KR20240059057A

KR20240059057A - 미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지

Info

Publication number: KR20240059057A
Application number: KR1020220139832A
Authority: KR
Inventors: 이성훈; 길민석; 배진한
Original assignee: 주식회사 클리노믹스
Priority date: 2022-10-27
Filing date: 2022-10-27
Publication date: 2024-05-07
Also published as: WO2024090620A1

Abstract

본 발명은 대용량의 혈액과 같은 체액에서 특정 성분에 대한 원심 분리를 수행하고, 동시에 유전자 변이의 검출이 가능한 올인원(All-in one) 카트리지에 대한 것이다. 이에 따르면, 체액(이를테면, 전혈) 성분을 분리 및 분석할수 있는 원심분리장치용 챔버와 중합효소 연쇄반응(PCR(polymerase chain reaction) 또는 실시간 정량 PCR(Realtime PCR, quantitative PCR)을 수행할 수 있는 구조로 구현하여, 분리된 특정성분(plasma, 혈장 등)에 존재하는 타겟성분(이를테면, cfDNA) 시료를 자동으로 추출함과 동시에, 해당 성분의 유전자 분석 정보까지 한번에 구현할 수 있는 카트리지를 제공할 수 있다.

Description

미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지{All-In-One type cartridge for centrifuge and real-time PCR}

본 발명은 대용량의 혈액과 같은 체액에서 특정 성분에 대한 원심 분리를 수행하고, 동시에 유전자 변이의 검출이 가능한 올인원(All-in one) 카트리지 구조에 대한 것이다.

핵산을 이용한 분자진단법은 높은 정확성과 재현성, 신속성 등의 장점이 있어 최근 식품위생 분야와 법의학 분야에서 많은 이슈가 되고 있는 방법이다. 그러나 이런 장점에도 불구하고 여러 부가적인 측정 설비를 갖추어야 하기에 최근에는 이를 랩온어 디스크(Lab-on-a Disc) 형태로 구현하고자 하는 연구들이 많이 진행되고 있다.

구체적으로, 회전식 원형 또는 다각형의 랩온어디스크의 기술은 전혈을 각 성분(플라즈마(plasma), 버피 코트(buffy coat) 및 백혈구, 적혈구) 별로 분리하기 위하여 단일 튜브 용기에 전혈을 투입한 후, 이를 원심 분리 장치에 투입하여 비중을 기초로 분리방법에 비하여 시료의 교차오염 없이 효율적으로 분리할 수 있는 방법이다.

하지만, 기존의 회전식 원형 또는 다각형의 랩온어디스크를 이용하여 전혈내의 성분들은 심도있는 분석을 위해서는 또 다른 수작업을 요구한다. 특히, 최근에 암진단에 많이 이용되고 있는 세포유래핵산(cfDNA)는 플라즈마(plasma) 층에 존재하는데, 이를 분리하기 위해서는 filter나 마그네틱 비드를 사용하여 수작업으로 분리를 하여야 한다.

세포유래핵산(cfDNA)가 가지고 있는 유전정보를 분석하기 위해서는 RT-PCR 또는 NGS와 같은 분석방법을 사용하여야 하는데, 이러한 일련의 과정을 수행하기 위해서는 많은 시간과 노동력을 필요로 한다. 또한 분리, 분석 과정 중에 시료의 오염 및 교차 등 여러 문제를 수반한다.

그러므로, 위에 기술한 여러 문제들을 해결할 수 있는 시료(ex. 전혈)의 성분 분리, 분석을 한번에 자동으로 수행할 수 있는 장치가 필요한 실정이다.

한국공개특허 제2019-0143225호 일본등록특허 제4771595호

본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 체액(이를테면, 전혈) 성분을 분리 및 분석할수 있는 원심분리장치용 챔버와 연쇄효소중합반응(RT-PCR)을 구현하여, 분리된 특정성분(plasma, 혈장 등)에 존재하는 타겟성분(이를테면, cfDNA) 시료를 자동으로 추출함과 동시에, 해당 성분의 유전자 분석 정보까지 한번에 구현할 수 있는 카트리지를 제공하는 데 있다.

상술한 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명의 실시예에서는, 도 1 및 도 2에 도시된 것과 같이, 구동부로부터 동력을 전달받아 회전가능한 일정한 두께를 구비하는 디스크 형상의 카트리지 몸체(A); 상기 몸체(A) 내부에 배치되며, 주입구(10)에서 주입되는 체액을 유입받아 세포융해반응을 통해 타겟 성분을 추출하는 추출모듈(B); 상기 추출모듈(B)에서 추출되는 타겟성분외 분리물질을 수용 저장하는 분리물 보관모듈(C); 상기 추출모듈(B)와 밸브를 통해 선택적으로 연통하며, 타겟성분외 세정액 및 분순물을 보관하는 불순물 저장모듈(D); 상기 추출모듈(B)와 밸브를 통해 선택적으로 연통하여, 상기 타겟성분을 유입받아 연쇄중합효소반응을 수행하며, 상기 몸체(A)의 외주연(R)에서 외부 방향으로 연장되는 영역에 배치되는 PCR모듈(E);을 포함하는, 올인원 타입 원심분리 및 분석용 카트리지를 제공할 수 있도록 한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 체액(이를테면, 전혈) 성분을 분리 및 분석할수 있는 원심분리장치용 챔버와 중합효소 연쇄반응(PCR(polymerase chain reaction) 또는 실시간 정량 PCR(Realtime PCR, quantitative PCR)을 수행할 수 있는 구조로 구현하여, 분리된 특정성분(plasma, 혈장 등)에 존재하는 타겟성분(이를테면, cfDNA) 시료를 자동으로 추출함과 동시에, 해당 성분의 유전자 분석 정보까지 한번에 구현할 수 있는 카트리지를 제공할 수 있다.

