KR20010034600A - 미생물의 검출 및 성상 확인 - Google Patents
미생물의 검출 및 성상 확인 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20010034600A KR20010034600A KR1020007010102A KR20007010102A KR20010034600A KR 20010034600 A KR20010034600 A KR 20010034600A KR 1020007010102 A KR1020007010102 A KR 1020007010102A KR 20007010102 A KR20007010102 A KR 20007010102A KR 20010034600 A KR20010034600 A KR 20010034600A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- tube
- microorganism
- fluid
- nucleic acid
- microorganisms
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 95
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 14
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 title description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 101
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 90
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 87
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 48
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 40
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims abstract description 24
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims abstract description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 71
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 47
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 34
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 20
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 11
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 8
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 7
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 6
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 claims description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 238000005498 polishing Methods 0.000 claims description 3
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 3
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 2
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 claims description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims description 2
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims 6
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 claims 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims 2
- 229920004943 Delrin® Polymers 0.000 claims 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 claims 1
- 206010028470 Mycoplasma infections Diseases 0.000 claims 1
- 239000002998 adhesive polymer Substances 0.000 claims 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 claims 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 claims 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 claims 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 12
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 abstract description 10
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 abstract description 4
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 4
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 abstract description 3
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 abstract 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 16
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 7
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 6
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000002594 fluoroscopy Methods 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000755266 Kathetostoma giganteum Species 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 239000008239 natural water Substances 0.000 description 2
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000049 Carbon (fiber) Polymers 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 229910052771 Terbium Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003888 boundary cell Anatomy 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004917 carbon fiber Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N chembl1408157 Chemical compound N=1C2=CC=CC=C2C(C(=O)O)=CC=1C1=CC=C(O)C=C1 KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001317 epifluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004359 iodixanol Drugs 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005499 meniscus Effects 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- NJPPVKZQTLUDBO-UHFFFAOYSA-N novaluron Chemical compound C1=C(Cl)C(OC(F)(F)C(OC(F)(F)F)F)=CC=C1NC(=O)NC(=O)C1=C(F)C=CC=C1F NJPPVKZQTLUDBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005453 pelletization Methods 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N terbium atom Chemical compound [Tb] GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5021—Test tubes specially adapted for centrifugation purposes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/04—Investigating sedimentation of particle suspensions
- G01N15/042—Investigating sedimentation of particle suspensions by centrifuging and investigating centrifugates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
- G01N15/0255—Investigating particle size or size distribution with mechanical, e.g. inertial, classification, and investigation of sorted collections
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/04—Investigating sedimentation of particle suspensions
- G01N15/042—Investigating sedimentation of particle suspensions by centrifuging and investigating centrifugates
- G01N2015/045—Investigating sedimentation of particle suspensions by centrifuging and investigating centrifugates by optical analysis
- G01N2015/047—Investigating sedimentation of particle suspensions by centrifuging and investigating centrifugates by optical analysis by static multidetectors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
- Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
- Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
- Y10T436/255—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.] including use of a solid sorbent, semipermeable membrane, or liquid extraction
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Centrifugal Separators (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
침강 속도 및 등밀도 밴드 형성 밀도를 기초로 하는 2-차원 원심분리에 의해 혼합물로 부터 미생물, 특히 감염성 인자를 분리하고, 미생물이 내성을 나타내는 고정화 시약 대역을 통해 미생물을 침강시키고, 핵산 특이성 염료를 사용하여 광 산란 또는 형광에 의해 밴드 형성된 입자를 검출하고, 밴드 형성된 입자를 매우 작은 부피로 회수하고, 질량 분광법에 의하여 바이러스 단백질 소단위와 원상태 바이러스 입자를 분석하고 형광 유동 세포계측법에 의하여 핵산 질량과 제한효소에 의해 생성된 단편의 질량을 결정하여 성상확인하기 위한 방법. 이 방법은, 세균 및 바이러스 종과 같은 개개의 미생물이 각각 물리적으로 비교적 균질하고, 생물리학적 특성에 의해 다른 생물학적 입자 및 자연에서 발견되는 비-생물학적 입자로부터 구별될 수 있다는 발견을 기초로 한 것이다. 이 방법은 감염을 구별하고, 공지된 미생물을 동정하고, 신규 미생물을 발견 및 성상 확인에 유용하다. 이 방법은 미생물을 매우 빠르게 동정하고, 따라서 동정된 감염성 인자에 대한 합리적인 치료법을 선택할 수 있도록 한다. 특히 유용한 적용은 신규 항생물질 및 항바이러스제의 임상 시험에서이며, 이 경우 표적이 되는 감염성 인자로 감염된 초기 개체에서 동정하는 것이 필수이다.
Description
본 발명은, 광 산란 또는 형광을 기초로 한 밀도 구배에서의 검출과 조합하여, 2-차원 원심분리 및 화학 및 효소제로의 노출을 사용하여 미생물, 특히 감염성 인자를 분리 및 동정하고, 형광 유동 세포계측법에 의해 계수하고, 질량 분광법, 유동 세포계측법 및 형광위(epifluorescence) 현미경법에 의해 원상태의 비리온, 세균, 단백질 및 핵산을 성상 확인하는 분야에 관한 것이다.
본 발명의 배경을 해명하거나 실행에 관련된 추가 세부사항을 제공하기 위해 본 명세서에서 사용된 공보 및 기타 자료는 참고문헌으로 인용되었으며, 편의상 첨부된 참고문헌 목록에 모아놓았다. 본 명세서에 언급된 특허도 참고문헌으로 인용된 것이다.
선행기술에서는, 적절한 배지에 또는 조직 배양액에 원인 인자를 배양하여 분석을 위해 충분한 입자를 얻은 다음, 생육을 지탱하는 조건, 특정 항체에 대한 반응 또는 핵산 하이브리드형성을 기초로 하여 동정함으로써, 바이러스 및 세균 감염의 진단을 수행하였다 (가오(Gao) 및 무어(Moore), 1996). DNA를 증폭시키기 위해 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용할때 생물학적 생육이 생략될 수 있으나, PCR은 서열-특이적 프라이머를 요구하므로, 결국 공지되거나 추정된 인자만으로 한정된다 (배이(Bai) 등, 1997). 이러한 모든 방법을 위해서는 상당한 시간이 요구되고, 이 방법은 공지되거나 추정된 성질을 가진 인자에 대해서만 유용하다. 기존의 방법은 새로운 감염성 인자를 빠르게 단리하고 성상확인하기 위한 수단을 제공하지 않는다. 수백개의 감염성 인자가 공지되어 있으며, 이들의 상당한 부분에 대해 이용가능한 시약을 갖는 것은 실행불가능하다.
혈액, 뇨 및 조직으로부터 감염성 인자를 회수하기 위한 기술은 앞서 원심분리 또는 여과를 기초로 하여 개발되어 왔으나, 임상적으로 널리 사용되지 않았다 (앤더슨 (Anderson)등, 1966; 앤더슨 등, 1967). 가장 높은 분할 방법은, 침강 속도(스베드버그 단위, S로 측정됨) 및 등밀도 밴드 형성 밀도 (mL 당 그램 또는 ρ로 측정됨)를 기초로 하여 분획을 분리하는 속도 밴드 원심분리를 사용한다. S-ρ분리는 쥐 간 균질액으로부터 고 순도 상태로 바이러스 입자를 단리하기 위해 사용되었으며, 세포당 약 20 비리온의 당량을 단리하기 위해 사용되었다 (앤더슨 등, 1966). 이러한 연구에서, 바이러스 입자를 광 산란에 의해 검출하고 전자 현미경법에 의해 눈으로 관찰하였다. 이러한 분리법은 일반적으로 이용되지 않는 복합적인 특정한 장치와 하루 이상의 노력을 필요로 하였으며, 분리된 세균 또는 바이러스 종의 확실한 동정을 제공하지 못하였다.
원심분리 법에 의해 단리된 후보 감염성 입자가 실제로 핵산을 함유함을 나타내는 것이 중요하다. 활성 및 고정된 세균 및 바이러스 입자에서의 DNA 및 RNA를 핵산에 대해 특이적인 형광 염료로 염색하고, 형광 현미경법 및 유동 세포계측법에 의해 관찰 및 계수하였다. 자유 상태에서 형광을 거의 나타내지 않으나, 핵산에 결합시에 고 형광성이 되는 많은 염료가 공지되어 있다. 일부는 DNA 또는 RNA에 대해 또는 상이한 특정 영역에 대해 차별적으로 결합하며, 일부는 DNA 또는 RNA에의 결합 여부에 따라 상이한 방출 스펙트럼을 나타낸다. 이러한 개시내용에서 언급된 염료는 형광 염료이다. 차등 형광 분광법에 의해 ssDNA, dsDNA 및 RNA를 구별할 수도 있다. [참조: 호그랜드(Haugland), 1996; 메이어(Mayor) 및 다이완 (Diwan), 1961; 메이어, 1961; 하비(Hobbie)등, 1977; 지머맨 (Zimmerman), 1977; 피터(Perter) 및 페이그(Feig), 1980; 폴(Paul), 1982; 슈틀 (Suttle), 1993; 히론스(Hirons)등, 1994; 헤네스(Hennes) 및 슈틀, 1995; 헤네스 등, 1995].
세균 및 바이러스에서 발견된 치수의 단리된 핵산 분자를 계수하고, 용액중의 분자에 대해 형광 유동 세포계측법을 사용하고 고정화 분자에 대해 형광위 현미경법을 사용하여 그의 질량을 평가하였다 (헤네스 및 슈틀, 1995, 굿윈 (Goodwin)등, 1993). 양쪽 경우에, 제한효소에 의해 생성된 단편의 크기를 평가할 수 있으며, 상이한 제한 효소에 의해 생성된 공지된 DNA 분자의 단편의 크기를 기록한 데이타베이스를 참조하여 분자를 동정하였다 (하몬드 (Hammond)등, 미국 특허 제 5,558,998호; 징 (Jing) 등, 1998).
특정한 형광-표지된 항체를 사용하여, 특이한 동정을 수행할 수도 있다. 이러한 연구는 시간이 걸리고, 형광위 현미경 또는 형광계와 함께 일련의 특정한 항체를 요구한다.
매트릭스-보조의 레이저-탈착-이온화 TOF-MS 질량 분광법 (MALDI-TOF-MS)은 통상 50,000 달톤 이상의 분자량을 가진 단백질의 질량을 정확히 측정할 수 있다. 이전에는 각각의 비리온 단백질을 질량 분광법 (시우즈닥 (Siuzdak), 1998)에 의해 연구하였다; 그러나, 원상태 바이러스의 임상적으로 적절한 표본으로부터 바이러스 소단위의 전체 집합을 분할하는 것과, 그들의 각각의 질량에 의해 정확한 측정이 이루어질 수 있다는 증명은 앞서 보고된 바 없다. 단독 단백질 질량 측정은 많은 단백질을 확실하게 동정할 수 있으나, 바이러스 또는 세균 세포로부터의 단백질의 집합이 공지된 경우, 이러한 집합을 검출하면 더욱 정확한 동정이 제공된다. 또한, 단백질 또는 효소적으로 생성된 펩티드 단편을 부분적으로 서열화할 수 있고 따라서 동정의 신뢰성을 더욱 증가시키는 방법이 현재 개발되고 있다. MALDI-TOF-MS를 위하여 일반적으로 사용되는 방법은 피코몰 또는 그 이상의 단백질을 필요로 하는 반면, 전기분무 질량 분광법은 통상 5∼10 펨토몰을 필요로 한다. 질량 분광법, 특히 MALDI에서의 검출 한계는 시료를 농축시키고 매우 작은 표적 면적에 집중시키는 것에 의존된다. 더 작은 용량의 시료를 농축하고 전달하기 위한 초미량 방법이 개발됨에 따라 감도가 더욱 증가하게 된다. [참조: 글래이돈(Claydon)등, 1996; 펜셀라우 (Fenselau), 1994; 크리쉬매너티 (Krishmanurthy)등, 1996; 루 (Loo)등, 1997; 레논(Lennon) 및 왈쉬(Walsh), 1997; 쉐브켄코(Shevchenko)등, 1996; 홀란드 (Holland)등, 1996; 리앙(Liang)등, 1996].
큰 부피로부터 작은 부피내로 입자를 농축하기 위한 원심분리 법이 수십년간 사용되어왔다. 작은 관 부위쪽 아래로 원심분리 방향으로 점점 가늘어지는 단면적과 큰 실린더 부피를 가진 미소밴드 형성 원심분리용 관을 사용하여, 관의 좁은 관 하부로 제한된 밀도 구배로 입자를 농축하거나 밴드 형성시킬 수도 있고, 또는 펠릿화할 수도 있다. 이러한 관의 기본 구조는 당업자에게 공지되어 있다. [참조. 틴클러(Tinkler) 및 챌린저 (Challenger), 1917; 크로스 (Cross), 1928; ASTM 위원회 D-2, 1951; 다비스(Davis) 및 오텐리쓰 (Outenreath), 미국 특허 제4,624,835호; 키무라 (Kimura), 미국 특허 제4,861,477호; 레빈 (Levine)등, 미국 특허 제5,342,790호; 사운더즈 (Saunders)등, 미국 특허 제5,422,018호; 사운더즈, 미국 특허 제5,489,396호]. 이러한 유형의 초기의 관은 서더랜드 벌브(Sutherland bulbs)라 불리우고, 석유중의 물 함량을 결정하기 위해 사용되었다 (문헌; The Chemistry of Petroleum and Its Substitutes, 1917, 원심분리 수단에 의해 물 및 침강물에 대한 ASTM 일시적 시험 방법, ASTM 명칭: D 96-50T, 1947). 기본 구조의 약간의 변형은 미국 특허 제4,106,907호; 제4,624,835호; 제4,861,477호; 제5,422,018호; 제5,489,396호에 기재되어 있다. 이러한 관은 유리 또는 플라스틱 재료로 만들어졌으며, 금속 원심분리 차폐물에서 유리 또는 플라스틱 원심분리용 관을 지탱하기 위해 물 또는 기타 유체를 사용하는 것이 당 기술분야에 오랫동안 공지되어 왔다. 그러나, 본 발명의 미소밴드 형성 원심분리용 관과 유사한 형태를 포함하는 선행 기술에 개시된 원심분리용 관은, 바이러스 입자를 구배로 밴드 형성하기 위해 필요한 원심분리 힘을 견딜 수 없었다. 종래의 원심분리용 관 또는 서더랜드 구조로부터의 관 유도체가 밀도 구배 분리를 위해 사용되어 왔으며, 이러한 분리를 위해서는, 이러한 분획을 혼합없이 회수할 수 있도록, 상이한 밀도 영역 사이에 이들을 위치시키는 왁스 또는 플라스틱 장벽이 사용된다. 정지시에 단계 구배 성분의 혼합을 방지하는 장벽에 대해 이전에 언급된 바는 없으나, 이러한 장벽은 회전동안에 구배로부터 원심분리에 의해 제거된다. 고속 얇은 벽의 회전 버킷 원심분리용 관에 대하여, 관을 부하한 후에 그의 외부 표면을 소독할 수 있도록 하는 관의 폐쇄에 대해서 앞서 기재된 바 없다.
원심분리 분야에서 매우 얕은 밀도 구배의 효율적인 안정화가 공지되어 있으며, 이는 합성 경계 셀을 사용하여 혼합없이 시료층을 구배의 구심 표면으로 빠르게 유동시키기 위한 분석용 초원심분리에서 이용된다 (앤더슨, 미국 특허 제 3,519,400호). 따라서, 물리적 장벽 디스크가 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌과 같이 시료층의 밀도보다 낮은 물리적 밀도를 가진 다공질, 직조 또는 소결 재료로 만들어진다면, 단계 구배 성분들 사이의 가벼운 물리적 장벽 디스크는 구배를 방해하지 않으면서 원심분리 력에 의해 구배로 부터 이동될 수 있다.
