JP2015508667A - 陽性血液培養物から生存微生物を分離するための処方物およびプロセス - Google Patents

Abstract

本明細書に開示される種々の実施形態は、血液培養陽性試料から肺炎連鎖球菌を含む生存微生物細胞を迅速に分離するための試薬および方法を提供する。得られた微生物ペレットは、同定方法と抗菌薬感受性試験などの成長ベースの方法との両方で使用され得る。本明細書に記載の緩衝液は、基礎液、非イオン性洗剤、チオール、および任意選択で塩化アンモニウムを含有することができる。開示される方法は、哺乳類の血液細胞から、同定方法を妨害し得る細胞残屑を除去するとともに、単に１つの試料調製チューブおよび遠心分離を用いてＰＢＣ試料から生存微生物を迅速に分離し濃縮するためのプロセスを提供する。

Description

本発明は、血液培養陽性試料から生存微生物を分離し濃縮するための緩衝液、及び、その方法に関する。

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年２月２９日に出願した米国仮出願第６１／６０４，７３２号の出願日の利益を主張し、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。

関連出願
本出願は、２０１１年１０月７日に出願した特許文献１の出願日の利益を主張する２０１２年１０月８日に出願した特許文献２に主題が関連し、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。

敗血症は、感染に対する宿主免疫系の過剰反応によって引き起こされる深刻な疾患である。それは、血流障害を生じ得る広範囲の炎症を引き起こす可能性がある。敗血症が進行すると、体の臓器は酸素および栄養素が不足して、恒久的な損傷および最終的な不全を引き起こす可能性がある。不適切な診断または未治療で放置されると、心臓が衰弱し敗血症ショックが生じ、多臓器不全および死亡を招く可能性がある。敗血症患者の血液中のバクテリアまたは酵母の存在を検出するために血液培養物が必要とされる。微生物が存在する（血液培養陽性（「positive blood culture：ＰＢＣ」）である）場合、適切な治療を提供するために、微生物が同定され、抗生物質感受性が決定されなければならない。分離、同定、および抗生物質感受性試験（「ＡＳＴ」）の実施のためにＰＢＣ試料が使用される。微生物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを含む質量分析などの方法、またはＰｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤなどの表現型成長（phenotypic growth）ベースの方法によって同定されることが多い。

微生物を同定し、微生物に表現型分析を行い、ＡＳＴ試験を行うために、無傷の生存微生物が、採取された試料における血液細胞および他の物質から分離される必要がある。質量分析法による微生物の同定のために、微生物試料は、血液細胞成分、他の細胞残屑、および塩のようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ同定を妨害することが知られる物質が、十分に除かれている必要がある。加えて、微生物試料は、信頼できる同定を得るために十分な量である必要がある。Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤなどの表現型同定方法は、検査の酵素基質を妨害することがある物質が除かれた無処置の生存微生物を必要とする。Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＡＳＴなどのＡＳＴ試験のために、微生物試料は、検査の実施中に、耐性機構が存在する場合、抗生物質の存在下で成長できる改変されない生存微生物を含む必要がある。残留血液または培養液成分のキャリーオーバー（carryover）が、直接妨害する、または微生物の濃度（濁度）を不正に増大することで妨害するので、すべての方法において十分な量および純度があることが重要である。

ＰＢＣ試料から生存微生物を分離するための現行の技法は、微生物を継代培養することを含み、これは最大７２時間を要する可能性がある。これは、治療の遅延または不適切な抗生物質による治療を招くことになる。

微生物のいくつかの菌種については、例えば、ストレプトコッカスニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）（肺炎連鎖球菌）などの有機体の生存能力（viability）を維持しながら、ＰＢＣ試料から分離することが特に難しい。この難しさの一部は、微生物細胞を「自滅」させる、肺炎連鎖球菌による自己溶解素の活性化に由来する。例えば、非特許文献１参照。肺炎連鎖球菌を含む微生物を敗血症患者から分離するための現行の方法は、血液培養ボトルに接種することを含む。陽性のシグナルが得られると、ＰＢＣ試料の一部分がグラム染色を行うために除去され、別の部分が微生物を継代培養するために使用される。継代培養からの微生物コロニーが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる同定、表現型同定方法、およびＡＳＴ試験などの下流試験を行うために使用される。

ＰＢＣ試料から生存微生物を分離するための追加の技法は、ＰＢＣ試料中の血液細胞を溶解する洗剤を有する溶解緩衝液を含む液体分離方法を利用することが多い。溶解後、微生物が保持されながら溶解血液細胞が除去され得る。しかしながら、これらの溶解緩衝液の使用は、ＡＳＴ試験などいくつかの成長ベースの同定方法を行うためには不十分な微生物、すなわち、障害があり、損傷し、または生存不可能な微生物をもたらすことが多い。

１つのそのような液体分離方法であるＢｒｕｋｅｒ Ｓｅｐｓｉｔｙｐｅｒ（商標）システムは、微生物を継代培養する必要なしに、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによるＰＢＣ試料からの微生物の直接試験を可能にする。この方法は、ドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）および遠心分離を用いて、微生物のペレットを生成する。Ｓｅｐｓｉｔｙｐｅｒ（商標）方法は一般に微生物ペレットのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ試験をサポートするが、微生物細胞壁に対する過酷な洗剤の相互作用により、成長ベースの同定方法およびＡＳＴ方法をサポートするために十分な生存能力がない。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析のために細菌ペレットを調製するために塩化アンモニウムを使用してＰＢＣ試料中の赤血球を溶解するための方法が開示されている（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、これらの方法は、肺炎連鎖球菌を含む微生物のパネル全体にわたって信頼できるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳデータを得るには十分でない。加えて、これらの方法が、成長ベースの同定方法およびＡＳＴ試験で使用するために微生物の十分な生存能力を維持するであろうことを示す指標が存在しない。

血液細胞を溶解し、塩化アンモニウムを用いて特定のタイプの血液細胞を選択的に溶解するための洗剤の使用が提案されている（例えば、非特許文献３参照）。しかしながら、この参考文献は、妨害物質がないＰＢＣ試料からの生存微生物の分離を可能にし、また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ同定およびＡＳＴ試験など、１つのＰＢＣ試料からの複数の下流試験を可能にする、特定の処方物または方法に関しては何も述べていない。

非特許文献３とＮａｓｓｉｆらの特許文献３の両方では、ＰＢＣ試料から微生物を分離するための方法であって、サポニンおよび／または塩化アンモニウムをＰＢＣ試料の一部分に加え、混合物を遠心分離にかけ、得られたペレットを水で洗浄して残留血液タンパク質を除去することによって、ＰＢＣ試料から赤血球を除去することを含む方法を説明している。しかしながら、これらの方法は、微生物のパネル全体にわたる種レベルの微生物の同定に矛盾が生じ、かつ／または肺炎連鎖球菌の同定に失敗する。さらに、これらの方法が、ＡＳＴなどの成長ベースの試験方法を行うために十分な生存能力を有する微生物ペレットをもたらすという指標が存在しない。

米国特許仮出願第６１／５４４，４０７号明細書 米国特許出願第１３／６４７，０７２号明細書 国際公開第２０１０／１００６１２号パンフレット 米国特許第５，９２２，５９３号明細書 米国特許第６，０９６，２７２号明細書 米国特許第６，３７２，４８５号明細書 米国特許第６，８４９，４２２号明細書 米国特許第７，１１５，３８４号明細書 米国特許出願第１３／６３６，９４４号明細書

"Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｓｔ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｏｔｔｌｅｓ ａｓ ａｎ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ Ｔｏ Ｄｉａｇｎｏｓｅ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ"， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４３， Ｎｏ．５， Ｍａｙ ２００５， ｐ．２５１０−２５１２ Ｐｒｏｄ’ｈｏｍ ｅｔ ａｌ．， "Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ Ｄｉｒｅｃｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｅｌｌｅｔｓ"， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４８， Ｎｏ． ４， ｐ． １４８１−１４８３ （Ｆｅｂｒｕａｒｙ １７， ２０１０） Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， "Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｂｌｏｏｄ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｓｅｐｓｉｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ"， ＫＴＨ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， （２０１２） Ｍ． Ｄｒａｎｃｏｕｒｔ， "Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， １６：１６２０−１６２５， （２０１０） "Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ"， Ｃｕｍｉｔｅｃｈ ３１， （Ｆｅｂ． １９９７， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ）

