JP2017500006A - 細胞の検出及び単離のためのマイクロ流体選別器 - Google Patents

Abstract

マイクロ流体装置が開示される。該装置は、サンプルにおける循環腫瘍細胞とその他の細胞とを受け入れるための少なくとも１つの注入口と、サンプルが一部又は全ディーン循環を受けて循環腫瘍細胞をその他の細胞から単離する少なくとも１つの曲線状及び／又は螺旋状チャネルと、チャネルと連通して、単離された循環腫瘍細胞を提供するように構成された少なくとも１つの排出口と、を含む。チャネルは、循環腫瘍細胞の所望の臨界細胞サイズに基づいて事前に決定された力の比率を提供するよう構成される。同様の、該装置を製造する方法、及び関連する診断システムも開示される。【選択図】図５

Description

本発明は、マイクロ流体装置に関する。

細胞分離のための、対流を利用したマクロスケールにおける方法には、膜を利用したフィルタを用いた物理的濾過と、細胞のサイズ、変形、及び密度の差を利用して標的の細胞をフィルタで選別する密度勾配遠心分離とが含まれる。これらの技術は、多大な労働力を要し、人為的影響をもたらすか又は所望の細胞の欠失を導き得る多段階のサンプル調製を必要とする。また、膜フィルタ方法では詰まりが起こりやすく、頻繁に洗浄する必要がある。さらに、濾過及び遠心分離技術が用いられた標的細胞の原表現型が、機械的ストレスにより誘導されて変化することの裏付けも報告されている。

故に、続く分析のために細胞欠失を最小化してもとの標的細胞の表現型を維持することが可能である、血液サンプルを処理するためのより簡易で効果的な技術の発展が明らかに必要とされている。

マイクロ流体技術は、主にその長さスケールが小さいことから血液サンプルの処理に特に適し、長さスケールが小さいことにより血液分離時における細胞のマイクロ環境において優れた制御を実現する。オンチップの血液分析は、赤血球（ＲＢＣ（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ））の変形、血小板及び血漿の分離、白血球の分離、並びにＣＴＣ又は胎生細胞などの特殊細胞の血液からの単離の研究など、種々の適用について複数のグループにより提示されてきた。しかしながら、これらのマイクロ流体技術システムにおける主な制限はサンプルの希釈又は低い流速のいずれかによる低い処理スループットであり、通常は数ミリリットルの量である臨床における血液サンプルを処理するためには不適切になる。本明細書にはこれらの問題を克服するマイクロ流体装置が記載される。

本発明の第１の具体的な実施形態では、対象のサンプルにおいて１つ以上の循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ））を検出する方法が提示され、該方法は、１つ以上の螺旋チャネルを含むマイクロ流体装置の少なくとも１つの注入口にサンプルを導入するステップと、対象のサンプルにおける１つ以上の循環腫瘍細胞を検出するステップを含み、各チャネルは、長さと、高さ及び幅の断面と備え、該高さ及び幅の断面は、細胞のサイズに基づいてチャネルの断面の部分に沿って循環腫瘍細胞を単離するように適応されたアスペクト比を規定し、循環腫瘍細胞は、存在する場合に、チャネルにおいて半径方向に最も内側の部分に沿って第１の排出口へと流動し、サンプルの他の細胞はチャネルの別の部分に沿って第２の排出口へと流動する。

実施形態には、比較的大きい流速で連続的に動作すること、サンプルを化学的に改変することなく臨床サンプルをより高速で処理して処理時間及び費用を低減することを可能にすること、及び／又は続く生物学的分析のために生細胞を収集すること、を含む多くの有利性があり得る。

上述されたことは、添付の図面において示されるような例示的実施形態についての以下のより詳細な記載から明らかになり、類似する参照符号は異なる図において同様の部分を示す。図面は必ずしも寸法どおりではないが、その代わりに実施形態を例示することに重点が置かれている。

図１Ａ及び図１Ｂは、ＰＤＭＳで製造され、１つの注入口と８つの均等に分割された排出口（１〜８の表示）とを備えた、ＣＴＣ単離用の製造後の螺旋状マイクロチャネルの写真である（マイクロチャネルは視覚化のため色素で充填されている）。また図１Ａには、螺旋状マイクロチャネルの排出口部分を示す顕微鏡的画像が示される。 図２は、ＣＴＣ単離のための螺旋状選別器の概略図である。血球（ＲＢＣ、白血球、及びＣＴＣ）は、注入口において、マイクロチャネルの横断面に無作為に分布する。慣性揚力とディーン渦との影響のもと、これらの細胞は、そのサイズに基づき横断面内において異なる位置で平衡化され、より大きいＣＴＣは内側マイクロチャネル壁に最も近接して平衡化される。個々の細胞流は、等間隔の８つの排出口を使用して抽出され、分離される。 図３は、発展型超高スループットＣＴＣ単離チップの概略図であり、動作原理を表す。全血はポンプで装置の内側の注入口に送られ、シース流体は外側の注入口を通過する。より小さい血液細胞（ＲＢＣ及びＷＢＣ）は、曲線状チャネル形状により、ディーン抗力の影響のもと、２つの対向する回転渦に従ってチャネル外側壁に向かって移動する（断面図）。ＣＴＣは、サイズがより大きいため、マイクロチャネル内側壁に沿ってＣＴＣを平衡化する強い慣性揚力を受け、分離がおこなわれる。 図４Ａ及び図４Ｂは平均合成画像の図４Ａとライン走査の図４Ｂであり、螺旋状マイクロチャネルの排出口におけるＲＢＣ、白血球、及びＣＴＣの横方向の位置を示す。該画像は、血液細胞（ＲＢＣ及び白血球）がディーン抗力の影響もとでチャネルの外側半分に移動される一方で、より大きいＣＴＣは慣性揚力の影響のもとでチャネルの内側壁により近接して集束する。 図５は、一実施形態におけるマイクロ流体装置の曲線状チャネルの上面図と、細胞分離のために半ディーン循環の原理を適用して細胞を単離する工程を示す付随模式図とを表す図５ａ〜図５ｄを包含する。 図６は、一実施形態におけるマイクロ流体装置の螺旋状チャネルの上面図と、１つの全ディーン循環の原理を適用して細胞を単離する工程を示す付随模式図とを表す図６ａ〜図６ｄを包含する。 図７は、サンプルにおけるその他の細胞からＣＴＣを単離するように適応された図５ａ又は図６ａのマイクロ流体装置を製造する方法のフロー図である。 図８ａは、さらなる実施形態における、並列だが対向する配置で接続された２つの曲線状セクションを有するマイクロチャネルで構成された提示のバイオチップの上面図である。図８ｂは、ダンパー８２２を備えた単一の円弧８２０を示す。 図９は、診断構造９００の概略的模式図を示す。

実施形態は、概して、１つ以上の特定の型の細胞（例えば検出及び／単離される標的細胞）を、２つ以上（複数）の細胞型を含むサンプル（例えば細胞の集合又は細胞の混合物）から検出及び／又は単離するためのマイクロ流体装置及びそのような装置の使用に関する。特に、本発明は、細胞・粒子分離における高精度及び高スループットが重要である多くの環境的及び生物学的適用の用途に用いられ得る。より具体的に、サイズ及び慣性に基づく細胞・粒子の分離をおこなうための簡易な曲線状マイクロチャネル形状で構成されたマイクロ流体装置の実施形態が、以下、本明細書に記載される。マイクロ流体装置は、サンプル導入のための１つ以上の注入口と、サンプルが流れる１つ以上のチャネルと、１つ以上の排出口、通常は少なくとも２つの排出口を含み、サンプルにおいて検出される及び／又は単離される細胞は、排出口のうちの１つ（例として第１の排出口）を貫流し、サンプルにおける細胞の残りは単離された細胞が流れるのと同じ排出口を貫流せず、及び／又は他の（異なる）排出口（例として第２の排出口）を貫流する。１つ以上のチャネルのそれぞれは、長さと、チャネルの断面図の少なくとも一部分に沿って標的細胞を単離するように適応されたアスペクト比を規定する高さ及び幅の横断面を備え、標的細胞は、各チャネルの第１の部分に沿って第１の排出口に流れ、残りの細胞は各チャネルの第２の部分に沿って流れ、標的細胞と同じ排出口には流れないか、及び／又は１つ以上の（異なる、例えば第２、３、４、５、６、７、８等の）排出口を貫流する。

本明細書に記載されるように、マイクロ流体装置は、サンプルを装置に導入するための１つ以上（少なくとも１つ）の注入口を備えることが可能である。例えば、装置は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等の注入口を備えることが可能である。