많은 저자들은, 바이러스 및 세균이 생물학적 기원의 불순물 입자를 분해 또는 용해시키는 세제 및 효소의 작용에 대해 종종 내성이라는 점에 주목하였으며, 이들의 차별적인 감수성을 기초로 하여 감염성 인자들을 분류하기 위해 노력하였다. 이러한 차이점은 이전에는 감염성 인자를 검출 및 정량하기 위한 방법에서 편리하게 사용되지 않았다 (참조, 게슬러 (Gessler) 등, 1956; 테일러 (Theiler), 1957; 엡스테인(Epstein) 및 홀드(Hold), 1958; 코박스 (Kovacs), 1962; 플랜테로스 (Planterose)등, 1962; 가드(Gard) 및 마알로에(Maaloe), 1959). 바이러스와 세균의 상이한 종 사이의 밀도 상이점은 공지되어 있으나, 이전에는 동정의 목적을 위해 이용되지 않았다.
감염성 입자는, 존재하는 핵산의 유형, 및 존재하는 핵산, 단백질, 탄수화물 및 지질의 양 사이의 비율에 의존하며, 약 1.17 g/ml ∼ 1.55 g/ml 범위의 넓은 범위의 등밀도 밴드 형성 밀도를 나타낸다. 이러한 밴드 형성 밀도 차이는 공지되어 있으나, 이전에는, 감염성 인자를 체계적으로 측정하고 이들을 분류하는 데이타를 사용하기 위한 시도가 행해지지 않았다.
본 발명은, 침강 속도 및 밴드 형성 밀도를 기초로 한 분리, DNA와 RNA를 구별하기 위한 방출된 형광 빛의 스펙트럼 분석, 가용화 효소 또는 시약의 대역을 통한 침강에 의해 다른 입자로부터 바이러스 및 세균 입자의 분별, 합성 밀도 표준화 입자의 위치를 참조로 한 감염성 입자의 등밀도 밴드 형성 밀도의 결정, DNA 또는 RNA에 대한 형광 염료를 사용한 입자 검출, 펠릿화에 의한 밴드 형성된 입자의 추가 농축, 농축된 입자를 단백질 질량 결정 및 분석을 위해 질량 분석계 표적으로 전달, 형광위 현미경법 및 형광 유동 세포계측법에 의한 농축된 입자의 계수, 및 고정화된 핵산 분자를 사용한 제한효소 단편 길이 다형태 분석 또는 초감도 형광 유동 세포계측법에 의한 세균 또는 바이러스 핵산의 동정을 사용하여, 감염성 인자를 농축, 검출 및 성상확인하기 위한 통합된 시스템에 관한 것이다. 이 방법들은 낮은 역가의 바이러스를 갖거나 배양될 수 없는 바이러스를 함유하는 생물학적 시료를 성상확인함에 있어서 특히 유용하다.
또한, 형광 항체의 사용, 인자-결합 효소의 검출, 인자 질량을 증가시키기 위한 배양, PCR 증폭, 제한효소 단편 길이 다형태 분석, 칩 상에 고정화된 프로브에 대한 하이브리드 형성, 조직 화학 분석 및 전자 현미경을 포함한 모든 형태의 현미경을 포함하여, 감염성 인자를 검출 및 성상확인하기 위해 사용되는 모든 통용되는 방법들은 본 발명의 방법을 사용하여 미생물을 예비농축함으로써 현저히 개선된다.
이러한 기술들은 이전에는 일상 분야, 병원 및 임상 실험에서 사용가능한 하나의 운용 시스템으로 조합되지 않았었다. 본 출원은 이러한 시스템을 실현가능하게 만드는 기술혁신 및 발명을 설명한다. 잠재적인 치사성 인자를 사용한 연구를 위하여, 시스템을 봉쇄 상태로 조립하고 적어도 부분적으로 자동화시킨다.
발명의 요약
본 발명의 전체 목적은, 감염성 질병 인자를 생육시키지 않으면서 빠르게 동정하고, 새로운 감염성 인자를 발견하기 위한 물리적 시스템을 개발하는데 있다. 이 방법은 감염성 인자가 기타 천연 입자로부터 물리적 및 화학적 수단에 의해 단리될 수 있고 원심분리 수단, 형광 및 질량 분광법을 사용하여 그들의 물리적 매개변수에 의해 동정될 수 있는 독특한 입자의 군을 구성한다는 이론을 근거로 한다. 시스템은 바이러스 및 세균 감염을 빠르게 임상적으로 구별할 수 있고, 특정한 치료법을 제공하기 위한 목적으로 특정 인자를 동정할 수 있고, 새로운 감염성 인자를 빠르게 발견할 수 있도록 한다. 또한, 시스템은 세균 및 바이러스 부하에 대한 항생물질 및 항바이러스제의 효과를 측정함으로써 인간에서의 새로운 항생물질 및 항바이어스제를 개발 및 시험하는 것을 가능하게 한다. 현재, 새로운 항바이러스 약제의 개발은, 치료로부터 이익을 얻을 수도 있는 초기 감염 단계의 개체군을 한정할 수 없음으로 인해 심각하게 방해를 받고 있다.
본 발명에 따르면, 연속적으로 작아지는 직경을 가진 상부, 중간 및 하부 영역을 포함하는 원심분리용 관이 제공된다. 한가지 구현양태에서, 관은 시료를 수용하기 위한 상부 영역, 깔때기-형태의 중간 영역 및 하부의 좁은 관상 미소밴드 형성 영역을 갖고 있다. 하부 영역의 직경은 0.25 인치 또는 그 미만, 바람직하게는 0.1 인치 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.08 인치, 가장 바람직하게는 0.08 내지 0.039 인치일 수도 있다. 작은 직경의 미소밴드 형성 영역은 실현가능하고 본 개시내용의 범주 내이다. 하부 영역의 길이는 전형적으로 관 길이의 5 % 내지 25 %이다. 한가지 측면에서, 관은 또한 마개를 막거나 뺄 수 있는 중앙의 구멍을 가진 밀봉부를 포함할 수도 있다.
본 발명에 따르면, 원심분리용 관을 유지시키기 위해 버킷이 제공된다. 버킷은, 직경이 연속적으로 작아질 수 있거나, 내경을 연속적으로 감소시키기 위한 삽입물을 가질 수도 있거나, 또는 균일한 내경을 가질 수도 있는 상부 및 하부 영역을 포함하며, 버킷을 회전자(rotor)에 결합시키는 제 3의 영역을 더 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 미생물을 농축하기 위한 방법이 제공된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "미생물"이란, 바이러스, 마이오플라스마, 리켓티아, 효모 및 세균을 포함하는 것을 의미한다. 방법은 본 명세서에 기재된 초원심분리용 관에서 미생물을 함유하는 시료를 초원심분리하는 것을 포함한다. 초원심분리는 밀도 구배의 형성 및/또는 미생물(들)의 염색을 포함할 수도 있다. 한가지 측면에서, 염색은 바이러스의 DNA 또는 RNA 내용물을 구별하기 위해 사용될 수 있다. 초원심분리시에 미생물의 밴드 형성은 미생물을 동정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 측면에서, 질량 분광법, 유동 세포계측법, 광학적 맵핑(mapping), 등밀도 밴드 형성 밀도, 형광, 제한효소 분석, 게놈 크기, 효소 또는 약품 내성/감수성, 면역화학 등과 같은 통상적인 기술에 의해 농축된 미생물을 더 성상확인한다. 본 발명의 다른 측면에서, 미생물의 양 또는 역가를 결정할 수 있다.
본 발명에 따르면, 원심분리용 관내의 시료로부터 형광을 측정하기 위한 시스템이 제공된다. 한가지 구현양태에서, 시스템은 원심분리용 관, 레이저와 같은 광원, 및 시료를 통해 통과하는 빛 또는 시료를 통해 빛이 통과할 때 시료로부터 방출되는 빛을 검출하기 위한 검출기를 포함한다. 광학 필터는 빛의 여기 및 방출 파장을 선택 및 분리한다.
작은 바이러스 입자가 표면 불규칙성에 의해 지연되는 것을 방지하기 위하여 관 및 특히 깔때기 부분의 내부 표면은 매우 매끄러워야 하며, 또한 감염성 입자가 흡수되지 않도록 표면을 처리하여야 한다. 용매 증기에 짧게 노출시킴으로써 플라스틱 표면의 연마를 수행한다. 예를 들면, 가열된 염화 메틸렌 가스에 짧게 노출시킴으로써 폴리카르보네이트를 연마시킨다. 소 혈청 알부민 또는 젤라틴과 같은 단백질의 묽은 용액, 또는 헤파린 또는 헤파린의 유도체와 같은 하전된 중합체로의 노출에 의한 감염성 입자의 흡수를 막기 위해 플라스틱 표면을 개질시킨다. 이러한 절차는 모두 당업자에게 공지되어 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 작은 부피로 농축된 입자를 계수하기 위한 시스템이 제공된다. 시스템은 입자가 농축되어 있는 용기, 모세관, 2개의 펌프, 모세관에 대해 용기를 이동시키기 위한 수단, 유동 셀, 광원 및 검출기를 포함한다. 대안적으로, 펌프 대신에 가스 압력에 의해 유체를 이동시킬 수도 있다.
도 1은 전형적인 조직 및 대표적인 바이러스에 대한 S-rho 그래프를 나타낸다.
도 2A 내지 2C는 원심분리 미소밴드 형성 관의 한 가지 구현양태 및 그의 사용을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3A 내지 3G는 미소밴드 형성 관 및 회전자(3F)에서의 사용에 대한 대안적인 구현양태를 나타낸다.
도 4A 및 4B는 큰 부피의 시료를 고속 분별화할 수 있는 원심분리 회전 버킷 구조를 나타낸다.
도 5는 수직 단색파장 레이저 조명, 측각기 및 미소밴드 형성 관을 지탱 및 위치시키기 위한 X-Y 단, 밴드 형성된 바이러스 입자를 가진 미소밴드 형성 관, 및 카메라 시스템을 포함하는 완전한 시스템을 나타낸다.
도 6은 간섭 필터 광원, 광 파이프 조명, 디지탈 데이타 획득 및 CRT 데이타 표시를 포함하는 완전한 시스템을 나타낸다.
도 7은 마이크로피펫을 사용하여 밴드 형성된 바이러스 입자를 회수하고 유동 세포계측법에 의해 이들을 계수하기 위한 방법을 나타낸다.
도 8A 내지 8C는 밴드 회수의 상세도를 나타낸다.
도 9A 내지 9F는 회전하는 버킷 회전자 원심분리용 관에 대한 밀폐 및 관에 대한 시료 검출의 한가지 구현양태를 나타낸다.
본 발명은 생물학적 시료에서 세균 및 바이러스와 같은 미생물 인자의 존재를 동정 및 측정하는 방법에 관한 것이다. 방법은 미생물 인자를 매우 작은 부피로 정제하기 위한 원심분리 단계를 포함한다. 이어서, 등밀도 밴드 형성 밀도, 형광 또는 질량 분광법과 같은 수단에 의해 인자를 분석한다.
본 발명의 목적은, 감염성 인자를 포함한 미생물을 함유하는 현탁액을 하나 이상의 형광 염료로 염색하고, 원심분리시에 단계적 또는 연속적 구배가 자동적으로 형성되며, 염색-함유 현탁 매질로부터 미생물을 원심분리해 내고, 외부 오염이 없도록 세척하고, 매우 작은 단면적의 구배로 농축하고, 등밀도 밴드 형성 밀도에 따라 분리하고, 그들의 밴드 형성 밀도를 결정하고, 형광에 의해 미생물을 검출하는, 통합된 시스템 및 방법을 개발하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 감염성 인자를 포함한 미생물을 1 내지 5,000의 계수에 의해 미소밴드 로 농축하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 감염성 인자와 같은 미생물을 밀도 구배로 상이한 대역에 함유된 세제, 계면활성제, 효소 또는 유기용매를 포함한 시약에 노출시켜 불순물 입자를 용해 또는 분해시킴으로써, 불순물 입자들이 미생물과 함께 밴드 형성되는 것을 방지하고 염색된 입자를 염색되지 않은 초기 시료 부피로부터 분리하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, RNA, 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA에 차별적으로 결합되는 하나 이상의 염료를 사용하여, 이들을 형광 스펙트럼에 의해 구별할 수 있도록 하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 물 또는 매우 희석된 완충액에 전형적으로 0.04 mL인 밴드 형성 구배를 약 4 mL로 재현탁시키고, 미생물을 1 회 이상 펠릿화하여, 질량 분광분석 및 형광위 현미경 또는 유동 세포계측법에 의한 계수를 위해 구배 물질이 없는 농축된 펠릿을 제공함으로써, 밴드 형성된 미생물, 예를 들어 감염성 인자의 농축을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 감염성 인자에 대한 실험자의 노출을 최소화하는 감염성 질병의 진단 수단을 제공하는데 있다.
본 발명의 추가의 목적은, 원상태의 핵산 분자의 질량을 결정하고 유동 세포계측법 또는 형광위 현미경을 사용하여 제한 효소에 의해 생성된 단편을 성상 확인하기 위해, 감염성 인자를 포함한 소량의 미생물로부터 핵산을 제조하는 수단을 제공하는데 있다.
본 발명의 추가의 목적은, 감염성 인자와 같은 미생물의 밴드 형성 밀도를 구배에 첨가된 보정된 입자의 위치를 참고로 하여 정확히 결정하는데 있다.
용이한 설명을 위하여, 본 발명은 미생물로서 바이러스를 참고로 하여 설명할 것이다. 본 발명은 마이오플라스마, 효모 및 세균을 포함한 기타 미생물에 적용될 수도 있는 것으로 이해된다. 본 발명은 감염성 인자의 동정을 위해 특히 적합하며, 이하 명세서에서 설명될 것이다.
도 1은 "바이러스 윈도우 (Virus Window)" (앤더슨, 1966)의 개념을 설명하기 위하여 세포하의 세포소기관 및 바이러스의 침강 계수 및 등밀도 밴드 형성 밀도를 나타내는 그래프이다. 바이러스는 비교적 좁은 범위의 침강 계수 및 밴드 형성 밀도를 갖는 것이 명백하며, 고 분할 S-ρ분리 시스템을 사용하여 조직 균질물로부터 또는 혈액으로부터 고 순도 상태로 단리될 수도 있다. 고 분할 S-ρ원심분리 방법 및 바이러스 단리를 위한 원심분리 개발을 완벽하게 설명하기 위해서는, 문헌[국립 암 협회 (National Cancer Institute) 모노그래프 21, 조직 분별 및 분석을 위한 밴드 원심분리 및 보조 시스템의 개발, 미국 보건 교육 복지성, 공중 보건부, 1966]을 참조한다. 이 연구는 S-ρ분리 이론 및 시스템과, 단계적 밀도의 착색된 플라스틱 비드를 밀도 마커로서 사용하는 것을 설명한다.
실행시, 혈액 시료 또는 조직 균질물을 원심분리하여, 분석하고자 하는 입자 또는 입자보다 높은 침강 속도를 가진 모든 입자를 침강시킨다. 바이러스에 대하여, 이것은 약 10,000 S 이상의 입자를 버리는 것을 의미한다. 이어서 이러한 분리후의 상층액을, 모든 공지된 감염성 입자를 침강시키고 등밀도로 밴드 형성시키는 원심분리 조건을 사용하여, 본 명세서에 기재된 바와 같이 미소밴드 형성 관에서 수행되는 제 2 차원 등밀도 밴드 형성 분리를 위한 시료로 사용한다.