したがって、ＡＳＴ試験のような細胞生存能力を必要とする分析的な成長ベースの方法が実施できるように、微生物の生存能力を維持しながら、ＰＢＣ試料から微生物を迅速に分離する試薬および方法を開発することが望ましい。加えて、これらの試薬および方法が、肺炎連鎖球菌を含む微生物のすべてのタイプから生存細胞を分離するために使用可能であることが望ましい。

開示される発明の種々の実施形態は、肺炎連鎖球菌を含むＰＢＣ試料から生存微生物細胞を迅速に分離するための試薬および方法を提供する。種々の試薬および方法を用いて得られた結果の微生物ペレットは妨害物質が十分に除かれ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ、成長ベースの同定、およびＡＳＴ方法などの同定方法のために使用され得る。これは、微生物を継代培養する必要なしに迅速な結果を可能にする。種々の実施形態によって得られた生存微生物細胞の集中質量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳなどの高速ＩＤシステムの直接接種と、ＢＤ（商標）Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ／ＡＳＴシステムなどの従来のまたは自動化されたシステムによるＩＤ／ＡＳＴ試験（ＡＳＴ）との両方に使用され得る。種々の実施形態は、他のシステム、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの分子試験方法、および当業者に知られた他の方法にも適用可能であり得る。

本明細書では、微生物の生存能力を維持しながら、哺乳類の血液細胞を溶解すること、および細胞残屑および他の血液成分を洗い落とすことの両方のために使用され得る種々の「溶解および洗浄（lyse and wash）」緩衝液が説明される。本明細書に記載の「溶解および洗浄」緩衝液（"lyse and wash" buffer）は、微生物を保護するための例えば、塩、ペプトン、および他の栄養素を含む基礎液、ならびに、哺乳類の血液細胞から細胞残屑を除去するための洗剤、チオール、および塩化アンモニウムなどの溶解試薬を含有する。

本明細書に記載のＰＢＣ試料から微生物を分離するための方法は、「溶解および洗浄」緩衝液を利用して、種々の下流の試験方法、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ同定およびＡＳＴ試験のために使用され得る生存微生物のペレットを迅速に作成する。開示される方法は、１つの試料調製チューブ、単一溶解工程、単一洗浄工程、およびわずか１つの遠心分離工程を使用して、ＰＢＣ試料から微生物を迅速に分離および濃縮するためのプロセスを提供する。これらの方法は、自動化されたシステムに容易に適合され、細胞生存能力を維持するために微生物の継代培養を必要としない。

本明細書に記載の方法は、微生物を同定するための方法、例えば質量分析法、またはＰｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤなどの表現型方法を妨害する物質を利用しない。さらに、本明細書に記載の方法は、質量分析法による同定、表現型または成長ベースの同定検査、およびＡＳＴ試験など複数の下流の分析で使用するのに十分な量で、単一ＰＢＣ試料からの生存微生物の迅速な分離を可能にする。さらに、本明細書に記載の方法は、例えば肺炎連鎖球菌を特徴付けるための有機体の最も困難なものを含む微生物の広いパネルを同定する下流の分析のための試料を調製する。

別の実施形態では、例えば、試料から生存微生物を分離するための本明細書に記載の「溶解および洗浄」緩衝液のうちの１または複数を含むことができるキットが提供される。

ＰＢＣ試料からの生存微生物の分離のための本明細書に記載の一実施形態の方法を示す図である。 ＰＢＣ試料からの生存肺炎連鎖球菌の分離のための本明細書に記載の一実施形態の方法を示す図である。

「溶解および洗浄」緩衝液および本明細書に記載の方法を用いてＰＢＣ試料から微生物を分離し濃縮することは、微生物細胞の生存能力を維持し、結果として、ＡＳＴ試験などの成長ベースの試験に対応するそれらの反応を維持する。本明細書に記載の方法はまた、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳおよびＰｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤなど複数の同定方法を妨害することがある細胞残屑のような試料中の他の物質の量を減らす。一実施形態では、本明細書に記載の緩衝液は、塩の濃度を最小限に維持して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析に対する妨害を防止するように処方される。

さらに別の実施形態では、本明細書に記載の緩衝液および方法は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、または酵母を分離し、それに対して下流の分析を行うために使用される。別の実施形態では、グラム陽性菌は、肺炎連鎖球菌および他の種の連鎖球菌を含む。

［「溶解および洗浄」緩衝液］
本明細書に記載の「溶解および洗浄」緩衝液は、あるバランスの微生物を安定させる試薬、ならびに血液細胞を溶解するための溶解試料を含有する。一実施形態では、緩衝液は、微生物を安定させるための塩、ペプトン、他の栄養素を含む基礎液、ならびに、試料中の血液細胞を溶解するための非イオン性洗剤、チオール、および任意選択で塩化アンモニウムを含有する。

特定の理論に拘束されるものではないが、基礎液が微生物を安定させるのに役立つことが可能である一方、溶解試薬が血液細胞を溶解し妨害細胞残屑を除去すると考えられる。本明細書に記載の「溶解および洗浄」緩衝液は、複数の独立した溶解メカニズム、すなわち、水性（浸透圧溶解）、洗剤（膜可溶化）、チオール（膜内のタンパク質−タンパク質相互作用の破壊）、および塩化アンモニウム（赤血球膜が塩化アンモニウムに対して効果的な浸透性があり、それらのコロイド含有物の不平衡な浸透圧により細胞溶解が発生する）の可能性を備える。複数の溶解試薬の組み合わせは、微生物に対し各溶解試薬をより過酷でないようにし、また、別々に使用される場合よりも短い時間に使用可能である。

基礎液は、微生物用の栄養ブロス、等張緩衝液、ペプトン、および／または塩を含有することができる。栄養ブロスは、例えば、トリプチケース（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ）（商標）ソイブロスとすることができる。１つの例示的実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液中の栄養ブロスの濃度は、約１０ｇ／Ｌから約５０ｇ／Ｌである。等張緩衝液は、全血試料と適合することが当業者に知られている臨床用緩衝液である。そのような緩衝液は、典型的には、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、および、塩化ナトリウムまたはリン酸緩衝生理食塩水などの生理食塩水の混合物である。１つの例示的な実施形態では、等張緩衝液の濃度は、約１ｇ／Ｌから約８５ｇ／Ｌである。別の例示的な実施形態では、等張緩衝液はリン酸緩衝液である。一実施形態では、ペプトンは、カゼインペプトンおよび／または大豆ペプトンを含む。企図される基礎液の追加の構成要素は、例えば、ピルビン酸ナトリウム、酵母エキス、クエン酸ナトリウム、肉ペプトン、および／またはデキストロースを含む。

別の実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、非イオン性洗剤、または非イオン性洗剤の混合物を含有することができる。この実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液中の少なくとも１種の非イオン性洗剤は、選択的に血液細胞を溶解するが微生物を溶解しない非イオン性溶血性洗剤である。企図される例示的な非イオン性溶血性洗剤は、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（商標）Ｘ−１００、およびサポニンである。他の非イオン性溶血性洗剤は、例えば、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）系（family）、ブリジ（Ｂｒｉｊ）（登録商標）系、オクチル−β−グルコシド、タージトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）（登録商標）系、ＣＹＭＡＬ（登録商標）系、ＭＥＧＡ系（Ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミン（Noctanoyl-N-methylglucamine）、Ｎ−ノナノイル、Ｎ−デカノイルを含む）、Ｆ−６８などのＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）系、ジキトニン、およびＣＨＡＰ系を含むことができる。１つの例示的な実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液中の非イオン性洗剤の濃度は、約０．０１ｇ／Ｌから約２０ｇ／Ｌである。別の実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、約６．７ｇ／Ｌの濃度でトリトン（商標）Ｘ−１００を含有する。

