JP2015535728A - マイクロ流体装置およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アメリカ海軍宇宙海事システム司令所より授与された補助金第N66001−11−1−4182号により政府の支援を受けてなされたものであり、政府はその権利を有する。
本出願は、2012年9月21日に出願された米国仮特許出願第61/704,128号の利益を主張する。この出願の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
(実施例1)
台形断面渦巻き状マイクロ流路を有する高分離能サイズ別微粒子/細胞分離機
台形断面を有する渦巻き状マイクロ流体流路における粒子集束の挙動を、以下に説明する。側面視および上面視の両方から粒子の流れる位置を観察し、ディーン流れ場の数値シミュレーションと組み合わせることで、これら流路内の力平衡状態が、渦巻き状慣性マイクロ流体流路における粒子集束機構のよりよい理解のために研究される。渦巻き状慣性マイクロ流体流路においては、流路断面を変更することで、ディーン流れ場を移動させることができ、粒子集束の挙動に大きな影響を与える。この機構に基づき、高分解能およびハイスループットの両方を兼ね備える粒子の分離が実現される。
長方形断面渦巻き状流路において、ディーン渦は、幅方向において対称であり、粒子は、主として湾曲流路の内側に集束する。直径/高さの比が0.07以上である粒子は、通常、流路の上半分および下半分にある2つのディーン渦内の流れに集束する。流速が上がるにつれ、粒子集束位置は、初めは、慣性揚力の増加のために内側流路壁の近くに移動するが、流速がより速くなると遠心力が優勢になり始め、粒子の位置を内壁から離して外壁に向けて押し動かす(図10A)。異なるサイズの粒子の集束位置が互いに近くなるので、この現象によって、粒子/細胞分離のスループットおよび分離能は限定される。クンタゴウダナハリ(Kuntaegowdanahalli)らを参照のこと。外壁よりも内壁が浅い台形断面渦巻き状流路において、「慣性優勢」な状況から「ディーン優勢」な状況への移行は急であり、したがって、集束位置は流路の内側半分から外側半分へと直ちに移動する。これは、マイクロ流路の外側半分(図9Aにおける深い領域)に偏った強いディーン渦核の発達によるものであり、ディーン力場は非線形となる。慣性揚力は、高度にサイズ依存的であるので、サイズの異なる粒子/細胞は、異なる流速において、慣性優勢な状況からディーン優勢な状況へと移る。この原理を利用して、従来の長方形断面マイクロ流路よりも高い空間分解能で、サイズの異なる粒子/細胞を分離することができる。
マイクロ流体流路は、精密切削工程によって製造されたポリメタクリル酸メチル(PMMA)型(ホィッツ・テクノロジー社(Whits Technologies)、シンガポール)で鋳造された。その構成は、複数ループを有し曲率半径が約10mmである、注入口が1つで排出口が2つの渦巻き状流路からなる。その形状は、硬化剤を10:1の比で混合したシルガード(Sylgard)184シリコーンエラストマー(PDMS)プレポリマーを用いて鋳造された。硬化後、形状を有するPDMS鋳物は、はぎ取られ、3mm厚の別のPDMS層にプラズマ接着された。注入用の穴および排出用の穴は、接着する前に開けておいた。側面から粒子の位置を観察するために、装置を、流路の排出部分に沿って約2mm切断し、装置を扁平瓶容器に対して垂直に維持することで、第2の鋳造を行った。PDMSミキサーが流路に流れ込むのを防ぐために、第2の鋳造前に、管を穴に接続しておいた。
図10Aは、流速を上げていった際の、異なるサイズの粒子が集束した帯を上面視で示している。この結果によって、異なる流速において、サイズが異なる粒子の流れが、内壁(慣性状況)から外壁(ディーン状況)へ移動するという分離の原理が、はっきりと示されている。例えば、台形断面であると、流速1.5mL/minのとき、内側排出口および外側排出口から回収することで、直径が15.5μmよりも大きい粒子を、それよりも小さい粒子から分離することができる。同じ流路において、流速を2.5mL/minに上げると、直径が26.25μmよりも大きい粒子を、それよりも小さい粒子から分離することができる。