяцев.
В этой связи разработка и внедрение в практику эффективных методов выявления и этиологического подтверждения этого заболевания, а также других инфекционных заболеваний приобретают первостепенное значение в современной клинической практике.
Одним из наиболее перспективных методов обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний является метод обнаружения ДНК возбудителей с помощью полимеразой цепной реакции (ПЦР).
ПЦР-диагностика позволяет выявить инфекционные заболевания, в частности туберкулез, в несколько раз быстрее, чем бактериологический метод. С другой стороны, с помощью ПЦР можно осуществлять эпидемиологический контроль за бактериовыделителями и тем самым решать вопросы продолжения антибактериального лечения для каждого конкретного случая, несмотря на кажущуюся клинико-рентгенологическую стабилизацию специфического процесса.
Обнаружение ДНК микроорганизмов методом ПЦР применяется в составе комплексной диагностики инфекционных заболеваний, позволяет быстро определить наличие специфического возбудителя и разработать эффективные клинические и эпидемиологические мероприятия в отношении больного.
Метод ПЦР обеспечивает высокую чувствительность и специфичность (подавляющее число производителей подобных тестов гарантируют чувствительность выше 95%, специфичность выше 98%).
В этой связи этот метод может быть использован как скрининговый при диагностике инфекционного заболевания, определении политики лечения, контроля его качества и оценке эпидемической значимости больного.
Время, затрачиваемое на определение ДНК инфекционных агентов, составляет 4-5 часов.
В случае массового скрининга больных на инфекционные заболевания, включая определение лекарственной устойчивости, с учетом внедрения автоматизированных (роботизированных) платформ для пробоподготовки, количество образцов может возрастать до 300 и более (при норме нагрузки 36 образцов обычной бактериологической лаборатории) за рабочий день, что свидетельствует о возможности концентрации большого количества биологически опасного материала в одном месте.
Кроме того, существенным препятствием для широкомасштабного скрининга на инфекционные заболевания является то, что экстракция ДНК из биологических образцов должна быть проведена в течение 48 часов после забора материала. Это обстоятельство предполагает ограничения для проведения скрининга и делает доставку и транспортировку материла (в течение указанного времени) чрезвычайно дорогостоящей и трудоемкой, особенно при реализации исследований, проводимых в дальних труднодоступных регионах. В случае забора биологических образцов, их доставки и последующего хранения свыше указанного срока образцы должны быть заморожены. Размораживание-замораживание образцов не допустимо из-за возможности разрушения в них ДНК, что существенно ограничивает скрининг на инфекционные заболевания, даже при наличии высокоспециализированной сети ПЦР-лабораторий (в доступных источниках не описан способ (кроме заморозки) доставки и транспортировки).
При обработке и исследовании биологического материала в ПЦР-лабораториях создается высокий риск инфицирования сотрудников и объектов окружающей среды. Несмотря на существующие меры противоэпидемической защиты в соответствии с действующими нормативно-методическими документами разработаны комплексные меры защиты персонала лабораторий. Заболеваемость персонала лабораторий, осуществляющих диагностику туберкулеза, остается чрезвычайно высокой и в 6-10 раз превышает таковую среди общего населения. Лекарственная устойчивость микобактерий среди сотрудников противотуберкулезной службы существенно превышает уровень лекарственной устойчивости среди общего населения и доходит до 50%. Лекарственная устойчивость среди других инфекционных заболеваний неуклонно возрастает по данным государственной статистики.
Образцы мокроты, поступающие в лаборатории на исследования, отличаются высоким содержанием инфекционного агента (от 5000 до 1000000 микроорганизмов в 1 мл материала). Манипуляции, производимые в лабораториях, даже при наличии средств защиты, являются несомненным фактором риска заражения медицинского персонала, поскольку при обработке данного материала формируется аэрозоль, который может содержать до 1000000 микроорганизмов.
Опасность также представляют транспортировка и хранение биологического материала, для которых требуются специальные условия по безопасности в определенный временной промежуток.
В настоящее время широко распространена ПЦР-диагностика различных возбудителей в крови. Однако, даже при самых серьезных заболеваниях, возбудитель достаточно редко определяется в крови (за исключением инфекций, передаваемых через кровь), что свидетельствует о необходимости исследования других биологических материалов, взятых у больных, с целью этиологического подтверждения диагноза.
Вместе с тем, биологический материал, полученный у больных, такой как мокрота, биоптаты, спинно-мозговая жидкость и тому подобное, содержит достаточно много биологических примесей, таких как кровь, гной, разнообразные белковые субстанции, которые в свою очередь являются ингибиторами ПЦР-реакции и не позволяют эффективно выделить ДНК возбудителя.