一実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、トリトン（商標）Ｘ−１００を含有する。トリトン（商標）Ｘ−１００の濃度は、肺炎連鎖球菌の生存能力を維持するように選択される。例示的な実施形態では、最大約１ｇ／Ｌのトリトン（商標）Ｘ−１００の濃度が企図される。別の実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、約０．３３５ｇ／Ｌの濃度でトリトン（商標）Ｘ−１００を含有する。さらに別の実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、約０．１ｇ／Ｌから約１ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌから約０．９ｇ／ｌ、約０．１ｇ／Ｌから約０．８ｇ／ｌ、約０．１ｇ／Ｌから約０．７ｇ／ｌ、約０．１ｇ／Ｌから約０．６ｇ／ｌ、約０．１ｇ／Ｌから約０．５ｇ／ｌ、約０．１ｇ／Ｌから約０．４ｇ／ｌ、約０．２ｇ／Ｌから約１ｇ／ｌ、約０．３ｇ／Ｌから約１ｇ／ｌ、約０．２ｇ／Ｌから約０．９ｇ／ｌ、約０．２ｇ／Ｌから約０．８ｇ／ｌ、約０．２ｇ／Ｌから約０．７ｇ／ｌ、約０．２ｇ／Ｌから約０．６ｇ／ｌ、約０．２ｇ／Ｌから約０．５ｇ／ｌ、約０．２ｇ／Ｌから約０．４ｇ／ｌ、約０．３ｇ／Ｌから約０．９ｇ／ｌ、約０．３ｇ／Ｌから約０．８ｇ／ｌ、約０．３ｇ／Ｌから約０．７ｇ／ｌ、約０．３ｇ／Ｌから約０．６ｇ／ｌ、約０．３ｇ／Ｌから約０．５ｇ／ｌ、または約０．３ｇ／Ｌから約０．４ｇ／ｌの濃度でトリトン（商標）Ｘ−１００を含有する。肺炎連鎖球菌の生存能力を維持するように選択された濃度のトリトン（商標）Ｘ−１００を含有する「溶解および洗浄」緩衝液はまた、肺炎連鎖球菌以外の有機体から、生存微生物細胞を分離するために使用することができ、その際、これら追加の有機体のための異なる「溶解および洗浄」緩衝液を必要としない。

一実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、任意選択で塩化アンモニウムを含んでもよい。別の実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液中の塩化アンモニウムの濃度は、約０．０１ｇ／Ｌから約８０ｇ／Ｌである。

本出願人は特定の理論に拘束されることを望むものではないが、塩化アンモニウムまたは他の溶解成分を添加することで、微生物の生存能力に対する「溶解および洗浄」緩衝液の他の溶解成分の効果を軽減するのを助けることが可能である。種々の溶解試薬を使用するとき、ＰＢＣ試料中の血液細胞を溶解するために十分な量が必要とされる。これは、微生物細胞の死を引き起こす望ましくない効果を有する場合が多い。洗剤、チオール、および塩化アンモニウムは、血液細胞を溶解するために異なる作用機構を用いる。複数の溶解機構を１つの「溶解および洗浄」緩衝液に混ぜ合わせる場合、異なる溶解成分の各々が潜在的により少ない量で使用され得る。これは、潜在的に微生物細胞を溶解する負の効果を小さくするが、血液細胞を溶解するのに十分であり得るので、溶解材料を各々単独で使用する場合よりも効率的な血液細胞溶解が得られる。したがって、望ましくない血液細胞成分が除去されるとともに、微生物細胞の生存能力が維持されることが可能である。

一実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水、酵母エキス、クエン酸ナトリウム、肉ペプトン、デキストロース、およびピルビン酸ナトリウムを含む基礎液と、チオグリコール酸ナトリウムおよびＬ−システインＨＣＬを含むチオールと、サポニンおよびトリトン（商標）Ｘ−１００を含む非イオン性洗剤と、任意選択でＰＢＳとを含有する。

別の実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、トリプチケース（商標）ソイブロス、酵母エキス、クエン酸ナトリウム、肉ペプトン、およびピルビン酸ナトリウムを含む基礎液と、Ｌ−システインＨＣＬおよびチオグリコール酸ナトリウムを含むチオールと、サポニンおよびトリトン（商標）Ｘ−１００を含む非イオン性洗剤とを含有する。

さらに別の実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、トリプチケース（商標）ソイブロスを含む基礎液と、Ｌ−システインＨＣＬおよびチオグリコール酸ナトリウムを含むチオールと、サポニンおよびトリトン（商標）Ｘ−１００を含む非イオン性洗剤とを含有する。

一実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、約８ｇ／Ｌから約３５ｇ／Ｌの濃度でカゼインペプトン、約２ｇ／Ｌから約１０ｇ／Ｌの濃度で塩化ナトリウム、約１．５ｇ／Ｌから約１５ｇ／Ｌの濃度で大豆ペプトン、および約０．５ｇ／Ｌから約５ｇ／Ｌの濃度でリン酸カリウムを含む基礎液と、約０．０１ｇ／Ｌから約２．５ｇ／Ｌの濃度でＬ−システイン、および約０．０１ｇ／Ｌから約２．５ｇ／Ｌの濃度でチオグリコール酸ナトリウムを含むチオールと、約０．０１ｇ／Ｌから約１０ｇ／Ｌの濃度でサポニン、および約０．０１ｇ／Ｌから約２０ｇ／Ｌの濃度でトリトン（商標）Ｘ−１００を含む非イオン性洗剤とを含む。

一実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、約８ｇ／Ｌから約３５ｇ／Ｌの濃度でカゼインペプトン、約２ｇ／Ｌから約１０ｇ／Ｌの濃度で塩化ナトリウム、約１．５ｇ／Ｌから約１５ｇ／Ｌの濃度で大豆ペプトン、および約０．５ｇ／Ｌから約５ｇ／Ｌの濃度でリン酸カリウムを含む基礎液と、約０．０１ｇ／Ｌから約２．５ｇ／Ｌの濃度でＬ−システイン、および約０．０１ｇ／Ｌから約２．５ｇ／Ｌの濃度でチオグリコール酸ナトリウムを含むチオールと、約０．０１ｇ／Ｌから約１０ｇ／Ｌの濃度でサポニン、および約０．０１ｇ／Ｌから約２０ｇ／Ｌの濃度でトリトン（商標）Ｘ−１００を含む非イオン性洗剤と、約０．０１ｇ／Ｌから約８０ｇ／Ｌの濃度で塩化アンモニウムとを含む。

一実施形態では、製造上の便宜のため、任意選択で消泡剤が「溶解および洗浄」緩衝液に添加され得る。好ましくは、消泡剤は、「溶解および洗浄」緩衝液の特性に明白な影響を与えない。消泡剤は、当業者で周知であり、本明細書では詳細を説明しない。消泡剤の選択および量は、概して設計変更の問題であり、本明細書に記載の「溶解および洗浄」緩衝液の要件に基づき十分に当業者の能力の範囲内にある。一実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液中のその消泡剤の濃度は０．１ｇ／Ｌである。

本明細書に記載の「溶解および洗浄」緩衝液の種々の構成要素の濃度は、「溶解および洗浄」緩衝液中の各構成要素の最終濃度を表す。しばしば、１：１の容積比のＰＢＣ試料が「溶解および洗浄」緩衝液と混合されるが、他の容積比も企図される。したがって、「溶解および洗浄」緩衝液中の各構成要素の濃度は、ＰＢＣ試料と混合されたときに「溶解および洗浄」緩衝液の構成要素の望ましい最終濃度を達成するために、「溶解および洗浄」緩衝液のＰＢＣ試料に対する容積比の変化を構成する(ａｃｃｏｕｎｔ ｆｏｒ)ように調節され得る。

一実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、サポニンとトリトン（商標）Ｘ−１００の両方を含有するが、消泡剤を含有しない。理論に拘束されるものではないが、サポニンとトリトン（商標）Ｘ−１００の組み合わせは、サポニンを「溶解および洗浄」緩衝液中の単一の非イオン性洗剤として使用するのと比較して、処理されたＰＢＣ試料の発泡が非常に少ない結果となる。この発泡の減少は、ワークフローを改善し、遠心分離後の上清の除去をより容易にし、消泡試薬（すなわち、シリコーン溶液）の必要性を低減または除去する。

