KR20210043207A - 비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제1 관로를 통해 환자로부터 혈액을 배출하고 일 방향으로 이동시키는 배출부; 제1 관로의 일 측에 연결된 미세유체루프를 이용하여 혈액내에 포함된 복수의 세포 성분을 분리하는 분리부; 미세유체루프에 의해 분리된 세포 성분별로 분류하여 회수하는 복수의 샘플 튜브; 및 복수의 샘플 튜브에 회수된 세포 성분을 선택적으로 결합하여 제2 관로를 통해 환자에게 주입하는 주입부를 포함하도록 구성된, 비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치를 제공한다.

Description

비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치 및 방법{AN APPARATUS AND METHOD FOR SEPARATING CIRCULATIONG TUMOR CELLS IN AN UNBIASED AND CONTINUOUS MANNER}
본 발명은 비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치 및 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 많은 양의 샘플을 고순도 분리할 수 있는 순환종양세포 연속 분리 방법에 관한 것이다.
암 환자의 90% 이상은 암의 국소 재발 또는 전이(metastasis)에 의해 사망하게 된다. 즉, 암의 전이 정도는 궁극적으로 암환자의 치료 예후를 결정하기 때문에 암 환자의 생존 확률에 대한 중요한 요소이다. 따라서, 종양의 조기 발견 및 종양의 성장을 모니터링하는 것은 암 환자의 성공적인 치료에 매우 중요한 요소로 여겨진다.
여러가지 종양 모니터링 기술 중 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 검출은 암 환자의 말초혈액 내에서 순환하는 암 세포를 검출하는 기술로서 잘 알려져 있다. 순환종양세포는 암의 발생지점으로부터 떨어져 나와 혈관 내로 침입한 후 혈류와 함께 순환하면서 다른 조직에 침투해 암을 전이시킨다. 따라서, 순환종양세포를 검출하게 되면 암의 조기 진단 및 향후 전이 가능성 등을 예측할 수 있게 된다.
CTC를 검출하기 위한 대표적인 기술로, 항원/항체 반응을 이용한 종래 기술이 있었다. 그러나, CTC는 단일 세포가 아닌 서로 다른 여러 세포 성분(예를 들면, DNA, RNA, 단백질, 대사물)들로 이루어져 있는 이질성(heterogeneity)을 갖고 있기 때문에 항원/항체 반응을 활용한 종래 기술로는 검사가 어려웠다. 구체적으로, CTC가 떨어져 나온 암의 종류(일차 종양, 림프절, 전이 부위), 이동 방식(단일 세포 이동 또는 군집 형태의 이동) 또는 전이 능력에 따라 CTC는 상당한 이질성을 갖으며, 이에, 크기, 형태 및 유전적 종류가 매우 다양하고 불규칙하게 형성될 수 있다. 이러한 CTC의 이질성으로 인하여 항원/항체 반응만으로 검사를 할 경우에는 특정 유전자를 가진 암만을 편향적으로 검출하게 된다.
또 다른 종래 기술인 미세유체(microfluidics) 기술 기반 장치는 인체 내의 5L 정도의 전체 혈액 중 10ml 이하를 채혈하여 미세유체루프를 구비하는 분리기에 주입하여 암세포의 물리적 특성을 이용하여 분리하게 된다. 예를 들면, 미세유체 기술 기반 장치는 랩온어디스크(Lab-on-a-disk) 형태일 수 있고, 암세포의 물리적 특성은 크기, 밀도, 유전율 등을 의미하는 것일 수 있다. 그러나, CTC는 혈액 내에 극소량으로 존재하기 때문에 샘플량이 10ml 정도인 경우에는 1회의 측정으로 암세포의 존재 여부를 정확하게 판별하는 것이 매우 어려웠다.
따라서, 종래 기술 대비 샘플량을 증가시켜 정확도가 높으면서도 CTC의 유전적 이질성을 극복하기 위하여 비편향적으로 검사가 가능한 순환종양세포 분리 기술이 매우 절실하게 요청되고 있다.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위해 비편향적 순환종양세포 연속 분리 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 많은 양의 샘플을 비편향적으로 고순도 분리할 수 있는 비편향적 순환종양세포 연속 분리 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 암 전이의 원인인 순환종양세포(CTC, Circulating Tumor Cell)를 비롯한 면역세포(Immune cell), 줄기세포(Stem cell)까지 분리할 수 있는 비편향적 순환종양세포 연속 분리 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 현재 10ml의 채혈된 혈액에 불과한 검사 샘플량을 10ml~100ml의 양으로 증대시키고 100개 이상의 CTC 세포를 검출함으로써, 기존의 혈중순환DNA(cfDNA: Circulating free DNA) 중 순환종양DNA(ctDNA: Circulating tumor DNA) 검사방법 동등이상 수준의 검사 신뢰성을 확보하는 것이다.
마지막으로, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 새로운 배양세포(Cell line) 및 신약 개발이 가능한 통합 자동화 플랫폼을 구축하기 위하여 가장 중요한 기술인 새로운 비편향적 순환종양세포 연속 분리 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 실시예에 따른 비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치는 환자로부터 혈액을 배출하고 일 방향으로 이동시키는 제1 관로; 상기 제1 관로의 일 측에 연결된 미세유체루프를 이용하여 상기 혈액 내에 포함된 복수의 세포 성분을 분리하는 분리부; 상기 미세유체루프에 의해 분리된 상기 복수의 세포 성분 중 표적 세포를 회수하는 샘플 튜브; 및 상기 표적 세포를 제외한 나머지 세포 성분을 상기 환자에게 주입하는 제2 관로를 포함할 수 있다.