Разработка методов предварительной подготовки биологических образцов, позволяющих в последующем проводить эффективную экстракцию ДНК на основе очищения микробных клеток от ингибиторов ПЦР-реакции на стадии подготовки самого биологического образца, одновременно инактивировать микроорганизмы, разжижать образец и проводить данную подготовку однократным добавлением реагента к биологическому образцу (без дополнительных стадий смешения различных ингредиентов) и в последующем эффективно экстрагировать ДНК, хранить и транспортировать данный образец в течение длительного периода времени в целях проведения текущих и дальнейших исследований (на определение лекарственной устойчивости микроорганизмов), является важной задачей, позволяющей одновременно проводить качественную и быструю диагностику инфекционных заболеваний, эффективное лечение больного и осуществлять противоэпидемические мероприятия, направленные на защиту персонала лабораторий.
Наиболее сложными в отношении инактивации являются микобактерии туберкулеза. Благодаря особому химическому строению микобактерии туберкулеза обладают значительной устойчивостью к физическим и химическим агентам. Во влажной мокроте микобактерии выдерживают нагревание в течение 30 минут при 75ºС, при кипячении погибают через 5 минут. В выделенной мокроте МБТ погибают при 100ºС через 45 минут. В мокроте, выделенной и сохраняемой в темноте при комнатой температуре, жизнеспособность палочек сохраняется не менее 4 месяцев, в рассеянном свете они погибают через 1-11/2 месяца. В суховоздушной камере при увлажнении и температуре 80ºС МБТ выживают в течение 2 часов. Во внешней среде микобактерия туберкулеза достаточно устойчива. В уличной пыли МБТ сохраняются до 10 дней, на страницах книг - до 3 месяцев. В воде она может сохраняться до 150 дней. Высохшие микобактерии вызывают туберкулез у морских свинок через 1-1,5 года, лиофилизированные и замороженные жизнеспособны до 30 лет.
Существуют физические и химические способы инактивации микроорганизмов, к числу которых следует отнести кипячение, использование дезинфектантов, спиртов (этилового и изопропилового), четвертичных аммониевых соединений, гуанидиновых производных, альдегидов, третичных аминов. Устойчивость МБТ к физическим и химическим факторам обусловлена особенностью строения ее наружной мембраны.
С липидной фракцией внешней оболочки МБТ связывают устойчивость возбудителей туберкулеза к кислотам, щелочам и спиртам.
Известно, что гидроксид натрия (NaOH) обладает хорошим разжижающим эффектом. Этот реагент широко используется в пробоподготовке материала, особенно мокроты, полученной у больных туберкулезом, с целью его разжижения. Известно, что помимо разжижающего эффекта щелочь в концентрации более 2% способствует гибели клеток.
Обычно очистка от ингибиторов ПЦР-реакции проводится на стадии выделения ДНК, что предполагает лизис микробной клетки, выход ДНК в супернатант и ее смешивание с ингибиторами ПЦР-реакции, для чего требуются вспомогательные методы для дополнительного отделения искомой ДНК от других субстанций и ее последующая очистка и концентрация. В этой связи существующие методы выделения ДНК не обеспечивают достаточную чувствительность и специфичность ПЦР-анализа.
В доступных источниках описаны различные способы инактивации микроорганизмов, включая МБТ, к которым относятся кипячение, использование щелочей, органических растворителей, спиртов, детергентов и дезинфектантов.
Известны биоцидные моющие составы на основе N,N-бис-(3-аминопропил)лауриламина, содержащие N,N-бис-(3-аминопропил)лауриламин (ЕР 333143, 20.09.89), предназначенные для дезинфекции помещений и оборудования, но не предназначенные для использования в молекулярной диагностике.
Известно дезинфицирующее противомикобактиральное средство на основе N,N-бис-(3-аминопропил)лауриламина и воды, содержащее, кроме N,N-бис-(3-аминопропил)лауриламина и воды, хлорид дидецилдиметиламмония, этоксилаты жирных спиртов С8-С12, N-(лауриламинопропилен)глицин, додецилгуанидинацетат, метилендиаминтетраацетат натрия, хлорид лаурилдиметилбензиламмония, сульфаты жирных спиртов С12-С14, децилсульфонат, этанол, изопропиловый спирт (ЕР 343605, 29.05.89). Эти средства обладают бактерицидными свойствами, однако их использование в ПЦР-реакциях не предусматривается, они используются только в составе моющих средств при дезинфекции помещений и эндоскопического оборудования.
Описан инактивирующий реагент, входящий в состав диагностической системы GeneXpert. Составляющие этого инактивирующего реагента авторами не раскрыты. Однако в инструкции для пользователя и в многочисленных публикациях авторов сообщается, что инактивация МБТ ограничивается 100 клетками, полная инактивация образцов не гарантирована.
Известен раствор для инактивации микобактерий в биологическом образце, содержащий гидроксид натрия и изопропанол (Journal of Clinical Microbiology, Jan., 2010, p.229-237). Использование этого инактивирующего реагента, как отмечают сами авторы, не приводит к полной инактивации образца, а лишь снижает концентрацию микобактерий в образце до >2 КОЕ/мл.