一実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、コリン含有溶液、例えば、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献１に説明されるようなコリン含有溶液を含む。出願人は特定の理論に拘束されることを望むものではないが、「溶解および洗浄」緩衝液にコリン含有溶液を添加することで、「溶解および洗浄」緩衝液の溶解成分の存在下で、微生物、特に肺炎連鎖球菌の自己分解を、抑制、防止、および／または緩和することができる。

別の実施形態では、例えば、ＰＢＣ試料から生存微生物を分離するための本明細書に記載の「溶解および洗浄」緩衝液の１または複数を含むことができるキットが提供される。

［ＰＢＣ試料から微生物を分離するための方法］
本明細書に説明される、少なくとも１つの微生物を含有する疑いがある試料から、例えば、ＰＢＣ試料から、微生物を分離するための方法は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる同定、成長ベースの表現型検査、およびＡＳＴ試験など種々の下流の試験方法のために使用され得る生存微生物ペレットを迅速に生成することが企図される、種々の「溶解および洗浄」緩衝液を利用することができる。一実施形態では、この方法は、ＰＢＣ試料の一部分を「溶解および洗浄」緩衝液に加えて、混合物を形成するステップを含む。一実施形態では、ＰＢＣ試料の「溶解および洗浄」緩衝液に対する容積比は、１：１である。混合物は、ＰＢＣ試料中の血液細胞を溶解するために、一定期間インキュベートされる。

一実施形態では、ＰＢＣ試料の一部分と混合された「溶解および洗浄」緩衝液は、約０．０１ｇ／Ｌから約２０ｇ／Ｌの濃度で少なくとも１種の非イオン性洗剤を含む。別の実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、約６．７ｇ／Ｌの濃度でトリトン（商標）Ｘ−１００を含有する。さらに別の実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、最大約１ｇ／Ｌの濃度でトリトン（商標）Ｘ−１００を含有する。さらに別の実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、約０．３３５ｇ／ＬでトリトンＸ−１００を含有する。さらに別の実施形態では、「溶解および洗浄」緩衝液は、約０．１ｇ／Ｌから約１ｇ／ｌ、約０．１ｇ／Ｌから約０．９ｇ／ｌ、約０．１ｇ／Ｌから約０．８ｇ／ｌ、約０．１ｇ／Ｌから約０．７ｇ／ｌ、約０．１ｇ／Ｌから約０．６ｇ／ｌ、約０．１ｇ／Ｌから約０．５ｇ／ｌ、約０．１ｇ／Ｌから約０．４ｇ／ｌ、約０．２ｇ／Ｌから約１ｇ／ｌ、約０．３ｇ／Ｌから約１ｇ／ｌ、約０．２ｇ／Ｌから約０．９ｇ／ｌ、約０．２ｇ／Ｌから約０．８ｇ／ｌ、約０．２ｇ／Ｌから約０．７ｇ／ｌ、約０．２ｇ／Ｌから約０．６ｇ／ｌ、約０．２ｇ／Ｌから約０．５ｇ／ｌ、約０．２ｇ／Ｌから約０．４ｇ／ｌ、約０．３ｇ／Ｌから約０．９ｇ／ｌ、約０．３ｇ／Ｌから約０．８ｇ／ｌ、約０．３ｇ／Ｌから約０．７ｇ／ｌ、約０．３ｇ／Ｌから約０．６ｇ／ｌ、約０．３ｇ／Ｌから約０．５ｇ／ｌ、または約０．３ｇ／Ｌから約０．４ｇ／ｌの範囲の濃度でトリトン（商標）Ｘ−１００を含有する。

一実施形態では、ＰＢＣ試料の一部分を「溶解および洗浄」緩衝液と混ぜ合わせて混合物が調製された後、最大約５分間まで混合物がインキュベートされる。別の実施形態では、ＰＢＣ試料と「溶解および洗浄」緩衝液の混合をさらに確実にするために、インキュベーション中に混合物が数回転倒される。インキュベーション後、混合物は遠心分離にかけられて、生存微生物を含有するペレット、および血液細胞残屑を含有する上清を形成する。ペレットを攪乱せずに上清を容易に除去するために、簡単に識別できるペレットを実現するように遠心分離の速度および時間の範囲が最適化され得る。例えば、混合物の容積、試料管のサイズおよび形状、およびロータのタイプを含む、種々の変数が、遠心分離の速度および時間に影響する。一実施形態では、混合物は、約１００×ｇから約５０００×ｇで遠心分離にかけられる。別の実施形態では、混合物は、約１０分間を含めて最大約１０分間まで遠心分離にかけられる。

遠心分離の後、上清が廃棄されるとともに、ペレットが第２の容積の「溶解および洗浄」緩衝液で洗浄される。洗浄工程のために使用される「溶解および洗浄」緩衝液は、溶解工程で血液細胞を溶解するために使用される「溶解および洗浄」緩衝液と同じまたは異なる処方物とすることができる。ペレットを洗浄した後、混合物が２回目の遠心分離にかけられる。血液細胞残屑を含有する上清が再び廃棄される一方、生存微生物を含有するペレットは保持される。ペレットの上部から微量の液体が除去され得る。最後に、下流の分析のためにペレットが溶液中に再懸濁され得る。一実施形態では、ペレットは、少なくとも約４マクファーランド（McFarland）の濃度で溶液に再懸濁される。

本明細書に記載の種々の実施形態から得られる生存微生物ペレットは、質量分析法による同定、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ同定、表現型成長ベースの同定、例えばＰｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ、およびＡＳＴ試験、例えばＰｈｏｅｎｉｘ（商標）ＡＳＴ試験を含む種々の下流の試験方法に対する共通の試料を調製するために使用され得る。加えて、複数の管の間で試料を移動させる必要なく、方法全体が１つの試料管内で実施され得る。したがって、本明細書に記載の方法は自動システムに容易に適応可能である。

より大きいＰＢＣ試料容積、複数の分割量（aliquot）のＰＢＣ試料、複数の回転など、本明細書に記載の技法は、開始容積の微生物の数を増大して収量を高めるために展開され得る。加えて、これらの方法は、迅速な試料調製方法を提供するとともに、容易に自動化される。さらに、本明細書に記載の方法および緩衝液は、血液細胞を溶解にさらし、ＰＢＣ試料から妨害物質を除去し、生存微生物の収量を高める。一実施形態では、ＰＢＣ試料の開始容積を増大すること、および／または、１つのＰＢＣ試料のいくつかの分割量に対して分離方法を実施し得られた微生物ペレットを１つの試料に統合することによって、生存微生物ペレットの収量が増大され得る。

図１は、本明細書に記載の方法の一実施形態を示す。ＰＢＣ試料の一部分、例えば５ｍｌが、試料管に移される（１００）。ある容積、例えば５ｍｌの「溶解および洗浄」緩衝液が、ＰＢＣ試料に加えられ（１０５）、例えば、５分間混合される（１１０）。この混合物は、例えば、２２００×ｇで１０分間、遠心分離にかけられ（１１５）、その結果、生存微生物を含有するペレットＡ、および血液細胞残屑を含有する上清Ａが得られる。上清Ａは移され廃棄される（１２０）一方、ペレットＡは保持される（１２５）。第２の容積、例えば５ｍｌの「溶解および洗浄」緩衝液が、ペレットを再懸濁するために、ペレットＡに加えられる（１３０）。再懸濁されたペレットＡは混合されて（１３５）、第２の混合物が作成される。第２の混合物は、例えば、２２００×ｇで１０分間、遠心分離にかけられ（１４０）、その結果、生存微生物を含有するペレットＢ、および第１の遠心分離工程（１１５）で除去されなかった追加の血液細胞残屑を含有する上清Ｂが得られる。上清Ｂは移され廃棄される（１４５）一方、ペレットＢは保持される（１５０）。ペレットＢの少なくとも一部分は、液体中、例えば、６００μlの滅菌脱イオン水で再懸濁されて（１５５）、濃厚な微生物懸濁液、例えば、約４マクファーランドの懸濁液が得られる。得られた微生物懸濁液は、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる同定、表現型成長ベースの同定、例えばＰｈｏｅｎｉｘ（商標）システム、および、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＡＳＴ試験のような成長ベースのＡＳＴ方法など、種々の下流の試験方法（１６０）のために使用され得る。

