WO2024090620A1 - 미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지 - Google Patents

미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지 Download PDF

Info

Publication number
WO2024090620A1
WO2024090620A1 PCT/KR2022/016647 KR2022016647W WO2024090620A1 WO 2024090620 A1 WO2024090620 A1 WO 2024090620A1 KR 2022016647 W KR2022016647 W KR 2022016647W WO 2024090620 A1 WO2024090620 A1 WO 2024090620A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
chamber
analysis
body portion
separation
reaction
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/016647
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이성훈
길민석
배진한
Original Assignee
주식회사 클리노믹스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 클리노믹스 filed Critical 주식회사 클리노믹스
Publication of WO2024090620A1 publication Critical patent/WO2024090620A1/ko

Links

Images

Classifications

    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01LCHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices

Definitions

  • the present invention relates to an all-in-one cartridge structure that can perform centrifugation of specific components in large volumes of body fluids such as blood and simultaneously detect genetic mutations.
  • This application is the result of the market-friendly global competitiveness product development project (1711174434, RS-2020-KD000019), a project supported by the pan-governmental Life Cycle Medical Device Research and Development Project, and is a real-time liquid biopsy for lung cancer diagnosis linked to the Hospital Information System (HIS).
  • the application was filed by claiming priority of Korean Patent Application No. 10-2022-0139832, which was filed as a result of the development of a molecular diagnostic system.
  • the rotary circular or polygonal Lab-on-a-Disk technology involves putting whole blood into a single tube container to separate it into each component (plasma, buffy coat, white blood cells, and red blood cells). This is a method that allows efficient separation without cross-contamination of samples compared to separation methods based on specific gravity by inserting them into a centrifugal separation device.
  • cell-derived nucleic acid which has recently been widely used in cancer diagnosis, exists in the plasma layer, and in order to separate it, it must be separated manually using a filter or magnetic beads.
  • the purpose of the present invention is to implement a chamber for a centrifugal separation device capable of separating and analyzing components of body fluids (e.g., whole blood) and a chain reaction polymerization reaction (RT-PCR), so that the The goal is to provide a cartridge that can automatically extract samples of target ingredients (e.g., cfDNA) and simultaneously provide genetic analysis information for the ingredients.
  • body fluids e.g., whole blood
  • RT-PCR chain reaction polymerization reaction
  • An impurity storage module (D) that selectively communicates with the extraction module (B) through a valve and stores cleaning liquid and impurities other than the target ingredients; It selectively communicates with the extraction module (B) through a valve to receive the target component and perform a chain polymerase reaction, and is disposed in an area extending outward from the outer periphery (R) of the body (A).
  • E an all-in-one type centrifugation and analysis cartridge including a PCR module (E).
  • a chamber for a centrifugal separator capable of separating and analyzing body fluid (e.g., whole blood) components and a polymerase chain reaction (PCR) or real-time quantitative PCR (Realtime PCR, quantitative PCR) are used.
  • a cartridge that is implemented in a structure that can be used to automatically extract samples of target components (e.g., cfDNA) present in separated specific components (plasma, blood plasma, etc.) and simultaneously implement genetic analysis information for the components at the same time. can be provided.
  • target components cell-derived nucleic acids, etc.
  • RT-PCR Realtime PCR
  • the PCR reaction unit in the thermal warming process to realize the temperature required for the thermal denaturation process and the exact temperature required for the annealing process, the PCR reaction unit is placed in an embedded form inside the body. , it is difficult to quickly realize the critical temperature for reaction formation, making it difficult to obtain an efficient reaction, and when a heat source is applied, the reaction performance chamber or separation material inside the body is affected by the heat and is denatured or has an inconsistent temperature. It becomes difficult to obtain a reliable reaction by entering the PCR module.
  • the body containing the reaction chamber for extracting the target material through centrifugation and the PCR module are implemented in a single cartridge in a structure in which the PCR module is separated from each other, but the PCR module is installed on the outside of the body.
  • a rapid alternating temperature process can be implemented based on thermal warming to achieve the exact temperature required for the thermal denaturation process and the accurate temperature required for the annealing process, thereby maximizing the reliability of the PCR reaction. can do.
  • the advantage of obtaining stable PCR analysis results is realized by eliminating thermal denaturation and thermal effects on the sample that may occur when implementing the PCR module as an embedded type inside the body.
  • Figure 1 shows a perspective view of an integrated cartridge for microfluidic separation and analysis according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the exploded perspective view of Figure 1 as seen from the top.
  • Figure 3 shows the structure of Figure 2 as seen from below.
  • Figure 4 is a top plan view of the central body portion of Figure 2
  • Figure 5 is a bottom plan view of the central body portion of Figure 2.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view taken along line A-A' of FIG. 4 and a conceptual diagram illustrating the structure of the tube group in FIG. 2.
  • Figure 7 shows a three-dimensional conceptual diagram of Figures 4 and 6.
  • Figures 8 to 11 are images showing the results of testing the performance of the cartridge of the present invention.
  • Cartridge body A1 Main body
  • A2 Auxiliary body B: Extraction module
  • reaction tube group Ta first tube group
  • Figure 1 shows a perspective view of an integrated cartridge for microfluidic separation and analysis (hereinafter referred to as 'the present invention') according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the exploded perspective view of Figure 1 as seen from the top, and
  • Figure 3 shows the structure of Figure 2 as seen from the bottom.
  • the present invention includes a disk-shaped main body portion (A1) having a constant first thickness (t1) that can be rotated by receiving power from a driving unit, and the main body portion (A). It includes a cartridge body (A) composed of an extended body portion (A2) extending from the outer surface and formed into a second thickness (t2) thinner than the first thickness (t1).
  • the present invention includes a main body portion (A1) implemented as a three-dimensional structure with a first thickness (t1), and in the case of the main body portion (A1), an internal By injecting body fluid, which is an object requiring separation and analysis, a chamber structure such as a chamber for cell lysis, a reaction chamber for separation, and a cleaning fluid supply chamber is provided with a structure embedded therein.
  • a chamber structure such as a chamber for cell lysis, a reaction chamber for separation, and a cleaning fluid supply chamber is provided with a structure embedded therein.
  • a module structure for implementing a PCR reaction is implemented, a plurality of tube structures are mounted, and the main body portion (A1) is formed in a structure exposed to the outer portion. It enables polymerase chain reaction (hereinafter referred to as 'PCR') to be performed on the target component separated from the body portion (A1).
  • the structure of the body part of the present invention arranges the part that separates the target component from body fluid and the part that implements the PCR reaction in a mutually separated structure, so that the PCR reaction for the target component extracted through the centrifugation process proceeds. Avoid mutual influence. That is, in the case of RT-PCR, in the thermal warming process to realize the temperature required for the thermal denaturation process and the exact temperature required for the annealing process, when the PCR reaction unit is placed in an embedded form inside the body, the reaction occurs. It is difficult to quickly realize the critical temperature for formation, making it difficult to obtain an efficient reaction. When a heat source is applied, the reaction chamber or separation material inside the body is affected by heat and is denatured, or the PCR module has an inconsistent temperature. It becomes difficult to obtain a reliable response.
  • the body part containing the reaction chamber for extracting the target material through centrifugation and the PCR module are implemented in a single cartridge with a structure in which they are separated from each other, and the PCR module (C) is installed in the body.
  • the PCR module (C) is installed in the body.
  • the extraction module (B) of the present invention is composed of a plurality of chamber structures disposed inside the main body portion (A) and a valve structure that selectively controls communication between each chamber structure.
  • the present invention is implemented in a structure in which the main body portion (A) is sealed by the upper plate 10 and the lower plate 20.
  • a plurality of reaction chambers are provided inside the main body portion (A) to separate the injected body fluid, clean it, and extract the target material.
  • the injection port 1 is formed closest to the center P1 of the present invention, and the chamber parts that perform the separation function for body fluids can be sequentially arranged around the injection port outward.
  • the various body fluids to be analyzed in the present invention may be whole human blood, sweat, or other samples.
  • whole human blood is used as the target body fluid, and the first separated material is plasma.
  • the target component is cell-derived nucleic acid (cell free DNA; cfDNA).
  • the extraction module (B) of the present invention is disposed inside the main body portion (A1) and performs the function of centrifuging the injected body fluid and extracting the target component by providing a separation and reaction chamber.
  • the extraction module (B) is positioned sequentially away from the center (P1) of the main body, and a plurality of chamber parts below are sequentially arranged.
  • the extraction module (B) includes a first chamber unit 110 that separates and stores the first separation material containing the target component from the injected bodily fluid sample, receives the first separation material by centrifugal force, and cells.
  • a second chamber portion 120 that dissolves and separates the target component and the second separation material. In the second chamber portion, the dissolved target component is received and the magnetic bead reacts with the target component to separate the target component.
  • It may be configured to include a third chamber unit 130 and a fourth chamber unit 140 that stores the target material flowing from the third chamber unit.
  • the extraction module (B) includes the first chamber part 110, the second chamber part 120, the third chamber part 130, and the fourth chamber part 110, the second chamber part 120, and the fourth chamber part 130, in the direction from the center P1 to the outside.
  • the chamber units 140 are arranged sequentially. This arrangement is to ensure smooth transport of the separated material due to centrifugal force.
  • the movement of materials between the first chamber part 110, the second chamber part 120, the third chamber part 130, and the fourth chamber part 140 in communication with each other occurs in the flow path according to the opening and closing of the valve. It opens and moves selectively, and is implemented by centrifugal force resulting from the rotation of the cartridge body (A).
  • the injection port 1 is a place where body fluid (whole blood) is injected, and is the part where the body fluid separated by performing a centrifugal operation in the present invention is first injected.
  • the second chamber 120 disposed outside the first chamber 110 is selectively communicated with the first chamber 110 by the valve 19, and during the centrifugation process, valve opening and closing control and centrifugal force are used. This allows plasma to move to the second chamber (120).
  • the second chamber 120 performs the function of lysing cells in plasma by receiving lytic substances necessary for lysing the injected cells.
  • the dissolved material injected into the second chamber 120 may be, for example, a Protease K solution, which is injected through the dissolved material injection port 6, and is injected into the second chamber ( 120).
  • centrifugation at 180 degrees can be performed in a centrifugal separator.