Известен реагент для инактивации или деконтаминации микобактерий в клинических образцах, содержащий изотиоцианат гуанидина, Tris-Cl, N-лаурил саркозил, ЭДТК, меркаптоэтанол и ацетат аммония (патент RU 2338789, 20.01.08; заявка 2006124570). Использование этого раствора позволило авторам достигнуть чистоты выделенной ДНК. Вместе с тем, обработка клинических образцов этим раствором не приводит к адекватной концентрации ДНК в образце, что существенно снижает чувствительность ПЦР-анализа. Описанный реагент используется в модифицированном буфере для лизиса, который позволяет провести инактивацию образца на данной конкретной стадии. Обработка клинического образца данным реагентом приводит к лизису микобактериальной клетки и позволяет оптимизировать стадии очистки ДНК. Для разжижения образца по настоящему изобретению применяются вспомогательные стадии обработки щелочью средней силы и муколитическим средством. Авторы не сообщают об эффективности выделения ДНК с использованием описанного реагента и не указывают на возможность использования данного реагента для хранения и транспортировки образцов, а также о сохранении стабильности инактивированного образца со временем.
Таким образом, в литературе описаны многочисленные исследования, касающиеся использования различных реагентов для инактивации микроорганизмов в биологических (клинических) образцах. Однако ни в одном из них не рассматривается возможность использования такого реагента для комплексной подготовки биологических (клинических) образцов для ПЦР-исследования, включая очищение от ингибиторов ПЦР-реакции на стадии подготовки самих образцов, инактивацию, разжижение, возможность безопасной транспортировки, хранения клинических образцов и сохранения стабильности ДНК в данных образцах в течение длительного периода времени.
Цель изобретения
Основной целью изобретения является разработка реагента для предварительной подготовки биологического образца в форме, пригодной для in vitro диагностики инфекционных заболеваний молекулярно-генетическим методом.
Другая цель изобретения относится к дизайну реагента, позволяющего одновременно провести комплексную подготовку образца, включающую очищение микробных клеток от ингибиторов ПЦР-реакции, инактивацию и разжижение биологического образца.
Еще одна цель изобретения относится к разработке метода безопасной транспортировки клинических образцов в связи с поддержанием стабильности сохраняемой ДНК в клинических образцах (после получения образцов до поступления в скрининговую лабораторию может пройти до 4 суток).
Еще одной целью изобретения является безопасное хранение клинических образцов за счет их консервации в новом реагенте в случае необходимости проведения дополнительных ПЦР-исследований, в частности, для динамических наблюдений за больным на состояние носительства, определения лекарственной устойчивости МБТ и контроля качества лечения.
Еще одна цель изобретения заключается в возможности сохранения самого реагента в подходящей таре, в частности, в пластиковой или стеклянной, в течение не менее 1 года для использования с сохранением стабильности всех его параметров.
Еще одной целью изобретения является возможность сокращения времени подготовки биологического образца с помощью его однократного добавления к биологическому материалу.
Сущность изобретения
В одном аспекте изобретение относится к реагенту для подготовки биологического образца к in vitro диагностике инфекционного заболевания методом ПЦР. Реагент представляет собой водный раствор, содержащий спирт, щелочь и третичный амин в концентрациях, обеспечивающих повышение эффективности амплификации не менее чем на 2 цикла.
Совокупность признаков реагента обеспечивает комплексную подготовку биологических образцов, включающую очистку, отмывку микробных клеток от ингибиторов ПЦР-реакции, инактивацию, разжижение и сохранение стабильности ДНК в течение не менее 3 месяцев, что позволяет безопасно транспортировать и хранить клинические образцы, а также использовать их для последующих исследований.
В некоторых случаях допустимо снижение содержания щелочи в составе реагента, что приводит к снижению коррозийных свойств, увеличивает срок годности реагента, упрощает условия хранения и использования, при этом не отмечается снижения эффективности пробоподготовки.
В другом аспекте изобретение относится к способу подготовки биологического образца к in vitro диагностике инфекционного заболевания методом ПЦР, предусматривающему обработку его реагентом в течение не менее 1 часа.
Также изобретение относится к способу хранения биологического образца, пригодного для in vitro диагностики инфекционного заболевания методом ПЦР, предусматривающему обработку его реагентом в течение не менее 1 часа. Предложенный способ хранения позволяет повысить выход исследуемой ДНК после 4 дней и до 3 месяцев хранения.
Подробное описание изобретения
Авторами настоящего изобретения получен реагент для предварительной подготовки биологических образцов, таких как мокрота, спинно-мозговая жидкость, биоптаты тканей и другие, в форме, пригодной для in vitro диагностики инфекционных заболеваний молекулярно-генетическим методом вследствие очищения микробных клеток от ингибиторов ПЦР-реакции на стадии подготовки данных образцов, инактивации микроорганизмов, в том числе микобактерий туберкулезного комплекса (МБТ), в биологических (клинических) образцах, разжижения образцов и сохранения стабильности ДНК в биологических образцах для проведения последующих исследований (после добавления реагента и экспозиции биологического материала в течение от не менее 1 часа до 4 суток). Возможность исследования данного биологического образца сохраняется в течение не более 3 месяцев. Кроме того, хранение реагента в стеклянной или пластиковой таре (полипропилен) в течение года обеспечивает сохранение и стабильность всех составляющих реагента, возможность его использования в течение данного времени, а также транспортировку к месту сбора биологических образцов. В связи с применением реагента (однократного добавления к биологическому материалу) и экспозиции не менее 1 часа сокращается время подготовки биологического образца (особенно мокроты) для ПЦР-диагностики по меньшей мере на 2-3 часа.