1 피코몰의 바이러스는 6.022×1011바이러스 입자를 함유하는데 대하여, 6×109비리온은 비리온당 100 카피로 존재하는 바이러스 외피 단백질의 1 피코몰을 함유한다. 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여, 많은 감염성 질병에서 혈장 또는 혈청 mL당 108초과의 바이러스 입자가 존재하는 것을 증명하였다. 따라서, 108비리온/mL 를 함유하는 5 ∼ 10 mL 생물학적 시료로 부터의 비리온을 1 또는 2 마이크로리터로 농축하고 이어서 매우 작은 표적 부위에 적용한다면, MALDI-TOF-MS (크리쉬매너티(Krishmanurthy) 등, 1996; 홀란드(Holland) 등, 1966)을 사용하여 각각의 바이러스 단백질을 검출할 수 있다. 전자분무 기술을 사용하면 106바이러스 입자/mL를 함유하는 시료를 검출할 수 있는 반면, 유동 세포계측법 및 고정화 DNA 형광위 현미경법의 사용시에는 훨씬 적은 입자가 요구된다 (헤라(Hera) 등, 1991, 헤네스 및 슈틀, 1995). 이러한 방법을 세균에 적용하는 것은, 시료의 복합성을 감소시키기 위해 단백질의 예비분리를 필요로 할 수도 있다. 질량 분광법에서, 하전된 이온 검출에 의해 검출이 행해지며, 이러한 검출의 한계는 검출될 수 있는 단백질 및 핵산의 크기로 상한선이 설정된다. 100,000 달톤 이상의 생물학적 입자의 질량을 측정할 수 있는 질량 분광분석 방법을 이제 설명하겠다.
이러한 수준의 바이러스를 사용하여 연구하기 위하여, 바이러스는 매우 작은 부피로 농축되어야 한다. 이러한 농축은, 제 2 차원 원심분리 동안에 (등밀도 밴드형성 단계), 입자를 세척하고 이들을 선택된 시약에 노출시키는 구배층을 통해 통과시킨 후에, 바이러스를 농축하기 위해 특별하게 고안된 원심분리용 관을 사용하여 바이러스를 미소밴드 로 밴드 형성함으로써 달성된다. 이러한 미소밴드 형성 원심분리용 관의 예를 도 2A 내지 2C에 나타낸다. 도 2A는 상부 시료 용적 (2), 연속적으로 가늘어지고 평행-벽 부위 (4)-(6)를 가진 톱니모양의 깔때기 영역 (3), 및 그 아래에서 압축된 좁은 관상 미소밴드 형성 영역 (7)을 가진 중공형 투명 원심분리용 관 (1)을 도식적으로 나타낸다. 톱니모양의 깔때기 영역(3)은 톱니모양 영역을 포함하지 않고 위에서 아래로 단순히 가늘어지는 원심분리용 관에 비해 개선된 것이다. 톱니모양이란, 예를 들어 동심 고리 또는 테두리 또는 립(lip)을 의미한다. 이러한 고리, 테두리 또는 립은 원심분리용 관의 내경 주변에서 연속적인 것이 바람직하지만, 이것이 요구되지는 않는다. 예를 들면, 원심분리용 관의 내부벽으로부터 직경 주위에 동일한 간격으로 위치한 3개의 돌출부는 디스크를 위치에 고정시키기 위해 사용될 수 있다. 용어 톱니모양이란, 이러한 가능성을 포함하는 것을 의미하지만, 원심분리용 관의 내부 표면상에 고리, 테두리, 립 또는 돌출부를 갖지 않은채 직선으로 가늘어지는 것은 포함하지 않는다. 톱니모양은 2 이상의 유체 층을 분리하기 위해 디스크를 위치시킬 수 있는 받침대로서 사용될 수 있다. 톱니모양을 갖지 않은채 단순히 가늘어지는 관내에 디스크를 위치시킬 수 있긴 하지만, 이렇게 가늘어지는 관 내의 디스크는 맞은편 테두리상에서 밀어내림으로써 한쪽 테두리상에서 쉽게 기울어질 수 있다. 이로인해 디스크에 의해 분리되어진 층들이 조기에 혼합될 수도 있다. 톱니모양의 영역은 디스크를 평편하게 놓아지도록 하고 디스크가 사고로 기울어지는 것을 막을 수 있다. 일례로서, 원심분리용 관은 상부로부터 하부까지 3.45 인치일 수도 있고, 상부에서 0.562 인치의 외경을 갖고, 하부 미소밴드 형성 영역 (7)에서 0.064 인치의 내경을 가질 수 있다. 이러한 관은 SW41 Ti (벡맨 (Beckman))회전자에서 사용하기에 적절하다. 관의 내부 표면은 증기 연마를 포함한 통상의 기술을 사용하여 바람직하게 연마되며, 따라서 바이러스 입자가 관의 벽에 들러붙지 않는다. 추가로, 당 기술분야에 공지된 바와 같이, 입자 접착을 방지하기 위하여 관의 내부 표면을 단백질 또는 중합체로 코팅할 수도 있다.
도 2B는 감소되는 물리적 밀도의 일련의 유체가 정지 상태에서 관에 어떻게 부하되는지를 나타낸다. 표시된 관은 유체의 하나의 층을 유체의 다음 층과 분리하기 위해 디스크를 놓아둘 수 있는 일련의 톱니모양을 포함한다. 유체 (8)는 회수되는 임의의 입자보다 농후하며, 미소밴드 형성 영역 (7)을 부분적으로 채우기위해 사용된다. 덜 농후한 유체 (9)를 마이크로피펫으로 피펫팅할 때, 유체 (8)과 (9)가 분리상태로 유지되도록 공기 기포(10) (여기에서 공기란 대기중 공기 또는 기타 가스를 의미한다)가 존재할 수도 있다. 유사하게, 제1 오버레이 유체 (11)가 도입될 때, 공기 기포 (12)가 위치에 존재할 수도 있고, 따라서 원심분리가 개시될 때까지 3개의 유체가 분리상태로 유지된다. 2개의 유체층이 분리되도록 공기 기포가 위치에 존재할 수 있도록 하기 위해서는, 미소밴드 형성 영역 (7)에서 0.064 인치의 내경을 가진 관이 적절하다. 대안적으로, 공기 기포를 제거하고, 밀도 구배를 형성하도록 유체를 함께 확산시킬 수도 있다. 유체 (11)를 바람직하게는 소결 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌이고 제1 톱니모양에서 위치에 꼭 맞는 경질 다공성 플라스틱 디스크 (13)로 덮는다. 이어서, 유체 (11)보다 덜 농후하고 하나 이상의 시약을 함유할 수도 있는 유체(14)를 도입하고, 디스크 (15)로 덮은 다음, 더 덜 농후한 유체 (16)을 도입하고 이것을 디스크 (17)로 덮는다. 전체 시스템은 원심분리될 때까지 안정하다. 사용전에, 유체 (16)보다 낮은 밀도를 가진 시료 층 (18)을 수준 (19)까지 첨가한다. 이어서, 관을 금속 차폐물에서 전형적으로 차폐물에 첨가되는 물 또는 기타 유체와 함께 고속으로 원심분리한다. 또한, 관과 차폐물 사이의 공간을 채우는 어댑터를 끼움으로써 관을 지탱할 수도 있고, 추가의 지지체를 제공하기 위하여 물을 첨가함으로써 관, 어댑터와 차폐물 사이의 공간을 채울 수도 있다. 임의로, 조작자의 감염의 기회를 최소화하기 위하여, 관에 마개를 할 수도 있다 (도 9A 내지 9F에 나타냄, 이하 더욱 상세히 설명됨).
도 2C는 원심분리 후의 관을 도식적으로 나타낸다. 다공질 분리 디스크 (13), (15) 및 (17)가 관의 상부로 올라가고, 시료층 (18)에서 바이러스가 제거되며, 원래의 단계 구배가 확산에 의해 일련의 얕은 구배의 하나로 변화되었다. 또한, 가스 기포 (10) 및 (12)는 구심적으로 이동하고, 유체 (8) 및 (9)는 접촉되어 확산에 의해 급경사 구배를 형성한다. 원심분리가 진행함에 따라, 이 구배의 기울기는 감소되며, 감염성 인자의 밴드 형성을 위해 적절한 폭의 밴드 형성 구배를 생성한다. 염화세슘 구배에 대하여, 밀도는 전형적으로 1.18 내지 1.55 g/ml의 범위이다. 이러한 구배 단계는 비-바이러스성 입자를 용해시키는 시약을 함유할 수도 있을 뿐만 아니라, 입자로부터 과량의 형광 염료를 세척해내는 작용을 한다. 예를 들면, 각종 세제 또는 프로테아제와 같은 효소를 시료 층 (18)에 또는 (14) 또는 (16)과 같은 기타 층에 첨가할 수도 있다. 형광 염료가 이러한 영역에 존재할 수도 있다. 자유 염료는 바이러스가 밴드 를 형성하는 아래쪽의 더 농후한 영역에 들어가지 않게되며, 따라서 원심분리는 상부의 덜 농후한 층에 존재할 수도 있는 모든 시약으로부터 바이러스를 정제하게 된다. 원심분리 후에, 관의 미소밴드 형성 영역은 밴드 형성 구배의 윗 부분 (27), 밴드 형성된 바이러스 (28) (바이러스 또는 바이러스의 핵산에 결합된 임의의 염료를 포함함) 및 밴드 형성 구배의 아래쪽의 농후한 부분(29)을 함유하며, 이들 사이에서 확산에 의해 구배가 형성된다.
도 3A 내지 3G는 바이러스 및 세균의 미소밴드 형성을 위해 유용한 관의 대안적인 구현양태를 나타내며, 이들은 모두 정지 상태에서 하나 이상의 경질 장벽이 위치및 유지될 수 있도록 하는 톱니모양의 내부 구조물을 갖는다. 도 3A 내지 3D 및 3G에 나타낸 관은 회전하는 버킷 회전자에서 원심분리되도록 고안되므로, 따라서 관은 원심분리시에 수평이고 정지시에는 수직이다. 도 3A에 나타낸 관은 시료 저장부 (31), 톱니모양의 깔때기 영역 (32) 및 미소밴드 형성 부위 (33)를 가진 더욱 통상적인 구조이다. 도 3B에 나타낸 관은 도 3A에 나타낸 것과 유사하지만, 플라스틱 또는 금속일 수도 있는 지지체 삽입물 (34)에 의해 원심분리 차폐물에서 지탱된다. 도 3B 내지 3E에 나타낸 관은 회전자 챔버를 완전히 채운다. 도 3C의 관은 산란된 빛을 흡수하는 불투명 하부 부위 (35)를 갖는 반면, 도 3D에 나타낸 관은 구배의 농후한 말단을 형성하는 과다한 부피의 유체를 함유하도록 미소밴드 형성 관 (37)의 하부에 구형 부위 (36)를 가지며, 따라서 구배를 안정화한다. 도 3E에 나타낸 관은 도 3F에 나타낸 것과 같은 각 헤드 회전자에서 원심분리되도록 고안된 것이고, 회전자에 위치한 한쪽면을 따라 선형으로 연속한 벽 (38)을 가지며, 그 결과 입자가 미소밴드 형성 영역 (40)으로 쉽게 미끌어져 내릴 수 있다. 도 3G에 나타낸 관은 매우 큰 미소밴드 형성 관이 어떻게 조립될 수 있는지를 나타낸다.
도 4A 내지 4B는, 도 3G의 관이 상부에서부터 구부러진 하부까지 일정한 반경을 가진 관보다 더 빠른 속도로 어떻게 도 3G의 관이 원심분리될 수 있는지를 나타낸다. 이는 관(46)의 치수에 잘맞는 금속, 플라스틱 또는 탄소섬유 차폐물 (45)을 사용하여 달성된다. 차폐물은 마개 (47)를 가지며, 고속 회전 버킷 회전자에서 통상적으로 행해지는 바와 같이, 차폐물 또는 버킷은 일체식 부착장치 (48)상에서 회전된다. 차폐물의 팁 (49)은 차폐물의 상부 부위보다 훨씬 작은 직경을 가지며, 그의 최대 반경에서 훨씬 적은 질량이 회전하므로, 따라서 균일한 내부 직경의 차폐물을 가진 경우에 비하여 더 높은 속도에 도달할 수 있다. 이는 그렇지 않은 경우에 비하여, 더 큰 부피로부터 미량의 바이러스를 단리할 수 있도록 한다. 드라이브 (51)에 의해 구동되는 회전자(50)를 사용하여 원심분리하는 동안에, 차폐물 및 관 (52)은 표시된 바와 같이 수평 위치로 관찰된다.
이 단계에서 미소밴드 형성된 바이러스를 분석할 수 있거나 또는 이들을 수집하고, 희석하고 더 처리할 수 있다. 이 단계에서 미소밴드 형성된 바이러스를 분석하기 위하여, 도 5에 나타낸 것과 같은 시스템에 의해 이들을 검출할 수 있다. 예를 들면, 등밀도 밴드 형성 단계 또는 더 앞의 단계는 바이러스가 혼합되었거나 바이러스가 원심분리되었던 용액 내에 형광 염료 또는 형광 염료를 포함할 수도 있다. 원상태의 바이러스를 염색할 수도 있고, RNA, DNA, 단일가닥 핵산 및 이중가닥 핵산을 구별할 수 있는 염료가 공지되어 있으며, 이에 의해 감염성 인자의 존재 또는 부재를 검출할 수 있고 더욱이 정제된 바이러스의 유형을 결정할 수 있다. 이러한 염색된 입자를 분석하기 위하여, 도 5의 장치를 사용할 수 있다.
스캐닝 및 검출 시스템을 도 5에 도식적으로 나타내며, 여기에서 미소밴드 형성 관 (60)은 측각기 (62) 및 (63)에 의해 지지되는 설치대 (61)상에서 수직 위치로 유지되고, 다시, 관 (60)의 미소밴드 형성 부위가 레이저 빔 (66)에 대해 중심으로 배열되는 방식으로 X-Y 이동대 (64) 및 (65)에 의해 지지된다. 레이저 (67)에 의해 레이저 빔 (66)이 발생하며, 레이저는 458, 488, 496, 502 및 515 nm에서 결맞는 빛을 생성하는 아르곤 이온 레이저일 수도 있다. 빔은 하나의 파장을 단리시키기 위해 간섭 또는 기타 필터 (68)을 통과하며, 2색 거울 (69)에 의해 미소밴드 형성 관 내로 반사된다. 형광 밴드 형성 입자 대역 (70)은 방출 필터 (72)를 통해 카메라 (71)에 의해 촬영되거나 전자적으로 주사된다. 미광을 제거하기 위해 전체 시스템을 밀폐시킬 수도 있고, 필터 (68) 및 (72)를 필터 휠 (도시하지 않음)로 대체하여, 상이한 파장에서 흡수 및 방출되는 형광 염료를 사용하여 검출을 최적화하거나 또는 방출된 형광 빛의 스펙트럼에서의 차이에 의해 ssDNA, dsDNA 및 RNA를 구별할 수도 있다. 빛 및 카메라에 대한 시료 노출을 최소화하여 노출을 조절하기 위하여, 전자 셔터를 레이저에 부착할 수도 있다. 측각기 및 X-Y 이동대는 또한 모터 구동되고 원격 조정될 수도 있으며, 전체 시스템은 컴퓨터 (도시하지 않음)에 의해 조절될 수도 있다.
도 6은 모든 가시광 스펙트럼 및 근자외선까지 다룰수 있는 스캐닝 시스템의 상이한 변형을 나타낸다. 미소밴드 형성 관(80)은, 광 파이프 (83) 및 (84)에 결합된 투명한 강도 평형화기 (81) 및 (82) 사이의 고정된 지지체에 배열되며, 광 파이프 (83) 및 (84)는 다시 렌즈 (87)와 광원 (88)을 압축함으로써 필터(86)를 통해 조명을 받는 강도 평형화기 (85)에 연결된다. 필터 (86)는 모터 (90)에 의해 지시되는 필터 휠 (89)에 연결된 세트중의 하나이다. 그 결과 하나 이상의 밴드 (91), (92) 및 (93)의 양쪽으로부터 균일한 조명을 받게된다. 영상은 디지탈 카메라 (95)에 의하여 방출 필터 (94)를 통해 포착되며, CRT(97)상의 컴퓨터(96)에 의해 영상이 저장, 처리 및 표시된다. 필터 (94)는 (89) 및 (90)과 동일한 필터 휠로 대체될 수도 있으며, 따라서 여기 필터 휠 및 방출 필터 휠과 크세논 램프 또는 할로겐 램프와 같은 넓은 스펙트럼 광원을 사용하여 다양한 종류의 여기 및 방출 광의 조합을 선택할 수도 있고, 이는 다시 다양한 종류의 형광 염료를 사용하는 것을 가능하게 한다. 선택된 파장에서의 형광 및 광 산란 모두가 입자 검출을 위해 사용될 수도 있다. 이러한 배열은 ssDNA, dsDNA 및 RNA간의 구별을 수월하게 한다.