이를 통해, 숙련된 기술자가 아니더라도, 체액에서 정확하고 효율적인 타겟성분(세포유래핵산 등)의 분리 및 타겟성분이 가지고 있는 유전정보를 하나의 카트리지로 분석 및 판별할 수 있으며, 종래의 분석장비가 구현하지 못하는 신속성과 노동력절감효과를 구현할 수 있는 장점이 있다.

RT-PCR(Realtime PCR)의 경우, 열변성(denaturation) 과정에 필요한 온도와 결합과정(annealing)에 필요한 정확한 온도를 구현하기 위한 열적 가온과정에서, 몸체부 내부에 PCR 반응부가 매립형으로 배치되는 경우, 반응 형성의 임계 온도의 빠른 구현이 어려워, 효율적 반응을 얻어내기 어려우며, 열원의 인가시, 몸체부 내부의 반응 수행 챔버나 분리 물질이 열에 영향을 받아 변성되거나, 일정하지 않는 온도를 가진 상태로 PCR 모듈에 진입하여 신뢰도 있는 반응을 얻어 내기 어렵게 된다.

따라서, 본 발명의 실시예와 같이, 원심분리를 통해 타겟물질을 추출하는 반응챔버를 내장하는 몸체부와, PCR 모듈이 상호 분리되는 구조로 하나의 카트리지에 구현하되, PCR 모듈을 몸체부의 외측으로 독립적으로 배치하는 구조롤 구현하여, 열변성(denaturation) 과정에 필요한 온도와 결합과정(annealing)에 필요한 정확한 온도를 구현하기 위한 열적 가온에 따른 신속한 변온과정을 구현할 수 있어, PCR 반응의 신뢰도를 극대화할 수 있다.

아울러, 몸체부 내부에 PCR 모듈을 매립형으로 구현시 발생할 수 있는 열적변성 및 시료의 열적 영향을 일소하여, 안정적인 PCR 분석 결과를 얻을 수 있는 장점이 구현된다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지의 사시도를 도시한 것이다.
도 2는 도 1의 분해사시도를 상부에서 바라본 모습을 도시한 것이다.
도 3은 도 2의 구조를 하부에서 바라본 모습을 도시한 것이다.
도 4는 도 2의 중심몸체 부분의 상부 평면도, 도 5는 도 2의 중시몸체의 하부 평면도를 도시한 것이다.
도 6은 도 4의 A-A' 단면도 및 도 2에서의 튜브군의 구조를 예시하기 위한 개념도이다.
도 7은 도 4 및 도 6의 입체 개념도를 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 카트리지의 성능을 실험한 결과를 도시한 이미지이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예를 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지(이하, '본 발명'이라 한다.)의 사시도를 도시한 것이다. 도 2는 도 1의 분해사시도를 상부에서 바라본 모습을 도시한 것이며, 도 3은 도 2의 구조를 하부에서 바라본 모습을 도시한 것이다.

도 1 내지 도 3을 참조하면, 본 발명은, 구동부로부터 동력을 전달받아 회전가능한 일정한 제1두께(t1)를 구비하는 디스크 형상의 메인몸체부(A1)와, 상기 메인몸체부(A)의 외측면에서 연장되어 상기 제1두께(t1) 보다 얇은 2두께(t2)로 형성되는 연장몸체부(A2)로 구성되는 카트리지 몸체(A)를 포함한다.

즉, 도 1에 도시된 구조와 같이, 본 발명은, 제1두께(t1)을 가지는 입체형 구조로 구현되는 메인몸체부(A1)을 구비하며, 상기 메인몸체부(A1)의 경우, 내부에 분리 및 분석이 필요한 대상물인 체액을 주입하여, 세포용해를 수행하는 챔버, 분리를 수행하는 반응챔버, 세정액공급 챔버와 같은 챔버 구조물을 내부에 매립형으로 구현되는 구조를 구비하게 된다.

또한, 상기 메인몸체부(A1)의 외측부분으로 노출되는 구조로 형성되는 연장몸체부(A2)의 경우, PCR 반응을 구현하기 위한 모듈 구조가 구현되며, 다수의 튜브 구조물을 실장하고, 상기 메인몸체부(A1)에서 분리된 타겟성분에 대한 중합효소 연쇄반응(이하, 'PCR'이라 한다.)을 수행할 수 있도록 한다.