  • the third chamber 130 is disposed adjacent to the outside of the second chamber 120.
  • the magnetic bead provided in the third chamber 130 Cell-derived nucleic acid (cf DNA) reacts through a reaction with beads. That is, in the third chamber, the magnetic beads and the cell-derived nucleic acid (cfDNA) in the dissolved plasma are combined. For example, in order to efficiently implement this combination, an incomplete centrifugation of 180 degrees is required within the centrifuge device. It is desirable to separate to increase the binding reaction.
  • the present invention allows a washing process to be performed to remove impurities present in the plasma present in the third chamber.
  • the present invention is disposed inside the main body portion (A1) and further includes at least one cleaning fluid supply chamber 160 that communicates with the third chamber portion 130 and supplies cleaning fluid.
  • the cleaning liquid supply chamber 160 of the present invention is used to remove impurities present in plasma before and after the reaction of plasma flowing into the magnetic beads performed in the third chamber 130. Provides a supply of cleaning liquid to perform cleaning.
  • the cleaning fluid supply chamber 160 is provided with a total of four cleaning fluid chambers (161, 162, 163, and 164), and can supply a total of four cleaning fluids to perform four cleaning processes. Let it happen. At this time, the necessary cleaning solution is injected and filled in advance before centrifugation work, and when centrifugation begins, the cleaning solution sequentially moves to the third chamber by centrifugal force, the opening and closing operation of the valves (24, 25, 26, and 27), and centrifugal force. Impurities are removed. The removed impurities are moved to the impurity storage chamber (D) by the opening and closing operation of the valve 23 and centrifugal force.
  • the cell-derived nucleic acid (cfDNA) bound to the magnetic beads in the third chamber 130 is combined with the extraction buffer solution and dissolved.
  • This extraction buffer solution is injected through the extraction buffer solution inlet 13, and is injected into the third chamber by the opening and closing operation of the valve 28 and centrifugal force, thereby injecting the cell-derived nucleic acid combined with the magnetic bead. It dissolves.
  • the fourth chamber 140 which functions to store cell-derived nucleic acids, moves the cell-derived nucleic acid (cfDNA) solution, which is the target ingredient, to the metering chamber 150 by centrifugal force and the opening and closing operation of the valve 30.
  • the centrifugal force applied is maintained at 1000 rpm (centrifugal force increase and deceleration set at 1 rpm per second) for 1 minute.
  • the bottom surface of the third chamber 130 of the present invention is disposed adjacent to the fourth chamber portion. It is made to have a third inclination ( ⁇ 3) inclined toward the outside where (140) is located.
  • the third inclination ⁇ 3 is preferably in the range of 3° to 5° based on the horizontal plane of the floor. If the angle exceeds the above-mentioned range, the force with which the target material flows along the slope increases due to centrifugal force, making it difficult to achieve stability, and if the slope is less than 3° (3 degrees), residual target ingredients remain and do not achieve the desired effect. becomes difficult to implement.
  • the metering chamber 150 performs the function of quantifying and supplying the incoming and distributed amounts of cell-derived nucleic acid (cfDNA), and the cell-derived nucleic acid (cfDNA) moved to the metering chamber 150 is transferred to the adjacent PCR module. Injection is performed with the quantified sample into the first tube group (Ta) among the tube bodies (T) in (C). For example, in order to move the same amount of the first tube group (Ta), the centrifugal force is set to 2000 rpm (centrifugal force increases and decelerates at a rate of 1 rpm per second) and is set to 1 minute.
  • the movement of fluid in the plurality of chambers constituting the extraction module (B) and the above-mentioned tube group is achieved by centrifugal force and the operation of a valve that opens and closes a micro-channel that communicates between adjacent chambers.
  • a valve that opens and closes a micro-channel that communicates between adjacent chambers.
  • Figure 6 is for explaining the structure of a PCR module that implements a PCR reaction by receiving the target component extracted and separated in the third chamber 130 and the target component, cell-derived nucleic acid (cfDNA), supplied through the metering chamber 150.
  • Figure 4 shows a cross-sectional view taken along line A-A'.
  • the PCR module (C) of the present invention extends from the outer surface of the disk-shaped main body portion (A1) and has a second thickness (t2) thinner than the first thickness (t1). ) to be implemented in the auxiliary body portion (A2) formed by.
  • the PCR module (C) is formed with a connection passage communicating with the fourth chamber 140 that stores the target component of the extraction module (B), and is thicker than the thickness of the body portion. It consists of reaction plates (210, 220) having a thin thickness. The reaction plates 210 and 220 are divided into a first plate portion 210 and a first plate portion 220 extending from the connection boundary portion (W) on the outer surface of the upper plate 10 and are structured to correspond to each other. It is implemented.
  • the upper surface of the first flat portion 210 of the reaction plates 210 and 220 is provided with a plurality of openings, and a reaction tube group T is provided with a closed tube structure extending to the bottom of the openings. It is implemented.
  • the PCR module (C) of the present invention has a main body portion (A1) having a semicircular overall cross section, and a flat reaction plate extending from the boundary of the outer surface of the semicircular main body portion (A1).
  • the structure is implemented in a structure in which the auxiliary body portion (A2), in which the module in which the reaction tube is implemented, is connected, is coupled to the structure.
  • main body portion (A1) is implemented as a closed three-dimensional structure in which the upper plate 10, lower plate 30, and central body 20 are formed with a constant thickness t1, and the auxiliary body portion A2 has this structure. It is formed as a structure that protrudes outward independently from the three-dimensional structure.
  • whole blood is injected from the main body portion (A1) and goes through a cell lysis and separation process by centrifugation, and a process of extracting cell-derived nucleic acid (cfDNA) as the target component is performed, and the target component is the cell Derived nucleic acid (cfDNA) is introduced for the PCR reaction, and the site where the PCR reaction is performed is separated.
  • cfDNA cell-derived nucleic acid
  • the temperature control process required for the PCR process is adjusted to the temperature required for the heat denaturation process (ex: 95°C) and the binding process ( It is essential to apply the correct temperature (ex: 55°C) required for annealing to the reaction object.
  • the temperature control process required for the PCR process is adjusted to the temperature required for the heat denaturation process and the temperature required for the annealing process. It is very important to achieve the correct temperature to the reaction object in the minimum amount of time.
  • a device is provided to externally apply a heat source to the reaction object.
  • the tube structure that accommodates the target component (such as cell-derived nucleic acid in the reaction tube) for performing the PCT reaction is as described above. It can also be considered to implement a structure that is mounted as an embedded structure inside the main body portion (A1). However, in this structure, the heat source is transmitted via the main body portion (A1), causing heat diffusion, which also has a thermal effect on various adjacent reaction chambers, impeding the accurate extraction effect and the PCR reaction. Reliability decreases.
  • the tube structure in which the target component (such as cell-derived nucleic acid in the reaction tube) for performing the PCT reaction is accommodated is separated from the main body portion (A1) that performs the extraction process of the target component and connected to the outside. It is implemented as an independent structure, and temperature control is implemented in the auxiliary body portion (A2), which is implemented as a structure that extends and protrudes to the outside, making it possible to eliminate thermal effects on the extraction reaction components.
  • the PCR module (C) in the present invention has a plurality of openings on the upper surfaces of the reaction plates 210 and 220, and is provided with a closed tube structure extending to the bottom of the openings.
  • a reaction tube group (T) is provided.
  • the reaction tube group (T) implements a first tube group (Ta) in which the target material extracted from the extraction module is accommodated, and the first tube is located on both sides of the adjacent position of the first tube bacteria (Tb).
  • At least one second tube group (Tb1, Tb2) that is spaced apart from the group and is not in communication with the extraction module can be implemented in a structure in which each group is arranged.
  • the second tube group (Tb1, Tb2) can be set as a control group (negative control group, positive control group), so that the experiment can be performed simultaneously.
  • the reaction tube group (T) is implemented in a structure in which the width gradually narrows from the opening to the bottom, and one side and the other side of the reaction tube are different from the vertical direction (Y) of the body. It is desirable to form it to have a slope.
  • the shape of the tube body extending in the downward direction is such that the first inclination ⁇ 1 of the one side T1 adjacent to the center P1 of the body portion is the second inclination ⁇ 1 of the other side T2. It can be implemented to be smaller than the slope ( ⁇ 2). This means that the centrifugal force of the cartridge according to the present invention is formed in the opposite direction from the direction of the center (P1), and accordingly, the inclination is adjusted to the first inclination ( ⁇ 1) range of 30° to 60° on one side (T1).
  • the other side (T2) is formed to have a range of 70° to 90°, which is greater than the first inclination ( ⁇ 1), so that the reactants move naturally by centrifugal force and are efficiently collected at the bottom of the reaction tube.
  • the advantages that can be achieved are realized.
  • the first inclination ( ⁇ 1) is implemented as 45°
  • the second inclination ( ⁇ 2) is implemented as 90°.
  • Figure 7 shows a three-dimensional conceptual diagram of the main part shown in Figure 6.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view taken along line A-A' of FIG. 4, and FIG. 8 is a three-dimensional conceptual diagram of the configuration related to FIG. 6 based on this cross-section.
  • the extraction module (B) of the present invention is sequentially divided into a first chamber part 110, a second chamber part 120, and a third chamber part 130, based on the center P1 of the main body part.
  • the third chamber part 130 may be formed so that the bottom surface has a third inclination ⁇ 3 inclined toward the outside where the fourth chamber part 140 is located. Let it happen.
  • the third inclination ⁇ 3 is preferably in the range of 3° to 5° based on the horizontal plane of the floor.
  • the third chamber part 130 is such that at least one of the side wall parts 132 and 134 on both sides of the bottom surface has a fourth inclination ⁇ 4 inclined in the direction where the center P1 is located. It allows the formation of an inverted slope structure.
  • the fourth inclination ⁇ 4 of this reverse inclined structure is defined as the angle formed by the extension of the side wall and the upper surface of the chamber, and can be formed to range from 70° to 80°.
  • the present invention can be applied when using a large sample volume. Accordingly, the capacity of each chamber is large, which increases the risk of sample loss within the chamber. Accordingly, if the side wall of the third chamber, which is the reaction chamber, is implemented with a reverse tilt structure (in the downward direction), a function is implemented to prevent the sample in the chamber from sticking to the side wall and loss of the sample.
  • Figure 8 compares the extraction concentration of intracellular nucleic acid (cfDNA) from the same sample of whole blood from a randomly selected patient in Experimental Example 1 above with that extracted using the conventional manual method.
  • cfDNA intracellular nucleic acid
  • concentrations of intracellular nucleic acid (cfDNA) separated using the cartridge according to the embodiment of the present invention were measured on average at 596 pg/ul and 691 pg/ul, respectively, and the concentration of intracellular nucleic acid (cfDNA) using the existing manual method was It was measured at 439pg/ul.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)