처리된 영상 (98)은 관과 함유된 밴드 (99), (100) 및 (101)의 사진을 나타내도록 진열될 수도 있다. 각각의 밴드로부터의 빛의 양은 통합되어 피크 (102), (103) 및 (104)로서 표시될 수도 있고, 또한 통합된 값을 디지탈로 표시할 수도 있다 (도시하지 않음). 광원 및 카메라 (도시하지 않음)상의 셔터, 필터 이동 및 위치 결정, 및 카메라의 초점 조정을 포함하는 전체 시스템은 컴퓨터 (96)에 의해 디지탈로 조절될 수 있다.
원심분리용 관 밴드 (91) 및 (93)을 나타내는 표시 밴드 (90) 및 (101)은 공지된 밀도의 형광 또는 비-형광 밀도 마커 비드일 수도 있고, 바이러스 밴드 (92)는 표시 밴드 (103)로 나타난다. 바이러스의 밴드 형성 밀도는 밀도 마커의 위치로부터 보간법에 의해 결정될 수도 있다. 비-형광 밀도 마커가 사용될 때, 이들은 위치 (86) 및 (94)에서 동일한 필터를 사용하여 산란된 빛에 의해 검출된다. 이어서 적절하고 상이한 필터를 사용하여 제2 영상을 포착하고, 이는 단지 형광으로 이루어진다. 2개의 영상을 전자적으로 상호-비교하고, 감염성 인자의 물리적 밀도를 보간법에 의해 결정한다.
이 단계에서, 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스로서 확인될 수 있으며, 만일 DNA 바이러스라면 단일가닥 또는 이중가닥의 여부를 결정할 수 있다. 또한, 바이러스의 밀도를 결정할 수 있다. 이 데이타는 정제된 바이러스의 유형을 확인하는 것을 돕기위해 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 실제의 바이러스가 무엇인가를 충분히 결정하고 원래의 바이러스 역가를 결정하기 위해 더 많은 데이타를 모으는 것이 요망되거나 필요할 수도 있다.
도 7은, 밴드 형성 구배위의 모든 유체를 제거 및 대체한 후에, 밴드 형성된 바이러스의 대역(111) 및 (112)을 함유하는 관(110)으로부터 회수된 각각의 형광 입자의 계수 장치를 도식적으로 나타낸다. 관을 관 홀더 (113)에 위치시키고, 공급된 구배위에 탈이온수 또는 매우 묽은 완충액의 오버레이(114)를 관(115)을 통해 도입하여, 탐침(117)에서 끌어올려진 부피를 대체한다. 관을 플라스틱 마개(116)로 위에서 밀폐시킬 수도 있다. 모세관 탐침 (117)은 고정상태로 유지되고, 미소밴드 형성 관(110)이 그 아래에서 천천히 올라간다. 관 홀더 (113)는 정밀 구동 메카니즘(118)의 일부이고, 매우 느리고 조절가능한 속도로 관 홀더를 수직으로 이동시키는 단계적 모터(119)와 연결된다. 느린 정상류의 유체를 펌프(122)에 의해 제공되는 외피 스트림 (121)의 중심인 협착부(120)로 배수시킨다. 그 결과, 그 중심에 스트림을 함유하고 유동하는 외피에 의해 신장 및 연장되는 유동 셀(123)을 통하여, 순수한 바이러스를 가진 유체가 일정하게 흐른다. 제2 펌프 (124)는 유동 셀로부터 유체를 일정한 속도로 윗쪽으로 끌어올리고, 그 속도는 피스톤 펌프 (122)가 유체를 외피 (121)로 주입하는 속도보다 빠르다. 펌프 (124)와 (122)의 속도간의 차이는 모세관 탐침(117)을 통해 흐르는 유체에 의해 이루어진다. 모세관 탐침 (117)을 통해 흐르는 유체는 관 (115)를 거쳐 도입된 오버레이로부터의 유체와 바이러스의 혼합물이다.
유동 셀(123)은 레이저(126)에 의해 생성되고 여기 필터 (127)를 통과하는 레이저 빔 (125)에 의해 조명을 받는다. 방출된 빛은 방출 필터 (128)에 의해 단리되고 광전자증배기 (129)에 의해 검출된다. 광전자증배기 (129)로부터의 출력을 컴퓨터(130)에 의해 때때로 통합하고, 통합된 시그날 대 시간이 CRT(131)상에 표시된다. 2개의 바이러스 밴드가 존재할 때 (132) 및 (133)과 같은 2개의 피크가 나타난다. 존재하는 형광 입자의 수에 의존하여, 밴드로부터 발생된 시그날이 피크로 통합될 수도 있거나, 또는 현탁액이 충분히 희석된다면, 입자를 각각 계수하고 값을 저장하고, 통합된 결과를 표시할 수도 있다.
상기 기재된 바와 같이 입자를 계수하기 위해서는, 바이러스 입자가 유동 셀(123)을 통과할 때 이들을 매우 희석하는 것이 필요하다. 도 8은, 개개의 입자를 계수하기 위해 매우 작은 부피의 바이러스밴드를 초기에 희석하는 문제를 어떻게 달성할 것인가를 도식적으로 나타낸다. 도 8A는 도 7에서와 같은 관 (110)을 나타내고, 표시된 부위는 도 8B에서 확대되어 나타나며, 도 8B은 다시 도 8C에서 확대되는 구획의 부위를 나타낸다. 미소밴드 형성 관의 윗쪽으로의 이동은 모세관을 관 하부쪽으로 이동시킬 수 있기 때문에, 유동 셀에 결합된 2개의 피스톤의 펌프 속도에서의 차이로 인해 유체가 모세관 위쪽으로 유동되어지며, 이곳에서 도 7의 펌프 (122) 및 (124)의 조합된 작용에 의해 기재된 바와 같이 유체가 희석된다. 그러나, 모세관 (117)내로 들어간 유체의 양은, 모세관 및 미소밴드 형성 관의 상대적 이동에 의하여, 밴드 형성 구배로부터 효과적으로 배수된 유체의 부피보다 훨씬 크다. 이러한 부피는 마개(116)를 통해 관 (115)내로 유동되는 유체로 대체되며, 이는 초기에 관(110)이 채워질 때까지 유입될 수 있다. 이러한 유체는 미소밴드 형성 영역에서 구배의 상부에 있는 유체의 밀도보다 훨씬 덜 농후하며, 이는 구배에서의 최소의 장해를 일으킨다. 도 8B에 나타낸 바와 같이, 모세관 (117)은 바이러스 밴드 (144)에 서서히 접근하며, 도 8C에 나타낸 바와 같이, 소량의 구배 유체 (145)가 모세관 위로 유동될 때 다량의 상층 유체(114)에 의해 희석된다. 이러한 방식으로, 바이러스 입자의 예리한 밴드 (144)가 희석되며, 유동 셀을 통해 부피가 더 큰 밴드로서 이동되지만, 분할능은 거의 실질적으로 소실되지 않는다. 이러한 기술은 각각의 바이러스 입자를 실행가능하고 정확하게 계수하는데 필요한 희석을 제공한다. 희석량은 모세관에서의 미생물의 농도가 상기 시험관의 하부영역에 있는 밴드에서의 농도의 1/2, 또는 1/10, 또는 1/100, 또는 1/1000, 또는 1/10000, 또는 백만분의 일, 또는 십억분의 일 미만이 되도록 조절될 수 있다.
입자를 계수하거나 바이러스의 역가를 결정하는 것에 추가로, 바이러스 또는 기타 미생물에서의 DNA의 양을 각각의 입자에 대해 결정할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에서, 입자의 DNA의 양은 유동 형광 분석 (굿윈 등, 1993) 및 형광위 분석 (징 등, 1998)에 의해 측정된다. 이러한 방식으로, 효모, 세균, 마이코플라스마 또는 바이러스를 군으로서 구별할 수 있으며, 예를 들면 바이러스는 5 ∼ 200 ×103염기 또는 염기쌍을 함유하고, 전형적인 세균인 E.coli(이.콜리)는 4 ×106염기쌍을 함유하는 반면 전형적인 효모 세포는 1.3 ×107염기쌍을 함유한다는 것이 알려졌다. 즉, 존재하는 DNA 또는 RNA의 양의 산출은 감염성 인자의 부류를 결정할 수 있도록 한다.
따라서, 게놈의 크기를 결정할 수 있다. 본 발명의 이러한 구현양태에서, 미생물 밴드로부터 게놈을 추출하고 고체 지지체상에 고정화시킨다. 고정화된 DNA를 염색하고 형광위 현미경법 (징 등, 1998)을 사용하여 전자적으로 영상화한다. 각각의 핵산 분자의 길이를 측정할 수 있다.
미소밴드 형성 기술은 바이러스를 염료로 염색하기 위해 유용할 뿐만 아니라 바이러스 입자를 계수할 수 있다. 생물학적 시료로부터의 바이러스를 일단 고도로 정제하고 미소밴드 형성 원심분리용 관을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 2 차원 원심분리 기술에 의해 농축하면, 바이러스가 많은 기타 분석에서 사용하기에 적합해진다.
감염성 인자가 미소밴드 형성 관에서 밴드 형성될 때, 밴드를 수 마이크로리터의 부피내에서 모세관 침을 사용하여 신중하게 제거할 수 있고, 1000 정도로 큰 계수로 구배 물질을 희석하기 위하여 매우 묽은 완충액 또는 탈이온수로 5 mL 또는 그 이상으로 희석한 다음, 새로운 미소밴드 형성 관에서 펠릿화할 수도 있다. 이어서, 상층액을 흡인 모세관에 의해 조심스럽게 회수할 수도 있고, 매우 작은 스테인레스 강철 와이어 플런저가 꼭맞게 설치된 정밀한 테프론(Teflon)(R)배관으로 이루어진 주사기를 사용하여 바이러스 또는 기타 인자를 약 1 마이크로리터에 재현탁할 수도 있다. 이어서, 시료를 질량 분광계 표적으로 옮기고, 기질 염료와 혼합하고, 매트릭스 보조의 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분광법 (MALDI-TOF-MS)을 위해 사용하여 바이러스 외피 단백질 또는 세균 세포 단백질의 질량을 직접적으로 결정할 수도 있다. 시료 농축에 대해 설명된 기술은, 기질 염료를 사용하지 않고도, 원상태의 바이러스 집단의 검출을 포함한 전자분무 또는 기타 질량 분광법 분석 시스템에 또한 적용될 수도 있다.
도 7에 나타낸 것과 유사한 시스템은 또한, 제한 효소를 사용하여 DNA 분자의 분자 제한 단편 길이 지도의 상응물을 제작하는데 사용될 수도 있다. 이 작업을 위하여, 바이러스 또는 세균 입자 밴드를 상기 기재된 바와 같이 희석 및 침강시킬 수 있고, 그 후에 당 기술분야에 공지된 세제 또는 기타 시약을 사용하여 DNA를 추출할 수도 있고, 제한 효소 및 형광 염료로 처리하고, 유동 세포계측법에 의해 단편 크기를 결정할 수 있다 (굿윈 등, 1993; 하몬드 등, 미국 특허 제5,558,998호). DNA 분자의 길이를 결정하기 위해서는, 추출된 DNA를 또한 고체 지지체상에 고정화하고, 형광 염료로 염색하고, 형광위 현미경을 사용하여 촬영할 수도 있다. 이어서 표본을 제한 엔도뉴클레아제로 처리할 수도 있고, 올리고뉴클레오티드 단편의 수 및 길이를 결정한다 (징 등, 1998). 각각의 인자를 확인하기 위하여, 이러한 데이타를 상이한 바이러스 또는 세균 종에 대해 예상되는 단편 길이를 기록한 데이타베이스와 비교한다. DNA 단편 길이는 또한 겔 전기영동에 의해 결정될 수도 있다.
또한, 형광 표지 항체를 연구하고자 하는 입자 현탁액에 첨가할 수도 있고, 등밀도 밴드 형성된 입자에서 표지의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다. 이러한 접근법은 특정한 확인을 위해 유용하며, 상이하고 독특한 스펙트럼 특징을 가진 염료로 표지된 항체의 집단을 사용하여, 인자 집단의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다. 대안적으로, 지연된 형광을 측정하는 경우에, 유로품 및 테르븀과 같은 희토류에 대한 킬레이터로 표지된 항체를 사용할 수도 있다.
혈청 또는 혈장은 전형적으로 1.026 및 1.031의 물리적 밀도를 갖는다. 바이러스는 전형적으로 염화 세슘에서 1.17 내지 1.55의 밴드 형성 밀도를 가지며, 요오딕사놀 또는 슈크로스와 같은 요오드화 구배 물질에서는 훨씬 낮은 밀도이다 (그라햄 등, 1994). 따라서, 시료와 밴드 형성 구배 사이의 중간 세척 및 시약 층은 밴드 형성된 가장 가벼운 바이러스의 밀도보다 낮은 밀도를 가져야 한다. 바이러스 단리를 위하여 구배 물질을 용해시키기 위해 사용된 완충액은 0.05M 붕산 나트륨, 및 0.02M 시안화나트름율 포함하며, 이둘 모두는 세균 생육을 방지한다.
인간 혈청 또는 혈장에 있어서는, 바이러스 입자의 밴드 형성 이전에, 약 104S의 침강 계수를 가진 혈소판 및 기타 입자를 제거하기에 충분한 원심분리를 사용한다.
바이러스 입자의 밴드 형성 밀도는 핵산/단백질 비율, 및 지질 및 지질단백질의 존재 또는 부재에 의존된다. 따라서, 형광 염료로 표지된 특이적 동정 항체의 부착은, 형광에 의한 동정 뿐만 아니라 밴드 형성 밀도 변화에 의한 동정을 가능하게 해야 한다.
밀도에 의해 입자를 동정하는 것을 돕기 위하여, 공지된 밀도의 형광 입자를 도 6에 나타낸 시료에 포함시킬 수도 있다. 이러한 입자는 공지된 밴드 형성 밀도의 공지된 고정 및 형광 염색된 바이러스 또는 세균 입자, 또는 매우 작은 형광 표지되거나 비-형광 표지된 플라스틱 비이드를 포함할 수도 있다. 폴리스티렌 라텍스 입자를 항체로 코팅할 때, 그들의 밴드 형성 밀도는 상당히 증가되며, 항체-코팅된 입자와 항체가 특이성을 나타내는 항원과의 반응에 의해 밀도가 더욱 증가될 수도 있다 (앤더슨(Anderson) 및 브레일라트(Breillatt), 1971). 따라서, 바이러스 입자의 위치를 결정할 뿐만 아니라 이들을 동정하기 위하여 항체-코팅된 형광 폴리스티렌 비이드를 사용할 수도 있다.
통상 가장 유용한 염색은 문헌 (Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, R.P.Haugland, ed., Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon (1996)]에 기재되어 있으며, 여기에는 염료명의 약칭, 그들의 화학명, 흡수 및 방출 최대치 및 가장 많이 사용되는 필터 조합이 기록되어 있다.
인간 병원체를 사용한 연구시에는, 안전한 조작 및 봉입이 중요하다 (조 (Cho) 등, 1966). 회전하는 버킷 회전자의 사용은, 물리-화학적 관점에서 최적이긴 하지만, 광범위한 조작이 필요하고 각-헤드 회전자에 비해 더 많은 부품을 갖고 있다. 도 3E에 나타낸 관은 각-헤드 회전자에서 사용되도록 고안된 것이고, 이는 침강 입자가 하나의 변화되지 않는 각에서 벽을 따라 이동될 수 있도록 한다. 이러한 회전자는 회전하는 버킷 회전자에 비해 사용 및 봉입상태에서의 취급이 용이하긴 하지만, 각 헤드 회전자에서의 침강은 결코 이상적이지 못하다. 따라서, 회전하는 버킷 회전자를 사용하여 안전하게 작업하기 위한 방법 및 장치를 개발하는 것이 중요하다.