이러한 본 발명의 몸체부의 구조는, 체액에서 타겟성분을 분리하는 부분과, PCR 반응을 구현하는 부분을 상호 분리 구조로 배치하도록 하여, 원심분리 과정을 진행하여 추출되는 타켓성분에 대한 PCR 반응의 진행이 상호 영향을 받지 않도록 한다. 즉, RT-PCR의 경우, 열변성(denaturation) 과정에 필요한 온도와 결합과정(annealing)에 필요한 정확한 온도를 구현하기 위한 열적 가온과정에서, 몸체부 내부에 PCR 반응부가 매립형으로 배치되는 경우, 반응 형성의 임계 온도의 빠른 구현이 어려워, 효율적 반응을 얻어내기 어려우며, 열원의 인가시, 몸체부 내부의 반응 수행 챔버나 분리 물질이 열에 영향을 받아 변성되거나, 일정하지 않는 온도를 가진 상태로 PCR 모듈에 진입하여 신뢰도 있는 반응을 얻어 내기 어렵게 된다.

따라서, 본 발명의 실시예와 같이, 원심분리를 통해 타겟물질을 추출하는 반응챔버를 내장하는 몸체부와, PCR 모듈이 상호 분리되는 구조로 하나의 카트리지에 구현하되, PCR 모듈(C)을 몸체부의 외측으로 독립적으로 배치하는 구조롤 구현하여, 열변성(denaturation) 과정에 필요한 온도와 결합과정(annealing)에 필요한 정확한 온도를 구현하기 위한 열적 가온에 따른 신속한 변온과정을 구현할 수 있어, PCR 반응의 신뢰도를 극대화할 수 있다.

이하에서는, 구체적으로 본 발명의 내부 구조를 도 2 및 도 4를 중심으로 설명하기로 한다.

본 발명의 추출모듈(B)은, 메인몸체부(A)의 내부에 배치되는 다수의 챔버 구조물과 각 챔버 구조물 사이의 연통을 선택적으로 제어하는 밸브 구조물로 구성된다.

도 2에 도시된 것과 같이, 본 발명은, 상부판(10)과 하부판(20)에 의해 메인몸체부(A)가 밀폐되는 구조로 구현되게 된다.

이 경우, 메인몸체부(A) 내부에는, 주입되는 체액을 분리하고, 세정하여 타겟 물지를 추출하는 반응 챔버가 다수 개가 마련되게 된다.

우선, 주입구(1)는 본 발명의 중심부(P1)에 가장 인접하여 형성되게 되며, 상기 주입구를 중심으로, 바깥 방향으로 체액에 대한 분리 기능을 수행하는 챔버부가 순차로 배치될 수 있도록 한다.

도 2 및 도 2의 상부 평면을 도시한 도 4의 구조를 참조하여 각 구성의 배치관계를 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 적용되는 다양한 분석 대상 체액은 사람이 전혈, 땀, 또는 기타의 시료 등이 적용될 수 있으나, 본 발명의 바람직한 일례로서 대상 체액을 사람의 전혈을 적용하고, 제1분리물질은 혈장(plasma), 타겟성분을 세포유래핵산(cell free DNA; cfDNA)인 것을 바람직한 실시예로하여 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 카드리지의 추출모듈의 구성과, 각 구성간의 작용관계를 이하에서 설명한다.

본 발명의 추출모듈(B)은, 메인몸체부(A1) 내부에 배치되며, 주입되는 체액을 원심분리하여 분리 및 반응챔버를 구비하여 타겟성분을 추출하는 기능을 수행하게 된다.

구체적으로, 상기 추출모듈(B)은 상기 메인몸체부의 중심부(P1)에서 순차적으로 멀어지는 위치에, 아래의 다수의 챔버부가 순차적으로 배치되게 된다.

이를 위해, 상기 추출모듈(B)은 주입되는 체액시료에서 타겟성분을 포함하는 제1분리물질을 분리하여 보관하는 제1챔버부(110)와, 원심력에 의해 제1분리물질을 유입받고, 세포를 용해하여 타겟성분과 제2분리물질로 분리하는 제2챔버부(120), 상기 제2챔버부에서, 용해된 타겟성분을 유입받아, 마그네틱 비드와 타겟성분이 반응하도록 하여 타겟성분을 분리하는 제3챔버부(130), 상기 제3챔버부에서 유입되는 타겟물질을 저장하는 제4챔버부(140)를 포함하여 구성될 수 있다.

상기 추출모듈(B)은, 도 4에서와 같이, 중심부(P1)에서 외부 방향으로, 상기 제1챔버부(110), 제2챔버부(120), 제3챔버부(130) 및 제4챔버부(140)이 순차적으로 배치되게 된다. 이러한 배치는 원심력에 따른 분리 물질의 원활한 이송을 확보하기 위함이다.