또한, 제1 관로와 미세유체루프의 사이에 위치하며 복수의 세포 성분 중 백혈구를 선택적으로 채집하는 혈액성분채집기를 더 포함할 수 있다.
또한, 혈액성분채집기는 라담보울(Latham bowl)일 수 있다.
이 경우, 상기 미세유체루프는 상기 제1 관로와 연결되며 상기 제1 관로의 일 측에 연결된 제1 펌프에 의해 펌핑된 혈액이 주입되는 주입구 및 상기 주입구와 이격되어 배치되며 상기 복수의 세포 성분을 분리하여 추출하는 추출구를 포함할 수 있다.
또한, 상기 추출구는 상기 복수의 세포 성분 중 상기 표적 세포를 분리하여 추출하는 제1 추출관 및 상기 순환종양세포를 제외한 적혈구, 혈장 및 백혈구를 분리하여 추출하는 제2 추출관을 포함할 수 있다.
또한, 상기 제2 관로는 상기 제2 추출관 및 상기 환자 사이를 연결하며, 상기 제2 관로를 통과하는 상기 적혈구, 혈장 및 백혈구의 유속을 조절하고 상기 제1 관로와의 압력 차이를 조절하는 제2 펌프와 연결될 수 있다.
또한, 상기 미세유체루프는 나선형의 형상으로 형성될 수 있다.
또한, 상기 미세유체루프 내에서 복수의 세포 성분이 일 방향으로 회전하는 경우, 상기 미세유체루프를 통과하는 상기 복수의 세포 성분 각각에는 와류가 형성되고, 상기 와류에 의해 상기 미세유체루프의 외벽을 따라 서로 상이한 세포 성분이 서로 다른 속도로 이동할 수 있다.
또한, 상기 표적 세포는 순환종양세포(circulating tumor cell), 암 세포(cancer cell), 암 줄기 세포(cancer stem cell)를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 실시예에 따른 순환종양세포 연속 분리 방법은, 환자로부터 추출한 혈액을 제1 관로를 통해 미세유체루프로 이동시키는 단계; 상기 미세유체루프를 이용하여 상기 혈액내에 포함된 복수의 세포 성분을 분리하는 단계; 상기 미세유체루프에 의해 분리된 상기 세포 성분 중 표적 세포를 회수하는 단계; 및 상기 표적 세포를 제외한 나머지 세포 성분을 제2 관로를 통해 상기 환자에게 주입하는 단계를 포함하고, 상기 미세유체루프는 나선형의 형상으로 감겨진 형상을 갖을 수 있다.
이 경우, 상기 제1 관로는 상기 미세유체루프의 주입구와 연결되고, 상기 제2 관로는 상기 미세유체루프의 추출구와 연결되며, 상기 제1 관로 및 상기 제2 관로에는 상기 혈액의 유속을 조절하는 펌프가 배치될 수 있다.
또한, 상기 미세유체루프 내에서 일 방향으로 회전하는 상기 복수의 세포 성분은 상기 세포 성분별로 서로 다른 속도로 이동하는 것을 이용하여 상기 세포 성분 중 순환종양세포를 분리할 수 있다.
또한, 상기 표적 세포는 순환종양세포(circulating tumor cell), 암 세포(cancer cell), 암 줄기 세포(cancer stem cell)를 포함할 수 있다.
기타 실시예의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
따라서, 본 발명에 따르면, 순환종양세포 연속 분리 시스템을 통해 많은 양의 샘플 중 암 전이의 원인인 순환종양세포(CTC, Circulating Tumor Cell)를 고순도(High-purity)로 분리할 수 있는 비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치가 제공된다.
또한, 본 발명에 따르면, 샘플량을 증가시켜 검사의 정확도를 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 높은 처리량의 순환종양세포 연속 분리 시스템의 구성요소를 설명하기 위한 개념도이다.
도 2는 도 1의 A영역에 대한 확대도이다.
도 3은 도 1의 B영역에 대한 확대도이다.
도 4는 도 1의 C영역에 대한 확대도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 순환종양세포 연속 분리 방법을 설명하기 위한 순서도이다.
도 6은 종양 그룹 별 순환종양세포의 샘플량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 샘플 양에 따른 오차 범위를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 높은 처리량의 순환종양세포 연속 분리 시스템의 구성요소를 설명하기 위한 개념도이다.
도 9는 비교예와 본 발명의 일 실시예에 따른 순환종양세포 수를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 높은 처리량의 순환종양세포 연속 분리 시스템의 구성요소를 설명하기 위한 개념도이다.
도 11은 도 10에 따른 비교예와 실시예를 비교한 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따라 염색된 CTC세포를 나타낸 예시도이다.
발명의 이점, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명의 실시예를 설명하기 위한 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 본 명세서 상에서 언급된 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우, '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.
구성요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.
본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.
본 명세서의 해석의 명확함을 위해, 이하에서는 본 명세서에서 사용되는 용어들을 정의하기로 한다.