고속 원심분리용 관은 효과적으로 밀봉하기 곤란하고 실험자에게 감염되는 강력한 원인이 된다는 악평이 알려져 있다. 실제로, 거의 모든 고속 회전 버킷 회전자 관은 그 자체로는 밀봉되지 않지만, 관을 밀봉하지 않는 금속 마개로 밀봉된 금속 버킷내에 봉입된다. 따라서 원심분리용 관은 부하, 원심분리 회전자로의 이동, 삽입 및 제거시에 개방된다. 구배를 방해하지 않으면서, 밀도 구배를 함유하는 개방 관의 외부를 살균하는 것은 매우 곤란하다. 본 출원에서는, 관을 원심분리 차폐물내에 삽입하기 전에 외부 표면을 적절한 소독제로 세정할 수 있도록 플라스틱 관을 효율적으로 밀봉할 수 있는 것과, 이들이 주사될 때까지 안전하게 취급할 수 있는 것이 요망된다.
도 9A에 나타낸 바와 같이, 물의 밀도 보다 낮은 물리적 밀도를 가진 환상 고리 밀봉 (151)을 관 (152)에 삽입함으로써 밀봉을 수행한다. 고리 (151)는 관 (152)에 매우 꼭 끼게 맞도록 약간씩 가늘어지며, 마개를 밀어넣고 뺄수 있는 중앙 구멍을 갖고 있다. 한가지 구현양태에서, 짧은 플라스틱 민머리 나사를 수용하도록 하기 위하여, 중앙 구멍에 나사산을 낸다. 처음에, 가벼운 용액 (153)과 농후한 용액 (155)을 포함한 2개의 구배 성분을, 상기 기재된 바와 같이, 그들 사이에 작은 공기 기포 (154)를 가진 하부 미소밴드 형성 영역에 도입한다. 도 9B에 나타낸 바와 같이, 감염성 인자 또는 기타 입자들을 함유하는 용액 (156)을 관 (157)을 통해 도입하고 상부 구배 용액으로부터 시료를 분리하기 위하여 기포 (158)를 위치시킨다. 도입된 시료의 부피는 원심분리용 관을 완전히 채우지는 않고 공간 (159)을 빈채로 남겨둔다, 이어서, 도 9C에 나타낸 바와 같이, 관을 예를 들어 플라스틱 민머리 나사(160)로 밀봉하고, 공기 기포 (160)를 그 위치에 유지시킨다. 이어서, 관을 하이포아염소산 나트륨 또는 과산화수소 용액과 같은 살균제에 침지시킴으로써 관의 외부를 살균한 다음, 물로 세척하고 서서히 건조시킨다 - 모든 경우 관은 똑바로 선 위치이다. 원심분리후에, 도 9D에 나타낸 바와 같이, 포획된 공기가 플라스틱 밀봉 주위로 올라감에 따라, 플라스틱 상부 밀봉은 원심분리 힘에 의해 짧은 거리로 아래로 밀어내려진다. 그러나, 밀봉이 물에 비해 낮은 밀도를 갖기 때문에, 밀봉은 유체 시료의 상부에 유지되며, 작은 립 (162)이 남게되고, 이는 원심분리 차폐물로부터 관을 제거하기 위해 겸자로 잡을 수도 있다. 원심분리 동안에, 감염성 입자는 유체 (163)에서 침강되고 구배에 밴드 (164)를 생성한다. 이어서, 고리 밀봉부에서의 나사를 제거하고, 도 9E에 나타낸 바와 같이, 형광 염료를 함유할 수도 있는 상층 유체 (165)를 관 (166)을 통해 제거하고, 매니스커스 (167)를 위치시킨다. 도 9F에 나타낸 바와 같이, 위로부터 관으로 들어가는 레이저 빔 (168)이 관과 일직선으로 되고, 상기 기재된 바와 같이 밴드 형성된 감염성 인자는 검출을 위해 형광을 방출시킨다.
등밀도 밴드 형성을 위해 사용되는 것에 추가로 각종 시약을 함유하는 단계 구배가 사용될 때, 도 2에 나타낸 바와 같이, 여러 개의 용액을 분리하기 위해 사용되는 디스크가 위로 올라가고, 밀봉 및 디스크를 제거하지 않는다면 도 9F에 나타낸 바와 같은 수직 레이저 조명을 사용할 수 없게된다. 이러한 경우에, 도 6에 나타낸 바와 같은 측면 조명이 사용되어진다.
레이저 또는 지연된 형광 시스템이 완전히 함유될 수 있고, 작은 단계 모터를 통해 기계적 조작이 원격 수행되며, 원격 제어하에서 함유된 시스템의 안 및 밖으로 관이 이동된다.
감염성 인자를 빠르게 진단 및 동정하기 위하여, 이러한 기술을 질량 분광법 및 형광-기본의 제한 단편 지도화와 조합할 수 있다. 그러나, 각각의 단백질의 질량은 일반적으로 기록된 서열 데이타로부터 산출되며, 다수의 번역후 변형은 포함하지 않는다. 질량 분광분석 데이타베이스는 상이한 미생물의 실제 질량 측정을 포함하도록 만들어져야 한다. 또한, 비리온 단백질 질량 측정은 많은 유전자 변이체를 검출할 수 있다. 그러나, 데이타베이스의 개발을 포함한 많은 미생물 연구에 있어서, 주요 문제점은 환자 시료, 천연수 및 조직 배양액으로부터 미생물의 고 농축되고 정제된 마이크로시료를 체계적으로 제공하는 방법을 개발하는데 있다. 이 문제점은 본 발명에 의해 해결된다.
본 발명은 하기 실시예를 참고로 하여 설명되어지며, 하기 실시예들은 예증을 위해 주어진 것일 뿐 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 당 기술분야에 공지된 표준 기술 또는 하기 구체적으로 기재된 기술을 사용하였다.
미소밴드 형성 관의 사용을 예증하기 위하여, 작은 단일 가닥의 비-병원성 DNA 바이러스 φX 174를 사용하여 실험 연구를 수행하였다. 도 2A에 나타낸 것과 같은 미소밴드 형성 관에서 CsCl중에서의 등밀도 밴드 형성에 의해 정제된 약 1010바이러스 입자를 0.05 M 붕산염 완충액의 5mL에 현탁시키고, 회전하는 버킷 회전자에서 35,000 rpm에서 미소밴드 형성 관에서 펠릿화하고, 분석을 위해 약 3 ㎕중에 재현탁시켰다. 퍼셉티브 바이오시스템즈 (PerSeptive Biosystems) DESTR 장치상에서, 150초로 고정된 추출 지연 시간으로 시나핀산의 기질을 사용하여 분석을 수행하였다. 소 인슐린 (Mw=5,734.59) 및 말 심장 아포미오글로빈 (Mw=16,952)를 1 및 2 pmole 표준으로 사용하였다. 결과를 표 1에 나타낸다. 기록된 서열 데이타로부터 비리온 캡시드 단백질 F, G, H 및 J에 대한 φX 174 질량을 계산한다. F 및 H에 대한 계산치와 실험치 간의 차이는 번역후 변형에 의한 것으로 생각된다. 관련되지 않은 바이러스가 기록된 동일한 질량의 소단위를 가질 수 있는 가능성은 매우 작다. 그러나, 바이러스 단백질을 트립신과 같은 단백질 분해 효소로 처리하고 생성된 펩티드 단편의 질량을 측정함으로써 더욱 더 정확한 단백질 동정이 수행될 수 있다. 공지된 서열의 단백질의 단편 크기를 성상확인된 효소에 의해 계산하는 컴퓨터 프로그램이 이용될 수 있다. 이러한 프로그램은 단백질 프로스펙터 (Protein Prospector) (미국 샌프란시스코 더 유니버시티 오브 캘리포니아 (The University of California)로부터 입수가능) 및 프로화운드 (Profound) (록펠러 유니버시티 (Rockfeller University) 로부터 입수가능)을 포함한다.
| φX 174 비리온 단백질의 질량 분광 분석 | ||||
| 단백질 | 계산된 질량 | 실험 질량 | 질량 차이 | % 차이 |
| F | 48,351.53 | 48,407.4 | +55.9 | 0.12% |
| G | 19,046.73 | 19,046.7 | 0.0 | 0.00% |
| H | 34,419.25 | 34,466.1 | +46.9 | 0.14% |
| J | 4,095.78 | 4,097.03 | +1.2 | 0.03% |
이 실시예는, 미생물의 고 정제되고 농축된 현탁액이, 이에 한정되지는 않지만 혈장, 뇨, 분변 및 조직과 같은 환자 시료, 천연수 및 조직 배양액과 같은 생물학적 시료로부터 단리될 수 있음을 증명한다. 이 실시예는 또한, 정제되고 농축된 미생물이 예를 들어 바이러스를 동정하기 위한 질량 분광법을 사용하여 동정될 수 있음을 증명한다.
본 출원에서 본 발명은 바람직한 구현양태의 상세한 기술을 참고로하여 개시되었으나, 이 개시내용은 제한적 의미보다는 예증을 위한 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 취지 및 첨부된 청구범위의 범위내에서 당업자에 의해 쉽게 변형될 수 있는 것으로 여겨진다.
＜참고 문헌＞
_
Claims (91)
- 상부 구심 영역, 중간 영역 및 하부 원심분리 영역을 포함하는, 상기 상부 영역의 내경이 상기 중간 영역의 내경보다 크고, 상기 중간 영역의 내경이 상기 하부 영역의 내경보다 큰 초원심분리용 관.
- 제 1 항에 있어서, 상기 중간 영역이 하나 이상의 톱니모양을 포함하는 것인 초원심분리용 관.
- 제 1 항에 있어서, 상기 원심분리용 관의 하나의 벽이 직선형으로 연속되는 것인 초원심분리용 관.
- 제 1 항에 있어서, 상기 하부 영역의 내경이 0.25 인치 미만인 초원심분리용 관.
- 제 1 항에 있어서, 상기 하부 영역이 상기 관의 총 길이의 5 % 이상인 초원심분리용 관.
- 제 1 항에 있어서, 내부 표면이 증기 연마에 의해 연마된 초원심분리용 관.
- 제 1 항에 있어서, 내부 표면을 접착 중합체로 코팅하여 생물학적 입자의 흡착을 방지한 초원심분리용 관.
- 제 1 항에 있어서, 상기 하부 영역이 2개의 유체층 사이의 공기 기포를 포착하기에 충분히 작은 내경을 갖고 있어서, 원심분리용 관이 정지 상태인 동안 공기 기포가 상기 2개의 유체층을 분리 상태로 유지시키는 것인 초원심분리용 관.
- 상부 영역 및 하부 영역을 포함하는, 상기 하부 영역의 외경이 상기 상부 영역보다 작은, 원심분리용 관을 유지시키기 위한 버킷.
- 제 9 항에 있어서, 상기 버킷이 회전자(rotor)에 버킷을 결합시키는 제 3의 영역을 포함하는 버킷.
- (a) 미생물을 함유하는 생물학적 시료를 초원심분리용 관에 첨가하는 단계; 및(b) 상기 관 내의 상기 시료를 원심분리하여 상기 미생물을 농축시키는 단계를 포함하는,상기 초원심분리용 관이 상부 영역, 중간 영역 및 하부 영역을 포함하고, 상기 상부 영역의 내경이 상기 중간 영역의 내경보다 크고, 상기 중간 영역의 내경이 상기 하부 영역의 내경보다 큰, 생물학적 시료로부터 미생물을 농축하기 위한 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 관의 하부 영역에서 밀도 구배가 형성되는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 시료의 첨가전에 공기 기포에 의해 분리된 2 이상의 유체층을 상기 관의 하부 영역에 위치시키는 것을 더 포함하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 시료의 첨가전에 2 이상의 유체층을 상기 관의 중간 영역에 위치시키고, 상기 중간 영역 층을 상기 관에 삽입된, 원심분리 전에 2 이상의 유체층을 분리 상태로 유지시킬 수 있고 원심분리 동안에 위로 뜰 수 있는 하나 이상의 디스크에 의해 분리시키는 것을 더 포함하는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 모든 유체층의 물리적 밀도가 원심분리 방향으로부터 구심 방향으로 감소하는 것인 방법.
- 제 14 항에 있어서, 효소, 시약, 염료 또는 고정제가 별개의 층에 존재하고, 사용되는 원심분리 조건하에서 상당히 침강되지 않는 것인 방법.
- 제 14 항에 있어서, 불순물 입자는 분해 또는 용해되지만, 미생물은 시약층을 통과할 때 우선적으로 생존하도록 구배 용질을 선택하는 것인 방법.
- 제 14 항에 있어서, 다른 미생물은 구심 등밀도 밴드 형성 구배로 침강시키면서, 공지된 부류의 미생물을 선택적으로 분해시키도록 시약층을 선택하는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 바이러스로부터 세균이 쉽게 구별되는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 디스크가 다공질인 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 시료에 형광 염색을 첨가하는 것을 더 포함하는 방법.
- 제 11 항의 방법에 따라 미생물을 농축하고, 유동 형광 분석 또는 형광위 분석에 의해 DNA 또는 RNA의 양을 분석하는 것을 포함하는, 미생물에서 DNA 또는 RNA의 양을 측정하는 방법.
- 바이러스를 구별할 수 있는 염료를 시료중의 바이러스와 접촉시키고, 제 13 항의 방법에 따라 바이러스를 농축시키고, 바이러스의 밴드에서 결합된 염료를 검출하고, 이에 의해 바이러스에 존재하는 핵산의 유형을 결정하는 것을 포함하는, 바이러스를 함유하는 생물학적 시료중에 존재하는 단일 가닥 DNA 바이러스, 이중 가닥 DNA 바이러스 및 RNA 바이러스를 구별하는 방법.
- 제 23 항에 있어서, 상기 염료를 상기 시료에 첨가하는 방법.
- 제 23 항에 있어서, 상기 시료를 첨가하기 전에 관에 첨가된 유체층에 상기 염료를 첨가하고, 원심분리 동안에 바이러스를 상기 염료와 접촉시키는 방법.
- 제 23 항에 있어서, 상기 염료가 형광성이며, 상기 바이러스 밴드를 통해 여기상태의 형광 빛을 통과시키고 상기 바이러스 밴드로부터 방출되는 형광 빛의 피크 강도의 파장을 측정함으로써 상기 결합된 형광 염료를 검출하는 방법.
- 제 26 항에 있어서, 피크 강도의 상기 파장을 측정하기 전에 상기 관으로부터 결합되지 않은 염료를 제거하는 것을 더 포함하는 방법.
- 제 23 항에 있어서, 여기상태의 빛을 상기 바이러스 밴드를 통해 통과시키고 방출된 빛의 스펙트럼 분포를 결정함으로써 상기 결합된 염료를 검출하는 방법.
- 제 26 항의 방출된 형광 빛의 강도를 측정하는 것을 포함하는, 생물학적 시료중의 감염성 인자의 역가를 결정하는 방법.