즉, 제1챔버부(110), 제2챔버부(120), 제3챔버부(130) 및 제4챔버부(140) 들간의 상호 연통하는 챔버부간 물질이동은, 밸브의 개폐에 따라 유로를 개방하여 선택적으로 이동하며, 상기 카트리지 몸체(A)의 회전에 따른 원심력에 의해 구현되게 된다.

이들 챔버부의 구성의 작용을 설명하면, 우선, 주입구(1)는, 체액(전혈)이 주입되는 곳으로, 본 발명이 원심분리 동작을 수행하여 분리하는 체액이 최초로 주입되는 부분이다.

상기 주입구(1)에 인접하여, 원심분리에 의해 분리된 전혈의 성분중, 혈장(plasma)은 제1챔버부(110)에 보관되게 되며, 원심분리에서 분리된 성분 중 버피코트(buffy caot)를 인접챔버(115)로 이동시켜 보관하게 된다. 즉, 타겟성분이 들어가는 메인 물질은 제1챔버(110)에 저장하고, 그외 성분은 인접챔버(115)로 분리 보관하게 된다.

상기 제1챔버(110)에 바깥쪽에 배치되는 제2챔버(120)는 상기 제1챔버(110)와 밸브(19)에 의해 선택적으로 연통하게 되며, 원심분리 과정에서, 밸브 여닫이 조절과 원심력에 의해 혈장이 제2챔버(120)로 이동할 수 있도록 한다.

상기 제2챔버(120)는 주입되는 세포 용해에 필요한 용해물질을 주입받아, 혈장내의 세포를 융해(cell lysis)하는 기능을 수행한다. 상기 제2챔버(120)에 주입되는 용해물질은, 일예로 Protease K 용액일 수 있으며, 이는 용해물질 주입구(6)을 통해 주입되며, 밸브(21)의 개폐동작과 원심력에 의해 제2챔버(120)로 이동하게 된다. 일예로 이러한 세포융해가 완전히 이루어지도록, 원심분리장치에서는 180도 불원전 원심분리를 수행할 수 있다.

상기 제3챔버(130)는 상기 제2챔버(120)의 바깥쪽에 인접하여 배치된다. 상기 제2챔버(120)에서 용해된 혈장(plasma)이 밸브(22)의 개폐동작과 원심력에 의해 제3챔버(130)로 이동하게 되면, 제3챔버(130)에서는 구비되는 마그네틱 비드(magnetic bead)와 반응을 통해 세포유래핵산(cf DNA)이 반응하게 된다. 즉, 제3챔버 내에서는, 마그네틱 비드(magnetic bead)과 용해된 혈장내의 세포유래핵산(cfDNA)가 결합하게 되며, 일예로 이러한 결합이 효율적으로 구현되기 위해서, 원심분리 장치 내에서 180도 불완전 원심분리를 하여 결합반응을 높일 수 있도록 하는 것이 바람직하다.

이 경우, 본 발명에서는, 제3챔버내에 존재하는 혈장 내 존재하는 불순물을 제거하기 위한 세척과정을 수행할 수 있도록 한다. 이를 위해, 본 발명은, 상기 메인몸체부(A1)의 내부에 배치되며, 상기 제3챔버부(130)와 연통하여 세척액을 공급하는 적어도 하나 이상의 세척액 공급챔버(160)를 더 포함하여 구성될 수 있도록 한다.

즉, 도 4에 도시된 구조와 같이, 본 발명의 세척액 공급챔버(160)는 제3챔버(130) 내에서 수행되는 마그네틱 비드로 유입되는 혈장의 반응 전후, 혈장내 존재하는 불순물을 제거하기 위한 세척을 수행하기 위한 세척액을 공급할 수 있도록 한다.

도 4에 도시된 구조와 같이, 상기 세척액공급챔버(160)는 총 4개의 세척액챔버(161, 162, 163, 164)가 구비되어, 총4회의 세척액을 공급하여 4회의 세척과정을 수행할 수 있도록 한다. 이때 필요한 세척액은 원심분리 작업 전에 사전에 주입하여 충진하고, 원심분리가 시작되면, 원심력과 밸브(24,25,26,27)의 개폐동작과 원심력에 의해 제3챔버로 순차적으로 세척액이 이동하여 불순물을 제거하게 된다. 제거된 불순물은, 불순물저장챔버(D)로 밸브(23)의 개폐동작과 원심력에 의해 이동하게 된다.

이후, 상기 제3챔버(130) 내에서 마그네틱 비드(magnetic bead)와 결합한 세포유래핵산(cfDNA)는 추출버퍼(elution buffer) 용액과 결합하여 용해되게 된다. 이러한 추출버퍼 용액은, 추출버퍼 용액 주입구(13) 통해서 주입되게 되며, 밸브(28)의 개폐동작과 원심력에 의해 상기 제3챔버로 주입되게 되어, 마그네틱 비드(magnetic bead)와 결합한 세포유래핵산을 용해시키게 된다.