それに比べて、長方形流路においては、ある流速において、サイズの異なる粒子は流路内の異なる位置に集束する傾向があるが、粒子間の距離はごく小さく、粒子/細胞濃度が高い場合は不鮮明になり得、高ヘマトクリット細胞試料を処理する能力は制限される。図11A〜図11Cは、流速が最適化された3.4mL/minのときの、異なる2つのサイズの粒子(16.68μmおよび26.9μm)の分離効率を示す。両方の排出口における回収純度は96%を超えており、一方、スループットは8.85×106/minまで達することができ、これは1.33%体積/体積濃度(血液試料中のヘマトクリット数と同等)である。
台形断面渦巻き状マイクロ流体流路が、粒子のサイズ別の分離のために開発された。実験結果によって、上記流路により高分離能かつハイスループットな細胞の分離を実現可能であることが示される。16.68μm粒子と26.9μm粒子との間で、1.33%の濃度、3.4mL/minの流速で、96%を超える効率で粒子を分離することに成功し、これは、これまでのマイクロ流体法の中で最も高いスループットおよび効率である。ディーン流れ場の数値シミュレーションを行うとともに、力が平衡となる粒子の流れの位置を観察することによって、粒子が集束する機構を検討した。解析によって、粒子は、慣性揚力およびディーン抗力が優勢でない場所に集束し、粒子の力の平衡を説明するのに遠心力を考慮すべきであることが示されている。
台形断面を有する渦巻き状流路を用いた、血液からの白血球の分離
慣性マイクロ流体技術は、最近、効率的でハイスループットなマイクロ流体細胞分離方法として、広く注目を集めている。しかしながら、実現された分離分解能およびスループット、ならびに細胞−細胞間相互作用による細胞の分散にともなう問題は、この技術の、血液および他の体液などの現実の試料への適用における制限因子であったようである。本明細書では、分離分解能が向上した新規デザインの渦巻き状慣性マイクロ流体(台形断面)選別機を示し、希釈したヒト血液(1〜2%ヘマトクリット)から、多形核白血球(PMN)および単核白血球(MNL)を高効率(>80%)で分離/回収する能力を実証する。この方法で濃縮したPMNも、元々の注入試料と比べて無視できる程度しか活性化しておらず、一方、従来のRBC溶血法では、感受性PMNは、人為的な活性化が明らかに誘導されていた。したがって、この技術は、治療または診断用途のために、感受性血液細胞を濃縮/分離するための有望な代替法となるであろう。
マイクロ流路の製造
台形断面渦巻き状流路は、標準的なソフトリソグラフィ技術を用いて、ポリ(メタクリル酸メチル)(PMMA)のマスターテンプレートから、ポリジメチルシロキサンポリマー(PDMS、サイラード(Sylard)184シリコーンエラストマーキット、ダウ・コーニング社、米国)を用いて製造した。PMMAのテンプレートマスターは、切削処理によって製造され(ホィッツ・テクノロジー社(Whits Technologies)、シンガポール)、断面形状に対する特殊な要求を満たした。使用できる切削機の性能を考えると、テンプレートとなる鋳型の実際の形状は、仮想の設計と比較して±10μmの公差を有し、表面粗さはRa=0.8μmであった。その次に、10:1(w/w)の比で硬化剤と混合したPDMSプレポリマーを、PMMAのテンプレートマスターで鋳造し、80℃で2時間硬化させて、マイクロ流路の特徴を複製した。硬化したPDMS鋳造物をPMMAマスターからはぎ取り、1.5mm径の生検用穴あけ器を用いて、注入貯留槽用および排出貯留槽用の穴を開けた。最後に、PDMS鋳造物は、平坦な0.5cm厚の別のPDMS板に、不可逆的に接着され、その後、酸素プラズマ処理を行った(ハリックプラズマクリーナー/滅菌装置、ハリックプラズマ社(Harrick Plasma, Inc)、米国)。得られたPDMS装置は異なる4箇所で切断され、断面を顕微鏡で測定して、装置の正確な寸法を求めた。長方形断面渦巻き状流路も、PDMSポリマーで製造したが、エッチングしたシリコンウエハーマスターから、二重鋳造工程によって製造した(バガット,A.A.S.(Bhagat, A.A.S.)ら『ラボ・オン・ア・チップ(Lab on a Chip)』2011年;11巻;11号:1870〜1878頁を参照)。簡潔に言えば、まず、ポジティブAZ4620フォトレジストを6インチシリコンウエハー上でパターン化し、マイクロ流路の特徴を規定した。その後、パターン化されたウエハーを、深堀りイオンエッチング(DRIE)を用いて所望の深さにエッチングし、残ったフォトレジストを酸素プラズマ処理によって除去した。次に、PDMS鋳造物の取り外しを援助するために、トリクロロ(1H,1H,2H,2H−パーフルオロオクチル)シラン(シグマ−アルドリッチ社(Sigma-Aldrich)、米国)を用いて、エッチングしたウエハーを1.5時間コーティングした。その後、プレポリマー5部および硬化剤1部を混合したPDMS液体混合物をシリコンウエハー上に注ぎ、80℃で2時間硬化させた。得られたPDMS鋳造物は、表面から突出した流路の特徴を有し、次のPDMS鋳造のマスターとした。このPDMSマスターを用いて、シラン処理およびPDMSの硬化を繰り返し、ネガティブレプリカを得た。最後の工程として、注入貯留槽および排出口貯留槽の穴を開けたネガティブレプリカを、標準的なプラズマ補助下接着によって、別のPDMS基板に接着した。
ビーズ実験のために、直径6μm(5.518μm±0.122μm)、10μm(10.3μm±0.4μm)(ポリサイエンス社(Polysciences, Inc.)、米国)、または15.5μm(15.5μm±1.52μm、バングス・ラボラトリー社(Bangs Laboratories, Inc.))の蛍光ポリスチレン粒子(1wt%固形分)を、0.025mg/mLのPEG−PPG−PEGプルロニック(Pluronic)(登録商標)F−108(シグマ−アルドリッチ社(Sigma-Aldrich)、米国)を含む脱イオン水(0.1%体積分率)でそれぞれ希釈し、注入試料とした。PEG−PEG−PEGプルロニック(Pluronic)(登録商標)F−108を少量添加しても、流体の粘度および密度を変化させるほどではなかったが、粒子の流路壁への非特異的な接着を最小限度に押さえた(イングリス,D.W.(Inglis, D.W.)ら『アプライド・フィジクス・レター(Applied Physics Letters)』2004年;85巻;21号:5093〜5095頁を参照)。
上記装置を、12ビットCCDカメラ(C4742−80−12AG、浜松ホトニクス株式会社(Hamamatsu Photonics K.K.)、日本)を備えた、位相差/落射蛍光倒立顕微鏡(オリンパスIX71、オリンパス社(Olympus Inc.)、米国)に設置した。サンプルをシリンジに入れ、シリンジポンプ(ハーバード・アパラタスPHD2000、ハーバード・アパラタス社(Harvard Apparatus Inc.)、米国)を用いて、様々な流速でマイクロ流路に送り込んだ。粒子/細胞の沈殿を防ぐため、シリンジの内部に置いた小型の磁気攪拌棒を、試料を処理する間攪拌させた。イメージJ(ImageJ)(登録商標)ソフトウェアを用いて、一連の画像の蛍光強度の平均をとることによって、流路断面内の蛍光粒子の位置を求めた。細胞の場合、高速カメラであるファントムv9.1(Phantom v9.1)(ヴィジョンリサーチ社(Vision Research Inc.)、米国)を用いて位相差で記録した高速ビデオを解析して、細胞の位置を求めた。高速ビデオの光強度の標準偏差を計算し、高速移動する細胞の位置を視覚化した。
BDファーミンジェン(商標)(BD PharmingenTM)(BDバイオサイエンス(BD Biosciences)、米国)から、すべての抗体を購入した。分離効率を求めるために、0.1mg/mlのヘキスト33342(Hoechst 33342)(インビトロジェン社(Invitrogen)、米国)およびFITC結合マウス抗ヒトCD66bモノクローナル抗体(1:25v/v)を用いて、4℃で30分間、暗所で全血を染色した。その後、染色した血液細胞画分を遠心分離によって回収し、注入試料として所望のヘマトクリットになるように、サンプルバッファーに再懸濁した。注入試料および2つの排出口からの排出試料を回収し、BD(商標) LSR IIフローサイトメーター(BDバイオサイエンス社(BD Biosciences)、米国)で解析して、各試料中のWBC(ヘキスト陽性細胞)およびPMN(CD66b陽性細胞)を求めた。MNLが様々な種類の細胞を含み、MNLの総量を求めるのに利用できる便利な表面マーカーがないことを考え、MNLの数は、ヘキスト陽性だがCD66b陰性である細胞の数に基づいて計数した。それに加えて、RBC濃度を、Z2コールター計数器(ベックマン・コールター社(Beckman Coulter Inc)、米国)によってさらに測定した。同様に、バッフィーコート試料に対する装置性能を評価するために、MP−RMを用いた遠心分離によって単離されたWBCの表面マーカー、CD66b、および核を染色した。その後、染色されたWBCを、最初の全血体積と同じ体積のサンプルバッファーに再懸濁し、装置で処理した。次に、試料中の細胞のサイズ分布をZ2コールター計数器によって測定し、フローサイトメーターを用いて試料の組成を解析した。
MP−RMを用いた分画遠心分離によって単離されたWBCおよび1%ヘマトクリット注入試料を用いて渦巻き処理によって単離されたWBCを、細胞の最終濃度が約100万個/mLとなるようにサンプルバッファーに再懸濁した。各細胞試料40μLを、ポリ−L−リジンコートされたガラススライド(シグマ−アルドリッチ社(Sigma-Aldrich)、米国)上にそれぞれ置き、試料の領域はハイドロフォビック・バリアー・ペン(Hydrophobic Barrier Pen)(イムエッジ(商標)ペン(ImmEdgeTMPen)、ベクター・ラボラトリー社(Vector Laboratories, Inc.)、米国)を用いて、円形とした。その後、スライド上の試料を37℃で10分間インキュベートし、細胞を付着させた。NBT試験のアッセイバッファーは、新しく調整され、1×Ca2+/Mg2+含有DPBSバッファー(ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水;インビトロジェン社(Invitrogen)、米国)および0.25%(w/w)NBT(シグマ−アルドリッチ社(Sigma-Aldrich)、米国)で構成した。PMA刺激の条件では、アッセイバッファーは1μMのPMAも含んでいた。インキュベーション後、40μLのアッセイバッファーをスライド上に添加し、37℃で20分間インキュベートした。最後に、細胞試料を位相差顕微鏡(オリンパスCKX41、オリンパス社(Olympus Inc.)、米国)で観察し、NDPL−1(2×)接続レンズ(ヴィヴィタール(登録商標)サカール・インターナショナル社(Vivitar(R) Sakar International, Inc.)、米国)を用いて、顕微鏡下60倍の対物レンズで、DSLRカメラ(キヤノンEOS500D、キヤノン(Canon)、米国)によって、カラー画像を撮影した。
設計原理
マイクロ流路を流れるとき、流体中に懸濁された粒子は、慣性揚力および粘性抗力を受けていた。慣性揚力は、制限された流路における流れの放物線速度分布によって起こる剪断誘発性揚力(ディ・カルロ(Di Carlo)ら、2007年を参照)および壁に近づいたときに粒子の周囲の回転乱流から起きる壁面誘発性揚力(ゼン,L.(Zeng, L.)、S.バラチャンダー(S. Balachandar)、およびP.フィッシャー(P. Fischer)『ジャーナル・オブ・フルイド・メカニクス(Journal of Fluid Mechanics)』2005年;536巻:1〜25頁を参照)を含む。粒子が、ap/Dh≧0.07(ここでapは粒径を表し、
本明細書で開発された、RBCの除去に最適化されたPDMS装置は、注入口を1つと排出口を2つ有し、幅が500μm(485.00μm±2.31μm)で深さが70μm(内壁、72.84μm±1.16μm)および100μm(外壁、102.65μm±3.55μm)の台形断面を有する渦巻き状マイクロ流路からなる。排出口領域付近では、幅485μmの流路は、流路幅の比が3:7(内:外)である2つの排出口流路に分割され、その2つの流路の長さは、お互いに等しくなるように調整された。内側排出口は、RBCが除去された試料のWBC排出口(すなわち、PMN/MNL)であると定義され、外側排出口は、不要なRBC排出口であると定義された。最適な流速は、実験的に0.8mL/minと求められた(Rec=46.52;De=4.22)。