- (a) 제 11 항의 방법에 따라 미생물을 농축하는 단계;(b) 하부 밴드형성 영역의 위로부터 유체를 제거하는 단계;(c) 물 또는 상기 하부 영역에서 있는 유체보다 밀도가 낮은 완충액으로 잔류 유체를 덮는 단계;(d) 모세관의 개방형이 하나 이상의 미생물 밴드 위에 있도록 개방형 하단을 가진 모세관을 상기 원심분리용 관 내에 삽입하는 단계;(e) 상기 모세관의 개방형 하단을 통해 유체를 끌어올려 모세관을 통해 올라온 유체가 이것이 분석되는 유동 셀을 통과하는 유체 스트림을 형성시키는 단계;(f) 유체가 단계 (e)에서 회수될 때 또는 임의의 바이러스 밴드 위에 물 또는 완충액을 유지시키는 것이 필요할 때 상기 원심분리용 관의 상부 영역에 물 또는 완충액을 첨가하는 단계;(g) 상기 모세관이 미생물의 바이러스 밴드를 거쳐 상기 원심분리용 관의 하부 영역으로 이동되도록 상기 원심분리용 관을 모세관에 대해 이동시키는 단계;(h) 존재하는 미생물의 수를 결정하기 위하여 상기 유동 셀을 통해 유동되는 유체의 스트림 중의 미생물을 분석하는 단계; 및(i) 미생물의 결정된 수 및 상기 생물학적 시료의 공지된 부피로부터 역가를 계산하는 단계를 포함하는,공지된 부피의 상기 생물학적 시료 중에서 역가를 결정하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상기 모세관으로부터 배출된 유체의 스트림 주변의 외피 내에 유체를 펌핑하여 유동 셀을 통과하기 전에 상기 스트림을 희석하는 것을 더 포함하는 방법.
- 제 31 항에 있어서, 상기 유동 셀을 통과하는 유체의 속도보다 느린 속도로 유체의 외피내에 유체를 펌핑하는 방법.
- 제 32 항에 있어서, 각각의 유체의 유동을 펌프 대신에 기체 압력에 의해 조절하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상기 모세관 내의 상기 미생물의 농도가 상기 원심분리용 관의 하부 영역에 있는 미생물 밴드 내의 농도의 1/2보다 낮은 농도인 방법.
- (a) 제 11 항의 방법에 따라 미생물을 농축하는 단계;(b) 미생물을 농축된 형태로 회수하는 단계;(c) 각각의 단백질의 질량을 측정하기 위하여 미생물을 질량 분광분석하는 단계;(d) 상기 크기의 단백질의 질량 스펙트럼을 결정하는 단계;(e) 단백질의 질량 스펙트럼을, 공지된 미생물을 사용하여 수득된 질량 스펙트럼과 비교하는 단계; 및(f) 상기 생물학적 시료 중의 미생물이, 상기 생물학적 시료로부터의 미생물에 대해 수득된 질량 스펙트럼과 동일한 질량 스펙트럼을 나타내는 공지된 미생물과 동일함을 결정하는 단계를 포함하는,미생물을 함유하는 생물학적 시료에 미생물이 존재함을 결정하는 방법.
- 제 35 항에 있어서, 상기 질량 분광법이 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 TOF MS(time of flight mass spectrometry)인 방법.
- 제 35 항에 있어서, 상기 질량 분광법이 전자분무 질량 분광법인 방법.
- 제 35 항에 있어서, 질량 스펙트럼을 수득하기 전에 상기 단백질을 효소에 의해 분해시키는 방법.
- (a) 상기 미생물을 제 11 항의 방법에 따라 농축하여 농축된 미생물을 수득하는 단계;(b) 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 단계;(c) 상기 핵산을 제한 효소와 함께 인큐베이션하여 핵산 단편을 생성하는 단계;(d) 상기 핵산 또는 핵산 단편을 염색하는 단계;(e) 상기 핵산 단편의 크기 패턴을 결정하는 단계;(f) 상기 크기 패턴을 공지된 미생물로부터 수득되고 상기 제한효소로 분해된 핵산의 크기 패턴과 비교하는 단계; 및상기 생물학적 시료중의 상기 미생물을 동일한 제한효소 단편 패턴을 갖는 미생물로서 동정하는 단계를 포함하는,미생물을 함유하는 생물학적 시료 중에 미생물이 존재함을 결정하는 방법.
- 제 39 항에 있어서, 핵산 분자 또는 그의 단편의 크기를 유동 세포계측법을 사용하여 결정하는 방법.
- 제 39 항에 있어서, 핵산 분자 또는 그의 단편의 크기를 겔 전기영동에 의해 결정하는 방법.
- 제 39 항에 있어서, 핵산 분자 또는 그의 단편의 크기를 질량 분광법에 의해 결정하는 방법.
- 제 39 항에 있어서, 핵산 분자 또는 그의 단편의 크기를 광학적 맵핑(optical mapping)에 의해 결정하는 방법.
- (a) 제 11 항의 방법에 의해 미생물을 농축하는 단계;(b) 상기 미생물 게놈을 염색하는 단계;(c) 상기 미생물 게놈을 정제하는 단계; 및(d) 상기 미생물 게놈을 형광 유동 세포계측법에 의해 분석하는 단계를 포함하는,생물학적 시료중의 미생물의 게놈의 질량을 결정하는 방법.
- 제 44 항에 있어서, 상기 미생물 게놈을 단계 (d) 전에 제한 효소로 분해시키는 방법.
- (a) 제 11 항의 방법에 따라 미생물을 농축하는 단계; 및(b) 공지된 미생물에 대해 특이적인 형광 항체와 함께 배양하고 상기 항체가 상기 농축된 미생물에 결합된다면, 상기 미생물을 그의 형광에 의하여 항체가 결합되는 것으로 공지된 미생물로서 동정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 46 항에 있어서, 상기 형광 항체가 상기 생물학적 시료의 원심분리 동안에 상기 원심분리용 관의 상부 영역에 존재하고, 배양 동안에 항체가 특이적으로 결합하는 미생물에 대해 결합하며, 상기 미생물과 함께 공침강하고 함께 밴드를 형성하고, 상기 항체-미생물 컨쥬게이트 결합의 형광에 의해 검출되는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 다수 종류의 항체가 상기 생물학적 시료의 원심분리 동안에 상기 원심분리용 관의 상부 영역에 존재하며, 각각의 종류의 항체를 상기 상부 영역에 존재하는 다른 종류의 항체에 대한 마커와는 구별되는 마커로 표지화하는 방법.
- 제 46 항에 있어서, 항체-미생물 복합체가 자유 미생물과는 상이한 밴드 형성 밀도를 갖고 있으며, 이에 의해 복합체의 존재를 검출할 수 있는 방법.
- (a) 제1 밀도 층을 원심분리용 관 내에 삽입하는 단계;(b) 제1 및 제2 층을 분리하기 위한 수단을 제공하는 단계; 및(c) 제2 밀도가 낮은 층을 상기 관에 삽입하는 단계를 포함하는,상기 원심분리용 관이 상부 영역, 중간 영역 및 하부 영역을 포함하는, 상기 상부 영역의 내경이 상기 중간 영역의 내경보다 크고, 상기 중간 영역의 내경이 상기 하부 영역의 내경 보다 큰 것이며, 관의 유체가 제1 밀도층 및 이보다 밀도가 작은 제2 층을 포함하는 원심분리용 관에서 원심분리 전에 층을 분리하는 방법.
- 제 50 항에 있어서, 상기 층을 분리하기 위한 수단이 공기 기포인 방법.
- 제 50 항에 있어서, 상기 층을 분리하기 위한 수단이 다공질 디스크이고, 상기 다공질 디스크가 상기 제1 층의 상부에 삽입되는 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 디스크가 원심분리 동안에 상기 밀도가 낮은 제2 층 위의 영역으로 떠오르고, 이에 의해 제1 밀도 층이 상기 밀도가 낮은 제2의 층과 접촉되는 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 디스크가 소결된 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌으로 제조된 것인 방법.
- 제 1 항에 있어서, 원심분리용 관의 파괴없이 CsCl 구배 중에서 미생물 밴드를 형성시키기에 충분히 높은 속도로 원심분리용 관을 원심분리할 수 있는 재료로 제조되는 원심분리용 관.
- 제 55 항에 있어서, 상기 관이 폴리카르보네이트로 만들어진 원심분리용 관.
- 제 1 항에 있어서, 상기 상부 영역, 중간 영역 및 하부 영역이 서로 동일한 외경을 가진 원심분리용 관.
- 제 1 항에 있어서, 상기 상부 영역이 상기 하부 영역의 외경보다 큰 외경을 갖는 원심분리용 관.
- 제 11 항에 있어서, 상기 원심분리용 관이, 상기 원심분리용 관의 외부 치수에 일치되는 윤곽을 가진 내부 치수를 가진 어댑터에 의해 지탱되는 것인 방법.
- 제 59 항에 있어서, 상기 어댑터가 폴리카르보네이트 또는 델린(Delrin)(R)으로 제조된 것인 방법.
- 원심분리용 관을 수직 위치로 유지시키기 위한 원심분리용 관 홀더;레이저 빔을 생성하는 레이저;하나의 파장을 빛을 단리하기 위한 필터;원심분리용 관이 상기 원심분리용 관 홀더내에 위치할 때, 원심분리용 관에서 밴드 형성된 시료에 결합된 염료에 의해 방출되는 빛을 통과시키는 필터; 및부분 (c)의 필터를 통과하는 빛을 검출하는 검출기를 포함하는, 원심분리용 관 내의 시료로부터 형광을 측정하기 위한 시스템.
- 제 61 항에 있어서,상기 원심분리용 관 홀더 내에 있는 원심분리용 관이 레이저 빔의 직각에 일치되어 배향될 수 있도록, 그 위에 상기 원심분리용 관 홀더를 탑재시킨 측각기;임의의 X-Y 방향으로 관을 레이저 빔과 정렬시키기 위한 X-Y 이동대;상기 레이저 빔이 통과하는 필터; 및상기 원심분리용 관 홀더에 유지된 원심분리용 관을 통해 상기 레이저 빔을 굴절시키기 위한 거울을 추가로 포함하는 시스템.
- 제 61 항에 있어서, 컴퓨터를 더 포함하는 시스템.
- 제 63 항에 있어서, 모니터를 더 포함하는 시스템.
- 제 64 항에 있어서, 상기 모니터가 음극선 관인 시스템.
- 원심분리용 관을 위한 홀더;시료를 통과하는 빛을 생성하기 위한 광원; 및빛이 통과된 시료로부터 방출되는 빛을 검출하기 위한 검출기를 포함하는, 원심분리용 관 내의 시료로부터 형광을 측정하기 위한 시스템.
- 제 66 항에 있어서,광원으로부터의 빛이 통과되는 집광 렌즈;광원으로부터의 빛이 통과되는 필터;빛이 통과되는 강도 평형화기;빛이 통과되는 광 파이프; 및광 파이프에서 나온 빛이 통과되는 2개의 강도 평형화기를 더 포함하는 시스템.
- 제 67 항에 있어서, 상기 시료로부터 방출되는 빛이 통과되는 방출 필터를 더 포함하는 시스템.
- 제 67 항에 있어서, 상기 필터가 2개 이상의 필터를 포함하는 필터 휠로 대체된 것인 시스템.
- 제 67 항에 있어서,상기 시료로부터 방출되는 빛과 상기 검출기 사이에 한개의 방출 필터가 위치하는, 2개 이상의 방출 필터를 포함하는 필터 휠을 더 포함하는 시스템.
- 제 66 항에 있어서, 컴퓨터를 더 포함하는 시스템.
- 제 71 항에 있어서, 모니터를 더 포함하는 시스템.
- 제 72 항에 있어서, 상기 모니터가 음극선 관인 시스템.
- 입자를 농축하는 용기;모세관;제1 펌프 및 제2 펌프;상기 모세관에 대해 용기를 이동시키기 위한 수단;유동 셀;광원; 및검출기를 포함하는, 작은 부피로 농축된 입자를 계수하기 위한 시스템.
- 제 74 항에 있어서, 상기 제1 펌프가 상기 모세관의 상단 주위의 외피내로 유체를 펌핑 시스템.
- 제 75 항에 있어서, 상기 제2 펌프가 상기 유동 셀의 밖으로 유체를 펌핑하는 시스템.
- 제 76 항에 있어서, 상기 제2 펌프가 상기 제1 펌프에 비하여 주어진 시간동안 더 많은 유체를 펌핑하는 시스템.
- 제 77 항에 있어서, 유체가 상기 모세관의 하단을 통해 끌어올려지고, 상기 유체는 상기 제1 펌프로부터 펌핑된 유체에 의해 둘러싸인 모세관의 상단에서 방출되며, 상기 제2 펌프는 상기 모세관의 상단에서 방출된 유체와 상기 유동 셀을 통과한 제1 펌프로부터의 유체와의 혼합물을 펌핑하는 시스템.
- 제 78 항에 있어서, 상기 광원이 상기 유동 셀을 통과하는 광선을 생성하는 시스템.
- 제 79 항에 있어서, 상기 광원과 상기 유동 셀 사이에 필터를 더 포함하는 시스템.
- 제 80 항에 있어서, 상기 유동 셀과 상기 검출기 사이에 필터를 더 포함하는 시스템.
- (a) 제 11 항의 방법에 의해 미생물을 농축하여 농축된 미생물을 생성하는 단계;(b) 상기 농축된 미생물로부터 게놈을 추출하여 추출된 핵산을 생성하는 단계;(c) 고체 지지체 상에 상기 추출된 핵산을 고정시키는 단계;(d) 상기 추출된 핵산을 염색하는 단계;(e) 상기 추출되고 염색된 핵산을 형광위 현미경을 사용하여 상기 고체 지지체 상에 전자적으로 영상화하는 단계; 및(f) 각각의 핵산 분자의 길이를 측정하는 단계를 포함하는,생물학적 시료 내의 미생물의 게놈의 크기를 결정하는 방법.
- (a) 제 11 항의 방법에 의해 미생물을 농축하여 농축된 미생물을 생성하는 단계;(b) 상기 농축된 미생물로부터의 게놈을 추출하여 추출된 핵산을 생성하는 단계;(c) 상기 추출된 핵산을 염색하는 단계;(d) 상기 추출된 핵산을 고체 지지체 상에 고정하여 고정된 핵산을 생성하는 단계;(e) 고정된 핵산을 하나 이상의 제한 효소로 처리하는 단계;(f) 생성된 핵산 단편의 수 및 핵산 단편의 길이를 결정하는 단계를 포함하는, 미생물의 제한 효소 지도를 결정하는 방법.
- (a) 제 83 항의 방법에 따라 제한효소 지도를 결정하는 단계; 및(b) 상기 제한효소 지도를 공지된 미생물의 제한효소 지도와 비교하는 단계를 포함하고,여기에서 생물학적 시료중의 상기 미생물의 제한효소 지도와 공지된 미생물의 제한 효소 지도가 일치하면, 상기 생물학적 시료의 미생물을 상기 생물학적 시료의 미생물의 제한효소 지도와 동일한 제한효소 지도를 갖는 상기 공지된 미생물로서 동정하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료중의 미생물의 종류(identity)를 결정하기 위한 방법.
- (a) 제 11 항의 방법에 의해 미생물을 농축하여 농축된 미생물을 생성하는 단계;(b) 형광 염료로 미생물을 염색하는 단계;(c) 염색되고 농축된 미생물중의 핵산의 양을 측정하는 단계; 및(d) 상기 핵산의 양을 바이러스, 마이코플라스마, 효소 및 세균에 대한 핵산의 공지된 양과 비교하는 단계를 포함하는,생물학적 시료중의 바이러스, 마이코플라스마, 효모 또는 세균의 존재를 결정함으로써 바이러스, 마이코플라스마, 효모 및 세균 감염사이의 감염의 유형을 구별하기 위한 방법.
- 제 85 항에 있어서, 원심분리 동안에 미생물이 염색되는 방법.
- 제 85 항에 있어서, 미생물이 생물학적 시료 중에서 염색되는 방법.
- 제 85 항에 있어서, 핵산의 양을 유동 세포계측법에 의해 측정하는 방법.
- 제 85 항에 있어서, 핵산의 양을 광학적 맵핑에 의해 측정하는 방법.
- 제 29 항에 있어서, 공지된 약리학적 물질이 치료 효과가 있는지를 결정하고, 동물 및 인간 시험에서 신규 약물의 효능을 평가하고, 개발중의 약물의 유사체 사이에서 선택하기 위하여 감염성 인자의 역가의 변화를 사용하는 방법.