추출버퍼용액에 용해된 세포유래핵산(cfDNA)은 원심력과 밸브(29)의 개폐동작에 의해 상기 제3챔버(130)의 바깥쪽에 배치되는 제4챔버(140)으로 유입되게 된다. 세포유래핵산을 보관하는 기능을 수행하는 제4챔버(140)는 타겟성분인 세포유래핵산(cfDNA) 용액을 원심력과 밸브(30)의 개폐동작에 의해 미터링 챔버(150)으로 이동하게 된다. 일예로, 이러한 경우 적용하는 원심력은 1000rpm(1초당1rpm 속도로 원심력 증가 감속 설정)을 1분간 유지할 수 있도록 한다.

이 경우, 제3챔버(130) 내에 소량의 세포유래핵산(cfDNA) 용액이 잔류하여 남는 것을 방지하기 위해서, 본 발명의 제3챔버(130)의 바닥면은, 인접하여 배치되는 제4챔버부(140)가 위치한 외부 방향으로 기울어진 제3경사도(θ3)를 갖도록 한다. 이 경우, 제3경사도(θ3)는 바닥면의 수평면을 기준으로 3°~ 5°의 범위를 가지는 것이 바람직하다. 상술한 범위의 각도를 초과하는 경우에는, 원심력에 따라 타겟물질이 경사도를 따라 유동하는 힘이 커져 안정성을 구현하기 어려우며, 3°(3도) 미만의 기울기 에서는, 잔류하는 타겟성분이 남아 원하는 효과를 구현하기 어렵게 된다.

상기 미터링챔버(150)는 세포유래핵산(cfDNA)의 유입되는 양과 분배되는 양을 정량화하여 공급하는 기능을 수행하는 것으로, 미터링챔버(150)로 이동한 세포유래핵산(cfDNA)은 인접하는 PCR 모듈(C)의 튜브체(T) 중 제1튜브군(Ta)로 정량화한 시료로 주입이 이루어지게 된다. 일예로, 동일한 양의 제1튜브군(Ta)로 이동하기 위해서는 원심력은 2000rpm(1초당 1rpm속도로 원심력 증가, 감속 설정) 1분으로 설정하여 진행할 수 있도록 한다.

상술한 것과 같이, 추출모듈(B)를 구성하는 다수의 챔버와, 상술한 튜브군은 원심력과 인접하는 챔버 사이를 연통시키는 미세유로를 개폐하는 밸브의 동작으로 유체의 이동이 이루어지게 된다. 이에, 도 4에 도시된 것과 같이, 본 발명의 상기 제1챔버부(110), 제2챔버부(120), 제3챔버부(130), 제4챔버부(140) 및 제1튜브군 중 상호 연통하는 구조간의 물질이동은, 밸브의 개폐에 따라 유로를 개방하여 선택적으로 이동하며, 상기 몸체부(A)의 회전에 따른 원심력에 의해 구현되도록 한다.

도 6은 제3챔버(130)에서 추출분리된 타겟성분을 미터링챔버(150)을 통해 공급되는 타겟성분인 세포유래핵산(cfDNA)을 유입받아 PCR 반응을 구현하는 PCR모듈의 구조를 설명하기 위한 도 4에서 A-A' 부분의 단면도를 도시한 것이다.

도 2, 도 4, 도 6을 참조하여, 본 발명의 PCR모듈(C)은, 디스크 형상의 메인몸체부(A1)의 외측면에서 연장되어 상기 제1두께(t1) 보다 얇은 2두께(t2)로 형성되는 보조몸체부(A2)에 구현되도록 한다.

특히, 도 2에 도시된 것과 같이, 상기 PCR 모듈(C)은, 상기 추출모듈(B)의 타켓성분을 보관하는 제4챔버(140)와 연통하는 연결유로가 형성되며, 상기 몸체부의 두께 보다 얇은 두께를 가지는 반응플레이트(210, 220)로 구성된다. 상기 반응플레이트(210, 220)는, 상판(10)의 외측면에 연결경계부(W)에서 연장되는 제1평판부(210)와 제1평판부(220)으로 나뉘어져 상호 대응되게 합체되는 구조로 구현된다.

상기 반응플레이트(210,220)의 제1평판부(210) 상부면에는 다수의 개구부를 구비되며, 상기 개구부의 하부로 연장되는 구조인 밀폐형 튜브구조체를 구비하는 반응튜브군(T)이 마련되는 구조로 구현된다.

즉, 본 발명의 PCR모듈(C)은 전체적인 단면이 반원형태를 가지는 메인몸체부(A1)과, 상기 반원형태의 메인몸체부(A1)의 외측면의 경계부에서 연장되어, 평판형상의 반응플레이트 구조물에 반응튜브가 구현되는 모듈이 연계되는 보조몸체부(A2)가 결합되는 구조로 구현되게 된다.

또한, 메인몸체부(A1)는, 상판(10)과 하판(30), 중심부 몸체(20)가 일정한 두께(t1)을 가지고 형성되는 밀폐형 입체구조로 구현되며, 보조몸체부(A2)는 이러한 입체구조물에서 독립적으로 외부 방향으로 돌출되는 구조로 형성되게 된다.