Abstract

본 발명은 대용량의 혈액과 같은 체액에서 특정 성분에 대한 원심 분리를 수행하고, 동시에 유전자 변이의 검출이 가능한 올인원(All-in one) 카트리지에 대한 것이다. 이에 따르면, 체액(이를테면, 전혈) 성분을 분리 및 분석할수 있는 원심분리장치용 챔버와 중합효소 연쇄반응(PCR(polymerase chain reaction) 또는 실시간 정량 PCR(Realtime PCR, quantitative PCR)을 수행할 수 있는 구조로 구현하여, 분리된 특정성분(plasma, 혈장 등)에 존재하는 타겟성분(이를테면, cfDNA) 시료를 자동으로 추출함과 동시에, 해당 성분의 유전자 분석 정보까지 한번에 구현할 수 있는 카트리지를 제공할 수 있다.

Description

미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지
본 발명은 대용량의 혈액과 같은 체액에서 특정 성분에 대한 원심 분리를 수행하고, 동시에 유전자 변이의 검출이 가능한 올인원(All-in one) 카트리지 구조에 대한 것이다. 본 출원은 범부처 전주기의료기기연구개발사업단의 지원사업인 시장친화형 글로벌 경쟁력 확보 제품 개발사업(1711174434, RS-2020-KD000019)의 결과물로, 병원정보시스템(HIS) 연동 폐암 진단용 실시간 액체생검 분자진단 시스템개발의 결과물로 출원된 한국특허출원 제10-2022-0139832호를 우선권 주장하여 출원을 진행한 것이다.
핵산을 이용한 분자진단법은 높은 정확성과 재현성, 신속성 등의 장점이 있어 최근 식품위생 분야와 법의학 분야에서 많은 이슈가 되고 있는 방법이다. 그러나 이런 장점에도 불구하고 여러 부가적인 측정 설비를 갖추어야 하기에 최근에는 이를 랩온어 디스크(Lab-on-a Disc) 형태로 구현하고자 하는 연구들이 많이 진행되고 있다.
구체적으로, 회전식 원형 또는 다각형의 랩온어디스크의 기술은 전혈을 각 성분(플라즈마(plasma), 버피 코트(buffy coat) 및 백혈구, 적혈구) 별로 분리하기 위하여 단일 튜브 용기에 전혈을 투입한 후, 이를 원심 분리 장치에 투입하여 비중을 기초로 분리방법에 비하여 시료의 교차오염 없이 효율적으로 분리할 수 있는 방법이다.
하지만, 기존의 회전식 원형 또는 다각형의 랩온어디스크를 이용하여 전혈내의 성분들은 심도있는 분석을 위해서는 또 다른 수작업을 요구한다. 특히, 최근에 암진단에 많이 이용되고 있는 세포유래핵산(cfDNA)는 플라즈마(plasma) 층에 존재하는데, 이를 분리하기 위해서는 filter나 마그네틱 비드를 사용하여 수작업으로 분리를 하여야 한다.
세포유래핵산(cfDNA)가 가지고 있는 유전정보를 분석하기 위해서는 RT-PCR 또는 NGS와 같은 분석방법을 사용하여야 하는데, 이러한 일련의 과정을 수행하기 위해서는 많은 시간과 노동력을 필요로 한다. 또한 분리, 분석 과정 중에 시료의 오염 및 교차 등 여러 문제를 수반한다.
그러므로, 위에 기술한 여러 문제들을 해결할 수 있는 시료(ex. 전혈)의 성분 분리, 분석을 한번에 자동으로 수행할 수 있는 장치가 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 체액(이를테면, 전혈) 성분을 분리 및 분석할수 있는 원심분리장치용 챔버와 연쇄효소중합반응(RT-PCR)을 구현하여, 분리된 특정성분(plasma, 혈장 등)에 존재하는 타겟성분(이를테면, cfDNA) 시료를 자동으로 추출함과 동시에, 해당 성분의 유전자 분석 정보까지 한번에 구현할 수 있는 카트리지를 제공하는 데 있다.
상술한 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명의 실시예에서는, 도 1 및 도 2에 도시된 것과 같이, 구동부로부터 동력을 전달받아 회전가능한 일정한 두께를 구비하는 디스크 형상의 카트리지 몸체(A); 상기 몸체(A) 내부에 배치되며, 주입구(10)에서 주입되는 체액을 유입받아 세포융해반응을 통해 타겟 성분을 추출하는 추출모듈(B); 상기 추출모듈(B)에서 추출되는 타겟성분외 분리물질을 수용 저장하는 분리물 보관모듈(C); 상기 추출모듈(B)와 밸브를 통해 선택적으로 연통하며, 타겟성분외 세정액 및 분순물을 보관하는 불순물 저장모듈(D); 상기 추출모듈(B)와 밸브를 통해 선택적으로 연통하여, 상기 타겟성분을 유입받아 연쇄중합효소반응을 수행하며, 상기 몸체(A)의 외주연(R)에서 외부 방향으로 연장되는 영역에 배치되는 PCR모듈(E);을 포함하는, 올인원 타입 원심분리 및 분석용 카트리지를 제공할 수 있도록 한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 체액(이를테면, 전혈) 성분을 분리 및 분석할수 있는 원심분리장치용 챔버와 중합효소 연쇄반응(PCR(polymerase chain reaction) 또는 실시간 정량 PCR(Realtime PCR, quantitative PCR)을 수행할 수 있는 구조로 구현하여, 분리된 특정성분(plasma, 혈장 등)에 존재하는 타겟성분(이를테면, cfDNA) 시료를 자동으로 추출함과 동시에, 해당 성분의 유전자 분석 정보까지 한번에 구현할 수 있는 카트리지를 제공할 수 있다.
이를 통해, 숙련된 기술자가 아니더라도, 체액에서 정확하고 효율적인 타겟성분(세포유래핵산 등)의 분리 및 타겟성분이 가지고 있는 유전정보를 하나의 카트리지로 분석 및 판별할 수 있으며, 종래의 분석장비가 구현하지 못하는 신속성과 노동력절감효과를 구현할 수 있는 장점이 있다.
RT-PCR(Realtime PCR)의 경우, 열변성(denaturation) 과정에 필요한 온도와 결합과정(annealing)에 필요한 정확한 온도를 구현하기 위한 열적 가온과정에서, 몸체부 내부에 PCR 반응부가 매립형으로 배치되는 경우, 반응 형성의 임계 온도의 빠른 구현이 어려워, 효율적 반응을 얻어내기 어려우며, 열원의 인가시, 몸체부 내부의 반응 수행 챔버나 분리 물질이 열에 영향을 받아 변성되거나, 일정하지 않는 온도를 가진 상태로 PCR 모듈에 진입하여 신뢰도 있는 반응을 얻어 내기 어렵게 된다.
따라서, 본 발명의 실시예와 같이, 원심분리를 통해 타겟물질을 추출하는 반응챔버를 내장하는 몸체부와, PCR 모듈이 상호 분리되는 구조로 하나의 카트리지에 구현하되, PCR 모듈을 몸체부의 외측으로 독립적으로 배치하는 구조롤 구현하여, 열변성(denaturation) 과정에 필요한 온도와 결합과정(annealing)에 필요한 정확한 온도를 구현하기 위한 열적 가온에 따른 신속한 변온과정을 구현할 수 있어, PCR 반응의 신뢰도를 극대화할 수 있다.
아울러, 몸체부 내부에 PCR 모듈을 매립형으로 구현시 발생할 수 있는 열적변성 및 시료의 열적 영향을 일소하여, 안정적인 PCR 분석 결과를 얻을 수 있는 장점이 구현된다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지의 사시도를 도시한 것이다.
도 2는 도 1의 분해사시도를 상부에서 바라본 모습을 도시한 것이다.
도 3은 도 2의 구조를 하부에서 바라본 모습을 도시한 것이다.
도 4는 도 2의 중심몸체 부분의 상부 평면도, 도 5는 도 2의 중시몸체의 하부 평면도를 도시한 것이다.
도 6은 도 4의 A-A' 단면도 및 도 2에서의 튜브군의 구조를 예시하기 위한 개념도이다.
도 7은 도 4 및 도 6의 입체 개념도를 도시한 것이다.