本明細書に記載の生存微生物を分離するための方法の一実施形態では、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献４に説明されるように、ＰＢＣ試料が、「溶解および洗浄」緩衝液より前またはそれと同時にコリン溶液でインキュベートされる。

別の実施形態では、ＰＢＣ試料からの生存肺炎連鎖球菌の分離のための方法が提供される。これらの方法は、少なくとも１つの微生物を含有する疑いがある血液試料を得るステップを含む。血液試料の一部分が嫌気性血液培養ボトルに加えられる一方、血液試料の第２の部分が好気性血液培養ボトルに加えられる。これらのボトルは、陽性シグナルが得られるまでインキュベートされる。血液試料中の肺炎連鎖球菌の存在の早期表示は、好気性ＰＢＣ試料の一部分を本明細書に記載の「溶解および洗浄」緩衝液と混ぜ合わせて混合物を形成し、混合物を一定期間インキュベートして血液細胞を溶解し、混合物を遠心分離にかけてペレットを形成することによって得られる。緑色のペレットは、血液試料中の肺炎連鎖球菌の存在の早期表示を提供する。代替形態では、血液試料中の肺炎連鎖球菌の存在の早期表示は、緑色の溶液の好気性血液培養陽性ボトルを視覚的に観察することにより得られる。

この肺炎連鎖球菌の早期表示の後、生存微生物の分離のための本明細書に記載の方法のいずれかを用いて、下流の分析のための生存肺炎連鎖球菌を分離するために嫌気性ＰＢＣ試料が使用され得る。一実施形態では、方法は嫌気性ＰＢＣ試料の一部分を本明細書に記載の「溶解および洗浄」緩衝液に加えて、混合物を形成するステップを含む。混合物は、ＰＢＣ試料中の血液細胞を溶解するために、一定期間インキュベートされる。

一実施形態では、生存肺炎連鎖球菌を分離するための方法は、トリトン（商標）Ｘ−１００を含有する「溶解および洗浄」緩衝液の使用を含む。トリトン（商標）Ｘ−１００の濃度は、肺炎連鎖球菌の生存能力を維持するように選択される。最大約１ｇ／Ｌの濃度が企図される。別の実施形態では、生存肺炎連鎖球菌を分離するための方法は、約０．３３５ｇ／Ｌのトリトン（商標）Ｘ−１００を含有する「溶解および洗浄」緩衝液の使用を含む。

一実施形態では、ＰＢＣ試料の一部分を「溶解および洗浄」緩衝液と混ぜ合わせて混合物が調製された後、約５分間を含めて最大約５分間まで混合物がインキュベートされる。別の実施形態では、ＰＢＣ試料と「溶解および洗浄」緩衝液の混合をさらに確実にするために、インキュベーション中に混合物が数回転倒される。インキュベーション後、混合物は遠心分離にかけられて、生存微生物を含有するペレット、および血液細胞残屑を含有する上清を形成する。

遠心分離の後、上清が廃棄される一方、生存肺炎連鎖球菌を含有するペレットが第２の容積の「溶解および洗浄」緩衝液で洗浄される。洗浄工程のために使用される「溶解および洗浄」緩衝液は、溶解工程で血液細胞を溶解するために使用される「溶解および洗浄」緩衝液と同じまたは異なる処方物とすることができる。ペレットを洗浄した後、混合物が２回目の遠心分離にかけられる。血液細胞残屑を含有する上清が再び廃棄される一方、生存肺炎連鎖球菌を含有するペレットは保持される。最後に、下流の分析のためにペレットが溶液中に再懸濁され得る。

ＰＢＣ試料から生存肺炎連鎖球菌を分離するための方法の一実施形態が図２に示される。肺炎連鎖球菌を含有する疑いがある血液試料が得られる（２００）。血液試料の一部分（例えば１０ｍｌ）が嫌気性血液培養ボトルに加えられる（２０５）一方、血液試料の第２の部分（例えば１０ｍｌ）が好気性血液培養ボトルに加えられる（２１０）。嫌気性ＰＢＣボトルと好気性ＰＢＣボトルの両方で微生物の存在を示す陽性シグナルが得られる（２１５）。好気性ＰＢＣ試料の一部分、例えば５ｍｌが管に移される（２２０）。肺炎連鎖球菌の生存能力を維持するように選択された濃度のトリトン（商標）Ｘ−１００、例えば、０．３３５ｇ／Ｌのトリトン（商標）Ｘ−１００を含有する、ある容積、例えば５ｍｌの本明細書に記載の「溶解および洗浄」緩衝液が、ＰＢＣ試料に加えられて（２２５）、混合物が形成される。血液細胞を溶解するために、混合物が一定期間（例えば５分間）インキュベートされる（２３０）。次いで、混合物が遠心分離にかけられて（２３５）、血液試料中の肺炎連鎖球菌の存在の早期表示を示す緑色のペレットが形成される（２４０）。肺炎連鎖球菌の早期表示（２４０）の後、例えば、肺炎連鎖球菌の生存能力を維持するように選択された濃度のトリトン（商標）Ｘ−１００、例えば、０．３３５ｇ／Ｌのトリトン（商標）Ｘ−１００を含有する「溶解および洗浄」緩衝液を使用する図１で説明された方法を含む、ＰＢＣ試料から生存微生物を分離するための本明細書に記載の方法のいずれかを用いて、下流の分析のための嫌気性ＰＢＣ試料の一部分が調製される（２４５）。

［実施例］
［実施例１］
血液培養ボトルにエンテロバクターアエロゲネス（Enterobacter aerogenes）（ＡＴＣＣ １３０４８）またはスタフィロコッカスアウレウス（Staphylococcus aureus）（ＡＴＣＣ ４３３００ ＭＲＳＡ）を接種し、陽性シグナルが示されるまでインキュベートすることによって、血液培養陽性試料が得られた。ＰＢＣ試料（５ｍｌ）の一部分が、ボトルから直接引き出されて１５ｍｌ円錐管内に置かれた。塩化コリン（０．５ｍｌの２０％塩化コリン溶液）がＰＢＣ試料に加えられ、室温で２０分間インキュベートされ、ＪＳ−４．２ロータを有するＢｅｃｋｍａｎ Ｊ６−ＭＩ遠心分離機で５分間にわたって１３２×ｇで遠心分離にかけられた。上清は、第２の１５ｍｌ円錐管に移され、１６ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、６．７ｇ／Ｌのトリトン（商標）Ｘ−１００、およびＢＤ Ｂａｃｔｅｃ Ｌｙｔｉｃ １０（カタログ番号４４２２６５）を含有する、５ｍｌの「溶解および洗浄」緩衝液と混合された。混合物は、室温で５分間インキュベートされた。次いで、溶解された試料は、１８５５×ｇで１０分間遠心分離にかけられた。上清を除去した後、残りの細菌ペレットが、４．５ｍｌのＢＤ Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤブロス（カタログ番号２４６００１）において再懸濁された。回収された微生物の一部分が、プレートカウントにより有機体の生存能力を決定するために使用された。プレートカウントによる生存能力試験の結果は、溶解後のエンテロバクターアエロゲネスについて１．８５×１０^９ｃｆｕ／ｍｌを、溶解前のＰＢＣ試料の場合の１．６５×１０^９ｃｆｕ／ｍｌと対照して示した。また、生存能力試験は、溶解後の黄色ブドウ球菌（S. aureus）について１．２５×１０^８ｃｆｕ／ｍｌを、溶解前のＰＢＣ試料の場合の２．００×１０^８ｃｆｕ／ｍｌと対照して示した。

