CN103616434B

CN103616434B - 质谱鉴定微生物的方法

Info

Publication number: CN103616434B
Application number: CN201310684429.2A
Authority: CN
Inventors: 佟雪梅; 赵焕铸
Original assignee: 佟雪梅
Current assignee: New biological technology (Qingdao) Co., Ltd.
Priority date: 2013-12-12
Filing date: 2013-12-12
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2033-12-12
Also published as: CN103616434A

Abstract

本发明实施例提供的质谱鉴定微生物的方法，通过采用分割单元法，更好地反映了微生物的特征性和特异性；通过采用微生物加权乘积和的方法，更好的将微生物的波峰强度和出峰规律的相关性充分而综合的体现了出来；因此，用所有的已知微生物对该方法进行验证，微生物的鉴定准确率达到99%以上，准确率得到了极大的提高，有效的降低了误判和误报的几率，也降低了由于微生物的误判和误报带来的安全事故。

Description

质谱鉴定微生物的方法

技术领域

本发明涉及微生物鉴定领域，具体而言，涉及质谱鉴定微生物的方法。

背景技术

相关技术中，质谱鉴定微生物的方法，包括样品前处理方法、微生物分析鉴定方法及鉴定结果的报告方法均采用质谱蛋白质检测方法--MALDI-TOF法。

其中，微生物分析鉴定方法通过将被检测的微生物的特征峰列表与含有大量微生物特征数据的特征波谱库相比对来完成。通过对已知微生物种属和菌株在细微差别的条件下进行若干次测量制得特征波谱库。利用质谱鉴定微生物时，从质谱图中提取特征峰质量等信息，生成波峰列表，通过测量最多20个质谱图来获得特征峰质量数等信息的平均数；将含有大量不同微生物的特征峰信息的波谱库与从质谱中生成的峰列表进行比对，确定该待检测的微生物的种类。

但是，上述微生物分析鉴定方法，只能比对待测微生物的部分特征峰质量数，不能比对待测微生物的所有的特征峰质量数，导致微生物的鉴定准确率低，仅为80%-95%，从而增加了误判和误报的几率，也增加了由于微生物的误判和误报带来的安全事故。

发明内容

本发明的目的在于提供质谱鉴定微生物的方法，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供了一种质谱鉴定微生物的方法，按照如下步骤进行操作：

获取所有已知微生物的质谱波峰列表；

确定所述波峰列表中所有特征峰的质量区间，并将所述质量区间划分为若干个单元，使每种微生物的特征峰分别落入与峰值质量相应的单元内；

获取每种已知微生物在每个单元的出峰比例X或不出峰比例Y；

设置所有单元加权值的上限值为A，下限值为负A，

获取每种已知微生物在每个单元的加权值，具体按照如下公式计算：

A*X或（-A）*Y;

获取每种已知微生物在每个单元的峰强度与加权值的乘积，以及该微生物所有单元的加权乘积和；

获取待测微生物的质谱波峰列表；

获取所述待测微生物在每个单元的峰强度与某种已知微生物的加权值的乘积，并累加获得所述待测微生物的加权乘积和；

将所述待测微生物的加权乘积和与所述某种已知微生物的加权乘积和比对，当两者的相似度大于60%时，即可确定所述待测微生物为所述某种已知微生物。

具体地，所述获得所有已知微生物的质谱波峰列表的步骤，具体按照如下步骤操作：

获得所有已知微生物的质谱图；

获得每种已知微生物特征峰的波峰列表；

在所述波峰列表中选择显示峰强度，通过调整特征峰的质量误差，修正所述波峰列表。

进一步地，所述获得特征峰波峰列表之前还包括从所述质谱图中提取特征峰的步骤。

具体地，所述提取特征峰具体通过基线修正和降噪程序完成。

具体地，所述调整质量误差的步骤中质量误差小于等于300道尔顿。

具体地，确定所述波峰列表中所有特征峰的质量区间，并将所述质量区间划分为若干个单元，使每种微生物的特征峰分别落入与峰值质量相应的单元内的步骤，具体为：确定所述波峰列表中所有特征峰的质量区间为2000-18000道尔顿，并将所述质量区间划分为1500个单元，使每种微生物的特征峰分别落入与峰值质量相应的单元内。