이러한 구조는, 상기 메인몸체부(A1)에서 전혈를 주입하여 원심분리에 따른 세포용해 및 분리과정을 거쳐서, 타겟성분은 세포유래핵산(cfDNA)을 추출하는 과정이 수행되게 되는 것과, 타겟성분은 세포유래핵산(cfDNA)이 PCR 반응을 하기 위해 유입되어 PCR 반응을 수행하는 장소가 분리되게 된다.

PCR 반응을 수행하기 위해서는, 통상, 중합효소 연쇄반응(PCR(polymerase chain reaction)의 경우, PCR 과정에 필요한 온도 조절과정을 열변성(denaturation) 과정에 필요한 온도(ex: 95℃)와 결합과정(annealing)에 필요한 정확한 온도(ex: 55℃)를 반응 대상물에 인가하는 과정이 필수적이며, 이 경우 PCR 과정에 필요한 온도 조절과정을 열변성(denaturation) 과정에 필요한 온도와 결합과정(annealing)에 필요한 정확한 온도를 반응 대상물에 최소한의 시간으로 구현하는 것이 매우 중요하다.

이러한 온도조절을 위해서는 외부에 열원을 반응대상물에 인가하는 장치를 구비하여 진행되게 되며, 이 경우, PCT 반응을 수행하기 위한 타겟성분(이를테면 반응튜브 내의 세포유래핵산)이 수용되는 튜브구조물이 상술한 메인몸체부(A1) 내부에 매립형 구조로 장착시키는 구조로 구현하는 것도 고려할 수 있다. 그러나 이러한 구조는, 열원의 전달이 메인몸체부(A1)를 경유하여 전달하게 되어 열확산이 일어나게 되며, 인접하는 다양한 반응챔버들에도 열적 영향을 끼치게 되어, 정확한 추출효과를 저해하게 되며, PCR 반응의 신뢰성이 떨어지게 된다.

그러나, 본원 발명의 경우, PCT 반응을 수행하기 위한 타겟성분(이를테면 반응튜브 내의 세포유래핵산)이 수용되는 튜브구조물을 타겟성분의 추출과정을 수행하는 메인몸체부(A1)와 분리하여 외부에 연결되는 독립적인 구조로 구현하게 되어, 해당 연장되어 외부에 돌출되는 구조로 구현되는 보조몸체부(A2)에 온도조절 등을 구현하게 되는바, 추출반응 구성들에 열적 영향을 일소할 수 있게 된다.

또한, 도 2 및 도 6에서와 같이, 본 발명에서의 PCR 모듈(C)은, 반응플레이트(210,220) 상면에 다수의 개구부를 구비하며, 상기 개구부의 하부로 연장되는 구조인 밀폐형 튜브구조체를 구비하는 반응튜브군(T)을 구비한다.

상기 반응튜브군(T)은, 상기 추출모듈에서 추출된 타겟물질이 수용되는 제1튜브군(Ta)을 구현하고, 상기 제1튜브균(Tb)의 인접하는 위치의 양쪽에 상기 제1튜브군과 이격되며, 상기 추출모듈과 연통하지 않는 구조로 배치되는 적어도 하나 이상의 제2튜브군(Tb1, Tb2)을 각각 배치되는 구조로 구현할 수 있다.

상기 상기 제1튜브균(Tb)을 실험군으로 하는 경우, 제2튜브군(Tb1, Tb2)은 각각 대조군으로 설정(음성대조군, 양성대조군)하여 동시에 실험을 진행할 수 있도록 할 수 있다.

특히, 이 경우, 상기 반응튜브군(T)은, 개구부에서 하부방향으로 점진적으로 폭이 좁아지는 구조로 구현되며, 반응튜브의 일측면과 타측면이 상기 몸체부의 수직방향(Y)과 서로 다른 경사도를 가지도록 형성하는 것이 바람직하다.

즉, 도 6에서와 같이, 하부 방향으로 연장되는 튜브체의 형상은, 몸체부의 중심부(P1)에 인접한 상기 일측면(T1)의 제1경사도(θ1)가 상기 타측면(T2)의 제2경사도(θ2) 보다 작게 형성되도록 구현할 수 있다. 이는, 본 발명에 따른 캐트리지의 원심력은 중심부(P1)의 방향에서 반대 방향으로 형성이 되게 되며, 이에, 경사도를 일측면(T1)을 30°~ 60°의 제1경사도(θ1) 범위를 가지도록 형성하고, 타측면(T2)는 제1경사도(θ1)보다 큰 70°~ 90°의 범위를 가지도록 형성하여, 반응물이 원심력에 의해 자연스럽게 이동하며, 반응튜브의 바닥 부분에 효율적으로 모일 수 있게 되는 장점이 구현되게 된다. 도 7에서는 본 발명에서의 바람직한 예로, 제1경사도(θ1)를 45°로 구현하고, 제2경사도(θ2)는 90°로 구현하였다.

도 7은 도 6에서 도시한 요부의 입체개념도를 도시한 것이다.