サンプルは、当業者には既知の種々の技術を用いて装置に導入されることができる。例として、サンプルはシリンジ及び／又はポンプを用いて導入されることが可能である。

同様に、マイクロ流体装置は１つ以上の排出口を備えることが可能である。一部の態様では、装置は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等の排出口を備えることが可能である。特定の態様において、装置は少なくとも２つの排出口を備える。他の態様では、装置は少なくとも３つの排出口を備える。さらに他の態様において、装置は少なくとも４つの排出口を備える。また他の態様では、装置は少なくとも８つの排出口を備える。

また、装置は、１つ以上の注入口を１つ以上の排出口に接続する１以上のチャネル（例として並列のチャネル、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等の並列チャネル）を含む。チャネルは、サンプルにおける標的細胞を細胞の残りから分離することを実現するアスペクト比を規定する高さ及び幅の横断面を含む。本明細書で用いられるように、アスペクト比は、チャネルの幅で除算されたチャネルの高さの比率であり、また標的細胞がチャネルの横断面の少なくとも一部分に沿って第１の排出口に流れることが可能であり、残りの細胞がチャネルの異なる（例として第２、３、４等の）部分又は横断面に沿って、標的細胞とは同様の排出口ではなく、異なる（例として第２、３、４等の）排出口などに流れることができるように、チャネルの適切な横断面を提供する。適切なアスペクト比により、標的細胞はチャネルの区別される部分に沿って流れ、これは、サンプルにおける残りの細胞の同様又は類似の構造的特徴と比較された、サンプルにおける標的細胞の構造的特徴における差異に基づく。そのような構造的特徴の例は、細胞のサイズ、剛性、変形能、接着性（例えば細胞接着性）などを含む。例として、本明細書に示されるように、１、２．５、３．７５、５、又は７のアスペクト比が用いられることが可能である。

特定の態様においてチャネルは螺旋状である。螺旋状チャネルの高さは約１０μｍ〜約２００μｍの範囲であり得り、約１００μｍ〜約１４０μｍなどであり得る。螺旋状チャネルの長さは約１ｃｍ〜約１００ｃｍの範囲であり得る。

サンプルは、例として生理的流速（例えば生理的小動脈流速）、又は非生理的流速など種々の流速でマイクロ流体装置を貫流可能である。例示される流速は約２０００万細胞／分、又は約２．５ｍＬ／分〜約５μＬ／分の範囲を含む。

本明細書に記載されるマイクロ流体装置は、細胞のサンプルから標的細胞を検出、分離、及び／又は単離するために用いられ得る。細胞のサンプルは、血液（例として全血）、血漿、腹膜液、リンパ液、脊髄液、尿、組織など、例えば生物学的サンプルであってよい。サンプルはまた細胞培養サンプルであってもよい。特定の態様において、サンプルは血液サンプル（例として全血サンプル）である。血液サンプルは低ヘマトクリット値（例えば約１〜１０％）又は高ヘマトクリット値（例えば約２０〜５０％）を有し得る。

血液は、血漿における細胞（血液量の約４０％から４５％）の複合的懸濁液であり、酸素や栄養物を細胞に運搬すること、細胞老廃物を除去すること、及び免疫学的防御を提供すること、を含む複数の重要な役割を果たす。赤血球（ＲＢＣ）は、すべての血液細胞成分の９９％より多くを構成し（全血のミリリットル毎に約５×１０^９のＲＢＣ）、残りの１％未満は末梢血白血球（ＰＢＬ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））及び血小板からなる。その複雑な特性のため、マイクロ流体バイオチップを使用した血液分析は困難な課題であった。ＲＢＣと白血球に加え、胎児有核赤血、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、幹細胞、白血病細胞などの他の低含有細胞も患者の末梢血に見受けられ、該末梢血は、患者のモニタリング、疾患診断、治療的処置のモニタリング、及び基礎科学研究の実施などの種々の生物医学的適用に用いられ得る。しかしながら、これらの細胞は非常に希少であるので、分析前にそれらを血液から効率的に単離するためには、濃縮又は分離段階が総じて必要とされる。

このように、本明細書に記載される１つ以上のマイクロ流体装置（例えば並列又は連続のマイクロ流体装置一式）は、様々な目的のために、一態様においては種々の標的細胞の検出、分離、及び／又は単離のために、用いられることが可能である。種々の標的細胞が検出されることが可能である。例として病気の細胞（例えば、マラリア感染赤血球、白血性赤血球、鎌状細胞貧血赤血球、若しくはそれらの組合せなどの病気の血液細胞、非同調混合物における同調細胞、及び循環腫瘍細胞（ＣＴＣ））を含む。

他の態様において、マイクロ流体装置は循環腫瘍細胞を検出、分離、及び／又は単離するために用いられることができる。癌転移、腫瘍形成によりもたらされる死はすべての癌関連死の約９０％を占める。具体的に、循環腫瘍細胞又はＣＴＣとして既知の腫瘍由来上皮生細胞は、転移性癌を有する患者の末梢血において特定されている。これらのＣＴＣは、新規の転移部分を形成する離れた臓器での溢出の原因となり、癌を広める。臨床的報告において、存在するＣＴＣの数が疾患段階と通常は関連し、予測マーカとして使用可能であることが示されている。予測的意義とは別に、ＣＴＣの計数は治療的処置の効果を検証するためにも用いられることができ、生ＣＴＣの研究は転移の複雑な過程の理解のためにも有用であり得る。つまり、転移の主な要因である循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出により、疾患段階及び癌進行に関連した有用な見解を得られる。また、その計数は臨床上の評価や治療的処置反応のモニタリングにも用いられる。ＣＴＣは非常に希少であり、ミリリットル毎の１０^７〜１０^９の血液細胞毎にわずか１細胞からなり、非常に不均質な形態と分子的特徴とを有するので、血液からの単離は技術的に困難であった。

このように、本発明は、一態様において、個体のサンプルにおける１つ以上の循環腫瘍細胞を検出する方法にも関する。該方法は、１つ以上の螺旋状チャネルを含むマイクロ流体装置の少なくとも１つの注入口にサンプルを導入するステップを含み、各チャネルは、長さと、細胞のサイズに基づいてチャネルの横断面の部分に沿って循環腫瘍細胞を単離するように適応されたアスペクト比を規定する高さ及び幅の横断面とを備え、循環腫瘍細胞は、チャネルにおいて半径方向に最も内側の部分に沿って第１の排出口へと流動し、サンプルの他の細胞はチャネルの別の部分に沿って第２の排出口へと流動する。該方法は、第１の排出口から循環腫瘍細胞を収集するステップと、循環腫瘍細胞を分析して治療的処置の効果を評価するステップとをさらに含む。サンプルは血液サンプルであり得る。

マイクロ流体技術を用いて循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を血液から選別するための高スループットの細胞分離技術が本明細書に記載される。一態様において、その設計は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で製造された低アスペクト比であり且つ螺旋状に形状づけられたマイクロチャネルからなる。分離は、大きい細胞サイズによる慣性揚力と、螺旋形状によるディーン抗力との相互作用に依存して、マイクロチャネルの横断面内の異なる部分に細胞を平衡化する。適切に分岐された排出口を設計することで、細胞はそのサイズに基づいて別々に収集されることができる。この技術は、早期の癌検出及び処置による効果のモニタリングのために、サイズが大きく、通常は約１５〜２０μｍの直径であるＣＴＣを、血液細胞（ＲＢＣは約８μｍ、白血球（ＷＢＣ）は約８〜１２μｍ）から分離するように適用される。

螺旋状マイクロチャネル内を流れる細胞は、遠心加速誘導のディーン抗力と慣性揚力との組合せを受ける。細胞のサイズの四乗数で変化する慣性揚力は、マイクロチャネルの横断面における複数の異なる平衡位置に細胞を集束させる要因となる。螺旋状に形状づけられたマイクロチャネルを設計することによりディーン抗力の成分を加えることで、これらの複数の平衡位置は、内側マイクロチャネル壁近傍のものに減縮されることが可能である。揚力とディーン抗力との比率は細胞のサイズの変化で変わるので、細胞はそのサイズに基づいてマイクロチャネルの横断面に沿った異なる位置で平衡化されることが可能であり、最も大きい細胞はマイクロチャネル壁に最も近接して平衡化される。このため、細胞の異なるストリームが発生し、細胞は適切な排出口を設計することによって独立して収集されることができる。