次いで、回収された細菌懸濁液の第２の部分が、さらにＢＤ Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤブロスによって０．５マクファーランドの濃度まで希釈され、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ／ＡＳＴ試験に使用された。ＢＤ Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ／ＡＳＴシステムについては、例えば、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、および特許文献８に説明されている。上述のように調製された接種材料の一部分が、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤによる表現型同定のために使用され、ＢＤ Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ／ＡＳＴパネル（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）の識別部分内に注がれ、プラスチッククロージャ（plastic closure）によって封止された。上述のように調製された接種材料の第２の部分が、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＡＳＴによるＡＳＴ試験のために使用され、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ／ＡＳＴパネル（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）のＡＳＴ部分内に注がれ、プラスチッククロージャによって封止された。一連の抗生物質についての抗菌薬感受性最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）が、分離された微生物ペレットごとに計算された。微生物ペレットのＭＩＣ結果が、プレート化された純粋培養（「対照」）から得られた同じ株のＭＩＣ結果と比較された。この比較は、試験方法が、対照方法と実質的に等価な結果を与えるかどうか、すなわち、試験方法と対照方法の間の本質的な一致（essential agreement：ＥＡ）のレートを示す。０の希釈差は、試験方法と対照方法の間の正確な一致を示す。−１または＋１の希釈差は、試験方法が対照方法に対してＥＡの範囲内、すなわち、通常の試験の変動内であると考えられることを示す。この範囲外の、例えば、−４、＋４、−３、＋３、−２、および＋２などの希釈差は、結果が、試験された抗生物質／微生物についての本質的な一致の範囲内にないことを示す。ＡＳＴの方法および検証の結果はさらに説明されている（例えば、非特許文献参照）。

両方のＰＢＣ試料からの回収された細菌は、両方の試料が９９％の信頼値を有して、Ｅ．アエロゲネスおよび黄色ブドウ球菌として適正なＰｈｏｅｎｉｘ（商標）同定が得られた。Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＡＳＴの結果は、プレート化されたコロニーから調製されたそれらの試料と比較して１００％の本質的な一致（ＥＡ）、すなわち、希釈差が−１から＋１の希釈差の範囲内であることを示した。黄色ブドウ球菌ＡＳＴの結果は、メチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲＳ）、ｍｅｃＡ媒介耐性ブドウ球菌（mecA-mediated resistent staphylococcus）（ｍｅｃＡ）、β−ラクタマーゼ産生ブドウ球菌（ＢＬＡＣＴ）、およびブドウ球菌ＭＬＳｂ表現型（staphylococcus MLSb phenotype）（ＳＴＡＭＬＳ）を含む、このＭＲＳＡ株について期待される四（４）つの耐性マーカの適正な同定を含んでいた。

これらの結果は、本明細書に記載の「溶解および洗浄」緩衝液が、下流の同定およびＡＳＴ試験のためにＰＢＣ試料から生存微生物を分離するために使用され得ることを示す。

［実施例２］
４つの血液培養陽性試料が、エンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）（ＡＴＴＣ ７００２２１）、エンテロコッカスフェカリス（Enterococcus faecalis）（ＡＴＣＣ ５１２９９）、スタフィロコッカスアウレウス（ＡＴＣＣ ４３３００）、またはプロテウスミラビリス（Proteus mirabilis）（ＡＴＣＣ ２９９０６）のいずれかによって血液培養ボトルに接種することによって得られた。下記の表１に要約される処方物を含む４つの異なる「溶解および洗浄」緩衝液が調製された。

４つの「溶解および洗浄」緩衝液の各々は、４つのＰＢＣ試料の各々から微生物ペレットを調製するために使用され、合計１６個の試料が調製された。生存微生物を分離するために、各ＰＢＣ試料（５ｍｌ）の一部分が、１５ｍｌ円錐管内で２０分間、０．５ｍｌの２０％塩化コリン溶液で前処理された。塩化コリン溶液でインキュベート後、８ｍｌの各「溶解および洗浄」緩衝液が試料に加えられ、１０分間混合された。次いで、試料が１８５５×ｇで１０分間遠心分離にかけられた。上清が移され廃棄される一方、ペレットは、塩化アンモニウムなしでＢＤ Ｂａｃｔｅｃ Ｌｙｔｉｃ １０培地（カタログ番号４４２２６５）において５ｍｌの３．４ｇ／Ｌトリトン（商標）Ｘ−１００を有する同じ管内で、ペレットを再懸濁することによって洗浄された。再懸濁されたペレットは、５分間混合させられ、続いて、３０００ｒｐｍ、１８５５×ｇで１０分間遠心分離にかけられた。上清が除去され廃棄される一方、ペレットが、後述のように、ＭＡＤＬＩ−ＴＯＦ／ＭＳ同定およびＰｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ／ＡＳＴ試験の両方に使用された。

上述のように調製された細菌ペレットの一部分が、０．６ｍｌ滅菌脱イオン水を含有する微小遠心管内で再懸濁された。懸濁液の一部分（１μｌ）が、細菌同定分析のためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳのターゲットプレート上にスポットされ、空気乾燥された。ギ酸（１〜２μｌの７０％水溶液）が乾燥されスポットされた試料上に重ねられ、空気乾燥された。乾燥された試料は、１μｍのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳマトリックス溶液（脱イオン水における２５０μｌの２．５％トリフルオロ酢酸および４７．５％アセトニトリルに２．５ｍｇのＨＣＣＡを溶解することによって調製されたＭＡＬＤＩ−ＭＳマトリックス溶液）で覆われ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による同定の前に空気乾燥された。すべての質量分析データが、Ｂｉｏｔｙｐｅｒ２．０ソフトウェアを用いてＢｒｕｋｅｒ Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ（商標）ＬＴ上で記録された。分離された微生物ペレットを調製し、質量分析によって微生物を同定する方法については、参照により本明細書に組み込まれる２０１２年８月３１日に出願された特許文献９にさらに説明されている。２．０以上のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスコアは、種レベルの同定を示す。１．７と１．９９９の間のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスコアは、属レベルの同定を示す。そして、１．７未満のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスコアは、非同定または信頼できない同定を示す。それらの結果は下記の表２に要約されている。「はい」は、少なくとも属レベルまで、すなわち少なくとも１．７のＭＡＬＤＩスコアで適切な同定が得られたことを示す。

上述のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳのために調製された懸濁液の第２の部分が、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤブロスによって約０．５マクファーランドまでさらに希釈され、実施例１に説明されたようにＰｈｏｅｎｉｘ（商標）ＡＳＴパネルに接種するために使用された。それらの結果は下記の表２に要約されている。Phoenix（商標）AST結果に関して、「いいえ」は、対照試料（プレート化されたコロニー）との間で本質的な一致があった、すなわち、希釈差がわずか＋１ないし−１の試料を表す。

結果は、種々の「溶解および洗浄」緩衝液が、微生物のパネル全体にわたって、下流の質量分析による同定およびＡＳＴ試験のために、ＰＢＣ試料から生存微生物を分離するために使用され得ることを示す。

［実施例３］
３つの血液培養陽性試料が、エンテロコッカスフェカリス（ＶＲＥ ＡＴＣＣ ５１２９９）、クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）（ＡＴＣＣ ７００６０３）、またはスタフィロコッカスアウレウス（ＡＴＣＣ ４３３００）のいずれかによって血液培養ボトルに接種することによって得られた。下記の表３に要約される処方物を含む２つの異なる「溶解および洗浄」緩衝液が調製された。緩衝液＃１と緩衝液＃２の唯１つの違いは、緩衝液＃２には１６ｇ／Ｌの塩化アンモニウムが加えられることである。

表３の「溶解および洗浄」緩衝液の各々は、３つのＰＢＣ試料の各々から微生物ペレットを調製するために使用され、合計６個の試料が調製された。各ＰＢＣ試料（５ｍｌ）の一部分が、０．５ｍｌの各「溶解および洗浄」緩衝液と混合された。次いで、試料は、２２００×ｇで１０分間遠心分離にかけられた。上清が移され廃棄される一方、ペレットは、同じ「溶解および洗浄」緩衝液を有する同じ管内でペレットを再懸濁することによって洗浄された。再懸濁されたペレットは、２２００×ｇで１０分間遠心分離にかけられた。上清が除去され廃棄される一方、ペレットが、後述のように、ＭＡＤＬＩ−ＴＯＦ／ＭＳ同定およびＰｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤ／ＡＳＴ試験の両方に使用された。