본 명세서에서 개시된 “표적 세포”는 순환종양세포 연속 분리 장치를 사용하여 시료 내에 존재 여부 및 정량 분석을 하고자 하는 세포를 의미할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 순환종양세포(Circulating Tumor Cell, CTC), 암 줄기 세포(cancer stem cell) 또는 암 세포(cancer cell) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 본 명세서에서 표적 세포는 순환종양세포로 지칭될 수도 있다. 예를 들어, 유방암, 방광암, 자궁경부암, 담관암종, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 비인두암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 전립선암, 갑상선암, 골육종, 횡문근육종, 활막육종, 카포시육종, 평활근육종, 악성 섬유성 조직구종, 섬유육종, 성인 T세포 백혈병, 림프종, 다발 골수종, 신경교아세포종/성상세포종, 흑색종, 중피종 및 윌름스 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암 또는 종양 세포일 수 있다.
또한, 순환종양세포는 대략 109 개의 세포 중에서 1개가 발견될 정도로 그 양이 매우 적다. 예를 들어, 유방암의 경우 혈액 약 7.5ml 중에 약 5개 미만의 순환종양세포가 발견되며, 대장암의 경우, 혈액 약 7.5 ㎖ 중에 약 3개 미만의 순환종양세포가 발견될 수 있다. 따라서, 희소한 순환종양세포를 소실없이 포획하는 것이 중요하다. 또한, 순환종양세포는 쉽게 사멸되기 때문에, 순환종양세포를 파괴할 수 있는 외부 환경 요소를 최소화하여야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “시료”는 표적 세포가 존재할 수 있는 생물학적 시료를 의미할 수 있다. 예를 들면, 시료는 순환종양세포를 분리하기 위해, 혈액을 시료로써 사용할 수 있다.
이하에서는, 도 1 내지 도 5를 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 순환종양세포 연속 분리 시스템의 구성 및 이를 이용한 처리 과정을 설명하기로 한다.
도 1은 높은 처리량의 순환종양세포 연속 분리 시스템의 구성요소를 설명하기 위한 개념도이다. 도 2는 도 1의 A영역에 대한 확대도이다. 도 3은 도 1의 B영역에 대한 확대도이다. 도 4는 도 1의 C영역에 대한 확대도이다. 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 순환종양세포 연속 분리 방법을 설명하기 위한 순서도이다.
순환종양세포 연속 분리 시스템은 관성 분류(Inertial Sorting) 특성을 이용하여 환자로부터 추출된 혈액 중 순환종양세포성분을 체외에서 분리하고 나머지 세포 성분을 환자의 체내로 주입하는 시스템이다. 도 1을 참조하면, 순환종양세포 연속 분리 시스템은 기본적으로 환자와 연결된 복수의 관로(L1, L2), 미세유체루프(110), 샘플튜브(120), 제1 펌프(P2) 및 제2 펌프(P2)를 포함할 수 있다.
복수의 관로(L1, L2)는 환자의 신체 일부분(예컨대, 팔)에 삽입된 바늘에 연결되어 혈액을 추출하고, CTC 분리 과정을 거친 혈액이 주입될 수 있도록 연결해주는 관이다.
미세유체루프(110)는 혈액에 포함된 복수의 세포 성분을 딘 유동 분류(Dean Flow Fractionation, DFF)를 통해 CTC를 연속적으로 분리할 수 있는 구성이며, 미세유체루프가 나선형으로 감겨져 있는 구조를 가진다. 미세유체루프(110)는 대략 500um 정도의 두께이고, 분리된 CTC가 이동하는 미세유체루프(110)의 내측 출구(inner outlet)는 50um 정도의 두께이고, 외측 출구(outer outlet)는 약 450um 정도의 두께이다.
샘플튜브(120)는 미세유체루프(110)에 의해 분리되는 CTC를 포함한 성분을 수용하는 구성이다.
도 1 및 도 5를 참조하면, 환자로부터 추출한 혈액은 제1 관로(L1)를 통해 순환종양세포 연속 분리 장치로 이동한다(S100). 이어서, 추출한 혈액을 혈중세포 연속 분리 장치의 딘 유동 분리(Dean Flow Fractionation, DFF)를 이용하여 혈액의 순환종양세포 성분을 분리한다(S200).
보다 상세하게, 환자로부터 추출한 혈액은 제1 펌프(P1)에 의하여 제1 관로(L1)를 통해 미세유체루프(110)로 이동한다. 이때, 제1 관로(L1)는 환자의 혈관, 예컨대, 동맥 측에 직접 바늘을 삽입하여 연결될 수 있다. 미세유체루프(110)의 주입구(IP)에 연결된 제1 관로(L1)에 의해 혈액이 미세유체루프(110)로 이동한다. 이 경우 바람직하게는 10ml~100ml의 혈액을 처리하여 순환종양세포(CTC)를 분리하는 것이 바람직하다.