- 제 29 항에 있어서, 신규 항생물질 및 기타 치료제를 발견하기 위하여 감염성 인자의 역가의 변화를 사용하는 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7747298P | 1998-03-10 | 1998-03-10 | |
| US60/077,472 | 1998-03-10 | ||
| PCT/US1999/005511 WO1999046047A2 (en) | 1998-03-10 | 1999-03-09 | Detection and characterization of microorganisms |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20010034600A true KR20010034600A (ko) | 2001-04-25 |
Family
ID=22138250
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020007010102A KR20010034600A (ko) | 1998-03-10 | 1999-03-09 | 미생물의 검출 및 성상 확인 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (10) | US6254834B1 (ko) |
| EP (1) | EP1062044A2 (ko) |
| JP (1) | JP2002505866A (ko) |
| KR (1) | KR20010034600A (ko) |
| AU (1) | AU754999B2 (ko) |
| CA (1) | CA2322202C (ko) |
| WO (1) | WO1999046047A2 (ko) |
Families Citing this family (124)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU732703B2 (en) | 1996-11-20 | 2001-04-26 | Crucell Holland B.V. | An improved method for the production and purification of adenoviral vectors |
| AU754999B2 (en) * | 1998-03-10 | 2002-11-28 | Large Scale Proteomics Corporation | Detection and characterization of microorganisms |
| US6491872B1 (en) * | 1999-09-17 | 2002-12-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Method and system for detecting and recording submicron sized particles |
| US6485686B1 (en) * | 1999-09-17 | 2002-11-26 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Method and apparatus for counting submicron sized particles |
| FR2807953A1 (fr) * | 2000-04-19 | 2001-10-26 | Frederic Vareilles | Dispositif pour la centrifugation d'un prelevement de tissu graisseux |
| DE10021737C2 (de) * | 2000-05-04 | 2002-10-17 | Hermann Haller | Verfahren und Vorrichtung zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung eines Protein- und/oder Peptidmusters einer Flüssigkeitsprobe, die dem menschlichen oder tierischen Körper entnommen wird |
| US6387030B1 (en) * | 2000-06-30 | 2002-05-14 | Beckman Coulter, Inc. | Internal adapter with a pellet well for a centrifuge container |
| US6680203B2 (en) | 2000-07-10 | 2004-01-20 | Esperion Therapeutics, Inc. | Fourier transform mass spectrometry of complex biological samples |
| US6980674B2 (en) | 2000-09-01 | 2005-12-27 | Large Scale Proteomics Corp. | Reference database |
| US6539102B1 (en) | 2000-09-01 | 2003-03-25 | Large Scale Proteomics | Reference database |
| WO2002021108A2 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Large Scale Proteomics Corporation | Method for detecting molecules or chemical reactions by determining variation of conductance |
| US6447995B1 (en) | 2000-10-04 | 2002-09-10 | Genvec, Inc. | Utilizing intrinsic fluorescence to detect adenovirus |
| WO2002044695A1 (en) * | 2000-11-16 | 2002-06-06 | Burstein Technologies, Inc. | Methods and apparatus for detecting and quantifying lymphocytes with optical biodiscs |
| US6933109B2 (en) * | 2000-12-22 | 2005-08-23 | Large Scale Proteomics Corporation | Rapid particle detection |
| US7666588B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy |
| US7226739B2 (en) | 2001-03-02 | 2007-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc | Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations |
| US20030027135A1 (en) * | 2001-03-02 | 2003-02-06 | Ecker David J. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
| US7718354B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-05-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
| US20040121314A1 (en) * | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in containers |
| US20040121311A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in livestock |
| WO2002073163A1 (en) | 2001-03-07 | 2002-09-19 | The Texas A & M University Systems | Density gradient solutions of metal ion chelate complexes |
| JP2002310886A (ja) * | 2001-04-11 | 2002-10-23 | Canon Inc | ディスクサイトメトリーによる分析方法及び装置 |
| US8073627B2 (en) | 2001-06-26 | 2011-12-06 | Ibis Biosciences, Inc. | System for indentification of pathogens |
| US7217510B2 (en) | 2001-06-26 | 2007-05-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for providing bacterial bioagent characterizing information |
| US20030044771A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-03-06 | Anderson Norman G. | Method for discovering new infectious particles |
| US20030129665A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-07-10 | Selvan Gowri Pyapali | Methods for qualitative and quantitative analysis of cells and related optical bio-disc systems |
| US20030143637A1 (en) * | 2001-08-31 | 2003-07-31 | Selvan Gowri Pyapali | Capture layer assemblies for cellular assays including related optical analysis discs and methods |
| JP2005502872A (ja) * | 2001-09-07 | 2005-01-27 | バースタイン テクノロジーズ，インコーポレイティド | 光バイオディスクシステムを使用した、核の形態に基づく白血球の型の識別および定量 |
| US6756586B2 (en) | 2001-10-15 | 2004-06-29 | Vanderbilt University | Methods and apparatus for analyzing biological samples by mass spectrometry |
| US7157049B2 (en) * | 2001-11-20 | 2007-01-02 | Nagaoka & Co., Ltd. | Optical bio-discs and fluidic circuits for analysis of cells and methods relating thereto |
| JP2006516193A (ja) | 2002-12-06 | 2006-06-29 | アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド | ヒトおよび動物における病原体の迅速な同定方法 |
| US8046171B2 (en) | 2003-04-18 | 2011-10-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and apparatus for genetic evaluation |
| US8057993B2 (en) | 2003-04-26 | 2011-11-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of coronaviruses |
| US8158354B2 (en) | 2003-05-13 | 2012-04-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
| US7964343B2 (en) | 2003-05-13 | 2011-06-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
| US8097416B2 (en) | 2003-09-11 | 2012-01-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
| US8394945B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-03-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of bacteria |
| US8546082B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-10-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
| US20050101025A1 (en) * | 2003-11-12 | 2005-05-12 | Ho Winston Z. | Apparatus for proteins and nucleic acids analysis |
| JP4055802B2 (ja) * | 2003-12-08 | 2008-03-05 | 和光純薬工業株式会社 | 自動分析装置用反応ディスク |
| US7666592B2 (en) | 2004-02-18 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent |
| US8119336B2 (en) | 2004-03-03 | 2012-02-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of alphaviruses |
| EP1766659A4 (en) | 2004-05-24 | 2009-09-30 | Ibis Biosciences Inc | MASS SPECTROMETRY WITH SELECTIVE ION FILTRATION THROUGH DIGITAL THRESHOLD COMPARISON |
| US20050266411A1 (en) | 2004-05-25 | 2005-12-01 | Hofstadler Steven A | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA |
| US7811753B2 (en) | 2004-07-14 | 2010-10-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for repairing degraded DNA |
| EP1776585B1 (en) * | 2004-07-23 | 2010-07-07 | Biosystem Development, LLC | Immunoassay assembly and methods of use |
| WO2006135400A2 (en) | 2004-08-24 | 2006-12-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification of recombinant organisms |
| CA2583406A1 (en) * | 2004-09-20 | 2007-01-04 | Boston Microfluidics | Microfluidic device for detecting soluble molecules |
| US7465560B2 (en) * | 2004-11-30 | 2008-12-16 | Purdue Research Foundation | System and method for rapid detection and characterization of bacterial colonies using forward light scattering |
| US8084207B2 (en) | 2005-03-03 | 2011-12-27 | Ibis Bioscience, Inc. | Compositions for use in identification of papillomavirus |
| WO2006094238A2 (en) | 2005-03-03 | 2006-09-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for use in identification of adventitious viruses |
| US7355698B2 (en) * | 2005-04-25 | 2008-04-08 | Spin Diagnostics, Inc. | High throughput imaging device and method |
| US20060287506A1 (en) * | 2005-06-15 | 2006-12-21 | Alfa Wassermann, Inc. | Method for separating and concentrating biological materials using continuous-flow ultracentrifugation |
| ITUD20050118A1 (it) * | 2005-07-13 | 2007-01-14 | Sire Analytical Systems Srl | Procedimento per la taratura di macchine per l' analisi di parametri del sangue connessi alla densita' del sangue, quali la velocita' di eritrosedimentazione e/o di aggregazione dei globuli rossi |
| WO2007014045A2 (en) | 2005-07-21 | 2007-02-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants |
| DE202006007867U1 (de) * | 2006-05-15 | 2007-09-20 | Sartorius Biotech Gmbh | Probengefäß |
| DE102006022878B3 (de) * | 2006-05-15 | 2007-09-06 | Sartorius Biotech Gmbh | Verfahren und Detektionsvorrichtung zur bildgebenden Erfassung einer Probe |
| CA2663029C (en) | 2006-09-14 | 2016-07-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens |
| US8012349B2 (en) * | 2006-11-20 | 2011-09-06 | Orbital Biosciences, Llc | Small volume unitary molded filters and supports for adsorbent beds |
| US7724372B1 (en) | 2006-11-21 | 2010-05-25 | David Coombs | Apparatus with probe |
| US7936459B1 (en) | 2006-11-21 | 2011-05-03 | David Coombs | Apparatus with probe |
| US8787633B2 (en) * | 2007-01-16 | 2014-07-22 | Purdue Research Foundation | System and method of organism identification |
| JP5680304B2 (ja) | 2007-02-23 | 2015-03-04 | アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド | 迅速な法医学的ｄｎａ分析法 |
| US9598724B2 (en) | 2007-06-01 | 2017-03-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
| FR2917826B1 (fr) * | 2007-06-19 | 2010-03-19 | Commissariat Energie Atomique | Systeme et methode d'extraction en continu d'une phase liquide de microechantillons, et installation automatisee pour les prelever, realiser l'extraction et des mesures les concernant. |
| US20090069743A1 (en) * | 2007-09-11 | 2009-03-12 | Baxter International Inc. | Infusion therapy sensor system |
| CN101965508B (zh) * | 2007-09-17 | 2013-11-27 | 卢米尼克斯股份有限公司 | 识别流中的微粒的系统和方法 |
| US20090109432A1 (en) * | 2007-10-26 | 2009-04-30 | Olson Robert J | Systems and methods for submersible imaging flow apparatus |
| US9637776B2 (en) * | 2008-02-19 | 2017-05-02 | Opgen, Inc. | Methods of identifying an organism |
| CN102027369B (zh) | 2008-03-21 | 2018-10-26 | 艾博特健康公司 | 单独和在聚合凝块中检测和计数血小板的方法及设备 |
| DE102008026803A1 (de) * | 2008-06-03 | 2009-12-10 | Levin, Felix, Dr. | Analytisches Vorrichtungssystem und Verfahren zur Bestimmung von Substanzen in Flüssigkeiten |
| US8512975B2 (en) | 2008-07-24 | 2013-08-20 | Biomerieux, Inc. | Method for detection and characterization of a microorganism in a sample using time dependent spectroscopic measurements |
| EP2157599A1 (en) * | 2008-08-21 | 2010-02-24 | Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO | Method and apparatus for identification of biological material |
| WO2010033599A2 (en) | 2008-09-16 | 2010-03-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods |
| US8534447B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-09-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Microplate handling systems and related computer program products and methods |
| US8148163B2 (en) | 2008-09-16 | 2012-04-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
| WO2010062356A1 (en) * | 2008-10-31 | 2010-06-03 | Biomerieux, Inc. | Methods for separation, characterization and/or identification of microorganisms using spectroscopy |
| RU2510844C2 (ru) * | 2008-10-31 | 2014-04-10 | Биомерьё, Инк. | Контейнер для изоляции и идентификации микроорганизма |
| US10059975B2 (en) * | 2008-10-31 | 2018-08-28 | Biomerieux, Inc. | Methods for the isolation and identification of microorganisms |
| CA2741036C (en) * | 2008-10-31 | 2018-01-09 | Biomerieux, Inc. | Methods for separation, characterization, and/or identification of microorganisms using raman spectroscopy |
| US10167494B2 (en) * | 2008-10-31 | 2019-01-01 | Biomerieux, Inc. | Method for detection, characterization and/or identification of microorganisms in a sealed container |
| JP6182574B2 (ja) * | 2008-10-31 | 2017-08-16 | ビオメリュー・インコーポレイテッド | 分光法を使用した微生物の分離、キャラクタリゼーションおよび／または同定方法 |
| EP2350667B1 (en) | 2008-10-31 | 2015-04-29 | Biomerieux, Inc | Method for identification of microorganisms using mass spectrometry |
| US8647835B2 (en) * | 2008-10-31 | 2014-02-11 | BIO MéRIEUX, INC. | Methods for separation, characterization and/or identification of microorganisms using spectroscopy |
| MX2011004169A (es) * | 2008-10-31 | 2011-09-27 | Bio Merieux Inc | Metodos para la separacion y caracterizacion de microorganismos utilizando agentes identificadores. |
| EP2396803A4 (en) | 2009-02-12 | 2016-10-26 | Ibis Biosciences Inc | IONIZATION PROBE ASSEMBLIES |
| WO2010101950A1 (en) * | 2009-03-02 | 2010-09-10 | Catholic Healthcare West | Diagnostic devices and methods of use |
| WO2010100501A1 (en) * | 2009-03-04 | 2010-09-10 | Malvern Instruments Limited | Particle characterization |
| US8614792B2 (en) * | 2009-03-04 | 2013-12-24 | Malvern Instruments, Ltd. | Particle characterization |
| CN104655840B (zh) * | 2009-05-07 | 2018-03-23 | 生物梅里埃有限公司 | 用于抗微生物剂抗性测定的方法 |
| KR20120027359A (ko) | 2009-05-15 | 2012-03-21 | 바이오메리욱스, 인코포레이티드. | 자동 미생물 탐지 장치 |
| US8609024B2 (en) | 2009-05-15 | 2013-12-17 | Biomerieux, Inc. | System and method for automatically venting and sampling a culture specimen container |
| US8383025B2 (en) * | 2009-05-19 | 2013-02-26 | Nanyang Technological University | Method of manufacturing micro patterned device and device obtained by the method |
| US9194877B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-11-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems for bioagent indentification |
| US8950604B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-02-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Lift and mount apparatus |
| EP3225695A1 (en) | 2009-10-15 | 2017-10-04 | Ibis Biosciences, Inc. | Multiple displacement amplification |
| DE102010033105B4 (de) * | 2010-08-02 | 2016-05-04 | Bruker Daltonik Gmbh | Massenspektrometrische Sepsisdiagnose ohne Blutkultur |
| US10335785B2 (en) | 2010-12-17 | 2019-07-02 | Biomerieux, Inc. | Methods for the isolation, accumulation, characterization and/or identification of microorganisms using a filtration and sample transfer device |
| EP3434759A1 (en) | 2011-07-22 | 2019-01-30 | bioMerieux, Inc. | Method and kit isolating microorganisms from culture |
| WO2013059754A1 (en) * | 2011-10-20 | 2013-04-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Continuous flocculation deflocculation process for efficient harvesting of microalgae from aqueous solutions |
| JP6057251B2 (ja) | 2011-11-11 | 2017-01-11 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 粒子分別装置および粒子分別方法 |
| US8837802B2 (en) * | 2012-03-12 | 2014-09-16 | National Chung Cheng University | Image analysis system and method for determining cancerous cells |