В состав реагента входят:
1. Спирт, например изопропанол. Использование изопропилового спирта позволяет снизить поверхностное натяжение на границе дезинфектант - клеточная мембрана микроорганизма, повысить проникновение действующих веществ (дезинфектанта) в клеточные структуры микроорганизма, что, в свою очередь, позволяет быстрее достигать инактивации микроорганизма и использовать для этого меньшие концентрации дезинфицирующего средства. Известно, что при равных концентрациях раствор изопропилового спирта проявляет большую бактерицидную активность, чем раствор этилового спирта.
2. Третичный амин, например N,N-бис-(3-аминопропил)додециламина. В ходе проведенных исследований было неожиданно установлено, что третичный амин в сочетании со спиртом обеспечивает очистку микробных клеток и избавляет их от прилипших ингибиторов ПЦР-реакции, при этом не оказывая разрушающего действия на клеточную стенку и способствуя сохранению стабильности ДНК и облегчая ее экстракцию при дальнейшем исследовании.
3. NaOH в качестве разжижающего агента.
Были получены различные варианты реагента (изменялись соотношения компонентов, входящих в его состав) и изучена их активность. Подбор количественного соотношения компонентов, входящих в состав реагента, находится в компетенции специалиста в данной области и зависит от вида биологического образца, исследуемого на наличие того или иного патогенного или условно-патогенного инфекционного агента.
Изучение активности различных вариантов состава реагента
В этой связи, в соответствии с различиями в концентрациях были исследованы растворы А, В, С, D (таблица 1) и обычный метод - кипячение.
| Таблица 1 Состав растворов, используемых в работе |
|
| Раствор | Состав раствора |
| A | Изопропанол 40%, 0,2М (2,4%) NaOH, 0,075% N,N-бис-(3-аминопропил)додециламина |
| B | Изопропанол 40% |
| C | Н-Бутанол 20% |
| D | Н-Бутанол 20%, 0,2М (4%) NaOH |
Были исследованы образцы, полученные у больных с диагнозом туберкулез легких. Из каждого образца был сделан мазок, который красили люминесцентными красителями для выявления кислотоустойчивых палочек. Во всех образцах были обнаружены кислотоустойчивые бациллы. Образцы мокроты разделяли на 5 групп, которые обрабатывались растворами А, В, С, D и кипячением.
Лучше всего разжижал мокроту раствор А (реагент).
Было использовано разное время экспозиции с растворами A, B, C, D: 1 час, 24 часа и 4 суток. По истечении срока экспозиции 0,5 мл каждого разжиженного и хорошо перемешанного образца отбирали в микроцентрифужную пробирку и использовали для выделения ДНК, 0,5 мл отбирали в 50-мл пробирку, отмывали 2 раза фосфатным буфером и засевали на жидкую питательную среду Middlebrook 7H9 в пробирки MGIT, которые помещали в аппарат BACTEC MGIT 960 для автоматической детекции роста.
В качестве контроля использовали мокроту 12 бациллярных больных, предобработанную стандартным методом с использованием реагента NALC-NaOH.
Отрицательный результат (роста микобактериальной культуры нет) выдавали через 42 дня после посева.
Результаты посева на BACTEC MGIT 960 представлены в таблице 2.
| Таблица 2 Результаты посева образцов мокроты, обработанных растворами А, В, С и D и стандартным реагентом NALC-NaOH |
| Метод предобработки мокроты | Время предобработки | Номер образца | Результат посева | Время от момента посева до детекции роста в пробирке, дни |
| Стандартное разжижение NALC-NaOH | 20 минут (стандартное) | 1 | рост есть | 7 |
| 2 | рост есть | 8 | ||
| 3 | рост есть | 9 | ||
| 4 | рост есть | 8 | ||
| 5 | рост есть | 8 | ||
| 6 | рост есть | 9 | ||
| 7 | рост есть | 8 | ||
| 8 | рост есть | 7 | ||
| 9 | рост есть | 7 | ||
| 10 | рост есть | 10 | ||
| 11 | рост есть | 7 | ||
| 12 | рост есть | 8 |
| Метод предобработки мокроты | Время предобработки | Номер образца | Результат посева | Время от момента посева до детекции роста в пробирке, дни |
| Раствор А | 1 час | 1А | роста нет | -- |
| 2А | роста нет | -- | ||
| 3А | роста нет | -- | ||
| 24 часа | 1А | роста нет | -- | |
| 2А | роста нет | -- | ||
| 3А | роста нет | -- | ||
| 4 суток | 1А | роста нет | -- | |
| 2А | роста нет | -- | ||
| 3А | роста нет | -- |
| Метод предобработки мокроты | Время предобработки | Номер образца | Результат посева | Время от момента посева до детекции роста в пробирке, дни |
| Раствор B | 1 час | 4B | роста нет | -- |
| 5B | роста нет | -- | ||
| 6B | роста нет | -- | ||
| 24 часа | 4B | роста нет | -- | |
| 5B | роста нет | -- | ||
| 6B | роста нет | -- | ||
| 4 суток | 4B | роста нет | -- | |
| 5B | роста нет | -- | ||
| 6B | роста нет | -- |
| Метод предобработки мокроты | Время предобработки | Номер образца | Результат посева | Время от момента посева до детекции роста в пробирке, дни |
| Раствор C | 1 час | 7C | роста нет | -- |
| 8C | роста нет | -- | ||
| 9C | роста нет | -- | ||
| 24 часа | 7C | роста нет | -- | |
| 8C | роста нет | -- | ||
| 9C | роста нет | -- | ||
| 4 суток | 7C | роста нет | -- | |
| 8C | роста нет | -- | ||
| 9C | роста нет | -- |
| Метод предобработки мокроты | Время предобработки | Номер образца | Результат посева | Время от момента посева до детекции роста в пробирке, дни |
| Раствор D | 1 час | 10D | роста нет | -- |
| 11D | роста нет | -- | ||
| 12D | роста нет | -- | ||
| 24 часа | 10D | роста нет | -- | |
| 11D | роста нет | -- | ||
| 12D | роста нет | -- | ||
| 4 суток | 10D | роста нет | -- | |
| 11D | роста нет | -- | ||
| 12D | роста нет | -- |
Результаты ПЦР представлены в таблицах 3-6.
| Таблица 3 Результаты ПЦР после предобработки мокроты раствором А |
|||||||
| Краситель | Время экспозиции | Образец # 1А | Образец # 2А | Образец # 3А | |||
| Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | ||
| FAM | 1 час | 22,13 | 0,04 | 22,56 | 0,28 | 20,08 | 0,08 |
| 24 часа | 21,12 | 0,00 | 21,40 | 0,01 | 19,34 | 0,04 | |
| 4 суток | 19,55 | 0,04 | 20,07 | 0,03 | 17,32 | 0,03 | |
| ROX | 1 час | 27,43 | 0,01 | 27,78 | 0,15 | 25,32 | 0,08 |
| 24 часа | 26,31 | 0,06 | 26,71 | 0,06 | 24,51 | 0,10 | |
| 4 суток | 24,78 | 0,01 | 25,36 | 0,01 | 22,37 | 0,06 | |
| Таблица 4 Результаты ПЦР после предобработки мокроты раствором В |
|||||||
| Краситель | Время экспозиции | Образец # 4В | Образец # 5В | Образец # 6В | |||
| Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | ||
| FAM | 1 час | 20,49 | 0,11 | 16,30 | 0,06 | 22,89 | 0,20 |
| 24 часа | 20,86 | 0,07 | 16,91 | 0,10 | 23,31 | 0,21 | |
| 4 суток | 21,00 | 0,30 | 16,82 | 0,33 | 23,38 | 0,01 | |
| ROX | 1 час | 26,09 | 0,10 | 21,64 | 0,02 | 28,40 | 0,21 |
| 24 часа | 26,41 | 0,04 | 22,23 | 0,09 | 28,62 | 0,18 | |
| 4 суток | 26,41 | 0,25 | 22,08 | 0,24 | 28,88 | 0,01 | |
| Таблица 5 Результаты ПЦР после предобработки мокроты раствором С |
|||||||
| Краситель | Время экспозиции | Образец # 7С | Образец # 8С | Образец # 9С | |||
| Среднее значение(Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | ||
| FAM | 1 час | 23,40 | 0,06 | 22,85 | 0,05 | 23,70 | 0,57 |
| 24 часа | 23,02 | 0,06 | 22,80 | 0,06 | 22,04 | 0,03 | |
| 4 суток | 20,35 | 0,16 | 20,45 | 0,07 | 19,87 | 0,12 | |
| ROX | 1 час | 28,96 | 0,01 | 28,22 | 0,04 | 28,75 | 0,32 |
| 24 часа | 28,13 | 0,06 | 27,81 | 0,06 | 27,09 | 0,02 | |
| 4 суток | 24,84 | 0,03 | 25,21 | 0,13 | 24,45 | 0,11 | |
| Таблица 6 Результаты ПЦР после предобработки мокроты раствором D |
|||||||
| Краситель | Время экспозиции | Образец # 10D | Образец # 11D | Образец # 12D | |||
| Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | ||
| FAM | 1 час | 21,79 | 0,30 | 20,14 | 0,09 | 19,19 | 0,05 |
| 24 часа | 22,17 | 0,01 | 21,15 | 0,25 | 18,62 | 0,27 | |
| 4 суток | 21,69 | 0,01 | 20,23 | 0,28 | 18,75 | 0,18 | |
| ROX | 1 час | 27,13 | 0,18 | 25,37 | 0,10 | 24,21 | 0,01 |
| 24 часа | 26,79 | 0,01 | 26,41 | 0,29 | 23,80 | 0,01 | |
| 4 суток | 26,62 | 0,09 | 25,04 | 0,13 | 23,97 | 0,22 | |
В результате проведенных исследований было установлено следующее.
1. Лучше всего разжижал мокроту раствор А (реагент).
2. Обработка материала растворами A, B, C и D в течение 1 ч и 24 ч экспозиции не влияла на эффективность выделения ДНК и ПЦР.
3. Экспозиция в течение 4 суток с растворами А и С приводила к увеличению эффективности выделения ДНК (в среднем на 2 амплификационных цикла) по сравнению с 1 ч и 24 ч экспозиции, тогда как экспозиция с растворами B и D в течение 4 суток не оказывала влияния на эффективность ПЦР.
4. Обработка мокроты растворами А, В, С и D приводила к гибели микобактериальных клеток при всех сроках экспозиции.
5. Предобработка реагентами более предпочтительна, чем кипячение, так как является более технологичным методом, сочетающим в себе разжижение, деконтаминацию и инактивацию мокроты одновременно.
На второй стадии была проведена работа по подбору оптимальных концентраций компонентов раствора (таблица 7), объемов реагента и протоколов пробоподготовки для молекулярно-генетического исследования мокроты больных с диагнозом туберкулез легких.
| Таблица 7 Подбор оптимальных концентраций компонентов раствора |
|
| Раствор | Состав раствора |
| A2 | Изопропанол 40%, 0,6М (12%) NaOH |
| A3 | Изопропанол 40%, 0,2М (2,4%) NaOH, 0,3% N,N-бис-(3-аминопропил)додециламина |
| A4 | Изопропанол 40%, 1М (20%) NaOH |
| A5 | Изопропанол 40%, 0,2М (2,4%) NaOH, 0,075% N,N-бис-(3-аминопропил)додециламина |
Схему пробоподготовки образцов мокроты разрабатывали, используя растворы А2 и А3, далее сравнивали ее со стандартной схемой пробоподготовки с использованием NALC-NaOH. Выделение ДНК проводили ручным и автоматическим способами. Результат оценивали по следующим критериям: разжижение мокроты, образование осадка после центрифугирования, выход ДНК после выделения, деградация ДНК при действии реагента. Исследовали следующие способы пробоподготовки:
- стандартная обработка NALC-NaOH;
- добавление раствора А в количестве от 20 до 50 мл к образцу объемом 3-5 мл.
В результате проведенных исследований образцов мокроты было установлено следующее.
1. Лучше всего разжижает образцы раствор А3. В этом случае отмечался неожиданный эффект: по мере снижения концентрации щелочи и добавления третичного амина отмечалось более гомогенное разжижение, позволяющее эффективно проводить последующие стадии исследования. Кроме того, содержание в растворе щелочи в количестве 12% обуславливает выраженный коррозийный эффект, что создает опасность при работе с реагентом и ограничивает его транспортировку. Снижение концентрации щелочи до 2,4% существенным образом снижает это нежелательное свойство.
На образцах нативной мокроты был проведен эксперимент по влиянию предобработки с использованием растворов А2, А4 и А5 на выделение ДНК ручным и автоматическим способами. Схема пробоподготовки состояла в добавлении раствора А к образцам в количестве от 20 до 50 мл. Критерии оценки результата были аналогичны предыдущим экспериментам. Использованная схема пробоподготовки показала хорошие результаты, растворы А2 и А5 были выбраны для дальнейших экспериментов.
Влияние различных способов предобработки мокроты с использованием растворов А2 и А5 на выделение и деградацию ДНК в сравнении со стандартной процедурой обработки с помощью NALC-NaOH проводили на образцах мокроты. Исследовали следующие способы пробоподготовки:
- стандартная обработка NALC-NaOH;
- добавление раствора A2 к образцу мокроты в количестве до 50 мл и перемешивание в течение 1 ч;
- добавление раствора A2 к образцу мокроты в количестве до 50 мл, перемешивание в течение 1 ч и инкубация в течение 96 часов;
- добавление раствора A5 к образцу мокроты в количестве до 50 мл и перемешивание в течение 1 ч;
- добавление раствора A5 к образцу мокроты в количестве до 50 мл, перемешивание в течение 1 ч и инкубация в течение 96 часов.
В результате проведенных исследований были сделаны следующие выводы.
1. Предобработка А5 повышает выход ДНК и, следовательно, чувствительность системы по сравнению со стандартной предобработкой NALC-NaOH при автоматическом способе выделения в среднем в 16,3 раза, при ручном способе - в среднем в 11,4 раза.
2. Инкубация образцов, обработанных А5 в течение 96 часов, не только не приводит к деградации ДНК и уменьшению выхода при выделении, в сравнении с обработкой NALC-NaOH, но и значительно повышает выход ДНК даже при сравнении с образцами, которые перемешивали в присутствии реагента в течение 1 часа без последующей инкубации.
Для окончательного выбора состава реагента проводили сравнение обработки образцов мокроты с различным содержанием ДНК M. tuberculosis complex, обработанных растворами А2 и А5. Результаты представлены в таблице 8.
| Таблица 8 Оценка воздействия реагентов А2 и А5 на выделение ДНК из клеток M. tuberculosis при использовании ручного и автоматического способов пробоподготовки |
||||
| Количество клеток | Количество копий ДНК, А2 | Количество копий ДНК, А5 | ||
| ручной способ | автоматический способ | ручной способ | автоматический способ | |
| 107-109 | 0,3×108 | 0,6×107 | 0,6×108 | 0,8×107 |
| 104-106 | 0,4×105 | 0,3×105 | 0,7×105 | 0,6×105 |
| 50-100 | 0,6×102 | 0,4×102 | 0,8×102 | 0,6×102 |
| 0-20 | 50 | 24 | 70 | 36 |
Как видно из таблицы, обработка реагентом А5 приводила к более эффективному выделению ДНК как при ручном, так и при автоматическом способе пробоподготовки. Особенно важным является эффективная экстракция ДНК при малом количестве клеток в материале, которая заметно выше при обработке материала реагентом А5, который был выбран как наиболее эффективный.
В последующих экспериментах была показана возможность использования реагента А5 как на нативном материале, так и на материале, прошедшем стандартную пробоподготовку с помощью NALC-NaOH, причем эффективность выделения ДНК при использовании реагента по сравнению со стандартной пробоподготовкой была выше в 5-10 раз.
Испытания реагента для обработки диагностического материала проводили с использованием образцов мокроты у больных туберкулезом с массивным бактериовыделением, подтвержденным бактериоскопическим методом исследования. Образцы были поделены на 3 части. Первую часть образцов (контроль роста МБТ) подвергали стандартной предобработке NALC-NaOH, затем культивировали на жидкой среде в системе BACTEC MGIT 960. Другую часть образцов инкубировали 1 ч с 20-50 мл реагента, затем дважды отмывали фосфатным буфером и также культивировали в системе BACTEC MGIT 960. Третью часть образцов обрабатывали стандартным методом NALC-NaOH, к полученным осадкам добавляли 0,5 мл реагента.
Ни в одном из исследованных образцов при культивировании в течение 42 дней в системе BACTEC MGIT 960 после инкубации с реагентом А5 рост МБТ не выявлен. В контрольных пробирках, без обработки реагентом А5, получен рост МБТ. В целях понимания сущности улучшения экстракции ДНК при ПЦР-анализе было проведено исследование образцов после обработки выбранным реагентом в течение 1 часа. Исследовано 100 образцов мокроты. При рассмотрении в реверсивный микроскоп после обработки реагентом клетки оказывались “чистыми” от примесей (фрагментов, «окружающих» клетку, волокон, белков). При этом разрыва клеток при обработке реагентом не происходило, т.о. внутриклеточная ДНК оставалась внутри клетки, а сама клетка оставалась свободной от ингибирующих ПЦР субстанций, что в последующем повышало эффективность экстракции ДНК. При обработке образцов реагентом, содержащим только щелочь и спирт, после 1 часа экспозиции эффекта, подобного таковому при обработке раствором А5, не наблюдалось. При рассмотрении в реверсивный микроскоп отмечалось большое число “прилипших” к клеткам субстанций, особенно волокон и эритроцитов.
Claims (5)
1. Реагент для предварительной подготовки биологического образца к in vitro диагностике инфекционного заболевания методом ПЦР, представляющий собой водный раствор, содержащий спирт, щелочь и третичный амин в концентрациях, обеспечивающих повышение эффективности амплификации не менее чем на 2 цикла.
2. Реагент по п. 1, который содержит 40% изопропанол, 0,2 М (2,4%) NAOH и 0,075-0,3% N,N-бис-(3-аминопропил)додециламин.
3. Способ предварительной подготовки биологического образца к in vitro диагностике инфекционного заболевания методом ПЦР, предусматривающий обработку реагентом по п. 1 или 2 в течение не менее 1 часа.
4. Способ хранения биологического образца, пригодного для in vitro диагностики инфекционного заболевания методом ПЦР, предусматривающий осуществление способа по п. 3.