여기서, 제1 관로(L1)와 주입구(IP) 사이에는 제1 펌프(P1)를 구비할 수 있다. 제1 펌프(P1)는 인체로부터 채혈한 혈액이 미세유체루프(110)로 원활하게 주입되고, 또한 미세유체루프 내에서 딘 유동이 발생될 수 있도록 혈액을 펌핑(pumping)해주는 역할을 수행할 수 있다. 제1 펌프(P1)를 펌핑할 경우, 최초 혈액은 도 2에 도시된 바와 같이, 미세유체루프(110)의 외벽(Outer)과 내벽(Inner)에 고르게 분포된 상태로 미세유체루프(110)를 통과한다. 이 경우, 제1 관로(L1)와 미세유체루프(110) 사이에 설치된 제1 펌프(P1)로 가해지는 유압에 의하여 미세유체루프 내부에서 딘 유동이 발생하게 된다.
바람직하게는 미세유체루프(110) 및 제1 펌프(110)는 복수개로 설치 될 수 있다. 1개의 미세유체루프(110)는 대략적으로 1mL의 혈액을 15분 이내에 처리할 수 있다. 제1 펌프(P1)는(110)에서 딘 유동이 발생할 수 있도록 유체의 흐름을 생성할 수 있다.
이 후, 혈액은 미세유체루프(110)의 코어를 중심으로 시계 반대 방향으로 이동한다. 다시 말해, 혈액이 주입구(IP)에서 추출구(EP) 방향으로 이동함에 따라 복수의 세포 성분 각각은 딘 유동에 의하여 각각의 속도로 미세유체루프(110) 내에서 회전하면서 이동하게 된다.
도 1과 같이, 주입구(IP)는 제1 관로(L1)가 미세유체루프(110)와 만나는 지점으로 정의될 수 있다. 또한, 추출구(EP)는 미세유체루프(110)와 내측/외측의 출력이 와 샘플튜브(120) 및 제2 샘플튜브(130) 사이를 연결하는 연결관(L3)과 미세유체루프(110)가 만나는 지점으로 정의될 수 있다.
복수의 세포 성분들이 미세유체루프(110)의 내부를 통과하면서, 각각의 세포 성분들 사이에는 도 3과 같이 시계 방향으로 와류(Vortex)가 형성된다. 도 3에서는 설명의 편의를 위해 미세유체루프(110) 내의 일부 영역에 와류가 형성되는 것처럼 도시하였으나, 실질적으로는 연속적으로 와류가 형성되는 것으로 이해되는 것이 바람직하다.
이에 따라, 각각의 세포 성분들 중 순환종양세포(CTC)는 미세유체루프(110)의 내벽을 따라 이동한 다음 다시 외벽으로 이동한다. 또한, 순환종양세포(CTC)를 제외한 나머지 세포들 즉, 적혈구(X, RBC), 혈장(Y), 백혈구(WBC) 등은 미세유체루프(110)의 외벽을 따라 이동한 다음 다시 내벽으로 이동한다. 이때, 적혈구(X), 혈장(Y), 백혈구는 비교적 순환종양세포(CTC)에 비해 크기가 작고 가볍기 때문에 순환종양세포(CTC)에 대비 빠른 속도로 회전하게 된다. 도 3에 도시된 바와 같이, 미세유체루프(110)의 중간 지점에서는 적혈구(X), 혈장(Y), 백혈구는 와류에 의해 미세유체루프(110)의 내벽에 다수 존재하고, 순환종양세포(CTC)는 미세유체루프(110)의 외벽에 다수 존재할 수 있다.
미세유체루프(110)는 미세유체루프(110)의 내벽에 순환종양세포(CTC)가 위치하는 지점까지 연장되며, 그 끝점에서 미세유체루프(110)는 순환종양세포(CTC) 분리를 위해 두 갈래로 나뉘는 것을 특징으로 한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 미세유체루프(110)를 빠른 속도로 통과한 복수의 성분들은 두 갈래로 나뉜 추출구(EP)를 통해 배출될 수 있다.
이때, 미세유체루프(100)의 관 내에서 추출구(EP) 방향으로 이동하는 다양한 성분들은 제2 관로(L2) 측에 배치된 제2 펌프(P2)의 제어에 따라 이동할 수 있다. 이에 대한 상세한 설명은 도 4를 함께 참조하여 후술하기로 한다.
도 4를 참조하면, 루프영역(RA)에서 미세유체루프(110)의 외벽 측에 적혈구(X), 혈장(Y), 백혈구 등이 상당량 존재하고, 미세유체루프(110)의 내벽 측에 순환종양세포(CTC)가 대부분 존재하는 경우, 추출영역(EA)에 형성된 추출구(EP)로 분리하여 배출될 수 있다. 이는 딘 유동에 의하여 CTC 성분과 나머지 성분의 속도차이에 의하여 발생된 분리이다. 대략적으로 셀 사이즈는 CTC는 16~20um 정도이고, 다른 셀은 8~14um 정도이다.
이에 따라, 미세유체루프(110)의 외벽을 따라 회전하면서 이동하는 순환종양세포(CTC)는 도 1과 같이, 미세유체루프(110)의 외벽부분에서 연장되어 형성되는 추출구(EP) 측으로 배출되어 샘플튜브(120) 내부로 주입된다. 또한, 미세유체루프(110)의 내벽을 따라 회전하면서 이동하는 적혈구(X), 혈장(Y), 백혈구는 미세유체루프(110)의 내벽부분에서 연장되어 형성되는 추출구(EP) 측으로 배출되어 제2 샘플튜브(130) 내부로 주입된다.
이처럼, 미세유체루프(110) 내에서 원심력에 의한 각 세포 성분의 속도차이에 의해 분리된 각각의 세포 성분들은 연결관(L3)을 통해 샘플튜브(120) 또는 제2 관로(L2)로 분리되어 주입된다.
도 1에 도시된 바와 같이, 미세유체루프(110)를 통과한 CTC 성분들은 연결관(L3)을 통해 샘플튜브(120)의 내부에 수용된다.
이처럼, 본 발명의 미세유체루프(110)는 현저하게 빠른 속도로 손쉽게 각각의 세포성분들을 분리할 수 있는 효과가 있다.
이어서, 혈액으로부터 표적 세포(순환종양세포(CTC))를 선택적으로 분리한다(S300). 이어서, 표적 세포가 제거된 혈장과 나머지 세포 성분들 즉, 적혈구, 백혈구 등이 제2 관로(L2)를 통해 이동한다(S400). 이때, 제2 관로(L2)는 환자의 정맥에 바늘을 삽입하여 다시 환자의 혈관으로 CTC를 제외한 나머지 성분들이 다시 들어갈 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 샘플튜브(120)에는 미세유체루프(110)의 순환종양세포(CTC)가 검출될 수 있다. 이 경우, 미세유체루프(110)로 혈액이 원만하게 이동할 수 있도록 미세유체루프(110)의 주입구(IP) 반대측, 즉, 제2 관로(L2)에는 제2 펌프(P2)가 배치될 수 있다. 이에 따라, 제2 펌프(P2)는 미세유체루프(110)의 추출구(EP) 측에 위한 제2 관로(L2)를 통과하는 혈액의 유속을 조절할 수 있고, 제2 관로(L2) 내의 압력을 미세하게 조절할 수 있다. 예컨대, 제2 펌프(P2)에 의해 혈류의 속도를 조절할 수 있다.
도 6은 종양 그룹 별 순환종양세포의 샘플량을 나타낸 그래프이다. 도 7은 샘플 양에 따른 오차 범위를 나타낸 그래프이다. 도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 높은 처리량의 순환종양세포 연속 분리 시스템의 구성요소를 설명하기 위한 개념도이다.
도 6에 도시된 그래프는, 암세포를 가진 환자 75명의 혈액을 대상으로 동일한 양의 혈액(예를 들어, 혈액은 대략 7.5ml)을 추출하는 것으로 가정한다.
도 6과 같이, 순환종양세포(CTC)는 유방암(Breast cancer), 전립선암(GI cancer), 산부인과암(Gynecological cancer), 폐암(Lung cancer), 흑색종(melanoma), 유전암(GU Cancer), 육종(Sarcoma) 및 다른 악성종양(Other malignancies)과 같이 다양한 종양에서 검출될 수 있다.
이때, 7.5ml의 혈액 중 순환종양세포(CTC)의 샘플량은 전립선암을 가진 환자에게서 가장 많이 발견되는 것을 알 수 있다. 예컨대, 전립선암을 가진 환자의 혈액에서 100개의 순환종양세포(CTC)가 추출된다. 또한, 7.5ml의 혈액 중 순환종양세포(CTC)의 샘플량은 폐암 및 육종을 가진 환자에게서 가장 적게 발견되는 것을 알 수 있다. 예컨대, 폐암 및 육종을 가진 환자의 혈액에서 10개 미만의 CTC 샘플이 추출된다.
이처럼, 순환종양세포(CTC)는 암의 발생지점으로부터 떨어져 나와 혈관 내로 침입한 후, 혈류와 함께 순환하면서 다양한 조직에 침투해 다양한 종류의 암으로 전이시킬 수 있다. 따라서, 다양한 종양으로부터 순환종양세포(CTC)를 검출함으로써 암의 조기 진단 및 전이 가능성 예측할 수 있다.
다만, 순환종양세포(CTC)는 혈액 내에 극소량으로 존재할 뿐만 아니라, 다른 세포 성분(예를 들면, DNA, RNA, 단백질, 대상물)들에 의해 유전적 이질성(heterogeneity)을 갖기 때문에, 별도의 CTC 검출 센서는 분리되어 샘플 튜브(120)에 저장된 액체에 대하여 생물학적 또는 화학적 반응을 이용하여 CTC 포함여부를 확인하고 CTC 세포의 개수를 카운팅할 수 있다.
도 8에 도시한 바와 같은 반응부(130)는 미세유체루프(110)을 통과하여 분리된 액체에 대하여 생물학적 또는 화학적 반응을 이용하여 CTC 포함여부를 확인하고 CTC 세포의 개수를 카운팅할 수 있다. 예컨대, CTC에 해당하는 세포들은 다양한 종류, 다양한 크기를 가지며, 따라서 화학적/생물학적으로도 다양한 반응을 하게 된다. 본 발명과 같이 비편향적으로 크기 및 종류에 관계없이 수집된 CTC 세포들은 예컨대, 도 12에 도시한 바와 같이, 다양한 물질에 반응하여 염색될 수 있다. 즉, 미세유체루프(110)를 통과하여 분리된 액체는 복수의 염료와 반응하여 복수의 종류의 CTC 세포가 각기 상이한 색상으로 염색된다. 이 때, 상술한 반응부(130)는 예컨대, 염색된 CTC 세포들을 이미지 기반 접근법으로 식별 및 카운팅할 수 있다.
또는 상기 반응부(130)는 CTC 검출 센서 또는 도 8에 도시한 바와 같은 반응부(130)는 복수의 표적 물질과 반응할 수 있는 복수 개의 생체 분자를 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 복수 개의 생체 분자는 DNA, RNA, 앱타머(aptamer), 항원(antigen), 항체(antibody) 및/또는 단백질 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 이러한 방식으로 CTC 검출 센서를 활용하여 다양한 종류의 CTC 세포들을 비편향적으로 검출할 수 있다.
한편, 도 7을 참조하면, 본 발명의 미세유체루프(100)를 이용하여 환자로부터 96개의 CTC 세포를 검출한 경우, 대략 10% 정도의 오차 범위를 갖는 것을 알 수 있고, 384개의 CTC 세포를 검출한 경우, 대략 5%의 오차범위를 갖는 것을 알 수 있다. 또한, 600개의 CTC 세포를 검출한 경우, 대략 4%의 오차 범위를 갖는 것을 알 수 있고, 1,067개의 CTC 세포를 검출한 경우, 대략 3%의 오차 범위를 갖는 것을 알 수 있다. 이때, 검출하는 CTC 세포 양은 상술한 바에 제한되지 않으며, 샘플의 양을 증가시키면 시킬수록 오차 범위를 줄일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 바람직하게는 대략 10% 오차 이내로 진단을 할 수 있도록 100개 이상의 CTC를 검출할 수 있는 검출 방식을 제공할 수 있다. 한편, 이를 위하여, 본 발명의 검사 샘플량은 암의 종류에 따라 달라질 수는 있지만, 100개 이상의 CTC를 검출하기 위해 바람직하게는 10ml~100ml의 피 검사 대상 혈액을 이용하여 CTC를 분리할 수 있다.
이하에서는, 실제 혈액내 암세포를 가진 환자들을 대상으로 비교예에 따른 분리 장치와 실시예에 따른 분리장치를 이용하여 분리한 순환종양세포의 수를 비교하기로 한다.
도 9는 비교예와 본 발명의 일 실시예에 따른 순환종양세포 수를 나타낸 그래프이다.
도 9에 도시된 그래프는, 암세포를 가진 환자 4명의 혈액을 대상으로 실험한 결과값을 나타낸 그래프이다. 이때, 환자마다 동일한 양의 혈액(예를 들어, 혈액은 대략 5 내지 6ml)을 추출하는 것으로 가정한다.
환자 A, C, D는 비교예에 따른 분리 장치를 이용하여 표적 세포, 즉, 순환종양세포(CTC)를 분리한 경우이고, 환자 B는 본 발명의 실시예에 따른 분리 장치를 이용하여 순환종양세포(CTC)를 분리한 경우이다.
도 9에 도시된 바와 같이, 비교예에 따른 분리 장치를 이용하여 혈액을 분리할 경우, 각각 2개, 4개, 8개의 순환종양세포가 추출된 것을 알 수 있다. 이에 반해, 실시예에 따른 분리 장치로 분리한 경우, 대략 18개의 순환종양세포가 추출되는 것을 알 수 있다.
이하에서는 도 10 및 도 11을 참조하여 본 발명의 또다른 실시예에 따른 비편향적 순환종양세포 분리방법에 대하여 설명한다. 도 10은 환자의 동맥 등의 혈관에서 관로를 통해 바로 추출한 혈액이 미세유체루프(1100)에 주입되기 전에 혈액성분채집기(1200)를 이용하여 혈액내 플라즈마 성분과 적혈구 성분을 분리한 후 미세유체루프(1100)를 통과시켜 순환종양세포의 분리 가능성을 현저하게 높이는 방법을 나타낸다. 도 11은 도 10에 따른 비교예와 실시예를 비교한 그래프이다.
본 실시예에 따른 비편향적 순환종양세포 연속 분리 시스템은 더 많은 양의 순환종양세포(CTC) 샘플을 확보하기 위해 말초 혈액(Peripheral Blood, PB)이 아닌 진단 백혈구(Diagnostic Leukapheresis, DLA)에서 미세유체(microfluidic) 루프를 이용하여 순환종양세포(CTC)를 배양하는 시스템이다. 이 경우, 비편향적 순환종양세포 연속 분리 시스템은 미세유체루프(1100), 혈액성분채집기(1200), CTC수용부(DC) 및 하우징(1300)을 포함할 수 있다. 여기서, 혈액성분채집기(1200)는 라담보울(Latham bowl)일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 다양한 장비가 사용될 수 있다. 예를 들면, 혈액성분채집용 장비로는 펜월(Fenwal) 사(社)의 Aurora, Amicus, Alyx 또는 TerumoBCT 사(社)의 COBE Spectra, Trima, Trima Accel, Spectra Optia 또는 Fresenius Kabi 사(社)의 AS104, Com.Tec 등이 사용될 수 있다.