도 6 및 도 7을 참조하면, 도 6은, 도 4의 A-A' 단면도를 도시한 것이고, 도 8은 이러한 단면을 기준으로 도 6에 관련한 구성의 입체 개념도를 도시한 것이다.

도시된 것과 같이, 본 발명의 추출모듈(B)은 메인몸체부의 중심부(P1)을 기준으로, 제1챔버부(110), 제2챔버부(120), 제3챔버부(130)이 순차로 형성되는 구조이며, 특히, 이 경우, 상기 제3챔버부(130)는, 바닥면이 상기 제4챔버부(140)가 위치한 외부 방향으로 기울어진 제3경사도(θ3)를 갖도록 형성될 수 있도록 한다. 이는, 이 경우, 제3경사도(θ3)는 바닥면의 수평면을 기준으로 3°~ 5°의 범위를 가지는 것이 바람직하다. 상술한 범위의 각도를 초과하는 경우에는, 원심력에 따라 타겟물질이 경사도를 따라 유동하는 힘이 커져 안정성을 구현하기 어려우며, 3° 미만의 기울기 에서는, 잔류하는 타겟성분이 남아 원하는 효과를 구현하기 어렵게 된다.

또한, 상기 제3챔버부(130)는, 바닥면의 양측에 측벽부(132, 134) 중 적어도 어느 하나가, 상기 중심부(P1)가 위치한 방향으로 기울어진 제4경사도(θ4)를 구비하도록 하는 역경사구조를 형성할 수 있도록 한다. 이러한 역경사 구조의 제4경사도(θ4)는 도 6에서와 같이, 측벽부의 연장선과 챔버부의 상부면이 형성하는 각도로 정의하되, 70°~ 80°의 범위를 구비하도록 형성할 수 있다. 이는, 본 발명은 대용량 시료를 사용하는 경우에 적용될 수 있으며, 그에 따라, 각 챔버의 용량이 커서, 챔버 내에서 시료의 loss가 많이 발생될 우려가 커지게 된다. 이에, 반응 챔버인 제3챔버 측벽의 (하측방향)역경사 구조로 구현하게 되면, 챔버안의 시료가 측벽에 붙어 시료 손실이 일어나지 않도록 방지하는 기능을 구현하게 된다.

[참고 실험예 1]

서울아산병원에서, 폐암환자 120명을 대상으로, 해당 환자의 임상혈액을 채취하고, 세포내유래핵산(cfDNA) 내에 존재하는 표피생장인자수용체((Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) 변이를 검출하는 테스트를 진행하여 다음과 같은 결과를 도출하였다.

위 표의 결과를 살펴보면, 본 발명에 의해서 개발된 All-in-one 카트리지를 사용한 세포내유래핵산(cfDNA)내에 존재하는 EFGR 변이 검출결과 민감도와 특이도 모두 타사의 제품과 비교하여 우수한 성능을 보였다. 타사의 제품은 특이도에 비하여 민감도가 현저히 떨어지는 결과를 보이고 있음을 확인할 수 있다.

[참조 실험예 2]

도 8은 위 실험예 1에서, 무작위로 선정한 환자의 전혈 동일 샘플에 대하여, 세포내 유래핵산(cfDNA)의 추출농도를 기존 종래의 일반(manual)방식으로 출한 것과 비교한 것이다.

{표 2}

본 발명의 실시예에 따른 카트리지를 이용하여 분리한 세포내 유래핵산(cfDNA)이 농도는 평균적으로 각각 596pg/ul, 691pg/ul 측정되었으며, 기존의 manual 방식으로 세포내유래핵산(cfDNA) 농도는 439pg/ul로 측정되었다.

위의 결과는 본 발명에 의해서 개발된 올인원(All-in-one) 카트리지의 세포내유래핵산(cfDNA) 정제 효율이 더 우수한 것을 확인하였다.

이상에서와 같이 본 발명의 기술적 사상은 바람직한 실시예에서 구체적으로 기술되었으나, 상기한 바람직한 실시예는 그 설명을 위한 것이며, 그 제한을 위한 것이 아니다. 이처럼 이 기술 분야의 통상의 전문가라면 본 발명의 기술 사상의 범위 내에서 본 발명의 실시예의 결합을 통해 다양한 실시예들이 가능함을 이해할 수 있을 것이다.