このように、細胞懸濁液を、マイクロ流体装置の少なくとも１つの注入口において横断面の内側半分に制限することと、より大きな細胞のみが慣性力に影響を受け、一方でより小さな細胞はディーン抗力のみを受けることを確実にすることで、高精度の分離がおこなわれることが可能である。マイクロチャネルの設計パラメータは、以下に記載される数値モデルを用いて容易に調整され、カットオフサイズを変更することが可能であり（つまり、カットオフサイズを超えるサイズの細胞は慣性集束（ｉｎｅｒｔｉａｌ ｆｏｃｕｓｅｄ）を受け、カットオフサイズより小さい細胞は受けない）、任意のタイプの細胞・粒子混合物用の所望のチャネルが容易に設計且つ構成されることが可能である。

装置は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で製造され、顕微鏡スライドガラスと連結される（図１Ａ及び図１Ｂ）。マイクロチャネルの設計は、８個に均等に分割された拡張排出口システムを有する、５００×１００μｍ（幅×高さ）のマイクロチャネルからなる。注入口のサンプルは、種々の濃度のＣＴＣを含む希釈全血（０．１％ヘマトクリット）からなる。サンプルがマイクロチャネルを貫流するとき、通常のＲＢＣ、白血球、及びＣＴＣは、細胞のサイズに基づいてマイクロチャネルの横断面にわたって平衡化される。ＣＴＣは、そのサイズが大きいため（約１５〜２０μｍ）慣性揚力による実質的な影響を受けて、内側チャネル壁の近傍で平衡化される。ＣＴＣより小さいＲＢＣ（約８μｍ）と白血球（８〜１２μｍ）とはディーン抗力に尚いっそう影響を受け、内側マイクロチャネル壁からより離れて集束し、分離がおこなわれる。この平衡位置の差異は低アスペクト比のマイクロチャネルを設計することによって増幅され、図２に示されるように希少なＣＴＣを排出口１から収集することを容易にし、その他の排出口は残りの血液細胞を含み、結果として高スループットであり、サイズに基づいた、連続的な分離がおこなわれる。この技術の他の実施形態において、腹膜液からの間質細胞、血液からの白血病細胞、及び母体血液からの胎児有核赤血球を含むその他の希少細胞を単離するための分離技術が用いられることが可能である。

一部の態様において、チャネルのアスペクト比は、約３．７５など約１〜約５の範囲である。特定の実施形態では、該方法は、細胞の直径に基づいて、混合細胞タイプの個体群内に存在する幹細胞又は前駆細胞を、機能的に区別される準個体群に分離することを含むことが可能である。これらの準個体群は装置から収集されて、特有の代謝機能について、例えば、増殖、分化、又は特定の医薬剤に対する反応において高い能力を有し得る特定の準個体群を単離及び濃縮するためなど、分析されることが可能である。特定の実施形態において、チャネルの幅は約５００μｍであり得り、チャネルの高さは約１００μｍであり得る。

螺旋状のマイクロチャネル形状を用いて、全血から循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を選別するための、高スループット且つサイズに基づいた細胞分離技術が本明細書に記載される。この設計は、様々なサイズの細胞に作用する慣性揚力及び粘性抗力の有利性を利用して、差異を示す移動を実現する。有力な慣性力及び螺旋状マイクロチャネルの形状によるディーン回転力のため、より大きいＣＴＣは集束して内側マイクロチャネル壁近傍の単一の平衡位置を占領する。より小さい血液成分（ＲＢＣ及び白血球）はディーン力の影響のもとチャネルの外側半分に移動し、２つの個別の排出口において収集される２つの異なるストリームを形成する。提示の本技術は、その全血を処理する能力により、１０分未満で１ｍＬの全血を処理し、血液細胞の９９％を除いて、内部排出口において９０％のＣＴＣが回収されることが可能である。

曲線状チャネルを貫流する流体は半径方向に外向きの方向である遠心加速を受け、チャネルの上半分と下半分とにおいて、ディーン渦として既知である２つの対向する回転渦がもたらされる。これらの２次的な流れの大きさは、
によって与えられる、無次元パラメータであるディーン数（Ｄｅ）によって定量化され、ρは流体密度（ｋｇ／ｍ^３）であり、Ｕ_ｆは平均流速（ｍ／ｓ）であり、μは流体の粘度（ｋｇ／ｍｓ）であり、Ｒ_Ｃはチャネル通路の曲率半径（ｍ）であり、Ｄ_Ｈはチャネルの水力直径（ｍ）であり、Ｒ_ｅは流動レイノルズ数（粘性力に対する慣性力の比率）である。流速は、流量又はポンプモジュールへの圧力（例えばシリンジポンプ）を変化させることで調整される。つまり、曲線状チャネル内を流れる粒子はこれらの横断ディーン流の存在により抗力を受け、渦内の流れ方向に沿って粒子を同調及び駆動させる。上部又は下部から可視化された場合の下流への距離が増すと、この動きが内側及び外側壁の間のチャネル幅に沿って前後に移動する粒子に伝えられる。これらの細胞がチャネル内で流れるときに横方向に移動する速度は、ディーン数に依存し、
を用いて算出されることが可能であり、ρは流体密度（ｋｇ／ｍ^３）であり、μは流体の粘度（ｋｇ／ｍｓ）であり、Ｄ_Ｈはチャネルの水力直径（ｍ）であり、ｋは、約０．０１などこれらの曲線状チャネルのために実験的に測定され且つこれらのチャネルのＣＯＭＳＯＬモデルを用いて検証されたスケール因子である。

ディーン渦に沿う粒子が横切る横方向の距離は「ディーン循環」に関して定義されることができる。例として、当初はマイクロチャネルの内側壁近傍に配置され、且つ下流の所定の距離でチャネルの外側壁に移動する粒子は、ディーン循環の半分を完了したと考えられる。マイクロチャネルの内側壁近傍の元の位置に戻ることで、全ディーン循環を完了する。所定のマイクロチャネルの長さにおいて、粒子は、流量（Ｒｅ）条件の増加に伴い複数のディーン循環移動を受け得る。全ディーン循環移動の長さは、
として算出されることが可能であり、ｗはマイクロチャネルの幅（ｍ）であり、ｈはマイクロチャネルの高さ（ｍ）である。つまり、ディーン移動に必要とされるマイクロチャネルの全長は、
によって与えられる。

ディーン抗力の大きさは、ストークスの式である
によって与えられ、ａ_ｃは細胞の直径（ｍ）である。

ディーン抗力とは別に、マイクロチャネルのサイズに近い直径を有するより大きい細胞もまた、相当の慣性揚力（Ｆ_Ｌ）（せん断と壁とによる誘導）を受け、集束と平衡化がもたらされる。ポアズイユ流れにおける放物速度プロファイルは、粒子に作用するせん断誘導慣性揚力Ｆ_ＩＬをもたらし、粒子をマイクロチャネル中心からチャネル壁に向かって方向づける。これらの粒子がチャネル壁近傍に移動すると、突然現れる壁が、粒子の周りに形成された回転移動を中断させ、壁から離れてマイクロチャネルの中心に向かって方向づける揚力（Ｆ_ＷＬ）を誘導する。これら２つの対向する揚力により、粒子は区別及び予測される位置でマイクロチャネル周囲辺りに平衡化（集束）する。この効果は、マイクロチャネルのサイズａ_ｃ／ｈ〜０．１に近いサイズを有する粒子にとって支配的である。特に慣性揚力（Ｆ_Ｌ）の大きさは、
によって与えられ、Ｃ_Ｌはチャネル横断面の粒子位置の関数である揚力係数であり、平均値０．５を取り、Ｇは流体のせん断速度（１／ｓ）である。ポアズイユ流れにおけるＧの平均値はＧ＝Ｕ_ｍａｘ／Ｄ_Ｈによって求められ、Ｕ_ｍａｘは最大流体速度（ｍ／ｓ）であり、２×Ｕ_Ｆと推測され得る。従って、上述の式（６）の慣性揚力（ＦＬ）は、
として再度示されることが可能である。

曲線状形状を有するマイクロチャネルにおいて、慣性揚力（Ｆ_Ｌ）とディーン抗力（Ｆ_Ｄ）との相互作用により、平衡位置は内側チャネル壁近傍の２か所のみに減縮され、そのそれぞれは上部ディーン渦及び下部ディーン渦内にある。２つの平衡位置はマイクロチャネルの高さについて互いに重なり、所定の粒子サイズでは、マイクロチャネルの内側壁から同様の距離に配置される、即ち、マイクロチャネル幅における単一の位置として観測される。