具体地，所述相似度利用二项分布的分布律计算。

具体地，所述相似度的区间的上限为所述待测微生物加权乘积中的最高值，所述相似度的区间的下限为所述待测微生物加权乘积中的最低值。

本发明实施例提供的质谱鉴定微生物的方法，与现有技术中的MALDI-TOF法相比，其通过将微生物波谱库中的特征峰的质量区间划分为若干个单元，根据每个单元中的某种微生物的出峰比例或不出峰比例，并对该已知微生物的每个单元进行加权，利用该微生物的每个单元的峰强度乘以加权值得到每个单元的加权积，对每个单元的加权积求和后，得到该微生物的加权乘积和；按照上述方法获取已知菌库中所有的每种已知微生物的加权乘积和。然后再获取待测微生物的加权乘积和，将其与每种已知微生物的加权乘积和比对，当两者的相似度大于60%时，即可确定所述待测微生物为所述某种已知微生物。本发明实施例提供的质谱鉴定微生物的方法，通过采用分割单元法，更好地反映了微生物的特征性和特异性；通过采用微生物加权乘积和的方法，更好的将微生物的波峰强度和出峰规律的相关性充分而综合的体现了出来；因此，用所有的已知微生物对该方法进行验证，微生物的鉴定准确率达到99%以上，准确率得到了极大的提高，有效的降低了误判和误报的几率，也降低了由于微生物的误判和误报带来的安全事故。。

附图说明

图1示出了质谱波峰曲线的示意。

具体实施方式

下面通过具体的实施例并结合附图对本发明做进一步的详细描述。

一种质谱鉴定微生物的方法，按照如下步骤进行操作：

获取所有已知微生物的质谱波峰（如图1所示）的列表；

设置所有单元加权值的上限值为A，下限值为负A，

A*X或（-A）*Y；

获取待测微生物的质谱波峰列表；

将所述待测微生物的加权乘积和与所述某种已知微生物的加权乘积和比对，当置信度大于60%时，即可确定所述待测微生物为所述某种已知微生物。

相关技术中，质谱鉴定微生物是通过将待测微生物的波谱与微生物波谱库中进行比对，只通过峰强度或出峰时间等信息进行比对，而不涉及峰强度和出峰时间或出峰规律之间的相关性，因此，相关技术中，质谱鉴定微生物的准确率低，容易出现误判的现象。为了解决这个问题，本发明实施例提供的质谱鉴定微生物的方法，不仅考虑了峰强度，而且充分的考虑了峰强度与出峰规律的相关性的问题，通过使用该方法鉴定已知微生物进行验证，发现本发明实施例提供的方法，微生物鉴定的准确率与相关技术相比，得到了极大的提高，在99%以上。

采用分割单元的方法，由于相同种属的微生物在相同的时间区间出现特征峰的数量和强度类似，呈现出一种特殊的“指纹”，反映了微生物的稳定性和生物学特性。因此，本发明实施例中，将所有的特征峰的质量区间进行分割成多个单元，则每种微生物的特征峰会分别落入不同的单元内。

为了提高该方法的可信度和准确率，为已知的菌库中的微生物每个单元赋予加权值时，对15000-20000各菌株进行了试验，使每种微生物在每个单元中的出峰比例或不出峰比例更加可信和准确。

应当说明的是，如下步骤：

设置所有单元加权值的上限值为A，下限值为负A，

A*X或（-A）*Y;

解释为：

当试验的微生物假设为10种，其中包括某微生物W，

当某个单元中只出现微生物W的特征峰，而未出现其他的9种微生物，则该微生物W的出峰比例为100%，则微生物W在该单元的加权值为A*100%，为最大加权值，该单元的微生物W的特异性出峰单元；