| WO2013192412A1 (en) * | 2012-06-20 | 2013-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Novel methods of measuring effective density of nanoparticles in fluids |
| JP5882177B2 (ja) * | 2012-10-19 | 2016-03-09 | 株式会社日立製作所 | 生体物質回収方法及び生体物質回収装置 |
| AU2013202778A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Gen-Probe Incorporated | Systems, methods, and apparatuses for performing automated reagent-based assays |
| KR101414248B1 (ko) * | 2013-03-27 | 2014-07-01 | (주)로고스바이오시스템스 | 형광 이미징 장치 |
| USD717468S1 (en) | 2013-06-24 | 2014-11-11 | Bioptic, Inc. | Microwell strip |
| US10267783B2 (en) * | 2013-09-09 | 2019-04-23 | Woods Hole Oceanographic Institution | Submersible flow imager |
| US10144015B2 (en) * | 2013-11-11 | 2018-12-04 | Life Technologies Corporation | Rotor plate and bucket assembly and method for using same |
| EP3209998A4 (en) * | 2014-10-24 | 2018-05-02 | Monash University | Method and system for detection of disease agents in blood |
| CN104596900B (zh) * | 2015-01-05 | 2017-04-12 | 暨南大学 | 一种自动实现大气颗粒物粒径校正的方法及系统 |
| WO2016163415A1 (ja) | 2015-04-08 | 2016-10-13 | ＳｏｎｏＣｏｒｅ株式会社 | バブルの製造方法 |
| GB201515921D0 (en) * | 2015-09-08 | 2015-10-21 | Parker Hannifin Mfg Uk Ltd | Method |
| CN106353137B (zh) * | 2016-08-30 | 2023-10-31 | 徐州憬美新材料科技有限公司 | 一种取液容器组件及取液方法 |
| KR102638609B1 (ko) | 2017-07-27 | 2024-02-19 | 바이오메리욱스, 인코포레이티드. | 격리 튜브 |
| EP3696534A1 (en) * | 2019-02-14 | 2020-08-19 | SmartDyeLivery GmbH | Method for determining physicochemical properties of nanoscale systems (nss) |
| JP7322593B2 (ja) * | 2019-08-23 | 2023-08-08 | 株式会社サタケ | 微生物の検査装置及びその方法 |
| FR3103900A1 (fr) * | 2019-11-29 | 2021-06-04 | Universite Du Mans | Méthode d'identification rapide de microorganismes par analyse de matrices excitation-émission |
| EP4129488A4 (en) * | 2020-04-28 | 2024-04-24 | HORIBA, Ltd. | MEASURING CELL AND CENTRIFUGAL SEDIMENTATION TYPE PARTICLE SIZE DISTRIBUTION MEASURING DEVICE USING SAID MEASURING CELL |
| JPWO2022054878A1 (ko) * | 2020-09-11 | 2022-03-17 | ||
| US11285485B1 (en) * | 2020-11-17 | 2022-03-29 | Aid Genomics Ltd | Test tube with an internal member and test tube with a narrowed region at its closed end |
| US11135591B1 (en) | 2020-11-17 | 2021-10-05 | Aid Genomics Ltd | Test tube with an internal member |
| JPWO2022244877A1 (ko) * | 2021-05-20 | 2022-11-24 | ||
| KR20240059057A (ko) * | 2022-10-27 | 2024-05-07 | 주식회사 클리노믹스 | 미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지 |
Family Cites Families (60)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL109202C (ko) * | 1959-11-20 | |||
| US3468474A (en) * | 1966-07-07 | 1969-09-23 | Arvid W Shoblom | Centrifuge accessory |
| DE2115032C3 (de) * | 1971-03-29 | 1975-05-07 | Kernforschungsanlage Juelich Gmbh, 5170 Juelich | Vorrichtung zum Trennen zweier Phasen bei der Flüssig-Flüssig-Extraktion in einer Zentrifuge |
| US3752390A (en) * | 1972-04-04 | 1973-08-14 | Beckman Instruments Inc | Swinging bucket rotor assembly |
| US3916205A (en) | 1973-05-31 | 1975-10-28 | Block Engineering | Differential counting of leukocytes and other cells |
| US4003834A (en) | 1975-03-31 | 1977-01-18 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health, Education And Welfare | Density gradient fractionation by piston displacement |
| US3957653A (en) * | 1975-04-03 | 1976-05-18 | Becton, Dickinson And Company | Apparatus for collection, separation and isolation of blood |
| GB1533272A (en) | 1976-02-13 | 1978-11-22 | Radiochemical Centre Ltd | Centrifuge tube |
| US4214993A (en) * | 1978-04-03 | 1980-07-29 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Apparatus for separating fluids |
| US4260873A (en) * | 1978-10-18 | 1981-04-07 | A-T-O Inc. | Electrically heated hand held vaporizer for vapor polishing plastic surfaces |
| JPS561352A (en) * | 1979-06-20 | 1981-01-09 | Olympus Optical Co Ltd | Container for corpuscular cohesion judgement |
| FR2474166A1 (fr) * | 1980-01-23 | 1981-07-24 | Commissariat Energie Atomique | Dispositif de mesure photometrique pour solutions complexes a bruit de fond variable |
| US4369117A (en) * | 1980-05-12 | 1983-01-18 | American Hospital Supply Corporation | Serum separating method and apparatus |
| US4436631A (en) * | 1981-08-05 | 1984-03-13 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Multiple particle washing system and method of use |
| JPS58129366A (ja) * | 1982-01-29 | 1983-08-02 | Olympus Optical Co Ltd | 分配分注方法 |
| US4480038A (en) | 1982-04-30 | 1984-10-30 | E. I. Dupont De Nemours And Company | Density separation of protein overproducing bacteria |
| US4695431A (en) | 1982-08-16 | 1987-09-22 | Technicon Instruments Corporation | Volumetric pumping apparatus and method for supplying fluids to sheath stream flow cells |
| US4624835A (en) | 1982-09-03 | 1986-11-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Microcentrifugation tube for the concentration of samples for electron microscopy |
| US4609991A (en) * | 1983-07-19 | 1986-09-02 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Automated system for determining the molecular weight and/or concentration of macromolecules via sedimentation equilibrium |
| US4558947A (en) | 1983-11-07 | 1985-12-17 | Wardlaw Stephen C | Method and apparatus for measuring blood constituent counts |
| US4717660A (en) * | 1984-01-26 | 1988-01-05 | Becton, Dickinson And Company | Detection of bacteria by fluorescent staining in an expanded buffy coat |
| US4865812A (en) | 1987-02-03 | 1989-09-12 | Davstar Industries, Inc. | Integral specimen collection tube and microscope slide device |
| KR970007077B1 (ko) * | 1987-03-13 | 1997-05-02 | 코울터 일렉트로닉스 인커퍼레이티드 | 광산란 기술을 이용한 다중-부분식별 분석 방법 |
| US4871248A (en) * | 1987-08-11 | 1989-10-03 | Monsanto Company | Method of particle size determination |
| JPH01199159A (ja) | 1988-02-04 | 1989-08-10 | Kosumitsuku:Kk | 遠心チューブ |
| US4867887A (en) * | 1988-07-12 | 1989-09-19 | Becton Dickinson And Company | Method and apparatus for separating mononuclear cells from blood |
| US5030421A (en) | 1988-08-31 | 1991-07-09 | Davstar Industries, Inc. | Integral centrifuge tube and specimen slide |
| CA1324894C (en) * | 1989-03-31 | 1993-12-07 | Maritime Scientific Services Ltd. | Method and apparatus for the identification of particles |
| DE69025969T2 (de) | 1989-04-05 | 1996-08-08 | New York University, New York, N.Y. | Verfahren zur Charakterisierung von Teilchen |
| US5449621A (en) | 1989-07-31 | 1995-09-12 | Biotope, Inc. | Method for measuring specific binding assays |
| US5030002A (en) | 1989-08-11 | 1991-07-09 | Becton, Dickinson And Company | Method and apparatus for sorting particles with a moving catcher tube |
| IE903997A1 (en) * | 1989-11-07 | 1991-05-08 | Du Pont | Hinged centrifuge tube adapter |
| US5183740A (en) * | 1990-02-23 | 1993-02-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Flow immunosensor method and apparatus |
| GB9005021D0 (en) * | 1990-03-06 | 1990-05-02 | Alfa Laval Sharples Ltd | Turbidity measurement |
| JPH0436636A (ja) | 1990-06-01 | 1992-02-06 | Canon Inc | フローセル装置 |
| EP0488947B1 (de) * | 1990-11-26 | 1995-02-15 | Ciba-Geigy Ag | Detektorzelle |
| US5236604A (en) | 1991-05-29 | 1993-08-17 | Sherwood Medical Company | Serum separation blood collection tube and the method of using thereof |
| US5488469A (en) | 1991-08-30 | 1996-01-30 | Omron Corporation | Cell analyzing apparatus |
| ATE130755T1 (de) | 1991-09-26 | 1995-12-15 | Klaus Bous | Reinigungsflüssigkeit, insbesondere für notfallsets, und ihre verwendung. |
| US5260032A (en) * | 1991-12-27 | 1993-11-09 | Davstar California, Inc. | Integral centrifuge tube and specimen slide |
| US5558998A (en) | 1992-02-25 | 1996-09-24 | The Regents Of The Univ. Of California | DNA fragment sizing and sorting by laser-induced fluorescence |
| US5242660A (en) * | 1992-02-28 | 1993-09-07 | Paul Hsei | Sample preparation device |
| US5552310A (en) | 1992-06-12 | 1996-09-03 | Hiroshi Yoshikura | Replication of hepatitis C virus genome and identification of virus having high infectivity |
| US5342790A (en) | 1992-10-30 | 1994-08-30 | Becton Dickinson And Company | Apparatus for indirect fluorescent assay of blood samples |
| CA2148483A1 (en) * | 1992-11-03 | 1994-05-11 | Alexander Saunders | Methods and procedures for preparing red blood fractions |
| US5395588A (en) * | 1992-12-14 | 1995-03-07 | Becton Dickinson And Company | Control of flow cytometer having vacuum fluidics |
| US5946220A (en) * | 1993-08-25 | 1999-08-31 | Lemelson; Jerome H. | Computer operated material processing systems and method |
| US5422018A (en) * | 1994-01-31 | 1995-06-06 | Applied Imaging | Centrifuge tube and adaptor |
| US5578832A (en) * | 1994-09-02 | 1996-11-26 | Affymetrix, Inc. | Method and apparatus for imaging a sample on a device |
| DE59501086D1 (de) | 1994-03-21 | 1998-01-22 | Sia Schweizer Schmirgel & Schl | Vorrichtung und Verfahren zum automatischen Ermitteln der Sedimentationshöhe in einem Sedimentometer |
| US5512490A (en) * | 1994-08-11 | 1996-04-30 | Trustees Of Tufts College | Optical sensor, optical sensing apparatus, and methods for detecting an analyte of interest using spectral recognition patterns |
| US5663051A (en) * | 1994-08-31 | 1997-09-02 | Activated Cell Therapy, Inc. | Separation apparatus and method |
| US6074614A (en) * | 1995-06-07 | 2000-06-13 | Molecular Devices Corporation | Multi-assay plate cover for elimination of meniscus |
| US5632905A (en) | 1995-08-07 | 1997-05-27 | Haynes; John L. | Method and apparatus for separating formed and unformed components |
| IT1286631B1 (it) * | 1996-05-16 | 1998-07-15 | Diesse Diagnostica | Apparecchio per la preparazione e la determinazione degli esami della velocita' di sedimentazione di liquidi organici ed altro |
| DE19631855C2 (de) * | 1996-08-07 | 1998-10-15 | Komanns Aribert | Verfahren und Vorrichtung zur Erfassung von Oberflächenantigenen oder Strukturmerkmalen von Zellen, Partikeln oder Makromolekülen |
| US6083763A (en) * | 1996-12-31 | 2000-07-04 | Genometrix Inc. | Multiplexed molecular analysis apparatus and method |
| US5853894A (en) * | 1997-02-03 | 1998-12-29 | Cytonix Corporation | Laboratory vessel having hydrophobic coating and process for manufacturing same |
| JPH10239278A (ja) * | 1997-02-24 | 1998-09-11 | Hitachi Ltd | 電気泳動装置 |
| AU754999B2 (en) * | 1998-03-10 | 2002-11-28 | Large Scale Proteomics Corporation | Detection and characterization of microorganisms |
-
1999
- 1999-03-09 AU AU30030/99A patent/AU754999B2/en not_active Ceased
- 1999-03-09 KR KR1020007010102A patent/KR20010034600A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-03-09 EP EP99911379A patent/EP1062044A2/en not_active Withdrawn
- 1999-03-09 WO PCT/US1999/005511 patent/WO1999046047A2/en not_active Application Discontinuation
- 1999-03-09 US US09/265,541 patent/US6254834B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-09 JP JP2000535454A patent/JP2002505866A/ja active Pending
- 1999-03-09 CA CA2322202A patent/CA2322202C/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-05-16 US US09/571,290 patent/US7070739B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-16 US US09/571,274 patent/US6340570B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-16 US US09/571,278 patent/US6346421B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-16 US US09/571,279 patent/US6479239B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-11-27 US US09/993,501 patent/US20030138770A1/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-01-18 US US10/050,102 patent/US20020137026A1/en not_active Abandoned
- 2002-01-18 US US10/050,848 patent/US20020132338A1/en not_active Abandoned
- 2002-01-18 US US10/050,847 patent/US6911312B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-18 US US10/050,846 patent/US20020132230A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20020127546A1 (en) | 2002-09-12 |
| US6340570B1 (en) | 2002-01-22 |
| JP2002505866A (ja) | 2002-02-26 |
| US6479239B1 (en) | 2002-11-12 |
| US6346421B1 (en) | 2002-02-12 |
| AU754999B2 (en) | 2002-11-28 |
| CA2322202A1 (en) | 1999-09-16 |
| WO1999046047A3 (en) | 1999-12-02 |
| US6911312B2 (en) | 2005-06-28 |
| US20020132230A1 (en) | 2002-09-19 |
| US20020132338A1 (en) | 2002-09-19 |
| CA2322202C (en) | 2010-11-30 |
| US20020137026A1 (en) | 2002-09-26 |
| US6254834B1 (en) | 2001-07-03 |
| EP1062044A2 (en) | 2000-12-27 |
| US7070739B1 (en) | 2006-07-04 |
| WO1999046047A2 (en) | 1999-09-16 |
| AU3003099A (en) | 1999-09-27 |
| US20030138770A1 (en) | 2003-07-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20010034600A (ko) | 미생물의 검출 및 성상 확인 | |
| WO2002021108A2 (en) | Method for detecting molecules or chemical reactions by determining variation of conductance | |
| US7713744B2 (en) | Determining the risk of cardiovascular disease using ion mobility of lipoproteins | |
| JP4923065B2 (ja) | 蛍光標識生物学的成分の検出のための試料採取装置及び方法 | |
| US7129056B2 (en) | Method for the detection, identification, enumeration and confirmation of virally infected cells and other epitopically defined cells in whole blood | |
| US20100317106A1 (en) | Harvesting target materials from centrifuged suspensions | |
| US6933109B2 (en) | Rapid particle detection | |
| JP2005502872A (ja) | 光バイオディスクシステムを使用した、核の形態に基づく白血球の型の識別および定量 | |
| US20120070911A1 (en) | Method of Detecting and Quantifying Analytes of Interest in a Liquid and Implementation Device | |
| Ramirez et al. | RareCyte® CTC analysis step 1: AccuCyte® sample preparation for the comprehensive recovery of nucleated cells from whole blood | |
| WO2006020936A2 (en) | A method for assessing disease states by profile analysis of isolated circulating endothelial cells | |
| US4414197A (en) | Method for preparing permanent slides of rare sorted cells | |
| MXPA00008845A (en) | Detection and characterization of microorganisms | |
| US20080000284A1 (en) | Systems and methods for centrifuge sample holders | |
| Anderson | THE VIROME PROJECT, A “MANHATTAN PROJECT’FOR BIOTERRORISM. II. TECHNIQUES FOR PHYSICAL VIRUS DETECTION USING MICROBANDING TUBES Version 1.0 | |
| Anderson et al. | CT RANKIN, JR., and EL CANDLER, Biology Di-vision, Oak Ridge National Laboratory, ³ and Technical Division and Biophysical Separations Laboratory, Oak Ridge Gaseous Diffusion Plant, ³ Oak Ridge, Tennessee | |
| Petrone et al. | A novel mini-invasive finger-prick protocol for preparing blood micro-samples for morphological analysis of human erythrocytes by scanning electron microscopy | |
| EP2799872B1 (en) | Selective release of sub-group of biological units | |
| Daugherty et al. | Electron microscopy in the diagnosis of pediatric disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |