JP7091861B2 - 細胞培養システム及び細胞培養方法 - Google Patents

Description

本開示は、細胞培養を通じて有用な物質を効率的に入手するための細胞培養システム及び細胞培養方法に関する。

近年、医薬品業界を初めとする幅広い分野において、動物細胞が産生する抗体物質や機能性物質等の有用な物質を利用することが注目されている。有用物質の市場供給を実現するために、細胞培養における条件の好適化及び効率化、産生される有用物質の単離精製手法などにおいて様々な工夫や改良が行われている。

細胞の培養方法は、概して、バッチ式及び連続式の二つに分類される。バッチ式培養方法では、所定量の液体培地及び細胞を培養タンクに投入し、ある程度の濃度まで細胞が増殖すると、栄養素の不足又は代謝物による被毒によって増殖は停止するので、その時点で培養を終了する。連続式培養方法では、所定量の液体培地及び細胞を培養タンクに投入して細胞を増殖させると共に、液体培地の一部を抜き出して新たな液体培地と交換して投入し、補充した栄養素を利用して細胞培養を継続する。連続式の培養方法の利点として、培養を長期間継続でき、高濃度の培養細胞が得られるので、生産性の向上及び設備費が見込まれる。但し、抜き出した液体培地には細胞が含まれるので、抜き出した液体培地から細胞を分離して培養タンクに戻す必要がある。液体培地に含まれる細胞を分離又は濃縮する手段として、膜分離や遠心分離が利用される。しかし、膜分離は、目詰まりが生じ易く、細胞を損傷し易い。又、遠心分離は、分離に時間が必要であり、実験レベルの少量の分離は良好であっても、実用への適用性は決して高くない。

特許文献１は、細胞培養のための装置に関し、バイオリアクターの出口に流通する音響定在波細胞分離器が記載される。音響定在波による分離においては、異なる方向から高い周波数の波動を作用させて定在波を生成させると、定在波の節に粒子が集中する。この現象を利用して、定在波の節に細胞を集中させて液体培地から細胞が分離される。

一方、流体に含まれる粒子の分離に関する文献として、下記特許文献２があり、湾曲チャネルを有する流体力学的分離デバイスが記載される。このデバイスでは、粒子を含む流体を湾曲チャネルに供給して、湾曲チャネルを流れる流体に作用する力を利用して粒子を分離することができる。

特表２０１７－５０２６６６号公報 特表２０１６－５２６４７９号公報

前述のように、細胞の連続培養を実用化するには、培養中の液体培地から細胞を分離する分離方法が重要である。この点に関し、上記特許文献１に記載される装置においては、高い周波数の波動が作用することによる細胞への物理的影響が大きい。このため、分離後の細胞における生存率の低下が懸念され、分離した細胞を用いて培養を繰り返しても、生存率の低下による培養効率の低下を生じる可能性がある。

特許文献２に記載される分離技術は、固体粒子の分離に関するものであるので、単に、培養終了後の細胞を分取する際に利用することは予想し得る。しかし、細胞培養に適用する場合には、細胞への影響を検討する必要があり、特に、培養途中の細胞を液体培地から分離する場合、分離技術に求められる要件はより厳しくなる。

このように、培養終了後の培地から細胞を分離する場合の要件と、培養途中の細胞を液体培地から分離する場合の要件とは異なるので、分離技術を細胞培養に適用するには、効率的な細胞培養が可能であるかについて十分に検討を重ねる必要がある。

本開示は、効率的に細胞を培地から分離すると共に、分離後の細胞が増殖能力を好適に維持して連続培養を実施可能な細胞培養システム及び細胞培養方法を提供することを課題とする。

上記課題を解決するために、培地から細胞を分離する際に細胞に及ぶ影響について検討し、流体力分離技術を利用して、培地から効率的に細胞を濃縮分離して培養を継続することが可能であることを見出した。

本開示の一態様によれば、細胞培養システムは、細胞を培養する液体培地を収容する培養槽と、細胞分離装置とを有する細胞培養システムであって、前記細胞分離装置は、矩形断面を有する湾曲流路を有し、前記湾曲流路を流れることによって生じる渦流れを利用して液体培地に含まれる細胞から相対的に大きい細胞を分離する流体力分離装置と、前記流体力分離装置を流通する間の前記液体培地における圧力変動による細胞生存率の低下が抑制されるように制御された圧力環境で前記液体培地を前記流体力分離装置に流通させる送液部とを有することを要旨とする。

前記流体力分離装置は、前記液体培地を取り入れる単一の導入口と、分離した液体培地を排出する少なくとも２つの導出口とを有し、前記導出口の１つから相対的に大きい細胞が濃縮して含まれる液体培地が排出され、もう１つの導出口から相対的に小さい細胞が含まれる残部の液体培地が排出されるように構成するとよい。前記送液部は、前記流体力分離装置へ液体培地を供給するための流動圧を液体培地に付勢する付勢装置を有する。前記送液部は、前記流体力分離装置へ導入される液体培地と、前記流体力分離装置から導出される液体培地との圧力差が所定値以下になるように圧力環境を制御する圧力制御機構を有する。圧力制御によって、細胞の生存率が高く維持される。

前記圧力制御機構は、前記流体力分離装置へ供給される液体培地の圧力を監視する圧力監視部と、前記圧力監視部によって監視される圧力に基づいて、前記流体力分離装置へ供給される液体培地の圧力を調整する圧力調整部材とを有するとよい。前記送液部は、更に、前記流体力分離装置へ供給される液体培地の流量を制御する流量制御機構を有するとよい。前記流量制御機構は、前記流体力分離装置へ供給される液体培地の流量を監視する流量計と、前記流量計によって監視される流量に基づいて、前記流体力分離装置へ供給される液体培地の流量を調整する流量調整部材とを有し、分離する細胞の大きさに対応して、前記流体力分離装置へ供給される液体培地の流量が好適に調整される。

細胞培養システムは、更に、前記細胞分離装置の前記流体力分離装置によって分離される相対的に大きい細胞を含む液体培地を前記培養槽に還流して、前記培養槽と前記細胞分離装置との間で液体培地を循環させる循環システムを有する。更に、残部の液体培地の量に対応する新たな液体培地を前記培養槽に補充する培地補充部を有する。これにより、細胞培養が継続的に行うことができる。前記培地補充部は、前記培養槽へ補充される新たな液体培地の量を監視する監視装置と、前記監視装置によって監視される量に基づいて、前記培養槽へ補充される新たな液体培地の流量を調整する流量調整部材とを有し、流量計、液面計又は重量計などを用いて上記監視を行うことができる。

前記送液部は、前記培養槽と前記流体力分離装置とを接続する供給路、及び、 前記供給路において一時的に液体培地を収容し、収容される液体培地を加圧して前記流体力分離装置へ液体培地を供給するための流動圧を付与する加圧容器を有するように構成可能である。その場合、前記細胞分離装置は、更に、前記流体力分離装置のもう一つの導出口から排出される残部の液体培地を収容する一時収容器と、前記供給路における前記加圧容器の下流側と前記一時収容器とを接続し、前記一時収容器に収容される残部の液体培地を前記流体力分離装置へ再度供給する戻し路と、切り替え機構とを有するとよい。切り替え機構は、前記培養槽から前記流体力分離装置への液体培地の供給と、前記戻し路から前記流体力分離装置への残部の液体培地の供給とを切り替え、前記切り替え機構の切り替えによって、前記培養槽の液体培地及び前記一時収容器の残部の液体培地が交互に前記流体力分離装置に供給することが可能である。

前記切り替え機構は、前記供給路における前記加圧容器の上流側及び下流側、並びに、前記戻し路の各々に設けられる開閉弁又は逆止弁を有するとよい。前記細胞分離装置は、更に、前記流体力分離装置の前記導出口の１つから、相対的に大きい細胞が濃縮して含まれる液体培地を前記培養槽へ送る還流路を有するとよい。前記供給路の入口を前記還流路の出口と兼用可能なように、前記還流路の出口側末端は、前記供給路の入口近くに接続されるように構成可能である。

又、本開示の一態様によれば、細胞培養方法は、液体培地で細胞を培養する細胞培養と、前記液体培地から相対的に大きい細胞を含む液体培地を分離する細胞分離とを有する細胞培養方法であって、前記細胞分離は、矩形断面を有する湾曲流路を流れることによって生じる渦流れを利用して、細胞を含む液体培地から相対的に大きい細胞が濃縮して含まれる培地を分離する分離処理と、前記湾曲流路を流通する間の液体培地における圧力変動による細胞生存率の低下が抑制されるように、前記分離処理を流通する前記液体培地の圧力環境を制御する圧力制御とを有することを要旨とする。

上記細胞培養方法は、更に、前記分離処理によって分離される相対的に大きい細胞を含む液体培地を前記細胞培養に還流して、前記細胞培養と前記分離処理との間で液体培地を循環させる循環処理を有する。更に、前記分離処理において分離された相対的に小さい細胞を含む残部の液体培地の量に対応する新たな液体培地を前記細胞培養に補充する培地補充を有することによって、継続的な細胞培養が可能である。

本開示によれば、培養細胞を含む液体培地から効率的に細胞を分離すると共に、分離後の細胞の増殖能力を好適に維持することができる。故に、効率的に連続培養を実施可能な細胞培養システム及び細胞培養方法を提供され、細胞が産生する有用物質を効率的に得ることが可能である。

細胞培養システムの一実施形態を示す概略構成図。 細胞培養システムの他の実施形態を示す概略構成図。 流体力分離装置による細胞分離におけるＤｅ数と分離効率との関係を示すグラフ。 細胞分離において使用するポンプと細胞の生存率の関係を示すグラフ。 細胞分離を伴う培養とバッチ培養とを比較するためのグラフであり、（ａ）は培養時間(時間)と生細胞密度(×１０⁶ cells/mL)との関係、（ｂ）は培養時間(時間)と平均細胞径(μｍ)との関係を示す。 図５に示す培養における培養時間（時間）と細胞の生存率（％）との関係を示すグラフ。 細胞培養システムの他の実施形態を示す概略構成図。 細胞培養システムの他の実施形態を示す概略構成図。 細胞培養システムの他の実施形態を示す概略構成図。

本開示の実施形態について、図面を参照して、以下に詳細に説明する。尚、実施形態において示す寸法、材料、その他の具体的な数値等は、内容の理解を容易とするための記載であって、特に断る場合を除き、本開示を限定するものではない。又、本願明細書及び図面において、実質的に同一の機能及び構成を有する要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略し、本開示に直接関係のない要素は、図示を省略する。

液体中に含まれる粒子を分離する分離技術の一つに、流体に発生するディーン渦の作用を利用するものがある（前記特許文献２参照。以下、この技術を流体力分離と称する）。これは、流れ方向に垂直な断面が矩形である一側に湾曲した湾曲流路を流れる液体にディーン渦が発生することによって、液体中の粒子の分布に偏りが生じることを利用した分離技術である。湾曲流路を流れる粒子は、その大きさによって流路における分布が異なる変化をする（前記特許文献２参照）。具体的には、流路の断面において輪を描くような粒子分布が形成されて、粒子は螺旋状に流路を流れ、この際、相対的に大きい粒子が輪の外側に、相対的に小さい粒子が内側に位置する。更に、所定の分離条件に設定することにより、粒子の分布形態は更に変化し、一定の大きさを超える粒子が流路の外周側へ収束する。

本開示においては、液体培地に含まれる培養細胞の分離に上述の流体力分離を適用し、所定の大きさ以上の細胞が湾曲流路の外周側へ収束する分離形態を利用する。本開示の培養システムにおいては、比較的高い流速で液体培地を湾曲流路に供給する。供給される液体培地が湾曲流路を流れる間に、相対的に小さい細胞は、前述したように、流路の断面において輪を描くように分布するが、相対的に大きい細胞は、湾曲流路の外側（外周側）に遍在するように収束する。従って、大きい細胞が集中する画分と残部の画分とに分離することによって、相対的に大きい細胞が濃縮した液体培地を分取することができる。大きい細胞が濃縮した画分は、相対的に小さい細胞を少量含むが、分離前に比べて小さい細胞の濃度は大幅に減少する。残部の画分には、小さい細胞の大部分が含まれ、更に、細胞培養によって生じる代謝物、老廃物の微小凝縮物、死細胞片（デブリ）等の多くも含まれる。このようにして、液体培地を流通させる条件によって分離状態を調整して、相対的に大きな粒子と小さい粒子とを分別することが可能である。供給する液体培地の流速（流量）、及び、湾曲流路における断面の大きさの設定によって、濃縮する細胞の大きさを調整することができる。

細胞は、活性が高い状態においては大きく生育するが、活性が低下すると、比較的小さい状態で死滅し分解する。相対的に小さい細胞の多くは、死細胞又は死細胞片であり、ＤＮＡ合成途中の活性な細胞が含まれる割合は少ない。故に、相対的に大きい細胞が濃縮した画分を液体培地から分取することによって、代謝物などの不要物が除去されてその量が低下する。分取した相対的に大きい細胞の画分を培養槽に還流させると共に、取り除いた残部の画分に相当する量の新たな液体培地を培養槽に加えることによって、栄養素が補給されるので、細胞培養の継続が可能である。従って、上記のような細胞分離と、分離細胞の還流とを繰り返して、細胞培養が連続的に進行する。

流体力分離は、細胞の分離において非常に有効であるが、効率的な細胞培養を継続するために、分離中の細胞へのダメージを抑制可能な分離条件が整えられる。この分離条件として、分離中に細胞に加わる圧力の変動（圧力低下）が一定レベルを超えないように、湾曲流路へ液体培地を供給する圧力環境が制御される。細胞は、比較的高圧下でも耐性を有し、例えば、１ＭＰａ程度の加圧供給においても細胞の生存率は維持される。しかし、圧力変動が大きいと、０．６ＭＰａ程度の供給圧力（入口圧力）でも、細胞のダメージが大きく、生存率が低下する。従って、分離中に細胞に加わる圧力の変動（入口圧力と出口圧力との差）が所定値以下となるように液体培地の供給が制御される。具体的には、圧力変動（圧力差）が０．６０ＭＰａ未満になるように制御され、好ましくは０．４５ＭＰａ以下、より好ましくは０．４０ＭＰａ以下となるように設定するとよい。上記のように圧力変動が抑制された分離条件においては、細胞の生存率は９８％程度以上に維持することができるので、濃縮分離された大きい細胞を培養槽に還流させて、増殖効率を維持することができる。

以下に、細胞培養システムの構成について、図１に示す一実施形態を参照して説明する。図１の細胞培養システム１は、細胞を培養する液体培地を収容する培養槽２と、細胞分離装置３とを有する。細胞分離装置３は、流体力分離装置４と送液部５とを有し、培養槽２の液体培地Ｃは、送液部５を通じて流体力分離装置４へ供給される。流体力分離装置４は、流れ方向に垂直な一定の矩形断面を有する湾曲流路を内部に有し、湾曲流路の一端において液体培地Ｃを取り入れる単一の導入口４１と、湾曲流路の他端において液体培地を分離して排出する少なくとも２つの導出口４２，４３とを有する。流体力分離装置４は、湾曲流路を流れることによって一方向に旋回する液体に生じる渦流れを利用して、液体培地Ｃに含まれる細胞から相対的に大きい細胞を流路の外側（外周側）に遍在させる。従って、湾曲流路から排出される液体培地を、外側の画分と内側の画分とに分割することによって、外側の画分として、相対的に大きい細胞が濃縮された液体培地を分離することができる。１つの導出口４２から相対的に大きい細胞が濃縮して含まれる液体培地が排出され、もう１つの導出口４３から相対的に小さい細胞が含まれる残部の液体培地が排出される。湾曲流路の湾曲形状は、略円周状、略円弧（部分円周）状、螺旋状等が挙げられ、これらの形状の何れであってもよい。流体力分離装置４は、１つの湾曲流路を有する流路ユニットを構成単位として設計することができる。具体的には、流路ユニットとして、内部に１つの湾曲流路が形成された平層状の成形体をプラスチック等で形成し、その際に、湾曲流路の両末端が成形体の端面に開口して１つの導入口と少なくとも２つの導出口を有するように構成する。このような成形体を流路ユニットとして用いて、１つの流路ユニット、又は、複数の流路ユニットの組み合わせによって流体力分離装置を構成することができる。複数の流路ユニットを積層して並列状の流路を構成することによって、液体培地の処理流量を高めることができる。

送液部５は、培養槽２と流体力分離装置４とを接続する配管で構成される供給路６を有し、培養槽２の細胞を含む液体培地Ｃは、供給路６を通じて流体力分離装置４へ送られる。図１の細胞培養システム１は、還流路７を構成する配管を有し、還流路７は、培養槽２と細胞分離装置３との間で液体培地を循環可能なように、細胞分離装置３の流体力分離装置４と培養槽２とを接続する。つまり、細胞培養システム１は、供給路６及び還流路７によって構成される循環システムを有する。

細胞分離装置３の流体力分離装置４によって分離される相対的に大きい細胞を含む液体培地の画分は、還流路７を通じて培養槽２に還流されて、更に細胞培養が継続される。相対的に小さい細胞を含む残部の液体培地Ｃ’の画分（内周側の画分）は、流体力分離装置４から回収路８を通じて排出される。更に、流体力分離装置４から排出される残部の液体培地Ｃ’の量に対応する新たな液体培地Ｃ０を培養槽２に補充するために、培地補充部９が備えられており、培養槽２内の液体培地Ｃは、新たな液体培地Ｃ０の補充によって、一定量に維持される。

流体力分離装置４における細胞の分離効率は、湾曲流路に供給される液体におけるＤｅ数及び圧力によって変化し、好適な分離が可能なＤｅ数及び圧力の適正な範囲が存在する。ディーン数は、式：Ｄｅ＝Ｒｅ（Ｄ／２Ｒc）^1/2、によって表される（Ｒｅ：レイノルズ数(-)、Ｄ：代表長さ(ｍ)、Ｒc：流路の旋回半径(ｍ)）。Ｄｅ数は、液体の流速に比例するので、流体力分離装置に供給される液体の流速及び圧力を適正に制御することによって、好適な細胞分離が実施される。概して、Ｄｅ数が３０以上且つ１００以下であることが好ましく、５０～８０程度であると更に好ましい。従って、このような範囲のＤｅ数になるように液体培地の流速（流量）が設定される。

細胞培養システム１の送液部５は、流体力分離装置４へ液体培地Ｃを供給するための流動圧を液体培地Ｃに付勢する付勢装置、具体的には、ポンプ１０を有する。ポンプ１０が付与する流動圧によって、液体培地Ｃが流体力分離装置４へ供給される流量及び流圧は変化する。分離された相対的に大きい細胞を培養槽２に還流して細胞培養を継続する上で、細胞の生存率は重要な要素である。この点に関して、流体力分離装置４における分離の間に細胞の生存率は、圧力変動の大きさによって変化することが判明した。つまり、生存率の低下を防止するには、細胞分離における圧力変動を少なくすることが有効である。従って、この点に基づいて、送液部５が液体培地Ｃを流体力分離装置４に流通させる圧力環境は、流体力分離装置４を流通する間の液体培地における圧力変動による細胞生存率の低下が抑制されるように制御される。

つまり、送液部５は、圧力制御機構を有し、これにより、流体力分離装置４へ導入される液体培地と、流体力分離装置４から導出される液体培地との圧力差が所定値以下になるように圧力環境を制御する。圧力制御機構は、流体力分離装置４へ供給される液体培地の圧力を監視する圧力監視部と、圧力監視部によって監視される圧力に基づいて、流体力分離装置４へ供給される液体培地の圧力を調整する圧力調整部材とによって構成することができる。具体的には、図１の細胞培養システム１においては、圧力監視部として圧力計１１が、圧力調整部材として圧力調整弁１２が供給路６上に設けられる。この細胞培養システム１においては、流体力分離装置４の導出口４２，４３における導出側圧力は、大気圧に開放されるので、導入される液体培地と導出される液体培地との圧力差は、圧力計１１によって測定される圧力（ゲージ圧）に等しい。従って、この測定値に基づいて圧力制御を行える。分離中の細胞における生存率の低下を防止するために、圧力差が０．６０ＭＰａ未満になるように圧力環境は制御され、好ましくは、０．４５ＭＰａ以下、より好ましくは０．４０ＭＰａ以下になるように制御される。

前述したように、流体力分離装置４における分離効率は、湾曲流路を流通する液体培地の流速に依存する。従って、送液部５は、更に、流体力分離装置４へ供給される液体培地の流量を制御する流量制御機構を有し、流体力分離装置４の湾曲流路を流通する液体培地が適正な流速になるように、供給路６を流通する液体培地の流量が制御される。流量制御機構は、流量計１３と、流量調整弁１４とによって構成される。流量計１３は、流体力分離装置４へ供給される液体培地Ｃの流量を監視し、流量調整弁１４は、流量計１３によって監視される流量に基づいて、流体力分離装置４へ供給される液体培地Ｃの流量を調整する流量調整部材として機能する。分離する細胞の大きさに対応して、流体力分離装置４へ供給される液体培地の流量が調整される。

細胞培養システム１において、流体力分離装置４へ供給する液体培地の流量を、ポンプ１０の駆動制御によって適正に調整可能である場合、流量調整弁１４を省略することが可能である。又、流体力分離装置４へ供給する液体培地の供給圧を、ポンプ１０の駆動制御によって適正に調整可能である場合、圧力調整弁１２を省略可能である。従って、流体力分離装置４における処理能力（流路断面の大きさ及び流路数）に基づいて、供給路６及び還流路７の寸法を適正に設計することによって、細胞培養システムの構成を簡略化することができる。

細胞は、流体力分離装置４における圧力変動が上記のような範囲であれば、ある程度高い静圧にも耐性を有する。つまり、流体力分離装置４から排出される液体培地における圧力が高ければ、流体力分離装置４へ導入される液体培地に適用可能な圧力範囲の上限は高くなる。従って、流体力分離装置４へ導入される液体培地に加わる圧力が０．６ＭＰａ以上になる条件設定に対しても、液体培地の導入時と排出時の圧力差を減少させて対応することが可能である。つまり、還流路７及び回収路８に圧力調整弁を設けて、流体力分離装置４の導出口４２，４３から排出される液体培地における出口圧力を増加させて、圧力差を減少させればよい。この場合、還流路７及び回収路８に圧力計を設置して、適切な圧力差になるように排出圧力を監視すると好適である。この際、還流路７を流れる液体培地についても急激な圧力変動が生じないように圧力環境を確認することが望ましい。

細胞培養システム１の培地補充部９は、新たな液体培地Ｃ０を収容する培地タンク１５、及び、培地タンク１５と培養槽２とを接続する補給路１６を有し、培地タンク１５の新たな液体培地Ｃ０を培養槽２に補充して、培養槽２内の液体培地を一定量に維持する。つまり、分割された残部の液体培地Ｃ’（内周側の画分）の量に対応する量の新たな液体培地Ｃ０が、培地タンク１５から補給路１６を通じて補充される。このために、培地補充部９は、培養槽２へ補充される新たな液体培地Ｃ０の量を監視する監視装置と、監視装置によって監視される量に基づいて、培養槽２へ補充される新たな液体培地の流量を調整する流量調整部材とを有する。図１の細胞培養システム１においては、監視装置として、培養槽２に設置される液面計１７が設置され、流量調整部材として、流量調整弁１８が補給路１６に設置される。液面計１７が検出する液面レベルに応じて、流量調整弁１８が制御され、培養槽２の液体培地の液面が一定に維持されるように、培地タンク１５に付設されるローラーポンプ１９によって供給される液体培地Ｃ０の量が調整される。流体力分離装置４から培養槽２へ還流される液体培地の量は、流体力分離装置４において分割される相対的に小さい細胞を含む残部の液体培地の画分だけ減少している。従って、培養槽２内の液面を維持することで、相対的に小さい細胞を含む残部の液体培地の画分に対応した補充がなされる。液面計の代わりに、培養槽２の重量を測定する重量計を用いても、このような補充を行うことができ、重量が一定に維持されるように新たな液体培地を補充すればよい。或いは、培養槽２に還流される相対的に大きい細胞を含む液体培地の量、又は、相対的に小さい細胞を含む残部の液体培地の量を測定する測定装置（流量計）を用いてこのような補充を行ってもよい。具体的には、還流路７又は回収路８に流量計を設置して、その測定値に基づいて、新たな液体培地を供給することができる。

回収路８には、回収タンク２０が接続され、相対的に小さい細胞やデブリ等を含んだ液体培地が収容される。この液体培地は、フィルター２１によってデブリや凝集物が除去され、この後、精製処理によって液体培地から有用な成分を回収可能である。フィルター２１は、除去対象に応じて、適切な孔径のものを選択すればよく、例えば、精密濾過膜、限外濾過膜等が挙げられる。

培養槽２、培地タンク１５及び回収タンク２０は、微生物汚染を防止可能な容器であり、各々、ヒーター又は冷却器、及び、温度調節機能が装備されたものが使用され、内部の液体培地は、細胞培養又は保管に適した温度に維持される。培養槽２は、細胞を損傷しない適切な速度で攪拌可能な攪拌装置を備え、液体培地を均一化する。又、必要に応じて、培養する細胞に適した培養環境に調整可能なように、酸素／二酸化炭素／空気の量、ｐＨ、導電率、光量等の調整機能を備えたものを適宜利用すればよい。

上述のように、細胞培養システムにおいては、細胞の生存率を好適に維持するために、流体力分離装置４へ供給される液体培地の圧力環境が制御される。細胞の生存率は、細胞を含んだ液体培地に流動圧を供給するポンプ１０による影響も受けるので、細胞の生存率を維持する上で好適な送液手段をポンプ１０として選択することが好ましい。細胞の生存率への影響を抑制するには、細胞に剪断力を加えない方式のポンプであることが好ましく、具体的には、往復動又は回転動による容積変化を利用して一定容積の液を押し出す容積式ポンプを使用するとよい。容積式ポンプとしては、例えば、ピストンポンプ、プランジャポンプ、ダイヤフラムポンプ、ウィングポンプ等の往復ポンプ、歯車ポンプ、ベーンポンプ、ねじポンプ等の回転ポンプが挙げられる。一実施形態として、コンプレッサを付設した加圧タンクを利用するものが挙げられ、加圧タンクに収容した液体培地にコンプレッサで加圧することによって、加圧タンクから流体力分離装置へ液体培地を圧送することができる。

上述のような細胞培養システム１において実施可能な細胞培養方法について、以下に記載する。細胞培養方法は、液体培地で細胞を培養する細胞培養工程と、液体培地から相対的に大きい細胞を含む液体培地を分離する細胞分離工程とを有する。細胞培養工程は、上記培養槽２において行われ、細胞分離工程は、上記細胞分離装置３において実施される。細胞分離工程は、上記流体力分離装置４において実施される分離処理と、分離処理を流通する前記液体培地の圧力環境を制御する圧力制御とを含む。前記分離処理においては、矩形断面を有する湾曲流路を流れることによって生じる渦流れを利用して、細胞を含む液体培地から相対的に大きい細胞が濃縮して含まれる培地を分離する。圧力制御は、湾曲流路を流通する間の液体培地における圧力変動による細胞生存率の低下が抑制されるように実施される。

分離処理において、細胞を含む液体培地は、矩形断面を有する湾曲流路へ単一の導入口から導入され、均一な状態で湾曲流路に供給される。流体力分離装置の湾曲流路は、流れ方向に垂直な断面（径方向断面）が矩形の流路である。均一な液体培地が湾曲流路を流れる間に、相対的に小さい細胞及び微細粒子は、ディーン渦に載って、矩形断面において輪を描くように分布が変化する一方、相対的に大きい細胞は、流路の外周側に滞留する揚力が比較的強く作用するため、分布が外周側に集中する。湾曲流路の末端出口は、外周側に位置する導出口４２と内周側の導出口４３に二分割される。外周側の導出口４２から相対的に大きい細胞が濃縮して含まれる液体培地が排出され、内周側の導出口４３から相対的に小さい細胞及び微細粒子が含まれる残部の液体培地が排出される。

前述の式で示したように、Ｄｅ数は、湾曲流路の旋回半径Ｒc及び流路の断面寸法によって変化する（前述の式における代表長さＤは、湾曲流路の幅と見なすことができる）。従って、湾曲流路の設計に基づいてＤｅ数が好適な値になるように調整することができ、それによって、流体力分離装置は、細胞の濃縮分離を良好な分離効率で実施することができる。又、流体の流量は、湾曲流路の断面の幅（径方向）及び高さの何れかの設定によって調節可能であるので、湾曲流路の設計に基づいて、適正な圧力及び所望の流量で細胞の分離処理を実施可能なように流体力分離装置を構成することができる。従って、湾曲流路の設計は、分離対象の条件（細胞の寸法分布、培地の粘度等）に応じて、好適な分離が可能なように適宜変更可能である。細胞の分離効率の観点から、湾曲流路が、アスペクト比（幅／高さ）が１０以上の長方形の断面を有する流路であると好適である。このような湾曲流路に、液体培地を１００～５００ｍＬ／分程度の流量で供給することによって、分離が良好に進行し、５０億～２５０億細胞／分程度の効率で細胞の分離処理を行うことができる。相対的に大きい細胞として、粒径が７０μｍ程度以上の細胞を、外周側の画分として濃縮分取することができ、輪状に分布する２０μｍ程度以下の相対的に小さい細胞の大部分は、内周側の画分として分取できる。湾曲流路の末端出口の設計（導出口の分割位置）によって、外周側の画分に含まれる細胞の大きさ及び分離精度を調整することができ、外周側の画分に含まれる細胞の大きさの下限を７０μｍより小さくすることも可能である。大きい細胞は、小さい細胞に比べて生存率及び活性が高く、外周側の画分を分取することによって、死細胞や細胞片を減量することができる。従って、分離処理によって分離される相対的に大きい細胞を含む液体培地を培養槽における細胞培養に還流して、細胞培養と分離処理との間で液体培地を循環させる循環処理を行うと、細胞の培養効率を高めることができる。この際、分離処理において分離された相対的に小さい細胞を含む残部の液体培地（内周側の画分）の分だけ、還流する液体培地の量が減少するので、この量に対応する新たな液体培地を培養槽に添加して、細胞培養における液体培地を補充する培地補充を行う。これにより、細胞が使用する栄養素が継続的に補充され、代謝物の濃度が希釈されるので、連続的に培養を行うことができる。

流体力分離装置における細胞の分離状態（分取する細胞の大きさ、分取比率）は、出口における導出口の分割位置によって異なる。概して、外周側画分／内周側画分の分割比率（容積比）が、９０／１０～５０／５０程度になるように流路出口における断面積比を設計すると、上述のような細胞の濃縮分離に好適である。図１の細胞培養システムにおいて、流体力分離装置は、湾曲流路の出口として、２つの導出口を有するが、３つ以上の導出口に分割してもよい。末端出口を３つ以上の導出口に分割した場合、培養槽に還流させる画分の量を状況に応じて変更可能なように構成してもよい。

細胞培養システムは、図２に示す実施形態のように、流体力分離装置を複数使用するように応用することができる。図２の細胞培養システム１ａは、２つの流体力分離装置４，４ａを用いて２段階の分離処理を実施するように構成される。具体的には、液体培地Ｃの分離によって流体力分離装置４から排出される残部の液体培地Ｃ’、つまり、内周側の画分に含まれる相対的に小さい細胞を更に分離するための２段目の流体力分離装置４ａを有するように構成される。１段目の流体力分離装置４から回収路８’を通じて排出される残部の液体培地Ｃ’を収容する回収タンク２０ａは、供給路６ａによって２段目の流体力分離装置４ａと接続される。供給路６ａには、ポンプ１０ａ、圧力計１１ａ、圧力調整弁１２ａ、流量計１３ａ及び流量調整弁１４ａが設置される。回収タンク２０ａの液体培地Ｃ’がポンプ１０ａによって流体力分離装置４ａの導入口４１ａに供給され、液体培地Ｃ’は、更に２つの画分に分割される。液体培地Ｃ’に含まれる細胞のうち相対的に大きいものを含む画分（外周側）は、導出口４２ａから還流路７ａを通じて培養槽２へ還流される。相対的に小さいものを含む残部の液体培地Ｃ”（内周側の画分）は、導出口４３ａから回収路８ａを通じて回収タンク２０ｂに供給される。回収タンク２０ｂに収容される液体培地Ｃ”は、フィルター２１を通して、精製処理へ供給される。

図２の細胞培養システム１ａでは、２段階の細胞分離を行うことによって、液体培地に含まれる成分が３つに分割される。２段目の流体力分離装置４ａにおける分離条件は、供給路６ａを通じて供給される液体培地Ｃ’の流量及び供給圧の制御によって調整可能である。２つの流体力分離装置４，４ａにおける分離条件を適切に設定することによって、細胞の分離精度及び濃縮度の改善が可能である。一例として、容量が２００Ｌの培養槽２を用いて構成した図２の細胞培養システム１ａにおいて、例えば、以下のような培養方法を実施することができる。

定格の処理流量が３００ｍＬ／分である流路ユニットを６基用いて流体力分離装置４を構成し、同じ流路ユニットを２基用いて流体力分離装置４ａを構成した場合、１段目の流体力分離装置４においては１８００ｍＬ／分の流量で分離処理を進行可能である。この分離によって相対的に大きい細胞を含む液体培地を１２００ｍＬ／分の流量で培養槽２に還流し、残部の液体培地Ｃ’を、回収タンク２０ａから２段目の流体力分離装置４ａに供給すると、２段目の流体力分離装置４ａにおいて６００ｍＬ／分の流量で分離処理が適正に進行可能である。２段目の流体力分離装置４ａから４００ｍＬ／分の流量で外周側の液体培地を培養槽２に還流すると、２００ｍＬ／分の流量で液体培地Ｃ”が回収タンク２０ｂから精製工程へ供給される。培養槽２においては、液体培地の量を維持するために、２００ｍＬ／分の流量で新たな液体培地が補充され、一日の培地交換量は、２８８Ｌ（培地交換率：約１．４倍）となる。このように、濃縮された相対的に大きい細胞を継続的に細胞培養に導入すると共に、新たな液体培地の添加により栄養素が補充され、培養を継続的に進行させることができる。培養槽２の液体培地から死細胞等が徐々に取り除かれ、相対的に大きい培養細胞が増加する。

細胞培養システム１，１ａのシステム設計においては、流体力分離装置における適正な処理流量（定格流量）が基本となるので、培養槽２の容量と流体力分離装置の処理流量とのバランスが適正になるように細胞培養システムを構成するとよい。培養槽２の液体培地容量が、流体力分離装置における処理を連続して行うと適正な培地交換率を超えるような比較的少ない量である場合には、培地交換率が適正な値になるように流体力分離装置における処理量を設定する。そして、定格流量に基づいて処理時間を計算し、分離処理を複数回に分けて一定時間おきに断続的に実施するとよい。

上述のような細胞培養システムを用いて、様々な細胞について細胞培養方法を実施することができ、培養細胞が産生するタンパク質や酵素等の各種有用物質を回収して医薬品等の製造に利用できる。具体的には、動物細胞（ほ乳類、鳥類又は昆虫の細胞）のような真核細胞、及び、真菌細胞（大腸菌等の菌類又は酵母の細胞）の培養に適用可能であり、例えば、チャイニーズハムスターの卵巣細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＰＥＲ．Ｃ．６細胞、骨髄腫細胞、ＨＥＲ細胞などが挙げられる。このような細胞培養によって得られる有用物質として、例えば、免疫グロブリン（単クローン抗体又は抗体フラグメント）、融合タンパク質、インスリン類、成長ホルモン類、サイトカイン類、インターフェロン類、グルカゴン、アルブミン、リソソーム酵素、ヒト血清アルブミン、ＨＰＶワクチン、血液凝固因子、エリスロポエチン類、ＮＳ０やＳＰ２／０等の抗体などが挙げられる。細胞培養は、各細胞について判明している培養条件に基づいて、常法に従って培養を行えばよい。細胞培養に使用する液体培地についても、合成培地、半合成培地、天然培地の何れの液体培地であってもよく、培養する細胞に適したものを適宜選択して使用すればよい。概して、特定の菌種を増殖させるように処方された選択増菌培地や選択分離培地が好適に使用される。市販の液体培地から適宜選択して使用しても、或いは、既知の処方に従って栄養素及び精製水等を用いて調製してもよく、検査を目的とする鑑別剤（ｐＨ指示薬、酵素基質、糖類等）や、目的外微生物の発育を抑制する選択剤などを必要に応じて添加してよい。流体力分離を効率的に進行させるために、粘性があまり高くない液体培地を使用すると好ましい。

培養細胞が産生する有用物質が液体培地に含まれる場合、流体力分離装置から回収される内周側の画分の精製によって、有用物質を回収することができる。産生する有用物質が培養細胞内にある場合も、流体力分離装置から回収される内周側の画分には、死細胞から放出された有用物質が含まれ得るので、同様に、回収画分から有用物質を回収可能である。しかし、細胞培養と並行して、培養槽２の液体培地を一定割合で抜き出して細胞を分取すると、細胞から有用物質を効率的に回収することができる。この際、細胞培養システム１，１ａの流体力分離装置４を利用して、細胞を濃縮して回収することができる。このためには、流体力分離装置４の還流路７を分岐させて、導出口４２から排出される相対的に大きい細胞を含む液体培地の供給先を培養槽２から切り替え可能であるように変更するとよい。この回収形態においては、相対的に大きい細胞を含む液体培地の抜き出しと、培養槽２への還流とを交互に行う方法、及び、培養槽２における細胞の増殖速度に応じた所定割合で抜き出しを連続的に行う方法の何れも可能である。

図３は、流体力分離装置における分離効率とＤｅ数との関係を調べた結果を示すグラフである。図３は、流路の寸法が異なる５種類の流体力分離装置（装置Ａ１～Ａ５）の何れかと、ポリマー粒子（スチレン－ジビニルベンゼン共重合体）又はＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの卵巣細胞）の何れかの分離対象を用いて、流体力分離装置による分離を行った結果である。何れの分離対象も平均粒子径が１４～１８μｍの範囲にある。分離効率は、［１－（ｘ／Ｘ）］×１００（％）として計算した値であり、計算式中のＸは、分離前の液体に含まれる分離対象の濃度、ｘは、分離後の内周側の画分に含まれる分離対象の濃度を示す。何れの分離対象も粒径分布が狭いので、粒子又は細胞の全量が外周側の画分に濃縮される状態の分離効率を１００％と見なした評価である。グラフから理解されるように、ポリマー粒子及び動物細胞の何れにおいても、Ｄｅ数が７０前後において最も分離効率が高くなり、概して、Ｄｅ数が５０～８０の範囲になる条件において高い分離効率を達成することができる。

図４は、流体力分離装置へ液体培地を送るポンプの種類による細胞の生存率への影響を調べた結果を示す。細胞を培養した液体培地を、ポンプを用いて０．３ＭＰａの吐出圧で流体力分離装置へ供給し、分離装置から排出される液体培地の２つの画分を纏めて収集し、少量をサンプリングした。細胞計測装置（ベックマンコールター社製、製品名：Vi-Cell）によりサンプルの細胞の生存率（％、全細胞中の生細胞の割合）を計測した結果である。グラフ中の「ガス圧送」は、コンプレッサが接続された加圧タンクから液体培地を圧縮空気で圧送する形態であり、容積式ポンプとして分類することができる。図４から、遠心ポンプにおいては細胞における損傷が大きく、容積式ポンプに分類される他のポンプでは、生存率の低下が防止されることが判る。

前述したように、流動圧を与える付勢装置として使用するポンプの種類は、細胞の生存率に影響を与え、耐圧容器を用いたガス圧送を利用すると、好適に細胞培養を継続する上で有利である。ガス圧送によって流体力分離装置へ液体培地を供給する実施形態について、図７～９を参照して説明する。図１，２の細胞培養システムに関する説明では、流路の流通を規制する弁制御について省略しているが、細胞培養システムにおいては、通常、流路に開閉弁が設けられ、操作の開始時及び終了時に開閉作業が行われる。以下の細胞培養システムにおいては、系内の圧力変動に関連して弁制御の工夫が可能であるので、弁制御についても合わせて説明する。尚、図７～９の細胞培養システムにおいて、新たな培地を培養槽へ補給する培地補充部については、図１，２と同様であるので、その図示及び説明は省略し、前述を参照するものとする。

図７の細胞培養システム１ｂは、液体培地に流動圧を付与する付勢装置として、ガス圧送するガスラインを用いるように構成した実施形態である。このために、液体培地Ｃを一時的に収容して流動圧を付与するための加圧容器５０が設置される。更に、この実施形態は、一時収容器５１及び戻し路５２が設けられ、ガス圧送を利用して、流体力分離装置４において分離される内周側の画分に対して流体力分離を繰り返すことが可能なように構成されている。

詳細には、培養槽２と流体力分離装置４とを接続して液体培地Ｃを流体力分離装置４へ供給する供給路は、加圧容器５０が介在する供給路６ｂ及び供給路６ｃによって構成される。加圧容器５０の上流側の供給路６ｂには開閉弁Ｖ１が設置され、下流側の供給路６ｃには開閉弁Ｖ２が設置される。開閉弁Ｖ１を開放すると、培養槽２の液体培地Ｃは、供給路上の加圧容器５０に供給され、一時的に収容される。加圧容器５０は、耐圧性の密閉される容器であり、加圧空気を供給するガスライン５３’が接続される。供給される加圧空気によって、貯留される液体培地Ｃは加圧される。従って、流体力分離装置４へ液体培地を供給する流動圧が付与され、開閉弁Ｖ２の開放によって、液体培地Ｃは供給路６ｃから流体力分離装置４へ供給される。液体培地Ｃを供給する圧力及び流量は、送液部５において適正に制御される。

細胞培養システム１ｂは、一時収容器５１を有する。流体力分離装置４の導出口４２は還流路７によって培養槽２と接続され、還流路７には開閉弁Ｖ３が設置される。もう一つの導出口４３は、回収路８によって一時収容器５１と接続される。流体力分離装置４の導出口４３から排出される残部の液体培地Ｃ’（内周側の画分）は、回収路８から一時収容器５１へ供給され、一時収容器５１に収容される。一時収容器５１には、加圧空気を供給するガスライン５３が接続され、供給される加圧空気によって、貯留される液体培地Ｃ’を加圧される。また、一時収容器５１には、開閉弁Ｖ５が設置された戻し路５２が接続され、戻し路５２は、加圧容器５０及び開閉弁Ｖ２の下流側の供給路６ｃに接続される。従って、一時収容器５１の加圧によって、液体培地Ｃ’は、戻し路５２を通じて流体力分離装置４へ再度供給される。培養槽２へ新たな液体培地を補給する補給路１６には開閉弁Ｖ７が設置される。

ガスライン５３，５３’には、空気を逃がして脱圧するための残圧排除弁Ｖ８，Ｖ９が設置され、加圧及び脱圧を繰り返して、ポンプと同様に液体培地を繰り返し送出することができる。図７において、加圧空気を供給するガスライン５３，５３’は、ガス源を共通とする分岐したラインであるが、個別に制御されるので、個別のラインでもよい。

開閉弁Ｖ５を開放すると、一時収容器５１の液体培地Ｃ’は、加圧空気から与えられる流動圧によって、戻し路５２から供給路６ｃへ還流されて、流体力分離装置４へ再度供給される。開閉弁Ｖ２，Ｖ５を切り替えることによって、加圧容器５０の液体培地Ｃ及び一時収容器５１の液体培地Ｃ’のいずれか一方を流体力分離装置４へ供給することができる。従って、開閉弁Ｖ２、Ｖ５の切り替えによって、培養槽２の液体培地及び一時収容器の残部の液体培地Ｃ’を交互に流体力分離装置４に供給することができる。つまり、細胞培養システム１ｂの流体力分離装置４において、開閉弁Ｖ２，Ｖ５は、培養槽２から流体力分離装置４への液体培地Ｃの供給と、戻し路５２から流体力分離装置４への残部の液体培地Ｃ’の供給とを切り替える切り替え機構として機能し得る。この切り替えによって、培養槽２の液体培地Ｃ及び一時収容器５１の残部の液体培地Ｃ’が交互に流体力分離装置４に供給される。

つまり、図７の細胞培養システム１ｂでは、図２の細胞培養システム１ａの２つの流体力分離装置４，４ａにおける分離処理を交互に行うことができる。それにより、図７における流体力分離装置４の導出口４３から、図２における液体培地Ｃ’と液体培地Ｃ”とが交互に排出される。従って、流体力分離の繰り返しによって細胞密度（容積当たりの細胞数）が低下した画分を回収するために、回収路８から分岐する排出路５４が設けられ、排出路５４に開閉弁Ｖ６が設置される。従って、開閉弁Ｖ１，Ｖ２，Ｖ４の切り替えと同時に、開閉弁Ｖ６の切り替えも行われ、二度の流体力分離によって細胞密度が低下した画分が排出路５４から断続的に回収される。尚、開閉弁Ｖ２，Ｖ５の代わりに、戻し路５２が供給路６ｃに合流する合流点に切り替え弁を設置して流路の接続を切り替えるようにしてもよい。

細胞培養システム１ｂでは、単一の流体力分離装置４を用いて流体力分離を繰り返すことにより、細胞密度が低い内周側の画分を得ることができる。故に、図２の細胞培養システム１ａと同様に、培養槽２の液体培地の細胞密度が高いために一度の流体力分離で残部の液体培地の細胞密度が十分に低下しない場合に有用である。

細胞培養システム１ｂにおける多段の分離処理は、培養槽２の液体培地Ｃを加圧容器５０に収容した状態で、開閉弁Ｖ１，Ｖ５，Ｖ６を閉止し、開閉弁Ｖ２，Ｖ３，Ｖ４を開放して開始し、一回目の流体力分離が行われる。外周側の画分は培養槽２へ還流し、内周側の画分は一時収容器５１に収容される。二回目の流体力分離は、開閉弁Ｖ２，Ｖ４を閉止し、開閉弁Ｖ５，Ｖ６を開放して開始する。外周側の画分は培養槽２へ還流し、内周側の画分は排出路５４から排出される。流体力分離装置４での処理を行わない待機中には、開閉弁Ｖ１，Ｖ３，Ｖ６を閉止する。

図８の細胞培養システム１ｃは、図７の細胞培養システム１ｂにおける開閉弁Ｖ１～Ｖ５を逆止弁Ｖａ～Ｖｅに変更した実施形態を示す。これにより、弁制御の操作における煩雑さを軽減することができる。

詳細には、供給路６ｂには逆止弁Ｖａが設置され、加圧容器５０から培養槽２への逆流が防止される供給路６ｃには逆止弁Ｖｂが設置され、流体力分離装置４及び戻し路５２から加圧容器５０への流入が防止される。還流路７には逆止弁Ｖｃが設置され、培養槽２側から流体力分離装置４側への流れが防止される。従って、培養槽２と流体力分離装置４との間での液体培地の循環は一方向に規定される。回収路８には逆止弁Ｖｄが設置され、流体力分離装置４の導出口４３から排出される液体培地の供給先は、開閉弁Ｖ６の開閉のみによって切り替えることができる。戻し路５２には逆止弁Ｖｅが設置され、加圧容器５０及び流体力分離装置４から戻し路５２への流入が防止される。

従って、細胞培養システム１ｃにおいては、開閉弁Ｖ６を閉止して、ガスライン５３’からのガス圧送によって分離処理を開始する。培養槽２の液体培地は、加圧容器５０を介して流体力分離装置４へ供給されて分離され、外周側の画分は、培養槽２へ還流し、内周側の画分は一時収容器５１に収容される。次に、開閉弁Ｖ６を開放して、ガス圧送をガスライン５３から行うと、一時収容器５１の液体培地Ｃ’は、戻し路５２から流体力分離装置４へ供給されて分離される。外周側の画分は、培養槽２へ還流し、内周側の画分は、排出路５４から排出され、加圧される一時収容器５１には戻らない。

図７，８の細胞培養システム１ｃにおいては、培養槽２の液体培地は、加圧容器５０に一旦収容された後に流体力分離装置４において分離される。つまり、供給路６ｂにおける液体培地の流通と、還流路７における液体培地の流通は、交互に行われる。従って、供給路６ｂ及び還流路７は、培養槽側の末端を一つに統合して兼用することが可能である。図９は、図８の細胞培養システムにおいて還流路７の培養槽側の末端を供給路６ｂの末端に一体化した実施形態を示す。

図９の細胞培養システム１ｃにおいて、培養槽２から加圧容器５０へ液体培地Ｃを供給する供給路６ｂ’には、逆止弁ではなく開閉弁Ｖ１が設置される。加圧容器５０の液体培地Ｃは、前述と同様に流体力分離装置４において分離され、相対的に大きい細胞が濃縮して含まれる液体培地は導出口４２から排出される。導出口４２には、液体培地を培養槽２へ送るための還流路７’の一端が接続され、逆止弁Ｖｃが設置される。還流路７’の他端、つまり、出口側末端は、供給路６ｂ’の入口近くに接続されるので、供給路６ｂ’の入口を還流路７’の出口と兼用可能である。

細胞培養システムにおいて分離処理を停止すると、培養槽から液体培地を吸い上げる供給路、及び、流体力分離装置４から液体培地を返送する還流路を構成する配管内には、液体培地が滞留し易い。配管に閉じ込められた細胞は呼吸ができず、分離処理の再開によって流路から培養槽に細胞が戻されると、増殖に悪影響を及ぼす可能性がある。この点に関して、図９の細胞培養システム１ｃでは、還流路７’から培養槽２への還流によって操作を停止し、供給路６’及び還流路７’の開閉弁Ｖ１及び逆止弁Ｖｃは、培養槽２からの液体培地の逆流を防止する。従って、処理停止後の配管内に液体培地が滞留し難い。供給路及び還流路を一体化する構成以外は、図８の細胞培養システムと同じであるので、その説明は省略し、前述を参照するものとする。

このように、流体力分離技術を利用して、培養中の液体培地から相対的に大きい細胞を選択的に濃縮分離することができるので、これと共に新たな液体培地を培養槽に還流することによって、増殖力を高く維持したまま細胞培養を継続することができる。流体力分離は、遠心分離より極めて効率的に細胞の濃縮分離を進めることができ、フィルター分離等に比べて、細胞を損傷せずに高い生存率で濃縮分離することができる。分離除去された相対的に小さい細胞を含む画分は、フィルター等を用いて細胞片等の不要物を除去した後に精製することによって、有用成分を回収することができる。流体力分離において、液体培地を比較的高い速度で湾曲流路へ供給するので、本開示の細胞培養システムは、細胞の濃縮分離を行う処理能力が高く、製品製造規模の細胞培養に十分適用可能である。

＜バッチ培養＞
１．５Ｌの液体培地（ＧＥヘルスケア社製、製品名：SH30934.01 HyCell CHO Medium）にアミノ酸（Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン）及び抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ）を適量添加した。温度を３６．５～３７．０℃に維持した液体培地中で、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの卵巣細胞）を培養した。培養中、ｐＨが６．７０未満にならないように液体培地のｐＨを管理した。
培養中にサンプリングを行って、細胞計測装置（ベックマンコールター社製、製品名：Vi-Cell）を用いて、生細胞密度(×１０⁶ cells/mL)及び平均細胞径(μｍ)を測定した。結果を図５（ａ）及び（ｂ）のグラフに示す。又、この間の細胞の生存率を図６のグラフに示す。

＜培養Ｅ１＞
前記特許文献２に記載される粒子分離器を模倣して、円弧状の湾曲流路が内部に形成された平板状の樹脂製成形体を作製した。この成形体を流路ユニットとして用いて流体力分離装置を構成した。液体培地を圧送するためのポンプ１０としてガス圧送を使用し、流体力分離装置を用いて、図１の細胞培養システム１を構成し、培養槽２において、上述のバッチ培養を１００時間行った。

この後、１回の分離処理において所定量の液体培地を培養槽から抜き出して、０．２８～０．３６ＭＰａの圧力で液体培地を流体力分離装置へ圧送した（Ｄｅ数：４７～７０程度）。流体力分離装置から排出される外周側の画分を培養槽に戻し、内周側の画分と同量の新たな液体培地を追加した。この分離処理を、１日の培地交換率が０．５～１．４の範囲になるように、一定時間毎に繰り返して行いながら、培養を継続した。この間にサンプリングを行って、生細胞密度(×１０⁶ cells/mL)及び平均細胞径(μｍ)を測定した。結果を図５（ａ）及び（ｂ）のグラフに示す。又、この間の細胞の生存率を図６のグラフに示す。

図５及び図６から、バッチ培養における培養時間が１１０時間を超えると、栄養素の不足又は代謝物の被毒によって細胞の増殖が困難になり、生存率が大幅に低下することが判る。これに対し、上述の培養Ｅ１のように、液体培地を抜き出して相対的に大きい細胞を濃縮分離して、新たな液体培地と共に培養槽に供給すると、培養時間が１１０時間を超えても細胞の増殖は進行し、３００時間以上培養を継続できることが判る。又、培養される細胞は、１６μｍ以上の細胞径を維持しており、流体力分離装置において相対的に大きい細胞が好適に分離濃縮されていることが理解される。

＜細胞分離試験＞
実施例１と同様の液体培地及びＣＨＯ細胞を用いて細胞培養を１００時間行った。この液体培地を原液として、細胞計測装置（ベックマンコールター社製、製品名：Vi-Cell）を用いて細胞の生存率（全細胞中の生細胞の割合）を計測したところ、９２．９％であった。又、細胞濃度を測定したところ、全細胞濃度は２．８６×１０⁶cells／ｍＬ、生細胞濃度は、２．６６×１０⁶cells／ｍＬであり、平均細胞径は、１４．８７μｍであった。
プランジャポンプを用いて、上記原液を実施例１の流体力分離装置の湾曲流路へ０．２５ＭＰａの圧力で圧送して（Ｄｅ数：７８）、外周側の画分と内周側の画分とに分割した。

内周側の画分について、同様に、細胞濃度、平均細胞径及び細胞の生存率を測定したところ、全細胞濃度は０．２５×１０⁶cells／ｍＬ、生細胞濃度は、０．１８×１０⁶cells／ｍＬで、平均細胞径は、１１．４６μｍであった。細胞の生存率は、７０．０％であった。

外周側の画分についても同様に測定を行ったところ、全細胞濃度は５．７２×１０⁶cells／ｍＬ、生細胞濃度は、５．３７×１０⁶cells／ｍＬで、平均細胞径は、１４．９６μｍであった。細胞の生存率は、９３．８％であった。

上記結果から、第１に、細胞濃度を比較すると、液体培地が湾曲流路を流れることによって、細胞の分布が外周側に移行することが明らかである。更に、平均細胞径の比較から、内周側の画分には相対的に小さい細胞（細胞径：１１．４６μｍ）が含まれ、外周側の画分に相対的に大きい細胞（細胞径：１４．９６μｍ）が濃縮されることが明らかである。従って、液体培地を外周側と内周側の２つの画分に分割することによって、相対的に大きい細胞を選択的に高濃度で分取することができることが理解される。更に、内周側の画分における生存率が低いことから、相対的に小さい細胞を除去することによって、死細胞が除去され、原液より生存率が高い細胞群を含む液体培地が得られることが解る。

＜圧力環境による細胞への影響＞
流体力分離装置における圧力環境による細胞への影響を調べるために、以下のような試験システムを構成した。耐圧タンクと流体力分離装置の導入口とを、一方向弁及びシリンジポンプを介して配管で接続し、流体力分離装置から排出される２つの画分が共に耐圧タンクに還流するように、流体力分離装置の２つの導出口と耐圧タンクとをＹ字配管で接続した。流体力分離装置における液体培地の供給圧及び出口圧を計測する圧力計を配管に敷設した。

実施例１と同様の液体培地及びＣＨＯ細胞を用いて細胞培養を１００時間行い、培養後の液体培地を、約０．３ＭＰａの加圧空気と共に耐圧タンクに充填して、以下の試験Ｔ１～Ｔ１０を行った。試験を行う前後に、液体培地に含まれる細胞の生存率を細胞計測装置（ベックマンコールター社製、製品名：Vi-Cell）を用いて計測した。結果を表１に示す。尚、以下の試験においては、実施例１の湾曲流路を含む３種類の湾曲流路（Ｌ１～Ｌ３、同一幅で高さ又は長さが異なる）を作製して、何れかを有する流体力分離装置を使用した。

（試験Ｔ１～Ｔ８）
シリンジポンプを用いて表１のような供給圧に調節しながら、耐圧タンクに収容される液体培地を流体力分離装置へ圧送して分離処理を行った。流体力分離装置から排出される２つの画分は、併せて耐圧タンクに還流された。この分離処理を繰り返して、液体培地に１０回の分離処理を施した。尚、流体力分離装置から排出される画分の圧力は大気圧に開放されるので、流体力分離装置における圧力変動は、流体力分離装置へ圧送される供給圧（入口圧）に等しい。

（試験Ｔ９，Ｔ１０）
上記の試験システムにおいて、更に、流体力分離装置の２つの導出口に接続される配管に圧力調整弁を取り付けて、流体力分離装置から排出される画分の出口圧の調節を可能にした。この試験システムにおいて、供給圧及び出口圧を表１のように調節して、試験Ｔ１～Ｔ８と同様に分離処理を繰り返し行い、液体培地に１０回の分離処理を施した。流体力分離装置における圧力変動は、流体力分離装置へ圧送される供給圧（入口圧）と、導出口の圧力調整弁によって調節される圧力（出口圧）との差である。

細胞の生存率の測定においては、±０．５％の範囲は、誤差と見なすことができるので、試験Ｔ６の供給圧が０．６ＭＰａにおける生存率の低下は、明らかに有意な結果である。表１の試験Ｔ１～Ｔ８の結果から、生存率の低下が抑制可能な閾値は、０．４５ＭＰａ付近であると考えられる。但し、試験Ｔ９においては、供給圧が０．６ＭＰａであっても、細胞の生存率は高く維持されており、この結果から細胞の生存率を低下させる原因は、静圧ではなく、圧力変動の大きさであることが解る。

培養細胞のうちの相対的に大きい細胞を選択的に濃縮分離して培養を継続することができる。従って、バイオ技術を利用した医薬品の製造に利用して、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、ワクチン等の製品の提供において、経済性、品質の向上に寄与し、現状において稀少又は高価な医薬品の普及、汎用化を進めることが可能になる。

１，１ａ，１ｂ，１ｃ，１ｄ 細胞培養システム
２ 培養槽
３ 細胞分離装置
４，４ａ 流体力分離装置
５ 送液部
６，６ａ，６ｂ，６ｃ，６’ 供給路
７，７ａ，７’ 還流路
８，８’，８ａ 回収路
９ 培地補充部
１０，１０ａ ポンプ
１１，１１ａ 圧力計
１２，１２ａ 圧力調整弁
１３，１３ａ 流量計
１４，１４ａ，１８ 流量調整弁
１５ 培地タンク
１６ 補給路
１７ 液面計
１９ ローラーポンプ
２０，２０ａ，２０ｂ 回収タンク
２１ フィルター
４１ 導入口
４２，４２ａ，４３，４３ａ 導出口
５０ 加圧容器
５１ 一時収容器
５２ 戻し路
５３，５３’ ガスライン
５４ 排出路
Ｖ１，Ｖ２，Ｖ３，Ｖ４，Ｖ５，Ｖ６，Ｖ７ 開閉弁
Ｖ８，Ｖ９ 残圧排除弁
Ｖａ，Ｖｂ，Ｖｃ，Ｖｄ，Ｖｅ 逆止弁
Ｃ，Ｃ０，Ｃ’，Ｃ” 液体培地

Claims (17)

1. 細胞を培養する液体培地を収容する培養槽と、細胞分離装置とを有する細胞培養システムであって、前記細胞分離装置は、
   矩形断面を有する湾曲流路を有し、前記湾曲流路を流れることによって生じる渦流れを利用して液体培地に含まれる細胞から相対的に大きい細胞を分離する流体力分離装置と、
   前記流体力分離装置を流通する間の前記液体培地における圧力変動による細胞生存率の低下が抑制されるように制御された圧力環境で前記液体培地を前記流体力分離装置に流通させる送液部と
   を有し、
   前記送液部は、前記流体力分離装置へ導入される液体培地と、前記流体力分離装置から導出される液体培地との圧力差が０．６ＭＰａ未満になるように前記圧力環境を制御する圧力制御機構を有する細胞培養システム。
2. 前記流体力分離装置は、前記液体培地を取り入れる単一の導入口と、分離した液体培地を排出する少なくとも２つの導出口とを有し、前記導出口の１つから相対的に大きい細胞が濃縮して含まれる液体培地が排出され、もう１つの導出口から相対的に小さい細胞が含まれる残部の液体培地が排出される請求項１に記載の細胞培養システム。
3. 前記送液部は、前記流体力分離装置へ液体培地を供給するための流動圧を液体培地に付勢する付勢装置を有する請求項１又は２に記載の細胞培養システム。
4. 前記送液部は、前記流体力分離装置へ導入される液体培地と、前記流体力分離装置から導出される液体培地との圧力差が０．４５ＭＰａ以下になるように前記圧力環境を制御する圧力制御機構を有する請求項１～３の何れか一項に記載の細胞培養システム。
5. 前記圧力制御機構は、
   前記流体力分離装置へ供給される液体培地の圧力を監視する圧力監視部と、
   前記圧力監視部によって監視される圧力に基づいて、前記流体力分離装置へ供給される液体培地の圧力を調整する圧力調整部材と
   を有する請求項４に記載の細胞培養システム。
6. 前記送液部は、更に、前記流体力分離装置へ供給される液体培地の流量を制御する流量制御機構を有する請求項１～５の何れか一項に記載の細胞培養システム。
7. 前記流量制御機構は、
   前記流体力分離装置へ供給される液体培地の流量を監視する流量計と、
   前記流量計によって監視される流量に基づいて、前記流体力分離装置へ供給される液体培地の流量を調整する流量調整部材と
   を有し、分離する細胞の大きさに対応して、前記流体力分離装置へ供給される液体培地の流量が調整される請求項６に記載の細胞培養システム。
8. 更に、
   前記細胞分離装置の前記流体力分離装置によって分離される相対的に大きい細胞を含む液体培地を前記培養槽に還流して、前記培養槽と前記細胞分離装置との間で液体培地を循環させる循環システム
   を有する請求項１～７の何れか一項に記載の細胞培養システム。
9. 更に、
   残部の液体培地の量に対応する新たな液体培地を前記培養槽に補充する培地補充部
   を有する請求項８に記載の細胞培養システム。
10. 前記培地補充部は、
    前記培養槽へ補充される新たな液体培地の量を監視する監視装置と、
    前記監視装置によって監視される量に基づいて、前記培養槽へ補充される新たな液体培地の流量を調整する流量調整部材と
    を有する請求項９に記載の細胞培養システム。
11. 液体培地で細胞を培養する細胞培養と、
    前記液体培地から相対的に大きい細胞を含む液体培地を分離する細胞分離と
    を有する細胞培養方法であって、前記細胞分離は、
    矩形断面を有する湾曲流路を流れることによって生じる渦流れを利用して、細胞を含む液体培地から相対的に大きい細胞が濃縮して含まれる液体培地を分離する分離処理と、
    前記湾曲流路を流通する間の液体培地における圧力変動による細胞生存率の低下が抑制されるように、前記分離処理を流通する前記液体培地の圧力環境を制御する圧力制御とを有し、
    前記圧力環境は、前記細胞分離へ導入される液体培地と、前記細胞分離から導出される液体培地との圧力差が０．６ＭＰａ未満になるように制御される細胞培養方法。
12. 更に、
    前記分離処理によって分離される相対的に大きい細胞を含む液体培地を前記細胞培養に還流して、前記細胞培養と前記分離処理との間で液体培地を循環させる循環処理
    を有する請求項１１に記載の細胞培養方法。
13. 更に、
    前記分離処理において分離された相対的に小さい細胞を含む残部の液体培地の量に対応する新たな液体培地を前記細胞培養に補充する培地補充
    を有する請求項１２に記載の細胞培養方法。
14. 前記送液部は、前記培養槽と前記流体力分離装置とを接続する供給路、及び、前記供給路において一時的に液体培地を収容し、収容される液体培地を加圧して前記流体力分離装置へ液体培地を供給するための流動圧を付与する加圧容器を有し、
    前記細胞分離装置は、更に、
    前記流体力分離装置のもう一つの導出口から排出される残部の液体培地を収容する一時収容器と、
    前記供給路における前記加圧容器の下流側と前記一時収容器とを接続し、前記一時収容器に収容される残部の液体培地を前記流体力分離装置へ再度供給する戻し路と、
    前記培養槽から前記流体力分離装置への液体培地の供給と、前記戻し路から前記流体力分離装置への残部の液体培地の供給とを切り替える切り替え機構と
    を有し、前記切り替え機構の切り替えによって、前記培養槽の液体培地及び前記一時収容器の残部の液体培地が交互に前記流体力分離装置に供給される請求項２に記載の細胞培養システム。
15. 前記切り替え機構は、前記供給路における前記加圧容器の上流側及び下流側、並びに、前記戻し路の各々に設けられる開閉弁又は逆止弁を有する請求項１４に記載の細胞培養システム。
16. 前記細胞分離装置は、更に、前記流体力分離装置の前記導出口の１つから、相対的に大きい細胞が濃縮して含まれる液体培地を前記培養槽へ送る還流路を有し、
    前記供給路の入口を前記還流路の出口と兼用可能なように、前記還流路の出口側末端は、前記供給路の入口近くに接続される請求項１４又は１５に記載の細胞培養システム。
17. 前記もう１つの導出口から排出された前記残部の液体培地に含まれる相対的に小さい細胞から相対的に大きい細胞をさらに分離するもう１つの流体力分離装置をさらに備える、請求項２に記載の細胞培養システム。

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