이 경우, 환자의 신체 일부분(예컨대, 팔)에 삽입된 바늘에 연결된 제1 관로(L1)를 이용하여 혈액을 추출한 후, 혈액성분채집기(1200)를 이용하여 혈액 성분으로부터 플라즈마(Plasma)와 적혈구(WBC)를 분리할 수 있다. 여기서, 혈액성분채집기(1200)는 예컨대, 혈액성분을 각각 분리하기 위해 원심력을 이용하여 혈액을 처리할 수 있다. 이 때, 혈액성분채집기(1200)의 제1 튜브구(H1)를 통해 혈액이 펌핑(Pumping)되어 하부 방향으로 흘러 들어가게 된다. 이때, 원심력에 의해 밀도가 높은 세포 성분인 백혈구(WBC)와 순환종양세포(CTC)는 예컨대, 혈액성분채집기(1200)의 외측 방향으로 회전하면서 외측 보울(OB)로 이동하고, 밀도가 낮은 플라즈마(Plasma)는 내측 밴드(IB)로 이동하게 된다. 이때, 외측 보울(OB)의 공간이 도 10과 같이 복수의 세포 성분들에 의해 가득차게 되면 경우, 내측 밴드(IB)에 위치한 플라즈마는 제2 튜브구(H2)를 향해 이동하고, 복수의 세포 성분 중 적혈구(RBC)는 내측 밴드(IB)에 의해 제1 튜브구(H1) 또는 제2 튜브구(H2)를 통해 펌핑되어 환자에게 재투입된다.
이에 따라, 혈액성분채집기(1200)의 원심력에 의해 혈액으로부터 플라즈마(Plasma)와 적혈구(RBC)를 분리한 후, 분리된 플라즈마(Plasma)와 적혈구(RBC)는 다시 환자의 체내로 공급해준다.
이어서, 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 높은 처리량의 순환종양세포 연속 분리 시스템은 플라즈마(Plasma)와 적혈구(RBC)가 분리된 상태에서 백혈구(WBC) 및 순환종양세포(CTC)만 포함하는 혈액을 미세유체루프(1100)로 이동시킨다.
미세유체루프(1100)는 백혈구(WBC)와 순환종양세포(CTC)를 딘 유동 분류(DFF)를 통해 연속적으로 분리하는 구성으로, 도 10에 도시된 바와 같이, 나선형으로 감겨져 있는 구조를 갖는다. 미세유체루프(1100)는 대략 500um 정도의 두께이고, 내측 출구(inner outlet)는 50um 정도의 두께이고, 외측 출구(outer outlet)는 약 450um 정도의 두께를 갖을 수 있다.
이때, 미세유체루프(1100)의 코어를 중심으로 회전하는 복수의 세포 성분 각각은 딘 유동에 의하여 각각의 속도로 미세유체루프(1100) 내에서 회전하면서 이동하게 된다.
이에 따라, 순환종양세포(CTC)는 미세유체루프(1100)의 내벽을 따라 이동한 다음 다시 외벽으로 이동한다. 또한, 순환종양세포(CTC)를 제외한 백혈구(WBC)는 미세유체루프(1100)의 외벽을 따라 이동한 다음 다시 내벽으로 이동한다.
도 10에 도시된 바와 같이, 미세유체루프(1100)에 의해 분리된 순환종양세포(CTC)는 외측 출구와 연결된 제4 관로(L4)를 통해 CTC수용부(DC)로 이동하고, 백혈구(WBC)는 내측 출구와 연결된 제5 관로(L5)를 통해 환자의 체내로 재투여된다. 한편, 제5 관로(L5)으로는 환자의 체내에 부족한 세포 성분 예를 들면, 혈장 등이 추가로 투여될 수 있다.
또한, CTC수용부(DC) 수용된 복수의 순환종양세포(CTC)는 다양한 종류를 포함한다. 예를 들면, 유방암(Breast cancer), 전립선암(GI cancer), 산부인과암(Gynecological cancer), 폐암(Lung cancer), 흑색종(melanoma), 유전암(GU Cancer), 육종(Sarcoma) 및 다른 악성종양(Other malignancies) 등과 같이 다양한 종양에서 검출되는 순환종양세포(CTC)를 포함할 수 있다.
다만, 다양한 순환종양세포(CTC)는 세포의 기능이 상실하기 전에 분리하는 것이 중요하므로, 대략 2시간 이내에 분리해야 한다.
따라서, 본 발명의 다른 실시예에 따른 높은 처리량의 순환종양세포 연속 분리 시스템은 진단 백혈구(DLA)를 미세유체(microfluidic)루프(1100)에 의해 분리한 후 순환종양세포(CTC)와 분리함으로써 종래(도 11의 비교예)에 비해 현저하게 많은 양의 순환종양세포(CTC)를 얻을 수 있는 효과가 있다.
종래에는 소량의 혈액 샘플로부터 CTC를 분리하여 검출하였다. 예컨대, 미세유체 기술 기반 장치 등의 기존 기술은 대략 5L 정도 되는 체내의 혈액 중 대략 10ml정도를 피검사혈액을 채혈하여 검사한다. 이에 비하여 미세유체루프를 구비하는 분리기에 주입하여 암세포의 물리적 특성을 이용하여 분리하게 된다.
그러나, CTC는 혈액 내에 극소량으로 존재하므로 1회의 측정으로 CTC를 정확하게 검출하는 것은 매우 어려웠다. 이에 반해, 본 발명의 실시예에 따른 혈중종양 세포 연속 분리 장치는 딘 유동 분리를 이용하여 연속적으로 혈액을 분리함으로써 많은 양의 표적 세포를 분리할 수 있는 효과가 있다.