これら２つの現象、つまりディーン移動及び慣性集束（ｉｎｅｒｔｉａｌ ｆｏｃｕｓｉｎｇ）の有利性により、異なるサイズである粒子や細胞の混合物は分離されることができる。マイクロチャネルパラメータ（つまり、幅、高さ、長さ、曲率半径、及び流量）のサイズは前述された数学的モデルに基づいて選択され、より大きな細胞・粒子混合物が慣性集束を受ける一方で、より小さな細胞・粒子（カットオフサイズより小さい）は集束効果を受けないということを確実にする。注入口では、細胞・粒子混合物はマイクロチャネルの内側壁近傍に制限され、細胞・粒子が下流に移動すると、より小さい粒子は、ディーン抗力の影響下でチャネル横断面の他方半分に移動される。一方で、カットオフサイズより大きい細胞・粒子は強い慣性揚力を受け、内側チャネル壁近傍に集束して留まる。このようにして、排出口では、より小さい細胞・粒子が小細胞排出口から収集され、一方でより大きな細胞・粒子が大細胞排出口から収集されることができ、分離及び単離がおこなわれる。サイズのカットオフは２つの力（即ち、慣性揚力（Ｆ_Ｌ）とディーン抗力（Ｆ_Ｄ））の比率である
によって推測されることが可能であり、ｉ_Ｆは力の比率であり、その他のパラメータは、式（１）、（５）、及び（６）において規定された前述のものに関して理解される。流動密度（ρ）及び流体粘度（μ）は組合せられた密度と粘度とに関する。シース又はサンプルのいずれかを調整して、最終流体密度及び粘度を調整することができる。取得された実験データによると、ｉ_Ｆのしきい値は粒子・細胞の慣性集束について約２である。２未満のｉ_Ｆのテスト条件では、粒子・細胞はディーン抗力に影響されるのみであり、ディーン流れと共に循環する。つまり、慣性集束を受ける粒子・細胞について、ｉ_Ｆは２より大きいか、又は２と等しい（即ち、ｉ_Ｆ ³２）。力の比率であるｉ_Ｆはしきい値因子として作用して、粒子・細胞が慣性集束を受けるかどうかを決定すると考えることができる。式（８）より、ｉ_Ｆは粒子・細胞の曲率半径、直径（即ち、細胞・粒子のサイズ）及び水力直径など複数のパラメータによって決定されると考えられる。

これらのパラメータのなかで、粒子・細胞の水力直径及びサイズは、細胞・粒子が慣性集束を受けるか否かの決定において最も重要な作用を有する。低アスペクト比の矩形横断面のチャネルが分離に用いられるので、チャネルの高さｈは、既知の直径を有する粒子・細胞がチャネルの側方に集束されることができるか、又はディーン流れに沿って移動するかを決定するための重要なパラメータである（Ｄ_Ｈは、低アスペクト比のチャネルにおいてｈで置き換えられる）。従って、対象の粒子・細胞のサイズ範囲内で、チャネル内側で集束することが要求される粒子・細胞のためにチャネルの高さがｈ＜１０×ａ_ｃになるように選択することは妥当である。

上述に続き、本明細書に記載される事項は、ＣＴＣを血液から分離する能力を示すために２つの現象、つまりディーン移動と慣性集束との有利性を利用しているということが強調される。より具体的には、マイクロ流体装置において血液からＣＴＣを分離及び単離するためのサイズに基づいた分離方法は、本明細書の下記に記載され、（既に上述されたように）ＣＴＣとその他の血液細胞とのサイズの差異を用いて実施される。ＷＢＣの５＊ｌｏｇ_１０の減少を伴う既存のＣＴＣ分離技術と比較して、提示される装置により超高純度を得られるということは強調される必要がある。

一態様において、設計には、約１０ｃｍの全長を有する、２つの注入口と２つの排出口と備えた螺旋状マイクロチャネルが含まれる。マイクロチャネルの幅は約５００μｍであり、高さは約１４０μｍである。図４Ａ及び図４Ｂに示されるように、チャネルサイズは、より大きいＣＴＣが慣性集束を受ける一方で、より小さい血液細胞（ＲＢＣ及び白血球）の移動はディーン抗力の影響を受ける（即ち、ＣＴＣのみがａ_ｃ／ｈ〜０．１の比率を満たす）ように選択される。注入口では、全血サンプルはポンプで内側注入口に注入され、シース流体（例として１×ＰＢＳ）は螺旋状マイクロチャネルの外側注入口を介する（図３）。シース流体は注入口で全血を追い詰めて、全血サンプルをチャネル幅の狭小な領域に閉じ込めるために用いられ、すべての細胞は概ね同様の位置から移動を開始する。テスト時には、ディーン抗力の影響のもと、小さい細胞はディーン渦に沿って移動を始め、チャネルの外側壁に向かって移動する。ＣＴＣが受ける強い慣性揚力は、ＣＴＣがディーン抗力の影響のもとで移動することを抑止し、マイクロチャネルの内側壁近傍の２つの平衡位置にＣＴＣを集束及び占領させる。一方で、ＲＢＣ及び白血球は慣性力に影響されないので、これらの細胞はディーン渦に沿って循環を続ける。細胞が半ディーン循環移動を経験することを確実にする適切な流量を算出することによって、ＣＴＣは排出口においてチャネルの内側壁近傍に集束し、一方でＲＢＣ及び白血球はチャネルの外側半分に移動する。このように、ＣＴＣは内側排出口で分離及び収集されることができる一方で、その他の血液細胞は外側排出口で収集される（図３）。この技術を使用することの有利性は非常に高ヘマトクリットのサンプル（全血）を処理する能力にあり、サンプルの準備段階を減縮し、分析時間を大幅に削減する。この技術を用いて、１ｍＬの全血は１０分未満で処理されることができる。

他の異なる態様において、別の設計が図５ａに描出され、該図５ａはマイクロ流体装置（図示せず）の曲線状マイクロチャネル５０２の上面図を示し、半ディーン循環の原理を適用することによって細胞を単離する処理５０４を表す模式図が付随する。さらに具体的には、曲線状マイクロチャネル５０２は、用語が示すように、シース注入口５０６ａ、サンプル注入口５０６ｂ、並びに小細胞排出口５０８ａ及び大細胞排出口５０８ｂと名付けられた２つの排出口を有する、単一の曲線状マイクロチャネル部から形成される。さらに、曲線状マイクロチャネル５０２は通常はＣ形状構成を有する。曲線状マイクロチャネル５０２を用いて個体の血液（即ちサンプル）からＣＴＣを分離及び濃縮するために、曲線状マイクロチャネル５０２は、式（８）に関して、１．５ｃｍのＲ_Ｃと約１０ｃｍの全長とで選択される。加えて、曲線状マイクロチャネル５０２の幅と高さともそれぞれ６００μｍと１６０μｍになるように選択される。特に、曲線状マイクロチャネル５０２の上述のサイズは、理解されるように、より大きいＣＴＣのみが慣性力を受ける一方で、より小さい血液細胞（ＲＢＣ及び白血球）がディーン抗力に影響を受けるように意図されて選択される。

従って、処理５０４は、曲線状マイクロチャネル５０２のサンプル注入口５０６ｂを介した血液サンプル全体及び曲線状マイクロチャネル５０２のシース注入口５０６ａを介したシース流体（例として１×ＰＢＳ）を導入することによって開始される（図５ａ参照）。まず、細胞・粒子混合物は、図５ｂにおける曲線状マイクロチャネル５０２の断面Ａ−Ａに示されるように、曲線状マイクロチャネル５０２の内側壁近傍の側に閉じ込められ、適切に均質に混合された状態である。細胞・粒子がさらに下流に移動すると、図５ｃにおける曲線状マイクロチャネル５０２の断面Ｂ−Ｂに示されるように、より小さい細胞・粒子は２次ディーン流れにさらに強く影響を受け、曲線状マイクロチャネル５０２の（内側壁と対向する）外側壁近傍の側に移動する一方で、より大きい細胞・粒子は（慣性揚力の影響のもとで集束されるように）内側壁の側近傍にとどまる。内側壁は、外側壁よりも、曲線状マイクロチャネル５０２によって形成される円の仮想中心に半径方向において近いということが理解される。即ち、ディーン抗力の影響下で、すべての小細胞がディーン渦と共に移動を開始し、外側壁に向かって移動する。しかし、ＣＴＣが受ける強い慣性揚力は、ＣＴＣがディーン抗力の影響下で移動することを抑止し、ＣＴＣを集束させ、内側壁近傍の２つの平衡位置を占領する。一方で、ＲＢＣ及び白血球は慣性力に影響されないので、これらの細胞はディーン渦と共に循環を続ける。つまり、細胞が半ディーン循環移動をおこなうことを確実にするために適切な流用を算出及び選択することによって、流れが２つの排出口に達するときまでには、ＣＴＣは内側壁近傍に集束されるが、ＲＢＣ及び白血球は外側壁に移動される。即ち、この設計において、サンプルは曲線状マイクロチャネル５０２におけるディーン循環の半分のみを受ける。