5. Применение реагента по п. 1 или 2 для предварительной подготовки биологического образца к in vitro диагностике инфекционного заболевания методом ПЦР и хранения указанного биологического образца.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013138738/15A RU2574917C2 (ru) | 2013-08-20 | Реагент, позволяющий инактивировать микроорганизмы, экстрагировать и сохранять днк бактерий в форме, пригодной для высокоэффективной молекулярной диагностики | |
| PCT/RU2014/000616 WO2015026268A1 (en) | 2013-08-20 | 2014-08-19 | Reagent allowing for microorganism inactivation, extraction and storage of bacterial dna in form suitable for highly effective molecular diagnostics |
| EA201690347A EA032990B1 (ru) | 2013-08-20 | 2014-08-19 | Реагент для обработки и хранения биологического образца |
| ZA2016/01149A ZA201601149B (en) | 2013-08-20 | 2016-02-19 | Reagent allowing for microorganism inactivation, extraction and storage of bacterial dna in form suitable for highly effective molecular diagnostics |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013138738/15A RU2574917C2 (ru) | 2013-08-20 | Реагент, позволяющий инактивировать микроорганизмы, экстрагировать и сохранять днк бактерий в форме, пригодной для высокоэффективной молекулярной диагностики |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013138738A RU2013138738A (ru) | 2015-02-27 |
| RU2574917C2 true RU2574917C2 (ru) | 2016-02-10 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4843012A (en) * | 1986-09-17 | 1989-06-27 | Genetics Institute, Inc. | Novel composition for nucleic acid purification |
| RU2129610C1 (ru) * | 1997-04-04 | 1999-04-27 | Иркутский научно-исследовательский противочумной институт Сибири и Дальнего Востока | Способ выделения днк из микроорганизмов и клеток животных, пригодной для постановки полимеразной цепной реакции |
| RU2230120C2 (ru) * | 2002-04-08 | 2004-06-10 | Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана | Способ выделения днк микроорганизмов |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4843012A (en) * | 1986-09-17 | 1989-06-27 | Genetics Institute, Inc. | Novel composition for nucleic acid purification |
| RU2129610C1 (ru) * | 1997-04-04 | 1999-04-27 | Иркутский научно-исследовательский противочумной институт Сибири и Дальнего Востока | Способ выделения днк из микроорганизмов и клеток животных, пригодной для постановки полимеразной цепной реакции |
| RU2230120C2 (ru) * | 2002-04-08 | 2004-06-10 | Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана | Способ выделения днк микроорганизмов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Shot protocols in molecular biology: a compendium of method From Current protocols in molecular biology. USA "WILEY", published by JOHN Wiley, Sons, INC, 2002. v2, р.22-1 -22-7. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pagnier et al. | A decade of improvements in Mimiviridae and Marseilleviridae isolation from amoeba | |
| Benschop et al. | Post-coital vaginal sampling with nylon flocked swabs improves DNA typing | |
| JP6542531B2 (ja) | 陽性血液培養物から生存微生物を分離するための処方物およびプロセス | |
| Kwan et al. | Evaluation of procedures for the collection, processing, and analysis of biomolecules from low-biomass surfaces | |
| Litster et al. | Detection of feline upper respiratory tract disease pathogens using a commercially available real-time PCR test | |
| Hasan et al. | In vitro production of Clostridium difficile spores for use in the efficacy evaluation of disinfectants: a precollaborative investigation | |
| López et al. | Detection of Sars-Cov-2 in the air of two hospitals in Hermosillo, Sonora, México, utilizing a low-cost environmental monitoring system | |
| CN112725406A (zh) | 一种免核酸提取的灭活型病毒保存液及其应用 | |
| EP3348634B1 (en) | Method for separating nucleic acid from sample comprising nucleic acid, and device therefor | |
| Brosnahan et al. | Optimisation and validation of a PCR to detect viable Tenacibaculum maritimum in salmon skin tissue samples | |
| Donnison | Isolation of thermotolerant Campylobacter–Review & methods for New Zealand laboratories | |
| da Silva et al. | Diagnosis of Enterocytozoon bieneusi (microsporidia) infections by polymerase chain reaction in stool samples using primers based on the region coding for small-subunit ribosomal RNA | |
| RU2574917C2 (ru) | Реагент, позволяющий инактивировать микроорганизмы, экстрагировать и сохранять днк бактерий в форме, пригодной для высокоэффективной молекулярной диагностики | |
| Giladi et al. | Microbiological cultures of heart valves and valve tags are not valuable for patients without infective endocarditis who are undergoing valve replacement | |
| Noomi et al. | Evaluation of Isolation and Polymerase Chain Reaction in Diagnosis of Mycoplasma Gallisepticum in Broiler Chickens in Kirkuk Governorate, Iraq | |
| Cadmus et al. | Methods of sputum decontamination with emphasis on local tuberculosis laboratories | |
| WO2015026268A1 (en) | Reagent allowing for microorganism inactivation, extraction and storage of bacterial dna in form suitable for highly effective molecular diagnostics | |
| JP2014097051A (ja) | 抗酸菌の溶菌試薬および当該試薬を用いた抗酸菌の検出方法 | |
| Koteit et al. | Distribution of potentially pathogenic Acanthamoeba isolates in the environment of Helwan University, Egypt | |
| Arseculeratne et al. | The assessment of the viability of the endospores of Rhinosporidium seeberi with MTT (3-[4, 5-dimethyl-2-thiazolyl]-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) | |
| CN111926055B (zh) | 一种hpv样品采集保存卡及其制备方法 | |
| Irfan et al. | Evaluation of a microcolony detection method and phage assay for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples | |
| Subramanyam et al. | An alternative sputum processing method using chitin for the isolation of Mycobacterium tuberculosis | |
| Suwarsono et al. | The Evaluations of Bleach as Decontaminant Solution to Promote The Positivity Rate of Mycobacterium Tuberculosis Culture for Sputum Specimen | |
| Wisessombat et al. | A new biphasic test for the detection of Helicobacter pylori in gastric biopsies |