当某个单元中没有10种微生物中的任何一种出峰或不出峰时，则该单元的10种微生物中的任何一种的加权值为0；

当某个单元中既出现微生物W的特征峰，也出现了另外一种微生物的特征峰，则对于微生物W和上述另外一种微生物而言，其出峰比例为80%，则微生物W和上述另外一种微生物在该单元的加权值为A*80%；而对于其他的在该单元未出峰的8种微生物而言，其不出峰比例为80%，则未出峰的8种微生物在该单元的加权值为（-A）*80%。

确定了每种已知微生物在每个单元的加权值后，经过如下步骤：

“获取每种已知微生物在每个单元的峰强度与加权值的乘积，以及该微生物所有单元的加权乘积和；”的加权积以及加权乘积和的计算的操作，将进行试验的10种微生物的特征峰的峰强度进行了扩大，即将其生物学特征进行了扩大，则区分不同的微生物种类时，会更加容易，且更加准确。

得到了每种已知微生物的加权乘积和之后，就可以通过比较待测微生物相对于某种已知微生物的加权乘积和，由于同种微生物的不同菌株的生物学特征很相似，因此，同种微生物的不同菌株的加权乘积和的相近，如果待检测的微生物的加权乘积和与某种微生物的相似度大于60%以上时，则可以确定该待测微生物即为所述某种微生物。

本发明实施例提供的质谱鉴定微生物的方法，其中，获得所有已知微生物的质谱波峰列表的步骤，具体按照如下步骤操作：

获取所有已知微生物的质谱图；

获取每种已知微生物特征峰的波峰列表；

其中，得到微生物的质谱图后，提取质谱图中的特征峰，如本领域技术人员可以理解的，特征峰为峰强度比较大，且具有一定的分离度的峰。因此，在后续鉴定微生物时，使用微生物的特征峰，可以使鉴定结果更加准确和可信。

得到特征峰后，将特征峰转化为峰列表。

本发明实施例中，得到波峰列表后，根据微生物波谱库的数据对特征峰的原始峰强度进行质量调整，获得更接近波谱库的质量数。从而使后续获得的微生物鉴定结果更加准确。

本发明实施例中，通过基线修正和降噪程序来获得特征峰，如本领域技术人员可以理解的，基线修正和降噪程序可以去除杂质峰或由于质谱仪不稳定带来的震动峰。

本发明实施例中，修正波峰列表时，当质量误差小于等于300道尔顿时，对后续的鉴定结果不仅不会产生影响，同时还能够最大程度的修正波峰列表，得到最好的结果。

本发明实施例中，确定波峰列表中所有特征峰的质量区间可以为2000-18000道尔顿，并可以将所述质量区间划分为1500个单元，使每种微生物的特征峰分别落入与不同的单元内。2000-18000道尔顿的上下限差为16000，中间可以分成1500个单元，每个单元的单位差为十几道尔顿。这样，就可以使特征峰区分在不同的单元内。

本发明实施例中，置信度表示待测微生物的加权乘积和与已知某种微生物的加权乘积和的相似度。按照常规的置信度的计算方法，利用二项分布的分布律计算置信度，可利用常规的通用的公式进行计算。置信度区间的上限值为所述待测微生物加权乘积中的最高值，置信度区间的下限值为所述待测微生物加权乘积中的最低值。

用所有已知微生物通对该方法进行验证，确定置信度为60%就可以表示一个待测微生物的加权乘积和是在某已知菌种加权乘积和范围内，而且一定在数据库中所有其他菌种总加权乘积和的范围之外，其结果可认为确认的鉴定结果。准确率达到99%以上。

实施例

获取所有已知微生物的质谱波峰列表（如表1所示）；

确定所述波峰列表中所有特征峰的质量区间，并将所述质量区间划分为若干个单元，使每种微生物的特征峰分别落入不同的单元内；

设置所有单元加权值的上限值为A，下限值为负A，

获取每种已知微生物在每个单元的加权值（如表2所示），具体按照如下公式计算：

A*X或（-A）*Y;