細菌ペレットの一部分が、０．６ｍｌ滅菌水を含有する微小遠心管内で再懸濁された。懸濁液の一部分（１μl）が、実施例２で説明されたように、細菌同定分析のためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳのターゲットプレート上にスポットされた。それらの結果は、下記の図４に要約されており、少なくとも属レベルまで、すなわち少なくとも１．７のＭＡＬＤＩスコアで適切な同定が得られたかどうかを示す。上記のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳのために調製された懸濁液の第２の部分が、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤブロスによって約０．５マクファーランドまでさらに希釈され、実施例１に説明されたようにＰｈｏｅｎｉｘ（商標）ＩＤパネルに接種するために使用された。それらの結果は下記の表４に要約されている。

結果は、塩化アンモニウムの有無にかかわらず、種々の「溶解および洗浄」緩衝液が、微生物のパネル全体にわたって、下流の同定のために、ＰＢＣ試料から生存微生物を分離するために使用され得ることを示す。

［実施例４］
本明細書に記載の種々の「溶解および洗浄」緩衝液にさらされたときの肺炎連鎖球菌のいくつかの異なる株の生存能力を決定するために試験が行われた。ＰＢＣ試料をこれらの種々の「溶解および洗浄」緩衝液で処理することが、微生物の同定を妨害する物質を十分に除去するかどうかを決定するために、追加の試験が行われた。

［細胞生存能力］
３つの異なる「溶解および洗浄」緩衝液が下記の表５に要約されるように調製され、それぞれが異なる量のトリトン（商標）Ｘ−１００、すなわち、６．７ｇ／Ｌ、０ｇ／Ｌ、または０．３３５ｇ／Ｌを有していた。

これらの緩衝液の各々の容積（１０ｍｌ）が、１×１０^３ｃｆｕ／ｍｌの肺炎連鎖球菌非ムコイド株（ＰＯＳ３０９２）または肺炎連鎖球菌ムコイド株（ＰＯＳ６５０）のいずれかで接種され、最大４時間までインキュベートされた。陽性対照として、１０ｍｌの容積の嫌気性栄養ブロスも、この栄養ブロスで微生物が成長を期待されるように、肺炎連鎖球菌株の各々によって接種された。接種後、０時間、１時間、２時間、および４時間の時点で、混合物の１００μｌの容積が、５％羊血液を含有する寒天プレート上に約１×１０^２ｃｆｕ／プレートの濃度でプレートされた。これらのプレートは、３５℃／５％ＣＯ^２で一晩インキュベートされ、その時にプレートは細菌コロニーについて手作業でカウントされた。手作業のプレートカウントの結果が下記の図６に要約されている。

表６が示すように、生存肺炎連鎖球菌は、高濃度のトリトン（商標）Ｘ−１００（緩衝液＃１）に１時間さらされた後では得られなかった。しかしながら、トリトン（商標）Ｘ−１００なし（＃２）緩衝液、および低トリトン（商標）Ｘ−１００（＃３）緩衝液を使用して、同程度の量の生存肺炎連鎖球菌が得られた。

［ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる同定］
表５の種々の「溶解および洗浄」緩衝液は、種々の「溶解および洗浄」緩衝液が十分にＰＢＣ試料を洗浄して妨害細胞残屑を除いたかどうかを決定するためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる同定に使用するために、ＰＢＣ試料から細菌ペレットを調製するために使用された。ＰＢＣ試料は、非ムコイド株ＰＯＳ３０９２、非ムコイド株ＰＯＳ３９９６、非ムコイド株ＰＯＳ３９９９、ムコイド株ＰＯＳ６５０、およびムコイド株ＰＯＳ５３２を含む５つの異なる株の肺炎連鎖球菌を用いて、株ごとに好気性ボトルと嫌気性ボトルの両方に接種することによって調製された。表５の「溶解および洗浄」緩衝液の各々を使用して、各ＰＢＣ試料に１：１の比で「溶解および洗浄」緩衝液の容積を加えることによって、微生物がＰＢＣ試料の各々から分離された。混合物が、Ｎｕｔａｔｏｒ（商標）で５分間混合された。混合物が２２００×ｇで１０分間遠心分離にかけられ、続いて、上清が移され廃棄される。残留血液細胞残屑のペレットを洗浄するために、同じ「溶解および洗浄」緩衝液の追加の５ｍｌが管へ加えられ、ペレットを再懸濁するためにボルテックスされた。混合物は、２２００×ｇで１０分間遠心分離にかけられた。上清が移され、得られた微生物ペレットから余分な液体がコットンアプリケータ綿棒を使用して除去された。微生物ペレットが６００μｌ滅菌脱イオン水で再懸濁されて、約４マクファーランドの微生物懸濁液の接種材料が得られた。

得られたペレットは、前述の実施例２で説明された方法によって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる同定のために調製された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスコアが下記の表７に要約されている。

結果は、嫌気性ＰＢＣボトルからの生存微生物ペレットの調製が、好気性ＰＢＣボトルから調製されたペレットと比較して、肺炎連鎖球菌の種々の株についてかなり良好なＭＡＬＤＩスコアをもたらしたことを示す。加えて、低量のトリトン（商標）Ｘ−１００を含有する本明細書に記載の「溶解および洗浄」緩衝液は、高濃度のトリトン（商標）Ｘ−１００を用いて調製された試料と比較して、肺炎連鎖球菌株のパネル全体にわたってかなり良好なＭＡＬＤＩスコアをもたらす。

本明細書の発明は特定の実施形態を参照して説明されているが、これらの実施形態は、本発明の原理および用途の単に例示であることを理解されたい。したがって、多くの修正が例示的な実施形態に対して行われてもよく、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに他の構成が考案され得ることを理解されたい。

Claims (32)

1. 血液培養陽性試料から生存微生物を分離し濃縮するための緩衝液であって、基礎液、少なくとも１種の非イオン性洗剤、少なくとも１種のチオール、および任意選択で塩化アンモニウムを含み、前記緩衝液中の前記基礎液、前記少なくとも１種の非イオン性洗剤、および前記少なくとも１種のチオールの相対量は、肺炎連鎖球菌の生存能力を維持するように選択されることを特徴とする緩衝液。
2. 前記少なくとも１種の非イオン性洗剤は、最大約１ｇ／Ｌの前記緩衝液中の濃度でトリトンＸ−１００を含むことを特徴とする請求項１に記載の緩衝液。
3. 前記少なくとも１種の非イオン性洗剤は、約０．３３５ｇ／Ｌの前記緩衝液中の濃度でトリトンＸ−１００を含むことを特徴とする請求項１に記載の緩衝液。
4. 前記基礎液は、栄養ブロス、等張緩衝液、ペプトン、および塩からなる群から選択された少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１に記載の緩衝液。
5. 前記緩衝液中の前記栄養ブロスの濃度は、約１０ｇ／Ｌから約５０ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項４に記載の緩衝液。
6. 前記栄養ブロスは、トリプチケースソイブロスを含むことを特徴とする請求項４に記載の緩衝液。
7. 前記等張緩衝液は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸緩衝生理食塩水、および生理食塩水からなる群から選択された少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項４に記載の緩衝液。
8. 前記緩衝液中の等張緩衝液の濃度は、約１ｇ／Ｌから約２０ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項４に記載の緩衝液。
9. 前記ペプトンは、カゼインペプトンおよび大豆ペプトンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の緩衝液。
10. 前記基礎液は、ピルビン酸ナトリウム、酵母エキス、クエン酸ナトリウム、肉ペプトン、デキストロース、およびリン酸緩衝生理食塩水からなる群から選択された少なくとも１つをさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の緩衝液。
11. 前記少なくとも１種の非イオン性洗剤は、トリトン系の洗剤、サポニン、ブリジ系の洗剤、オクチル−b−グルコシド、タージトール系の洗剤、ＣＹＭＡＬ系の洗剤、ＭＥＧＡ系の洗剤、ＰＬＵＲＯＮＩＣ系の洗剤、およびＣＨＡＰ系の洗剤からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の緩衝液。
12. 約０．０１ｇ／Ｌから約２０ｇ／Ｌの前記緩衝液の濃度で少なくとも１種の追加的な非イオン性洗剤をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の緩衝液。
13. 前記少なくとも１種のチオールは、Ｌ−システインＨＣＬ、チオグリコール酸ナトリウム、メルカプトエチルアミン、メルカプトコハク酸、メルカプトエタノール、メルカプトエタンスルホン酸、およびチオグリセロールからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の緩衝液。
14. 前記緩衝液中の前記少なくとも１種のチオールの濃度は、約０．００５ｇ／Ｌから４ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項１に記載の緩衝液。
15. 塩化アンモニウムをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の緩衝液。
16. 前記緩衝液中の塩化アンモニウムの濃度は、約０．０１ｇ／Ｌから約８０ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項１５に記載の緩衝液。
17. 前記基礎液は、リン酸緩衝生理食塩水、酵母エキス、クエン酸ナトリウム、肉ペプトン、デキストロース、およびピルビン酸ナトリウムを含み、
    前記少なくとも１種のチオールは、Ｌ−システインＨＣＬおよびチオグリコール酸ナトリウムを含み、
    前記少なくとも１種の非イオン性洗剤は、サポニンおよびトリトンＸ−１００を含むことを特徴とする請求項１に記載の緩衝液。
18. 前記基礎液は、トリプチケースソイブロス、酵母エキス、クエン酸ナトリウム、肉ペプトン、およびピルビン酸ナトリウムを含み、
    前記少なくとも１種のチオールは、Ｌ−システインＨＣＬおよびチオグリコール酸ナトリウムを含み、
    前記少なくとも１種の非イオン性洗剤は、サポニンおよびトリトンＸ−１００を含むことを特徴とする請求項１に記載の緩衝液。
19. 前記基礎液は、トリプチケースソイブロスを含み、
    前記少なくとも１種のチオールは、Ｌ−システインＨＣＬおよびチオグリコール酸ナトリウムを含み、
    前記少なくとも１種の非イオン性洗剤は、サポニンおよびトリトンＸ−１００を含むことを特徴とする請求項１に記載の緩衝液。
20. 前記基礎液は、約８ｇ／Ｌから約３５ｇ／Ｌの前記緩衝液中の濃度でカゼインペプトン、約２ｇ／Ｌから約１０ｇ／Ｌの前記緩衝液中の濃度で塩化ナトリウム、約１．５ｇ／Ｌから約１５ｇ／Ｌの前記緩衝液中の濃度で大豆ペプトン、および約０．５ｇ／Ｌから約５ｇ／Ｌの前記緩衝液中の濃度でリン酸カリウムを含み、
    前記少なくとも１種のチオールは、約０．０１ｇ／Ｌから約２．５ｇ／Ｌの前記緩衝液中の濃度でＬ−システイン、および約０．０１ｇ／Ｌから約２．５ｇ／Ｌの前記緩衝液中の濃度でチオグリコール酸ナトリウムを含み、
    前記少なくとも１種の非イオン性洗剤は、約０．０１ｇ／Ｌから約１０ｇ／Ｌの前記緩衝液中の濃度でサポニン、および約０．０１ｇ／Ｌから約２０ｇ／Ｌの前記緩衝液中の濃度でトリトンＸ−１００を含み、
    前記任意選択の塩化アンモニウムは、存在する場合、約０．０１ｇ／Ｌから約８０ｇ／Ｌの前記緩衝液中の濃度であることを特徴とする請求項１に記載の緩衝液。
21. 消泡剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の緩衝液。
22. 前記少なくとも１種の非イオン性洗剤は、サポニンとトリトンＸ−１００との混合物であり、前記緩衝液は、消泡剤を含有しないことを特徴とする請求項１に記載の緩衝液。
23. 血液培養陽性試料から生存微生物を分離し濃縮するための方法であって、
    血液培養陽性試料の一部分を請求項１に記載の緩衝液と混合して、混合物を生成するステップであって、血液培養陽性試料に対する前記緩衝液の量は、細胞が溶解され、かつ前記血液培養陽性試料中の前記微生物の生存能力が維持されるような量になされる、ステップと、
    任意選択で、前記混合物をインキュベートするステップと、
    前記混合物を遠心分離にかけて、ペレットおよび上清を生成するステップと、
    前記ペレットを保持しながら、前記上清を廃棄するステップと、
    前記ペレットを前記緩衝液で再懸濁して、再懸濁されたペレットを作成するステップと、
    前記再懸濁されたペレットを遠心分離にかけて、第２の上清および第２のペレットを生成するステップと、
    生存微生物を含有している前記第２のペレットを保持しながら、前記第２の上清を廃棄するステップと
    を含むことを特徴とする方法。
24. 前記血液培養陽性試料の前記一部分は、同容積の緩衝液と混合されて、前記混合物を生成することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
25. 前記第２のペレットを溶液で再懸濁し、質量分析法による前記微生物の同定、表現型同定、抗菌薬感受性試験、および分子試験からなる群から選択される前記再懸濁された第２のペレットの少なくとも１つの下流の試験を行うステップをさらに含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
26. 前記微生物は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、および酵母からなる群から選択されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
27. 前記グラム陽性菌は、ストレプトコッカスニューモニエであることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
28. 血液培養陽性試料から生存ストレプトコッカスニューモニエを分離し濃縮するための方法であって、
    少なくとも１つの微生物を含有する疑いがある血液試料を得るステップと、
    前記血液試料の一部分を嫌気性血液培養ボトルに加える一方、前記血液試料の第２の部分を好気性血液培養ボトルに加えるステップと、
    前記嫌気性血液培養陽性ボトルと前記好気性血液培養陽性ボトルの両方で陽性シグナルを得るステップと、
    好気性血液培養陽性試料の一部分を前記請求項１に記載の緩衝液と混ぜ合わせて混合物を形成し、前記混合物をインキュベートして前記血液試料中の前記血液細胞を溶解し、前記混合物を遠心分離にかけて、前記血液試料中のストレプトコッカスニューモニエの存在の早期表示を提供する緑色のペレットを形成することによって、前記血液試料中のストレプトコッカスニューモニエの存在の早期表示を得るステップと、
    下流の分析のために嫌気性血液培養陽性試料の一部分を調製するステップであって、
    前記嫌気性血液培養陽性試料の一部分を、最大約１ｇ／ＬでトリトンＸ−１００を含む前記緩衝液と混合して、混合物を生成するステップ、
    任意選択で、前記混合物をインキュベートするステップ、
    前記混合物を遠心分離にかけて、ペレットおよび上清を生成するステップ、
    前記ペレットを保持しながら、前記上清を廃棄するステップ、
    前記ペレットを前記緩衝液で再懸濁して、再懸濁されたペレットを作成するステップ、
    前記再懸濁されたペレットを遠心分離にかけて、第２の上清および第２のペレットを生成するステップ、および
    生存ストレプトコッカスニューモニエを含有している前記第２のペレットを保持しながら、前記第２の上清を廃棄するステップを含む、調製するステップと
    を含むことを特徴とする方法。
29. 前記嫌気性血液培養陽性試料の前記一部分は、同容積の緩衝液と混合されて、前記混合物を生成することを特徴とする請求項２８に記載の方法。
30. 前記嫌気性血液培養陽性試料の前記一部分は、約０．３３５ｇ／Ｌの前記緩衝液中の濃度のトリトンＸ−１００を含む前記緩衝液と混合されて、前記混合物を生成することを特徴とする請求項２８に記載の方法。
31. 前記第２のペレットを溶液で再懸濁し、質量分析法による前記微生物の同定、表現型同定、抗菌薬感受性試験、および分子試験からなる群から選択される前記再懸濁された第２のペレットの少なくとも１つの下流の試験を行うステップをさらに含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
32. 請求項１に記載の緩衝液の少なくとも１つの処方物を含むことを特徴とする血液培養陽性試料から微生物を分離し濃縮するためのキット。