このように、選択された流量に適切であるチャネル長を設計することで、標的の細胞・粒子は、非標的細胞・粒子からの分離を結果的に完結し（図５ｄにおける曲線状マイクロチャネル５０２の断面Ｃ−Ｃを参照）、種々の異なる排出口を用いて収集されることができる。理解されるように、ＣＴＣは大細胞排出口５０８ｂで単離及び収集されることができ、その他の血液細胞は小細胞排出口５０８ａで収集される。より短い長さを用いることの有利性は非常に高流量で血液サンプルを処理する能力にあり、これは、いずれの希少細胞単離技術にも重要な事項である、より多い処理血液量に転換される。例示されるように、この技術を用いて８ｍＬの血液が約１０分以内で処理されることが可能である。理解されるように、重要なことはこれが現在のところマイクロ流体技術システムでおこなわれる最速の処理速度であり得るということである。また、背中合わせの構造で、同じ平面においてチャネルを多重化することも可能である。

さらなる態様において、代替的設計が図６ａに描出され、該図６ａはマイクロ流体装置（図示せず）の螺旋状マイクロチャネル６０２の上面図を示し、細胞分離のために１つの全ディーン循環の原理を適用することによって細胞を単離する処理６０４を表す模式図が付随する。マイクロ流体装置は、個体の血液（即ちサンプル）からＣＴＣを単離及び濃縮するために、提示されるバイオチップ（図示せず）の形態で実現される。この場合、螺旋状マイクロチャネル６０２は、螺旋状構造を形成するために（図５ａの曲線状マイクロチャネル５０２と比して）実質的な長さを有する単一の曲線状マイクロチャネル部からなり、シース注入口６０６ａ、サンプル注入口６０６ｂ、並びに小細胞排出口６０８ａ及び大細胞排出口６０８ｂという名の２つの排出口と共に構成される。小細胞排出口６０８ａと大細胞排出口６０８ｂとは、それぞれ外側排出口と内側排出口とも呼ばれる。上面図より、サンプル注入口６０６ｂはシース注入口６０６ａの左側に配置され、一方で小細胞排出口６０８ａは大細胞排出口６０８ｂの左側に配置される。この構成において、螺旋状マイクロチャネル６０２に導入される任意のサンプルが、螺旋状マイクロチャネル６０２の内側壁近傍の側よりも、まずその外側壁近傍の側に沿って流動することが特に確実になる。外側壁は、螺旋状マイクロチャネル６０２によって形成される円の仮想中心に対する外側壁よりも半径方向に離れているということが理解される。さらに、シース注入口６０６ａとサンプル注入口６０６ｂとはダンパーチャンバ（図示せず）に連結され、また、図６ａに示されるように螺旋状マイクロチャネル６０２の実質的に中心に配置される。ダンパーチャンバは、特に、マイクロチャネル内において安定的な層流流体ストリームを得るために、シース注入口６０６ａとサンプル注入口６０６ｂとをそれぞれ介して導入されるシース流体とサンプルとの流量を調節するためのものである。このことは、用いられるポンプの型が以下に言及されるようなぜん動ポンプである場合に重要であり得る。一方で、小細胞排出口６０８ａと大細胞排出口６０８ｂとは、螺旋状マイクロチャネル６０２に対して外部に配置される。

螺旋状マイクロチャネル６０２は、式（８）に関して、１．０ｃｍのＲ_Ｃ、それぞれ５００μｍと１７５μｍとになるように選択された螺旋状マイクロチャネル６０２の幅と高さ、１０ｃｍの長さで望ましくは選択される。従って、選択されたパラメータを取り入れた式（８）に基づき、１００μＬ／分のサンプル流量及び８００μＬ／分のシース流量において、式（８）に関し、１５μｍのポリスチレン粒子（ＣＴＣを表す）について０．１５４、及び１０μｍの粒子（ＷＢＣを表すポリスチレン粒子）について０．０４６の力の比率ｉ_Ｆが取得される。言うまでもなく、螺旋状マイクロチャネル６０２の上述のサイズは、より大きいＣＴＣのみが慣性集束を受ける一方で、より小さい血液細胞（ＲＢＣ及び白血球）の移動はディーン抗力に影響を受けるのみであるように選択される。

処理６０４は、サンプル注入口６０６ｂ介した血液サンプルとシース注入口６０６ａを介したシース流体とを導入することによって開始され、（上述されたように）血液サンプルを螺旋状マイクロチャネル６０２の外側壁近傍の側に沿ってまず流動させる。細胞は、図６ｂにおける螺旋状マイクロチャネル６０２の断面Ａ−Ａで示されるように、シース流体の補助により実質的に外側壁近傍でアライメントされる。半ディーン循環後、大小の細胞は螺旋状マイクロチャネル６０２の内側壁近傍の側に移動する（図６ｃにおける螺旋状マイクロチャネル６０２の断面Ｂ−Ｂを参照）。流動が螺旋状マイクロチャネル６０２長さの端部に達するときまでに、より小さい細胞はディーン循環と共に１循環を終える一方で、より大きい細胞は内側壁に沿った集束を維持する（図６ｄにおける螺旋状マイクロチャネル６０２の断面Ｃ−Ｃを参照）。

この場合の処理６０４は、（図５ｂ〜図５ｄの処理５０４において）まず始めに大きい細胞が内側壁の側に沿って集束される代わりに、すべての細胞を外側壁の側から内側壁の側に移動させるが、流動が螺旋状マイクロチャネル６０２の端部に達するときまでには小さい細胞が全ディーン循環を終えて外側壁の側に再び戻るという作用を伴う。即ち、この設計において、サンプルは螺旋状マイクロチャネル６０２における全ディーン循環を受ける。この設計では、より長いチャネル長と低流量とが必要とされ、せん断感応性細胞の分離に適切である。流れが十分に発展することにより、ＣＴＣ集束の質も向上され、また臨界サイズの細胞間の距離を増加させて細胞の分離を向上させ得る。また本実施形態において、小細胞排出口６０８ａと大細胞排出口６０８ｂとは、小細胞排出口６０８ａと大細胞排出口６０８ｂとにおける流れ抵抗、及び収集の容積比を調整するために最適化される各幅及び長さでそれぞれ構成される。これはダンパーチャンバの使用を介してさらに補完される。特に、大細胞排出口６０８ｂの長さと幅はそれぞれ１８ｍｍと３５０μｍとになるように選択される。一方で、小細胞排出口６０８ａの長さと幅はそれぞれ１０ｍｍと１５０μｍとになるように選択される。従って結果的に、小細胞排出口６０８ａと大細胞排出口６０８ｂとにおける収集の容積比は約２．８５±０．２０であると考えられる。血液細胞からのＣＴＣの分離を実現する目的で（マイクロ流体装置の）マイクロチャネルのサイズを設定するためのパラメータ選択を容易にするガイドラインとして、図５ａと図６ａとに関し、単離されるＣＴＣの細胞サイズ次第で、マイクロチャネル５０２、６０２の高さが約１２０μｍ〜１８０μｍの範囲になるように選択される一方で、マイクロチャネル５０２、６０２の幅が約３００μｍ〜６５０μｍの範囲になるように選択され、マイクロチャネル５０２、６０２の曲率半径が５ｍｍ〜２０ｍｍになるように選択されるということが提案される。

図７は、サンプル（例えば血液サンプル）においてＣＴＣを他の細胞から単離するように適応された図５ａ又は図６ａのマイクロ流体装置を製造する方法７００のフロー図を示す。広範には、カットオフされる細胞サイズの約１０倍になるように水力直径（Ｄｈ）が選択される（７０２）。ＣＴＣの場合、カットオフサイズは１５μｍであり、故に直径は約１５０μｍである。そして、幅及び高さの範囲はこの直径が得られるように選択される。曲率半径は、
１.入力を受け入れるチャネル中心の領域
２.製造能力
３.要求されるマイクロチャネルの長さ（２πＲ_Ｃ）
を含むがこれらに限定されない事項に基づいて最初に選択される（７０４）ことができる。

式（８）は、力の比率が２を超えるかどうかを決定するために用いられる（７０６）ことができる。速度は式（２）に基づいて選択される（７０８）。マイクロチャネル長は式（４）に基づいて選択される（７１０）。そしてマイクロチャネルはチャネルサイズ（幅、高さ）、半径曲率（Ｒ_Ｃ）、及び長さ（Ｌ_Ｃ）に基づいて設計される（７１２）ことができる。

上述の曲線状マイクロチャネル５０２を備える図５ａのマイクロ流体装置と螺旋状マイクロチャネル６０２を備える図６ａのマイクロ流体装置とは、細胞・粒子（例えばＣＴＣ）の単離及び検出のために特に構成された関連診断システム（図示せず）において、交換可能な使用に適するフォームファクタ（例えば使い捨てカートリッジとして）においてそれぞれバイオチップとして適用されるとよい。特に、単離される細胞・粒子のタイプ次第で使用されるように構成された種々の異なるバイオチップが存在し得る。また、使用におけるバイオチップは、続く分析におけるサンプル汚染を抑止するために１回の使用後に破棄及び交換されるとよい。新しいバイオチップは交換されて取り入れられ、その操作は当業者には明白である。加えて、診断システムは、バイオチップによって単離された循環腫瘍細胞の検出量に基づいて診断的読み取りをおこなうためのプロセッサを含み、さらに（循環腫瘍細胞を慣性集束させるために式（８）に従って）マイクロ流体装置を貫流するサンプルの流速を調整するための流れ調節器も含む。理解されるように、単離及び検出される細胞・粒子のタイプに基づいて、診断システムにおけるその他の異なる制御特性（例としてサンプルの流速の決定など）が、必要な目的を果たすために適切に調整されるとよい。

図９は診断構造９００の概略的模式図を示す。供される主要な制御特性は、サンプルポンプ９０２と希釈剤ポンプ９０４に送信される２つの制御信号である。液体速度は、希釈剤とサンプルとの組合せが曲線状マイクロチャネル５０２又は螺旋状マイクロチャネル６０２において流れる速度である。これは２つのポンプにおいて適切な流量を設定することによって制御される。曲率半径が図７のように規定されると、流量が調整されて所定のチャネル長さ内でディーン循環を得ることが可能である。逆もまた同様に、流量が固定され、チャネルの半径及び長さが上述の式に基づいて選択されることができる。圧力トランスデューサ９０６、９０８は、分離の質に影響し得る任意の妨害物がマイクロチャネルにあるかどうかを検出するために有用である。設定しきい値を超える圧力値の上昇は欠陥として検出され、ユーザの動作を必要とする機器を用いて分離は中止される。大きな妨害物はシステム内の圧力を安全限度を超えて上昇させ得り、有害物の漏えいや作業者の負傷をもたらし得る。圧力トランスデューサ９０６、９０８はそのような事故を防ぐ役に立つ。多くの圧力トランスデューサは低圧力定格において高感度を有しないので、流量センサ９１０は冗長機構として作用して、ポンプが適切な流量で分配しているかや、チャネル及び流体ライン内の任意の妨害物を検証する。

さらに他の態様によると、図８ａは、提示されるバイオチップ８００の上面図を示し、該バイオチップ８００は、並列だが対向する配置で連結された２つ（第１及び第２）の曲線状セクション８０４ａ、８０４ｂ（即ち円弧部分）を有するマイクロチャネル８０２で構成される。提示されるバイオチップ８００は、上述のように、診断システムに用いられるために同様に構成され、いくらかの使用（例えば１回の使用など）の後に交換されることもできる。マイクロチャネル８０２は開始端部と収集端部とを備え、サンプルと廃棄物とがそれぞれ誘導及び収集されることが可能である。２つの曲線状セクション８０４ａ、８０４ｂはマイクロチャネル８０２の開始端部に配置される。具体的には、２つの曲線状セクション８０４ａ、８０４ｂは互いの鏡反射であるように配置される。実際に、上部斜視図から認識されるように、バイオチップ８００が左部分と右部分とを有することが示唆される。さらに、バイオチップ８００は、実質的に類似する２つの部分に分割された付随の（第１及び第２）ダンパーチャンバ８０７ａ、８０７ｂと連結されたシース注入口８０６を含み、各８０７ａ、８０７ｂはバイオチップ８００の左部分と右部分とに配置される。また、シース注入口８０６はマイクロチャネル８０２に直接的に連結される。さらにまた、バイオチップ８００は、事前決定された長さと幅とを有する曲線状部分として構成される（付随するダンパーチャンバと連結された）２つ（第１及び第２）のサンプル注入口８０８ａ、８０８ｂも含み、各曲線状部分はバイオチップ８００の左部分と右部分とに配置される。

この場合、第１サンプル注入口８０８ａの曲線状部分は実質的に半円形状になるように構成される一方で、第２サンプル注入口８０８ｂ曲線状部分は実質的にＣ形状様になるように構成される。第２サンプル注入口８０８ｂはマイクロチャネル８０２の開始端部に直接的に連結され、第１サンプル注入口８０８ａは、高流れ抵抗のチャネル部分８１０を介してマイクロチャネル８０２の開始端部に非直接的に連結される。高流れ抵抗のチャネル部分８１０は屈曲構造の一連の半円マイクロチャネルを含む。またマイクロチャネル８０２は、マイクロチャネル８０２の収集端部から分岐する内側排出口８１２と外側排出口８１４とを備える。つまり、バイオチップ８００の左部分において、第１サンプル注入口８０８ａと高流れ抵抗のチャネル部分８１０とが、第１曲線状セクション８０４ａに包囲されるように配置され、そして該第１曲線状セクション８０４ａは第１ダンパーチャンバ８０７ａに包囲される。一方で、バイオチップ８００の右部分において、第２サンプル注入口８０８ｂは内側排出口８１２を包囲し、第２サンプル注入口８０８ｂと内側排出口８１２とは第２曲線状セクション８０４ｂに包囲され、そして該第２曲線状セクション８０４ｂは第２ダンパーチャンバ８０７ｂに包囲される。外側排出口８１４は、バイオチップ８００の左部分と右部分との間に形成された空間間隙にある。

この態様において提示されるバイオチップ８００の単純なチャネル設計が図５ａ及び図６ａの設計よりも有利であることは、スループットが２倍になることを可能にする簡易な並列化の実現にあり、そのスループットは既存のマイクロ流体技術システムと比較してこのクラスでは最高を示すことが理解される。提示されるバイオチップ８００を用いて、個体の血液からＣＴＣを単離（及び濃縮）する方法は、図５ａ及び図６ａの実施形態について上述されたように、図７の方法７００と類似するので、簡潔にするために繰り返すことはしない。他の有利性は、サンプル注入口８０８ａ、８０８ｂの曲線状部分及び高流れ抵抗のチャネル部分８１０と共にシース及びサンプル注入口８０６、８０８ａ、８０８ｂに連結された対応するダンパーチャンバが、ＩＣ設計におけるＲＣπフィルタと機能的に類似し、流量を安定化するように作用して、サンプル及びシース流体を送達するためのぜん動ポンプなどの大きい脈動をおこすポンプの使用を有利に可能にすることである。このように、流量調節器機能が提供され、該流量調節器機能は、（シース注入口８０６の）ダンパーチャンバ８０７ａ、８０７ｂの容積と、高流れ抵抗のチャネル部分８１０によりもたらされる流体抵抗とを適切に設計することにより、流れの脈動が１％〜５％内になるように制御できることを可能にする。

本実施形態において上記流量調節器機能が提供される目的は、既存のシステムにおいて注目される問題から持ち上がったものである。現在のところ、シリンジポンプ、ピストンポンプ、ギアポンプ、ぜん動ポンプ、圧電マイクロポンプを用いるか、又は制御可能な圧力調整器を用いるなど、マイクロ流体サンプルを送達するためのいくつかの方法が存在する。しかしながら、生物学的サンプルでは、サンプルの複合性を考慮する必要がある。例としてギアポンプや圧電ポンプは、ポンプ処理中にサンプルの細胞に有害な影響を与え得る。サンプルの流れが圧力差のみによって駆動される場合、流量は流体システムの構造により決定され、故に血液凝固などの妨害により所望の値から変動する可能性が高い。一方で、シリンジポンプには連続的送達量における制限があり、ピストンポンプは多くの場合に費用対効果が良くない。サンプル汚染、システムの簡易性、並びに流れの制御性、恒常性、及び連続性の問題を考慮すると、ぜん動ポンプが最も適切になる。ぜん動ポンプ使用についてのひとつの問題は、周期的脈動によりサンプルの流れが安定的でないことである。特に、ゴム管の断続的解放により起こる流れの脈動は、流れのプロファイルを著しく変化させ、提示されるバイオチップ８００の分離の質に影響する。故に、この問題に対する解決策は、ぜん動ポンプの流量を調節するためにフィルタ・ダンパー機能を包含することである。

図８ａに示される装置のチャネルサイズの範囲は、図５に示される装置と類似する。チャネルの高さは、約１００μｍ、１４０μｍ、１６０μｍ、及び１７５μｍなど約１０μｍ〜約２００μｍの範囲であり得る。チャネルの幅は約１００μｍ〜約７００μｍの範囲であり得る。チャネルの長さは、約１ｃｍ〜約１００ｃｍの範囲であり得る。

図８ａのバイオチップ８００に対する代替の実施形態において、マイクロチャネル８０２は構成の簡易性のため１つの曲線状セクションのみを備えるとよく、残りの特徴は図８ａに関して上述されたものと同様である。例として、図８ｂにおいてダンパー８２２を備えた単一の円弧８２０が提示される。

要約すると、上述の実施形態には、細胞のサイズ及び慣性に基づいて細胞・マイクロ粒子分離をおこなうように特に考案された（２つの注入口及び２つの排出口を有する）少なくとも１つの曲線状・螺旋状マイクロチャネル５０２、６０２を備えた、提示のマイクロ流体装置が記載されている。一方の注入口は細胞・粒子を有するサンプル溶液を導入するためのものであり、他方の注入口は細胞・粒子を含まない緩衝液（即ち、シース緩衝液）を導入するためのものであり、また一方の排出口は標的細胞・粒子を収集するためのものであり、他方の排出口は非標的細胞・粒子を含む廃棄物を収集するためのものであるということが理解される。

流体の流量Ｕ_Ｆのもとにおいて、比較的小さい直径を備えた細胞・粒子が比較的高いディーン抗力によりチャネル横断面の一方の側に駆動される一方で、比較的大きい細胞・粒子は比較的低いディーン抗力のもと他方の側に留まり続けるが、曲線状・螺旋状マイクロチャネル５０２、６０２の所定の長さＬ_Ｃで比較的高い慣性揚力を受けるように、曲線状・螺旋状マイクロチャネル５０２、６０２は平均曲率半径Ｒ_Ｃ及び水力直径Ｄ_Ｈを有する。

提示される設計を用いて、マイクロ流体装置が、実施可能な例示的適用として非常に高いスループットで血液細胞から循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を単離するために使用され得るということが示されてきた。患者の血液サンプルから循環腫瘍細胞又はＣＴＣを単離することはがん診断及び治療において不可欠である。実験において、提示されるマイクロ流体装置は、０．２５ｍＬ／分の速度で流れるように駆動される１．５倍濃縮のＲＢＣ除去血液溶液からの標的のＣＴＣから９９．９９９％の白血球を単離することができるということが示された。さらに、２つの曲線状セクションを１つのバイオチップに集積する並列設計（図８を参照）を単に追加することで、スループットが２倍になり、８ｍＬの血液サンプルを約１０分で処理することが可能になり得る。故に、提示される装置と方法とは、向上された高スループット、及び下流における単独の細胞又はその他の分子の解析と連結するための非常に高い純度で、希少標的細胞を混合物から単離することに適している。考えられ得るさらなる適用には、例として、疾患診断、水の濾過、迅速な溶媒交換などのための混合物からの細胞分離を含む。

図５ａの設計において、サンプル注入口は曲線状マイクロチャネル５０２の内側に配置され、内側チャネル壁から開始して外側チャネル壁へと半ディーン循環の移動をするより小さい細胞がもたらされるということが言及される。だが、図５ａの設計の変形として、螺旋状マイクロチャネル６０２の外側に配置されたサンプル注入口を備えた図６ａにおける代替的設計も提案される。特に、この設計では、螺旋状マイクロチャネル６０２の前半部分において、より大きな細胞がより小さい細胞と共に外側壁から内側壁に移動する（即ち半ディーン循環の喪失）。しかし、より大きな細胞は、（生成される大きい慣性揚力に従って）内側壁で結果的に慣性集束を受け、大きな細胞が大細胞排出口６０８ｂ（即ち内側排出口）から収集されることが可能になる一方で、小さな細胞はもう１つの半ディーン循環後に再びディーン流れに従って外側壁へと移動し続け、小細胞排出口６０８ａ（即ち外側排出口）から収集され得る。

既存のマイクロ流体技術のサイズに基づいた細胞・粒子分離システムに対する提示のマイクロ流体装置の有利性は、以下を含む。

（１）スループット、即ち、分毎に分離される細胞・粒子の総数
既存のマイクロ流体技術の細胞・粒子分離システムは、そのサイズが小さいことから、それらシステムに特徴付けられる低流量により低スループットに通常は制限される。提示されるマイクロ流体装置では、効果的な分離をおこなうために高流速が必要であることから、平均すると毎分約５×１０^６細胞・粒子となる処理スループットが得られ得る。このスループットは、曲線・螺旋状マイクロチャネルのサイズを増大させた結果として、より大きいカットオフサイズを有するように曲線・螺旋状マイクロチャネルを設計することによって、さらに増加され得る。

（２）チャネルの詰まりから起こる問題
多くの既存のマイクロ流体技術システムのマイクロチャネルのサイズは適切に小さく構成されるので、チャネルの詰まりは、高濃度又はチャネル壁における細胞・粒子吸収のため頻繁に起こる。このような状態では、全体的な流れのプロファイルにおける変化のため、分離の分解能も著しく低減される。一方で、提示されるマイクロ流体装置のマイクロチャネルのサイズは数百ミクロンの範囲になるように構成され、故にチャネルの詰まりから起こる関連の問題を受けやすくはない。

（３）スループットに応じた分離の分解能
多くの既存のマイクロ流体技術システムにおける分離の分解能は、流量（即ちスループット）に反比例する。これは、流量（及びスループット）が増加すると分離の分解能は減少することを意味する。しかし、提示されるマイクロ流体装置において、分離の分解能は高流量であっても適切に一定に留まる。さらに、流量とは別に、粒子同士（又は細胞同士）の相互作用の増加のため、細胞・粒子の濃度も分離の分解能に影響を与え得る。これについて、提示される曲線・螺旋状マイクロチャネル５０２、６０２は、適切に大きいチャネルサイズを有するので、より高濃度の粒子を許容し得る。

ＣＴＣ分離の適用について、提示されるマイクロ流体装置は、既存のＣＴＣ分離法に関する多くの主な問題に取り組んでいる。背景情報によると、ＣＴＣ濃縮の現在の手法は、その類似した浮遊密度のためＣＴＣを有する単核の画分を生成する密度勾配遠心法や、悪性上皮細胞に通常発現される（ＥｐＣＡＭなどの）接着分子に対して抗体を用いる免疫磁気的手法を含む。濃縮後、ＣＴＣは、サイトケラチン染色のための免疫学的分析、及び逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ））などの分子分析を用いて特定される。フローサイトメトリなどの代替的技術も、末梢血からＣＴＣを選別又は濃縮するために開発されている。しかしながら、これらの方法は複雑、高価であり、通常は長い処理時間を必要とする。多段階の調製が必要なので、細胞汚染又は細胞欠失が不必要に起こり得り、細胞分析結果の感度に影響し得る。さらに、これらの現存の技術の多くに細胞固定や細胞標識が要求されるので、ＣＴＣの生存性も低下する。

近年では、ＣＴＣの分離及び検出のためのマイクロ流体手法が魅力のある代替手法として出現してきており、その理由は臨床サンプルを処理するために作られた、完全に封入され且つ集積されたシステムが可能になるためであり、サンプルの欠失を最小化することに有益に役立ち、より感度の高いＣＴＣの計数が得られる。現在では、マイクロ構造を用いた物理的濾過、誘電泳動、抗ＥｐＣＡＭ被覆チャネル若しくはマイクロピラー、又は免疫標識超常磁性粒子などの異なる分離の原理を用いる種々のマイクロ流体システムがＣＴＣ分離に適用されている。しかし、物理的濾過に通常起こる問題としては、ＣＴＣの形状とサイズとの不均質性による詰まりの問題及び低感度が含まれる。これについて、標識又は化学的改変を必要としないことから誘電泳動技術が有利であるが、誘電泳動技術は、存在するＣＴＣが少数であることと、白血球とＣＴＣとのサイズが類似することとによって制限される。例えばＥｐＣＡＭなどの表面分子の使用も、存在するＥｐＣＡＭの量が異なる腫瘍型についてしばしば大きく変化し、細胞のマイクロ流体システムにおける結合により単離ＣＴＣの回収が困難であり得るため、さほど望ましくはない。

上述のものを考慮すると、提示されるマイクロ流体装置及び図７の方法７００は、既存のマイクロ流体ＣＴＣ分離法よりもいくつかの際立った有利性を示す。まず、提示のマイクロ流体装置及び方法では、高流量（即ち、毎分０．８ｍＬの血液）における連続的操作モードが実現され、臨床サンプルのより迅速な処理（即ち、全血８ｍｌ毎に１０分未満）を可能にする。また、提示のマイクロ流体装置及び方法を用いて血液サンプルを処理するために、チャネルの化学的改変又は抗体標識が必要とされず、処理時間と費用をさらに削減し、リソースの限られた状況において提示のマイクロ流体装置の使用が容易になる。さらに、曲線・螺旋状マイクロチャネル５０２、６０２のサイズ適切に大きく構成され、詰まりの問題は（完全ではなくとも）提示のマイクロ流体装置において実質的に除かれる。このため、高い反復性を有するＣＴＣ検出の感度は有益に増大される。最後に、提示のマイクロ流体装置により、単一の段階における分離後の生存ＣＴＣの収集が容易になり、選別されたＣＴＣにおける後続の生物学的分析に適切である。

＜結論＞
血液から生存希少細胞を単離するための高スループット且つ高感度の技術が曲線状チャネルを用いて提示される。装置において、慣性細胞集束（Ｉｎｅｒｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｆｏｃｕｓｉｎｇ）が、血液から低含有の細胞をサイズに基づいて単離するために用いられる。慣性とディーン抗力との、２より大きい力の比率（ｉ_Ｆ）を取得するために、曲線状マイクロチャネルのサイズを調整することによって、より大きい粒子・細胞（この場合ではＣＴＣ）が内側マイクロチャネルの横断面近傍から集束及び収集され、２未満の力の比率（ｉ_Ｆ）を有する血液細胞は外側横断面から収集される。本開発装置の適用として、高効率及び高スループットである、末梢血からのＣＴＣの分離が提示される。簡易なチャネル設計により、数ミリリットルの臨床血液サンプルを数分内で分析する能力を有する並列化を容易におこなうことが可能である。装置下流における集積チップを利用した検出により、臨床がん診断に適切な手段が提供される。最後に、安定的な層流流れを得るためにダンパーをマイクロチャネル設計に一体化する技術も提示される。

あらゆる特許、出願公開、及び本明細書に記載の引用文献の関連する教示は、その全体が参照することにより組み込まれる。

本発明は、その例示的実施形態に関して特に提示及び記載されるものの、形態及び詳細における種々の変更が、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から離れることなくおこなわれ得るということは当業者に理解される。

Claims (25)

1. サンプルにおける循環腫瘍細胞とその他の細胞とを受け入れる少なくとも１つの注入口と、
   前記サンプルが少なくとも一部のディーン渦に沿って移動させられて前記循環腫瘍細胞を前記その他の細胞から単離する、少なくとも１つの曲線状及び／又は螺旋状チャネルと、
   前記チャネルと連通して、前記単離された前記循環腫瘍細胞を提供するように構成された少なくとも１つの排出口と、を含み、
   前記チャネルは、前記循環腫瘍細胞の所望の臨界細胞サイズに基づいて事前に決定された力の比率を提供するよう構成された、マイクロ流体装置。
2. 前記装置は、使い捨てカートリッジとして構成されたマイクロ流体パッケージにおけるバイオチップとして構成されるものを含む、請求項１に記載の装置。
3. 前記チャネルの高さは、前記臨界細胞サイズの１０倍より小さくなるように構成される、請求項１又は請求項２に記載の装置。
4. 前記チャネルは、前記事前に決定された力の比率を提供するように構成された曲率半径を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
5. 前記チャネルは、前記事前に決定された力の比率を提供するように構成された水力直径を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
6. 前記水力直径は、前記チャネルのアスペクト比を構成するチャネル幅とチャネル高さとによって規定される、請求項５に記載の装置。
7. 前記チャネル幅は約３００μｍ〜６５０μｍになるように構成される、請求項６に記載の装置。
8. 前記チャネル高さは約１２０μｍ〜１８０μｍになるように構成される、請求項７に記載の装置。
9. 前記事前に決定された力の比率はディーン抗力に対する慣性揚力の比率として規定される、請求項１〜８のいずれかに記載の装置。
10. 前記事前に決定された力の比率は、
    である式によってさらに規定され、ｉ_Ｆは前記力の比率であり、Ｒ_Ｃは前記曲率半径であり、ａ_Ｃは前記細胞サイズであり、Ｄ_Ｈは前記水力直径であり、ｈは前記マイクロチャネル高さである、請求項９に記載の装置。
11. 前記事前に決定された力の比率は２以上の値である、請求項１〜１０のいずれかに記載の装置。
12. 前記曲率半径は約５ｍｍ〜２０ｍｍになるように構成される、請求項４に記載の装置。
13. 前記少なくとも１つの排出口は第１及び第２の排出口を含み、該第１及び第２の排出口は前記単離された前記循環腫瘍細胞と前記その他の細胞とがそれぞれに提供されることを可能にする、請求項１〜１２のいずれかに記載の装置。
14. 前記チャネルの全長は５ｃｍ〜１００ｃｍになるように構成される、請求項１〜１３のいずれかに記載の装置。
15. 前記サンプルは全血サンプル又は赤血球除去血液サンプルである、請求項１〜１４のいずれかに記載の装置。
16. 前記循環腫瘍細胞は、少なくとも一部のディーン渦を介して前記チャネルの一方の側から対向する側に移動させられる、請求項１〜１５のいずれかに記載の装置。
17. 前記少なくとも１つの注入口は第１及び第２の注入口を含み、該第１及び第２の注入口は、前記チャネルにおける前記サンプルの流量を調整するためにそれぞれのダンパーチャンバと連結されるように構成され、前記第１の注入口は前記サンプルを前記チャネルに導入するためのものであり、前記第２の注入口はシース流体を前記チャネルに導入するためのものである、請求項１〜１６のいずれかに記載の装置。
18. 前記チャネルは円弧状であり、その長さは半ディーン渦を生成するように構成された、請求項１〜１７のいずれかに記載の装置。
19. 前記チャネルは螺旋状であり、その長さは整数倍のディーン渦を生成するように構成された、請求項１〜１８のいずれかに記載の装置。
20. 前記注入口のいずれかに連結されるように構成された流れ抵抗チャネルをさらに含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の装置。
21. マイクロ流体装置を製造する方法であって、
    サンプルにおける循環腫瘍細胞とその他の細胞とを受け入れる少なくとも１つの注入口と、前記サンプルが少なくとも一部のディーン渦に沿って移動させられて前記循環腫瘍細胞を前記その他の細胞から単離する少なくとも１つの曲線状及び／又は螺旋状チャネルと、を設けるステップと、
    前記チャネルと連通して、前記単離された前記循環腫瘍細胞を提供するように構成された少なくとも１つの排出口を設けるステップと、
    前記循環腫瘍細胞の所望の臨界細胞サイズに基づいて事前に決定された力の比率を提供するために、チャネル高さ、曲率半径、長さ、及び流量を選択するステップとを含む、方法。
22. 前記事前に決定された力の比率を提供するために、前記チャネルの水力直径を選択するステップをさらに含む、請求項２１に記載の装置。
23. 前記事前に決定された力の比率を提供するために、流体速度を選択するステップをさらに含む、請求項２２に記載の装置。
24. サンプルにおける循環腫瘍細胞を検出するために構成された診断システムであって、
    前記サンプルにおいて前記循環腫瘍細胞を他の生体細胞から単離するように構成された請求項１〜２０のいずれかに記載のマイクロ流体装置と、
    前記マイクロ流体装置によって単離された前記循環腫瘍細胞に基づいて、診断上の指標を生成するように構成されたプロセッサとを含む、システム。
25. 前記マイクロ流体装置を貫流する前記サンプルの流体速度を調整するための流れ調節器をさらに含む、請求項２４に記載のシステム。