A: 카트리지 몸체
A1: 메인몸체부
A2: 보조몸체부
B: 추출모듈
C: PCR 모듈
110: 제1챔버부
120: 제2챔버부
130: 제3챔버부
140: 제4챔버부
150: 미터링챔버
T: 반응튜브군
Ta: 제1튜브군
Tb: 제2튜브군

Claims

구동부로부터 동력을 전달받아 회전가능한 일정한 제1두께(t1)를 구비하는 디스크 형상의 메인몸체부(A1)와,
상기 메인몸체부(A)의 외측면에서 연장되어 상기 제1두께(t1) 보다 얇은 2두께(t2)로 형성되는 보조몸체부(A2)로 구성되는 카트리지 몸체(A);
상기 메인몸체부(A1) 내부에 배치되며, 주입되는 체액을 원심분리하여 분리하는 분리챔버 및 반응챔버를 구비하여 타겟성분을 추출하는 추출모듈(B);
상기 보조몸체부(A2)에 배치되어, 상기 추출모듈(B)에서 원심력에 의해 선택적으로 유입되는 타켓성분을 수용하는 튜브구조체를 구비하여, PCR반응을 구현하는 PCR모듈(C);
상기 몸체부와 PCR모듈은 연결경계를 기준으로 상호 독립적으로 형성되며, 상기 연결경계를 경유하는 유로로 상호 연통하는 구조인,
미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
청구항 1에 있어서,
상기 PCR 모듈(C)은,
상기 추출모듈(B)의 타켓성분을 보관하는 제4챔버(140)와 연통하는 연결유로가 형성되며, 상기 몸체부의 두께 보다 얇은 두께를 가지는 반응플레이트(210, 220);
상기 반응플레이트(210,220) 상면에 다수의 개구부를 구비하며, 상기 개구부의 하부로 연장되는 구조인 밀폐형 튜브구조체를 구비하는 반응튜브군(T);
을 포함하는,
미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
청구항 2에 있어서,
상기 반응튜브군(T)은,
개구부에서 하부방향으로 점진적으로 폭이 좁아지는 구조로 구현되며,
반응튜브의 일측면과 타측면이 상기 몸체부의 수직방향(Y)과 서로 다른 경사도를 가지도록 형성되는,
미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
청구항 3에 있어서,
상기 경사도는,
상기 몸체부의 중심부(P1)에 인접한 상기 일측면(T1)의 제1경사도(θ1)가 상기 타측면(T2)의 제2경사도(θ2) 보다 작게 형성되는,
미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
청구항 4에 있어서,
상기 제1경사도는,
상기 수직방향(Y)의 가상의 직선성분과 상기 일측면이 이루는 제1경사도(θ1)는 30~60도의 범위로 구현되는,
미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
청구항 5에 있어서,
상기 반응튜브군(T)은,
상기 추출모듈에서 추출된 타겟물질이 수용되는 제1튜브군(Ta);
상기 제1튜브군과 이격되며, 상기 추출모듈과 연통하지 않는 구조로 배치되는 적어도 하나 이상의 제2튜브군(Tb1, Tb2);
을 포함하는,
미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
청구항 2에 있어서,
상기 추출모듈(B)은,
상기 메인몸체부의 중심부(P1)에서 순차적으로 멀어지는 위치에,
주입되는 체액시료에서 타겟성분을 포함하는 제1분리물질을 분리하여 보관하는 제1챔버부(110);
원심력에 의해 제1분리물질을 유입받고, 세포를 용해하여 타겟성분과 제2분리물질로 분리하는 제2챔버부(120);
상기 제2챔버부에서, 용해된 타겟성분을 유입받아, 마그네틱 비드와 타겟성분이 반응하도록 하여 타겟성분을 분리하는 제3챔버부(130);
상기 제3챔버부에서 유입되는 타겟물질을 저장하는 제4챔버부(140);
를 포함하는,
미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
청구항 7에 있어서,
상기 제3챔버부(130)는,
바닥면이 상기 제4챔버부(140)가 위치한 외부 방향으로 기울어진 제3경사도(θ3)를 갖도록 형성되는,
미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
청구항 8에 있어서,
상기 제3챔버부는,
바닥면의 양측에 측벽부가, 상기 중심부가 위치한 방향으로 기울어진 제4경사도(θ4)를 갖도록 형성되는,
미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
청구항 9에 있어서,
상기 제3챔버부(130)와 상기 제1튜브군(Ta) 사이에 타겟물질의 정량적인 공급을 제어하는 미터링챔버(150);
를 더 포함하는,
미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
청구항 7에 있어서,
상기 제1챔버부, 제2챔버부, 제3챔버부 및 제1튜브군 중 상호 연통하는 구조간의 물질이동은,
밸브의 개폐에 따라 유로를 개방하여 선택적으로 이동하며, 상기 몸체부(A)의 회전에 따른 원심력에 의해 구현되는,
미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
청구항 11에 있어서,
상기 메인몸체부(A1)의 내부에 배치되며,
상기 제3챔버부(130)와 연통하여 세척액을 공급하는 적어도 하나 이상의 세척액 공급챔버(160);를 더 포함하는,
미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
청구항 12에 있어서,
상기 몸체부의 내부 및 상기 세척액 공급챔버 외부에 배치되며,
상기 제2챔버부(120)에서 배출되는 배출물질을 수용저장하는, 불순물저장챔버(D);를 더 포함하는,
청구항 13에 있어서,
상기 체액은 전혈이며, 제1분리물질은 혈장, 타켓성분은 세포유래핵산(cell free DNA; cfDNA)인,
미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
청구항 1에 따른 분리 및 분석 카트리지를 적용하는 미세유체 분리분석장치.