获取每种已知微生物在每个单元的峰强度与加权值的乘积，以及该微生物所有单元的加权乘积和（如表3所示）；

获取待测微生物的质谱波峰列表；

表1已知微生物的波峰列表

表2已知微生物在每个单元的加权值

表3已知微生物所有单元的加权乘积和

同种不同菌株的加权乘积和可以在坐标系中形成一个加权积的正态分布图：

置信度表示这个未知菌的值与数据库中的已知标准菌种加权积的相似度，置信度的计算利用二项分布的分布律计算，程序可利用通用公式自行计算。其自动取得同组加权乘积和数据中的最高值和最低值经计算作为已知的上下限范围。

用所有已知标准菌种通过这一功能进行验证，确定置信度为60%就可以表示一个未知菌种的加权乘积和是在某已知菌种加权乘积和范围内，而且一定在数据库中所有其他菌种总加权乘积和的范围之外，其结果可认为确认的鉴定结果。准确率达到99%以上。

下面是如何鉴定未知菌，比如一个未知菌株第138单元峰强度0.47，第382单元峰强度0.39，第561单元强度峰0.79，第791单元峰强度0.31，第847单元峰强度0，第1500单元峰强度0.2…,其相对于大肠杆菌的整体加权积是-0.23，34%的置信度值。同样，相对于金黄色葡萄球菌的整体加权积是+4.99，99.9%的置信度值。

系统将会得到一个置信度的矩阵，进行分析，去掉置信度值小于60%的结果。最后，保留、确定结果，输送到报告系统最终报告鉴定的结果。一般来说，只有1个大于60%置信度的值，但如果有超过四个菌种在结果列表中或如果没有菌种名称在列表上，则打出“无法识别”的报告。需要通过其他辅助实验确认菌种的种类。

1.通过预设峰值误差功能，比如质量数300，对原始峰值表进行修正，可以得到更接近真实的平均质量数。从而能得到更准确的鉴定结果。

2.分隔“单元”法，是因为我们研究发现相同菌属的细菌在相同的时间区间出现特征峰的的数量和强度类似，呈现出一种特殊的“指纹”，反映了细菌的稳定性和生物学特性。这为我们将波峰段进行分割，提供了很好的依据。

反之，这个分隔法的应用可以更好地反映细菌的生物特性。比单一蛋白质质量的比较方法更准确和科学，提供了一个新的细菌计算标准。

3.加权乘积和的计算方法，将细菌中的每个蛋白的峰强度和出峰规律的相关性得到了充分而综合的体现；累加的效应，突出了每种细菌独特的生物学特性。是一种二维的计算模型。

4.置信度的计算方式，表现了某一菌株在整个同类菌株的试验数值中（是个正态分布图）出现的概率，以及和其它类别细菌区分的量化指标，是一个非常科学的计算方法。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种质谱鉴定微生物的方法，其特征在于，按照如下步骤进行操作：

获取所有已知微生物的质谱波峰列表；

设置所有单元加权值的上限值为A，下限值为负A，

A*X或(-A)*Y；

获取待测微生物的质谱波峰列表；

将所述待测微生物的加权乘积和与所述某种已知微生物的加权乘积和比对，当置信度大于60％时，即可确定所述待测微生物为所述某种已知微生物；所述置信度表示待测微生物的加权乘积和与已知某种微生物的加权乘积和的相似度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述获得所有已知微生物的质谱波峰列表的步骤，具体按照如下步骤操作：

获得所有已知微生物的质谱图；

获得每种已知微生物特征峰的波峰列表；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述获得特征峰波峰列表之前还包括从所述质谱图中提取特征峰的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述提取特征峰具体通过基线修正和降噪程序完成。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述调整质量误差的步骤中质量误差小于等于300道尔顿。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，确定所述波峰列表中所有特征峰的质量区间，并将所述质量区间划分为若干个单元，使每种微生物的特征峰分别落入不同的单元内的步骤，具体为：确定所述波峰列表中所有特征峰的质量区间为2000-18000道尔顿，并将所述质量区间划分为1500个单元，使每种微生物的特征峰分别落入不同的单元内。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述置信度利用二项分布的分布律计算。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述相似度的区间的上限为所述待测微生物加权乘积中的最高值，所述相似度的区间的下限为所述待测微生物加权乘积中的最低值。