이에 따라, 혈액에서 표적 세포를 효과적으로 분리하여 순도 높은 많은 양의 샘플을 얻을 수 있는 효과가 있다.
또한, 환자로부터 직접적으로 혈액을 추출하여 체외에서 분리하는 방식이기 때문에 기존의 채혈 과정을 생략할 수 있다. 이에 따라, 치료 시간을 효과적으로 단축할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 많은 양의 샘플을 비편향적으로 고순도 분리할 수 있는 비편향적 순환종양세포 연속 분리 방법이 제공되며, 특히, 현재 10ml의 채혈된 혈액에 불과한 검사 샘플량을 10ml~100ml의 양으로 증대시키고 100개 이상의 CTC 세포를 검출함으로써, 기존의 혈중순환DNA(cfDNA: Circulating free DNA) 중 순환종양DNA(ctDNA: Circulating tumor DNA) 검사방법 동등이상 수준의 검사 신뢰성을 확보할 수 있다.
마지막으로, 본 발명에 따르면, 새로운 배양세포(Cell line) 및 신약 개발이 가능한 통합 자동화 플랫폼을 구축하기 위하여 가장 중요한 기술인 새로운 비편향적 순환종양세포 연속 분리 방법을 제공할 수 있다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
110: 미세유체루프 120: 샘플튜브
L1,2: 제1,2 관로 L3: 연결관
P1, P2: 펌프

Claims (13)

  1. 환자로부터 혈액을 배출하고 일 방향으로 이동시키는 제1 관로;
    상기 제1 관로의 일 측에 연결된 미세유체루프를 이용하여 상기 혈액 내에 포함된 복수의 세포 성분을 분리하는 분리부;
    상기 미세유체루프에 의해 분리된 상기 복수의 세포 성분 중 표적 세포를 회수하는 샘플 튜브; 및
    상기 표적 세포를 제외한 나머지 세포 성분을 상기 환자에게 주입하는 제2 관로를 포함하는, 비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 관로와 상기 미세유체루프의 사이에 위치하며 상기 복수의 세포 성분 중 백혈구를 선택적으로 채집하는 혈액성분채집기를 더 포함하는, 비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 혈액성분채집기는 라담보울(Latham bowl)인, 비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 미세유체루프는 상기 제1 관로와 연결되며 상기 제1 관로의 일 측에 연결된 제1 펌프에 의해 펌핑된 혈액이 주입되는 주입구 및 상기 주입구와 이격되어 배치되며 상기 복수의 세포 성분을 분리하여 추출하는 추출구를 포함하는, 비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 추출구는 상기 복수의 세포 성분 중 상기 표적 세포를 분리하여 추출하는 제1 추출관 및 상기 순환종양세포를 제외한 적혈구, 혈장 및 백혈구를 분리하여 추출하는 제2 추출관을 포함하는, 비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제2 관로는 상기 제2 추출관 및 상기 환자 사이를 연결하며, 상기 제2 관로를 통과하는 상기 적혈구, 혈장 및 백혈구의 유속을 조절하고 상기 제1 관로와의 압력 차이를 조절하는 제2 펌프와 연결되는, 비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 미세유체루프는 나선형의 형상으로 형성되는, 비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 미세유체루프 내에서 복수의 세포 성분이 일 방향으로 회전하는 경우, 상기 미세유체루프를 통과하는 상기 복수의 세포 성분 각각에는 와류가 형성되고, 상기 와류에 의해 상기 미세유체루프의 외벽을 따라 서로 상이한 세포 성분이 서로 다른 속도로 이동하는, 비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 표적 세포는 순환종양세포(circulating tumor cell), 암 세포(cancer cell), 암 줄기 세포(cancer stem cell)를 포함하는, 비편향적 순환종양세포 연속 분리 장치.
  10. 환자로부터 추출한 혈액을 제1 관로를 통해 미세유체루프로 이동시키는 단계;
    상기 미세유체루프를 이용하여 상기 혈액내에 포함된 복수의 세포 성분을 분리하는 단계;
    상기 미세유체루프에 의해 분리된 상기 세포 성분 중 표적 세포를 회수하는 단계; 및
    상기 표적 세포를 제외한 나머지 세포 성분을 제2 관로를 통해 상기 환자에게 주입하는 단계를 포함하고, 상기 미세유체루프는 나선형의 형상으로 감겨진 형상을 갖는, 비편향적 순환종양세포 연속 분리 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 제1 관로는 상기 미세유체루프의 주입구와 연결되고, 상기 제2 관로는 상기 미세유체루프의 추출구와 연결되며,
    상기 제1 관로 및 상기 제2 관로에는 상기 혈액의 유속을 조절하는 펌프가 배치되는, 비편향적 순환종양세포 연속 분리 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 미세유체루프 내에서 일 방향으로 회전하는 상기 복수의 세포 성분은 상기 세포 성분별로 서로 다른 속도로 이동하는 것을 이용하여 상기 세포 성분 중 순환종양세포를 분리하는, 비편향적 순환종양세포 연속 분리 방법.
  13. 제10항에 있어서,상기 표적 세포는 순환종양세포(circulating tumor cell), 암 세포(cancer cell), 암 줄기 세포(cancer stem cell)를 포함하는, 비편향적 순환종양세포 연속 분리 방법.
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