도 8 내지 도 11은 본 발명의 카트리지의 성능을 실험한 결과를 도시한 이미지이다.
[부호의 설명]
A: 카트리지 몸체 A1: 메인몸체부
A2: 보조몸체부 B: 추출모듈
C: PCR 모듈 110: 제1챔버부
120: 제2챔버부 130: 제3챔버부
140: 제4챔버부 150: 미터링챔버
T: 반응튜브군 Ta: 제1튜브군
Tb: 제2튜브군
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예를 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지(이하, '본 발명'이라 한다.)의 사시도를 도시한 것이다. 도 2는 도 1의 분해사시도를 상부에서 바라본 모습을 도시한 것이며, 도 3은 도 2의 구조를 하부에서 바라본 모습을 도시한 것이다.
도 1 내지 도 3을 참조하면, 본 발명은, 구동부로부터 동력을 전달받아 회전가능한 일정한 제1두께(t1)를 구비하는 디스크 형상의 메인몸체부(A1)와, 상기 메인몸체부(A)의 외측면에서 연장되어 상기 제1두께(t1) 보다 얇은 2두께(t2)로 형성되는 연장몸체부(A2)로 구성되는 카트리지 몸체(A)를 포함한다.
즉, 도 1에 도시된 구조와 같이, 본 발명은, 제1두께(t1)을 가지는 입체형 구조로 구현되는 메인몸체부(A1)을 구비하며, 상기 메인몸체부(A1)의 경우, 내부에 분리 및 분석이 필요한 대상물인 체액을 주입하여, 세포용해를 수행하는 챔버, 분리를 수행하는 반응챔버, 세정액공급 챔버와 같은 챔버 구조물을 내부에 매립형으로 구현되는 구조를 구비하게 된다.
또한, 상기 메인몸체부(A1)의 외측부분으로 노출되는 구조로 형성되는 연장몸체부(A2)의 경우, PCR 반응을 구현하기 위한 모듈 구조가 구현되며, 다수의 튜브 구조물을 실장하고, 상기 메인몸체부(A1)에서 분리된 타겟성분에 대한 중합효소 연쇄반응(이하, 'PCR'이라 한다.)을 수행할 수 있도록 한다.
이러한 본 발명의 몸체부의 구조는, 체액에서 타겟성분을 분리하는 부분과, PCR 반응을 구현하는 부분을 상호 분리 구조로 배치하도록 하여, 원심분리 과정을 진행하여 추출되는 타켓성분에 대한 PCR 반응의 진행이 상호 영향을 받지 않도록 한다. 즉, RT-PCR의 경우, 열변성(denaturation) 과정에 필요한 온도와 결합과정(annealing)에 필요한 정확한 온도를 구현하기 위한 열적 가온과정에서, 몸체부 내부에 PCR 반응부가 매립형으로 배치되는 경우, 반응 형성의 임계 온도의 빠른 구현이 어려워, 효율적 반응을 얻어내기 어려우며, 열원의 인가시, 몸체부 내부의 반응 수행 챔버나 분리 물질이 열에 영향을 받아 변성되거나, 일정하지 않는 온도를 가진 상태로 PCR 모듈에 진입하여 신뢰도 있는 반응을 얻어 내기 어렵게 된다.
따라서, 본 발명의 실시예와 같이, 원심분리를 통해 타겟물질을 추출하는 반응챔버를 내장하는 몸체부와, PCR 모듈이 상호 분리되는 구조로 하나의 카트리지에 구현하되, PCR 모듈(C)을 몸체부의 외측으로 독립적으로 배치하는 구조롤 구현하여, 열변성(denaturation) 과정에 필요한 온도와 결합과정(annealing)에 필요한 정확한 온도를 구현하기 위한 열적 가온에 따른 신속한 변온과정을 구현할 수 있어, PCR 반응의 신뢰도를 극대화할 수 있다.
이하에서는, 구체적으로 본 발명의 내부 구조를 도 2 및 도 4를 중심으로 설명하기로 한다.
본 발명의 추출모듈(B)은, 메인몸체부(A)의 내부에 배치되는 다수의 챔버 구조물과 각 챔버 구조물 사이의 연통을 선택적으로 제어하는 밸브 구조물로 구성된다.
도 2에 도시된 것과 같이, 본 발명은, 상부판(10)과 하부판(20)에 의해 메인몸체부(A)가 밀폐되는 구조로 구현되게 된다.
이 경우, 메인몸체부(A) 내부에는, 주입되는 체액을 분리하고, 세정하여 타겟 물지를 추출하는 반응 챔버가 다수 개가 마련되게 된다.
우선, 주입구(1)는 본 발명의 중심부(P1)에 가장 인접하여 형성되게 되며, 상기 주입구를 중심으로, 바깥 방향으로 체액에 대한 분리 기능을 수행하는 챔버부가 순차로 배치될 수 있도록 한다.
도 2 및 도 2의 상부 평면을 도시한 도 4의 구조를 참조하여 각 구성의 배치관계를 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서 적용되는 다양한 분석 대상 체액은 사람이 전혈, 땀, 또는 기타의 시료 등이 적용될 수 있으나, 본 발명의 바람직한 일례로서 대상 체액을 사람의 전혈을 적용하고, 제1분리물질은 혈장(plasma), 타겟성분을 세포유래핵산(cell free DNA; cfDNA)인 것을 바람직한 실시예로하여 설명하기로 한다.
본 발명에 따른 카드리지의 추출모듈의 구성과, 각 구성간의 작용관계를 이하에서 설명한다.
본 발명의 추출모듈(B)은, 메인몸체부(A1) 내부에 배치되며, 주입되는 체액을 원심분리하여 분리 및 반응챔버를 구비하여 타겟성분을 추출하는 기능을 수행하게 된다.
구체적으로, 상기 추출모듈(B)은 상기 메인몸체부의 중심부(P1)에서 순차적으로 멀어지는 위치에, 아래의 다수의 챔버부가 순차적으로 배치되게 된다.
이를 위해, 상기 추출모듈(B)은 주입되는 체액시료에서 타겟성분을 포함하는 제1분리물질을 분리하여 보관하는 제1챔버부(110)와, 원심력에 의해 제1분리물질을 유입받고, 세포를 용해하여 타겟성분과 제2분리물질로 분리하는 제2챔버부(120), 상기 제2챔버부에서, 용해된 타겟성분을 유입받아, 마그네틱 비드와 타겟성분이 반응하도록 하여 타겟성분을 분리하는 제3챔버부(130), 상기 제3챔버부에서 유입되는 타겟물질을 저장하는 제4챔버부(140)를 포함하여 구성될 수 있다.
상기 추출모듈(B)은, 도 4에서와 같이, 중심부(P1)에서 외부 방향으로, 상기 제1챔버부(110), 제2챔버부(120), 제3챔버부(130) 및 제4챔버부(140)이 순차적으로 배치되게 된다. 이러한 배치는 원심력에 따른 분리 물질의 원활한 이송을 확보하기 위함이다.
즉, 제1챔버부(110), 제2챔버부(120), 제3챔버부(130) 및 제4챔버부(140) 들간의 상호 연통하는 챔버부간 물질이동은, 밸브의 개폐에 따라 유로를 개방하여 선택적으로 이동하며, 상기 카트리지 몸체(A)의 회전에 따른 원심력에 의해 구현되게 된다.
이들 챔버부의 구성의 작용을 설명하면, 우선, 주입구(1)는, 체액(전혈)이 주입되는 곳으로, 본 발명이 원심분리 동작을 수행하여 분리하는 체액이 최초로 주입되는 부분이다.
상기 주입구(1)에 인접하여, 원심분리에 의해 분리된 전혈의 성분중, 혈장(plasma)은 제1챔버부(110)에 보관되게 되며, 원심분리에서 분리된 성분 중 버피코트(buffy caot)를 인접챔버(115)로 이동시켜 보관하게 된다. 즉, 타겟성분이 들어가는 메인 물질은 제1챔버(110)에 저장하고, 그외 성분은 인접챔버(115)로 분리 보관하게 된다.
상기 제1챔버(110)에 바깥쪽에 배치되는 제2챔버(120)는 상기 제1챔버(110)와 밸브(19)에 의해 선택적으로 연통하게 되며, 원심분리 과정에서, 밸브 여닫이 조절과 원심력에 의해 혈장이 제2챔버(120)로 이동할 수 있도록 한다.
상기 제2챔버(120)는 주입되는 세포 용해에 필요한 용해물질을 주입받아, 혈장내의 세포를 융해(cell lysis)하는 기능을 수행한다. 상기 제2챔버(120)에 주입되는 용해물질은, 일예로 Protease K 용액일 수 있으며, 이는 용해물질 주입구(6)을 통해 주입되며, 밸브(21)의 개폐동작과 원심력에 의해 제2챔버(120)로 이동하게 된다. 일예로 이러한 세포융해가 완전히 이루어지도록, 원심분리장치에서는 180도 불원전 원심분리를 수행할 수 있다.
상기 제3챔버(130)는 상기 제2챔버(120)의 바깥쪽에 인접하여 배치된다. 상기 제2챔버(120)에서 용해된 혈장(plasma)이 밸브(22)의 개폐동작과 원심력에 의해 제3챔버(130)로 이동하게 되면, 제3챔버(130)에서는 구비되는 마그네틱 비드(magnetic bead)와 반응을 통해 세포유래핵산(cf DNA)이 반응하게 된다. 즉, 제3챔버 내에서는, 마그네틱 비드(magnetic bead)과 용해된 혈장내의 세포유래핵산(cfDNA)가 결합하게 되며, 일예로 이러한 결합이 효율적으로 구현되기 위해서, 원심분리 장치 내에서 180도 불완전 원심분리를 하여 결합반응을 높일 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
이 경우, 본 발명에서는, 제3챔버내에 존재하는 혈장 내 존재하는 불순물을 제거하기 위한 세척과정을 수행할 수 있도록 한다. 이를 위해, 본 발명은, 상기 메인몸체부(A1)의 내부에 배치되며, 상기 제3챔버부(130)와 연통하여 세척액을 공급하는 적어도 하나 이상의 세척액 공급챔버(160)를 더 포함하여 구성될 수 있도록 한다.
즉, 도 4에 도시된 구조와 같이, 본 발명의 세척액 공급챔버(160)는 제3챔버(130) 내에서 수행되는 마그네틱 비드로 유입되는 혈장의 반응 전후, 혈장내 존재하는 불순물을 제거하기 위한 세척을 수행하기 위한 세척액을 공급할 수 있도록 한다.
도 4에 도시된 구조와 같이, 상기 세척액공급챔버(160)는 총 4개의 세척액챔버(161, 162, 163, 164)가 구비되어, 총4회의 세척액을 공급하여 4회의 세척과정을 수행할 수 있도록 한다. 이때 필요한 세척액은 원심분리 작업 전에 사전에 주입하여 충진하고, 원심분리가 시작되면, 원심력과 밸브(24,25,26,27)의 개폐동작과 원심력에 의해 제3챔버로 순차적으로 세척액이 이동하여 불순물을 제거하게 된다. 제거된 불순물은, 불순물저장챔버(D)로 밸브(23)의 개폐동작과 원심력에 의해 이동하게 된다.
이후, 상기 제3챔버(130) 내에서 마그네틱 비드(magnetic bead)와 결합한 세포유래핵산(cfDNA)는 추출버퍼(elution buffer) 용액과 결합하여 용해되게 된다. 이러한 추출버퍼 용액은, 추출버퍼 용액 주입구(13) 통해서 주입되게 되며, 밸브(28)의 개폐동작과 원심력에 의해 상기 제3챔버로 주입되게 되어, 마그네틱 비드(magnetic bead)와 결합한 세포유래핵산을 용해시키게 된다.
추출버퍼용액에 용해된 세포유래핵산(cfDNA)은 원심력과 밸브(29)의 개폐동작에 의해 상기 제3챔버(130)의 바깥쪽에 배치되는 제4챔버(140)으로 유입되게 된다. 세포유래핵산을 보관하는 기능을 수행하는 제4챔버(140)는 타겟성분인 세포유래핵산(cfDNA) 용액을 원심력과 밸브(30)의 개폐동작에 의해 미터링 챔버(150)으로 이동하게 된다. 일예로, 이러한 경우 적용하는 원심력은 1000rpm(1초당1rpm 속도로 원심력 증가 감속 설정)을 1분간 유지할 수 있도록 한다.
이 경우, 제3챔버(130) 내에 소량의 세포유래핵산(cfDNA) 용액이 잔류하여 남는 것을 방지하기 위해서, 본 발명의 제3챔버(130)의 바닥면은, 인접하여 배치되는 제4챔버부(140)가 위치한 외부 방향으로 기울어진 제3경사도(θ3)를 갖도록 한다. 이 경우, 제3경사도(θ3)는 바닥면의 수평면을 기준으로 3°~ 5°의 범위를 가지는 것이 바람직하다. 상술한 범위의 각도를 초과하는 경우에는, 원심력에 따라 타겟물질이 경사도를 따라 유동하는 힘이 커져 안정성을 구현하기 어려우며, 3°(3도) 미만의 기울기 에서는, 잔류하는 타겟성분이 남아 원하는 효과를 구현하기 어렵게 된다.
상기 미터링챔버(150)는 세포유래핵산(cfDNA)의 유입되는 양과 분배되는 양을 정량화하여 공급하는 기능을 수행하는 것으로, 미터링챔버(150)로 이동한 세포유래핵산(cfDNA)은 인접하는 PCR 모듈(C)의 튜브체(T) 중 제1튜브군(Ta)로 정량화한 시료로 주입이 이루어지게 된다. 일예로, 동일한 양의 제1튜브군(Ta)로 이동하기 위해서는 원심력은 2000rpm(1초당 1rpm속도로 원심력 증가, 감속 설정) 1분으로 설정하여 진행할 수 있도록 한다.
상술한 것과 같이, 추출모듈(B)를 구성하는 다수의 챔버와, 상술한 튜브군은 원심력과 인접하는 챔버 사이를 연통시키는 미세유로를 개폐하는 밸브의 동작으로 유체의 이동이 이루어지게 된다. 이에, 도 4에 도시된 것과 같이, 본 발명의 상기 제1챔버부(110), 제2챔버부(120), 제3챔버부(130), 제4챔버부(140) 및 제1튜브군 중 상호 연통하는 구조간의 물질이동은, 밸브의 개폐에 따라 유로를 개방하여 선택적으로 이동하며, 상기 몸체부(A)의 회전에 따른 원심력에 의해 구현되도록 한다.
도 6은 제3챔버(130)에서 추출분리된 타겟성분을 미터링챔버(150)을 통해 공급되는 타겟성분인 세포유래핵산(cfDNA)을 유입받아 PCR 반응을 구현하는 PCR모듈의 구조를 설명하기 위한 도 4에서 A-A' 부분의 단면도를 도시한 것이다.
도 2, 도 4, 도 6을 참조하여, 본 발명의 PCR모듈(C)은, 디스크 형상의 메인몸체부(A1)의 외측면에서 연장되어 상기 제1두께(t1) 보다 얇은 2두께(t2)로 형성되는 보조몸체부(A2)에 구현되도록 한다.
특히, 도 2에 도시된 것과 같이, 상기 PCR 모듈(C)은, 상기 추출모듈(B)의 타켓성분을 보관하는 제4챔버(140)와 연통하는 연결유로가 형성되며, 상기 몸체부의 두께 보다 얇은 두께를 가지는 반응플레이트(210, 220)로 구성된다. 상기 반응플레이트(210, 220)는, 상판(10)의 외측면에 연결경계부(W)에서 연장되는 제1평판부(210)와 제1평판부(220)으로 나뉘어져 상호 대응되게 합체되는 구조로 구현된다.
상기 반응플레이트(210,220)의 제1평판부(210) 상부면에는 다수의 개구부를 구비되며, 상기 개구부의 하부로 연장되는 구조인 밀폐형 튜브구조체를 구비하는 반응튜브군(T)이 마련되는 구조로 구현된다.
즉, 본 발명의 PCR모듈(C)은 전체적인 단면이 반원형태를 가지는 메인몸체부(A1)과, 상기 반원형태의 메인몸체부(A1)의 외측면의 경계부에서 연장되어, 평판형상의 반응플레이트 구조물에 반응튜브가 구현되는 모듈이 연계되는 보조몸체부(A2)가 결합되는 구조로 구현되게 된다.
또한, 메인몸체부(A1)는, 상판(10)과 하판(30), 중심부 몸체(20)가 일정한 두께(t1)을 가지고 형성되는 밀폐형 입체구조로 구현되며, 보조몸체부(A2)는 이러한 입체구조물에서 독립적으로 외부 방향으로 돌출되는 구조로 형성되게 된다.
이러한 구조는, 상기 메인몸체부(A1)에서 전혈를 주입하여 원심분리에 따른 세포용해 및 분리과정을 거쳐서, 타겟성분은 세포유래핵산(cfDNA)을 추출하는 과정이 수행되게 되는 것과, 타겟성분은 세포유래핵산(cfDNA)이 PCR 반응을 하기 위해 유입되어 PCR 반응을 수행하는 장소가 분리되게 된다.
PCR 반응을 수행하기 위해서는, 통상, 중합효소 연쇄반응(PCR(polymerase chain reaction)의 경우, PCR 과정에 필요한 온도 조절과정을 열변성(denaturation) 과정에 필요한 온도(ex: 95℃)와 결합과정(annealing)에 필요한 정확한 온도(ex: 55℃)를 반응 대상물에 인가하는 과정이 필수적이며, 이 경우 PCR 과정에 필요한 온도 조절과정을 열변성(denaturation) 과정에 필요한 온도와 결합과정(annealing)에 필요한 정확한 온도를 반응 대상물에 최소한의 시간으로 구현하는 것이 매우 중요하다.
이러한 온도조절을 위해서는 외부에 열원을 반응대상물에 인가하는 장치를 구비하여 진행되게 되며, 이 경우, PCT 반응을 수행하기 위한 타겟성분(이를테면 반응튜브 내의 세포유래핵산)이 수용되는 튜브구조물이 상술한 메인몸체부(A1) 내부에 매립형 구조로 장착시키는 구조로 구현하는 것도 고려할 수 있다. 그러나 이러한 구조는, 열원의 전달이 메인몸체부(A1)를 경유하여 전달하게 되어 열확산이 일어나게 되며, 인접하는 다양한 반응챔버들에도 열적 영향을 끼치게 되어, 정확한 추출효과를 저해하게 되며, PCR 반응의 신뢰성이 떨어지게 된다.
그러나, 본원 발명의 경우, PCT 반응을 수행하기 위한 타겟성분(이를테면 반응튜브 내의 세포유래핵산)이 수용되는 튜브구조물을 타겟성분의 추출과정을 수행하는 메인몸체부(A1)와 분리하여 외부에 연결되는 독립적인 구조로 구현하게 되어, 해당 연장되어 외부에 돌출되는 구조로 구현되는 보조몸체부(A2)에 온도조절 등을 구현하게 되는바, 추출반응 구성들에 열적 영향을 일소할 수 있게 된다.
또한, 도 2 및 도 6에서와 같이, 본 발명에서의 PCR 모듈(C)은, 반응플레이트(210,220) 상면에 다수의 개구부를 구비하며, 상기 개구부의 하부로 연장되는 구조인 밀폐형 튜브구조체를 구비하는 반응튜브군(T)을 구비한다.
상기 반응튜브군(T)은, 상기 추출모듈에서 추출된 타겟물질이 수용되는 제1튜브군(Ta)을 구현하고, 상기 제1튜브균(Tb)의 인접하는 위치의 양쪽에 상기 제1튜브군과 이격되며, 상기 추출모듈과 연통하지 않는 구조로 배치되는 적어도 하나 이상의 제2튜브군(Tb1, Tb2)을 각각 배치되는 구조로 구현할 수 있다.
상기 상기 제1튜브균(Tb)을 실험군으로 하는 경우, 제2튜브군(Tb1, Tb2)은 각각 대조군으로 설정(음성대조군, 양성대조군)하여 동시에 실험을 진행할 수 있도록 할 수 있다.
특히, 이 경우, 상기 반응튜브군(T)은, 개구부에서 하부방향으로 점진적으로 폭이 좁아지는 구조로 구현되며, 반응튜브의 일측면과 타측면이 상기 몸체부의 수직방향(Y)과 서로 다른 경사도를 가지도록 형성하는 것이 바람직하다.
즉, 도 6에서와 같이, 하부 방향으로 연장되는 튜브체의 형상은, 몸체부의 중심부(P1)에 인접한 상기 일측면(T1)의 제1경사도(θ1)가 상기 타측면(T2)의 제2경사도(θ2) 보다 작게 형성되도록 구현할 수 있다. 이는, 본 발명에 따른 캐트리지의 원심력은 중심부(P1)의 방향에서 반대 방향으로 형성이 되게 되며, 이에, 경사도를 일측면(T1)을 30°~ 60°의 제1경사도(θ1) 범위를 가지도록 형성하고, 타측면(T2)는 제1경사도(θ1)보다 큰 70°~ 90°의 범위를 가지도록 형성하여, 반응물이 원심력에 의해 자연스럽게 이동하며, 반응튜브의 바닥 부분에 효율적으로 모일 수 있게 되는 장점이 구현되게 된다. 도 7에서는 본 발명에서의 바람직한 예로, 제1경사도(θ1)를 45°로 구현하고, 제2경사도(θ2)는 90°로 구현하였다.
도 7은 도 6에서 도시한 요부의 입체개념도를 도시한 것이다.
도 6 및 도 7을 참조하면, 도 6은, 도 4의 A-A' 단면도를 도시한 것이고, 도 8은 이러한 단면을 기준으로 도 6에 관련한 구성의 입체 개념도를 도시한 것이다.
도시된 것과 같이, 본 발명의 추출모듈(B)은 메인몸체부의 중심부(P1)을 기준으로, 제1챔버부(110), 제2챔버부(120), 제3챔버부(130)이 순차로 형성되는 구조이며, 특히, 이 경우, 상기 제3챔버부(130)는, 바닥면이 상기 제4챔버부(140)가 위치한 외부 방향으로 기울어진 제3경사도(θ3)를 갖도록 형성될 수 있도록 한다. 이는, 이 경우, 제3경사도(θ3)는 바닥면의 수평면을 기준으로 3°~ 5°의 범위를 가지는 것이 바람직하다. 상술한 범위의 각도를 초과하는 경우에는, 원심력에 따라 타겟물질이 경사도를 따라 유동하는 힘이 커져 안정성을 구현하기 어려우며, 3° 미만의 기울기 에서는, 잔류하는 타겟성분이 남아 원하는 효과를 구현하기 어렵게 된다.
또한, 상기 제3챔버부(130)는, 바닥면의 양측에 측벽부(132, 134) 중 적어도 어느 하나가, 상기 중심부(P1)가 위치한 방향으로 기울어진 제4경사도(θ4)를 구비하도록 하는 역경사구조를 형성할 수 있도록 한다. 이러한 역경사 구조의 제4경사도(θ4)는 도 6에서와 같이, 측벽부의 연장선과 챔버부의 상부면이 형성하는 각도로 정의하되, 70°~ 80°의 범위를 구비하도록 형성할 수 있다. 이는, 본 발명은 대용량 시료를 사용하는 경우에 적용될 수 있으며, 그에 따라, 각 챔버의 용량이 커서, 챔버 내에서 시료의 loss가 많이 발생될 우려가 커지게 된다. 이에, 반응 챔버인 제3챔버 측벽의 (하측방향)역경사 구조로 구현하게 되면, 챔버안의 시료가 측벽에 붙어 시료 손실이 일어나지 않도록 방지하는 기능을 구현하게 된다.
[참고 실험예 1]
서울아산병원에서, 폐암환자 120명을 대상으로, 해당 환자의 임상혈액을 채취하고, 세포내유래핵산(cfDNA) 내에 존재하는 표피생장인자수용체((Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) 변이를 검출하는 테스트를 진행하여 다음과 같은 결과를 도출하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2022016647-appb-img-000001
위 표의 결과를 살펴보면, 본 발명에 의해서 개발된 All-in-one 카트리지를 사용한 세포내유래핵산(cfDNA)내에 존재하는 EFGR 변이 검출결과 민감도와 특이도 모두 타사의 제품과 비교하여 우수한 성능을 보였다. 타사의 제품은 특이도에 비하여 민감도가 현저히 떨어지는 결과를 보이고 있음을 확인할 수 있다.
[참조 실험예 2]
도 8은 위 실험예 1에서, 무작위로 선정한 환자의 전혈 동일 샘플에 대하여, 세포내 유래핵산(cfDNA)의 추출농도를 기존 종래의 일반(manual)방식으로 출한 것과 비교한 것이다.
{표 2}
Figure PCTKR2022016647-appb-img-000002
본 발명의 실시예에 따른 카트리지를 이용하여 분리한 세포내 유래핵산(cfDNA)이 농도는 평균적으로 각각 596pg/ul, 691pg/ul 측정되었으며, 기존의 manual 방식으로 세포내유래핵산(cfDNA) 농도는 439pg/ul로 측정되었다.
위의 결과는 본 발명에 의해서 개발된 올인원(All-in-one) 카트리지의 세포내유래핵산(cfDNA) 정제 효율이 더 우수한 것을 확인하였다.
이상에서와 같이 본 발명의 기술적 사상은 바람직한 실시예에서 구체적으로 기술되었으나, 상기한 바람직한 실시예는 그 설명을 위한 것이며, 그 제한을 위한 것이 아니다. 이처럼 이 기술 분야의 통상의 전문가라면 본 발명의 기술 사상의 범위 내에서 본 발명의 실시예의 결합을 통해 다양한 실시예들이 가능함을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (15)

  1. 구동부로부터 동력을 전달받아 회전가능한 일정한 제1두께(t1)를 구비하는 디스크 형상의 메인몸체부(A1)와,
    상기 메인몸체부(A)의 외측면에서 연장되어 상기 제1두께(t1) 보다 얇은 2두께(t2)로 형성되는 보조몸체부(A2)로 구성되는 카트리지 몸체(A);
    상기 메인몸체부(A1) 내부에 배치되며, 주입되는 체액을 원심분리하여 분리하는 분리챔버 및 반응챔버를 구비하여 타겟성분을 추출하는 추출모듈(B);
    상기 보조몸체부(A2)에 배치되어, 상기 추출모듈(B)에서 원심력에 의해 선택적으로 유입되는 타켓성분을 수용하는 튜브구조체를 구비하여, PCR반응을 구현하는 PCR모듈(C);
    상기 몸체부와 PCR모듈은 연결경계를 기준으로 상호 독립적으로 형성되며, 상기 연결경계를 경유하는 유로로 상호 연통하는 구조인,
    미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 PCR 모듈(C)은,
    상기 추출모듈(B)의 타켓성분을 보관하는 제4챔버(140)와 연통하는 연결유로가 형성되며, 상기 몸체부의 두께 보다 얇은 두께를 가지는 반응플레이트(210, 220);
    상기 반응플레이트(210,220) 상면에 다수의 개구부를 구비하며, 상기 개구부의 하부로 연장되는 구조인 밀폐형 튜브구조체를 구비하는 반응튜브군(T);
    을 포함하는,
    미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 반응튜브군(T)은,
    개구부에서 하부방향으로 점진적으로 폭이 좁아지는 구조로 구현되며,
    반응튜브의 일측면과 타측면이 상기 몸체부의 수직방향(Y)과 서로 다른 경사도를 가지도록 형성되는,
    미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 경사도는,
    상기 몸체부의 중심부(P1)에 인접한 상기 일측면(T1)의 제1경사도(θ1)가 상기 타측면(T2)의 제2경사도(θ2) 보다 작게 형성되는,
    미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 제1경사도는,
    상기 수직방향(Y)의 가상의 직선성분과 상기 일측면이 이루는 제1경사도(θ1)는 30~60도의 범위로 구현되는,
    미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 반응튜브군(T)은,
    상기 추출모듈에서 추출된 타겟물질이 수용되는 제1튜브군(Ta);
    상기 제1튜브군과 이격되며, 상기 추출모듈과 연통하지 않는 구조로 배치되는 적어도 하나 이상의 제2튜브군(Tb1, Tb2);
    을 포함하는,
    미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
  7. 청구항 2에 있어서,
    상기 추출모듈(B)은,
    상기 메인몸체부의 중심부(P1)에서 순차적으로 멀어지는 위치에,
    주입되는 체액시료에서 타겟성분을 포함하는 제1분리물질을 분리하여 보관하는 제1챔버부(110);
    원심력에 의해 제1분리물질을 유입받고, 세포를 용해하여 타겟성분과 제2분리물질로 분리하는 제2챔버부(120);
    상기 제2챔버부에서, 용해된 타겟성분을 유입받아, 마그네틱 비드와 타겟성분이 반응하도록 하여 타겟성분을 분리하는 제3챔버부(130);
    상기 제3챔버부에서 유입되는 타겟물질을 저장하는 제4챔버부(140);
    를 포함하는,
    미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 제3챔버부(130)는,
    바닥면이 상기 제4챔버부(140)가 위치한 외부 방향으로 기울어진 제3경사도(θ3)를 갖도록 형성되는,
    미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 제3챔버부는,
    바닥면의 양측에 측벽부가, 상기 중심부가 위치한 방향으로 기울어진 제4경사도(θ4)를 갖도록 형성되는,
    미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 제3챔버부(130)와 상기 제1튜브군(Ta) 사이에 타겟물질의 정량적인 공급을 제어하는 미터링챔버(150);
    를 더 포함하는,
    미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
  11. 청구항 7에 있어서,
    상기 제1챔버부, 제2챔버부, 제3챔버부 및 제1튜브군 중 상호 연통하는 구조간의 물질이동은,
    밸브의 개폐에 따라 유로를 개방하여 선택적으로 이동하며, 상기 몸체부(A)의 회전에 따른 원심력에 의해 구현되는,
    미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 메인몸체부(A1)의 내부에 배치되며,
    상기 제3챔버부(130)와 연통하여 세척액을 공급하는 적어도 하나 이상의 세척액 공급챔버(160);를 더 포함하는,
    미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 몸체부의 내부 및 상기 세척액 공급챔버 외부에 배치되며,
    상기 제2챔버부(120)에서 배출되는 배출물질을 수용저장하는, 불순물저장챔버(D);를 더 포함하는,
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 체액은 전혈이며, 제1분리물질은 혈장, 타켓성분은 세포유래핵산(cell free DNA; cfDNA)인,
    미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지.
  15. 청구항 1에 따른 분리 및 분석 카트리지를 적용하는 미세유체 분리분석장치.
PCT/KR2022/016647 2022-10-27 2022-10-28 미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지 WO2024090620A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2022-0139832 2022-10-27
KR1020220139832A KR20240059057A (ko) 2022-10-27 2022-10-27 미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024090620A1 true WO2024090620A1 (ko) 2024-05-02

Family

ID=90831086

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/016647 WO2024090620A1 (ko) 2022-10-27 2022-10-28 미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20240059057A (ko)
WO (1) WO2024090620A1 (ko)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002505866A (ja) * 1998-03-10 2002-02-26 ラージ・スケール・プローティオーミックス・コーポレイション 微生物の検出および特性付与
KR101228308B1 (ko) * 2007-05-23 2013-01-31 삼성전자주식회사 미세유동 칩을 이용한 디스크형 미세유동장치 및 생체물질마이크로어레이 칩을 이용한 디스크형 미세유동장치
KR20210138640A (ko) * 2019-03-12 2021-11-19 노비럭스 엘엘씨 현장 진단 농도 분석기
KR20220009548A (ko) * 2020-07-16 2022-01-25 주식회사 에이아이바이오틱스 올인원 rt-pcr 장치
WO2022033822A1 (de) * 2020-08-14 2022-02-17 SpinDiag GmbH Verfahren zum betrieb eines analysegeräts, verwendung einer kartusche und analysegerät

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102063865B1 (ko) 2018-06-20 2020-01-08 울산과학기술원 원심력 기반 혈소판 분리 및 검진 장치

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002505866A (ja) * 1998-03-10 2002-02-26 ラージ・スケール・プローティオーミックス・コーポレイション 微生物の検出および特性付与
KR101228308B1 (ko) * 2007-05-23 2013-01-31 삼성전자주식회사 미세유동 칩을 이용한 디스크형 미세유동장치 및 생체물질마이크로어레이 칩을 이용한 디스크형 미세유동장치
KR20210138640A (ko) * 2019-03-12 2021-11-19 노비럭스 엘엘씨 현장 진단 농도 분석기
KR20220009548A (ko) * 2020-07-16 2022-01-25 주식회사 에이아이바이오틱스 올인원 rt-pcr 장치
WO2022033822A1 (de) * 2020-08-14 2022-02-17 SpinDiag GmbH Verfahren zum betrieb eines analysegeräts, verwendung einer kartusche und analysegerät

Also Published As

Publication number Publication date
KR20240059057A (ko) 2024-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019132406A1 (ko) 카트리지를 이용한 핵산 추출 방법
US9513196B2 (en) Methods and systems for microfluidic DNA sample preparation
EP1771786B1 (en) Sample multiprocessing
US20070105213A1 (en) Fluid manipulation assembly
EP3563151A1 (en) Digital microfluidic devices and methods
NO744440L (ko)
WO2019132546A1 (ko) 핵산 추출용 카트리지
KR102486349B1 (ko) 기체 이동 통로와 추출액 이동 통로를 갖는 증폭 모듈
WO2019132405A1 (ko) 핵산 추출용 카트리지의 유로 구조
EP4112174A1 (en) Genome extraction device including flow cover
WO2017118128A1 (zh) 多种血清标志物综合检测设备
WO2021025233A1 (ko) 미세 유체 제어를 위한 진단용 카트리지 및 이를 포함하는 현장형 분자진단 시스템
WO2024090620A1 (ko) 미세유체 분리 및 분석용 통합카트리지
WO2022234897A1 (ko) Rt-pcr 측정용 인터페이스 모듈 및 이를 포함하는 회전형 rt-pcr 디바이스
EP4112172A1 (en) Genome extraction device of dual chamber structure in which outer chamber and inner chamber are combined with each other
CN114182000A (zh) 一种基于crispr技术的一体化核酸检测芯片及方法
KR101780429B1 (ko) 정량주입 가능한 바이오칩
EP4134164B1 (en) Genome extraction device including safety clip combined with inner chamber
EP4112175B1 (en) Genome extraction device of dual chamber structure in which outer chamber and bead chamber are combined with each other
WO2022055049A1 (ko) 반응효율이 향상된 휴대용 실시간 유전자 분석시스템 및 이에 사용되는 그라인딩유닛
KR101512161B1 (ko) 핵산 분석 장치용 카트리지
WO2024117301A1 (ko) 유전자 추출 및 검출용 카트리지
WO2023163561A1 (ko) 원심분리장치용 카트리지
WO2020166980A2 (ko) 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩
KR20210043207A (ko) 비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치 및 방법