MP−RMを用いた遠心分離によって単離されたPMNおよびMNLを、装置に別々に注入し、図17Aに示す、流路内における平衡位置を求めた。最適な流速においては、PMNは、上面視で、内側流路壁から約75μm離れたところに集束流れを形成し、MNLは、同様の横方向の位置を占めたが、おそらくより小型の細胞サイズのために、流れがわずかに広かった。これに対し、さらに細胞サイズが小さいRBCは、外側流路壁付近に広がった流れとして示され、これによって、装置の排出口において、RBCからPMN/MNLを単離することが可能となった。0.1%以上のヘマトクリットの注入試料の場合に、図16Aに示す、WBCの分布がRBCの分布と著しく重なる従来の長方形断面渦巻き状マイクロ流路と比較して、開発された台形断面渦巻きは、図16Bに示すように、WBCとRBCとの間に、より大きい間隔を実現し、それによって、単離されたWBCの純度と回収を損なうことなく、ヘマトクリットがより高い注入試料を処理することを可能にした。図17Bは、1回通した後の、本装置のWBC排出口からの血液成分の回収を示し、ここでは0.5%ヘマトクリット血液試料において、RBCの約95%が除去され、全WBCの98.4%が回収され(PMNは99.4%、MNLは92.4%回収された)、最適な性能が実現された。この条件下において、装置のスループットは、1分あたり全血(45%ヘマトクリット)約10μLということになり、これは、10倍希釈した血液の場合に20μL/minでWBCを約29倍濃縮する「流体力学的濾過」(ヤマダ,M.(Yamada, M.)およびM.セキ(M. Seki)『ラボ・オン・ア・チップ(Lab on a Chip)』2005年;5巻;11号:1233〜1239頁を参照)、50μL/hrでWBCを92%回収する誘電泳動(DEP)マイクロ分離機(ハン,K.H.(Han, K.-H.)およびA.B.フレイジャー(A.B. Frazier)『ラボ・オン・ア・チップ(Lab on a Chip)』2008年;8巻;7号:1079〜1086頁を参照)、および2.5〜20μL/hrでWBCを97%回収する磁気泳動マイクロ分離機(ハン,K.H.(Han, K.-H.)およびA.B.フレイジャー(A.B. Frazier)『ラボ・オン・ア・チップ(Lab on a Chip)』2006年;6巻;2号:265〜273頁を参照)などの他のマイクロ流体白血球単離装置よりも著しく高い。注入試料のヘマトクリットがさらに高くなると、流路の幅にわたってRBCの分布が広がることになり、RBCの除去は減少するが、全WBCおよびPMNの回収は比較的一定のままであった。1.5%ヘマトクリットまでは、依然としてRBCの86.8%を除去することができ、全WBCの96.2%を回収することができる。図17Cおよび図17Dに示すように、第1装置のWBC排出口からの排出試料を希釈することなく第2装置の注入試料として用いる2段階処理によって、1〜1.5%ヘマトクリット試料の場合に、良好なWBCの回収を維持しつつ、高いRBC除去を実現できた。第1装置から回収されたWBCは約6倍濃縮されたので、2段階処理によって、25分よりも短い時間で、500μLの全血を容易に処理することができ、これは、セス(Sethu)らが報告したマイクロ流体RBC溶血装置に匹敵する(セス,P.(Sethu, P.)ら『アナリティカル・ケミストリー(Analytical Chemistry)』2006年;78巻;15号:5453〜5461頁を参照)。
RBCの、試料からの穏やかな除去は、残りの細胞の後段の解析にとって非常に重大である。最近の研究で、癌細胞であるMCF7において、Rec=21での慣性分離後に、全体的な遺伝子発現プロファイルおよび細胞の生存率が測定され、選別されていない対照試料と比較して、分離工程に起因する顕著な影響は観察されなかった(ハー,S.C.(Hur, S.C.)ら『ラボ・オン・ア・チップ(Lab on a Chip)』2011年;11巻;5号:912〜920頁を参照)。このことは、細胞を短時間、一時的に剪断条件にさらしても、細胞機能を変化させるのに十分でないであろうことを示している。本明細書で述べる渦巻き状装置の場合、単離されたWBCの生存率は、98.22%±0.83%(トリパンブルー染色;注入試料:98.05%±1.08%)であることがわかり、インビトロの刺激(PMA)に応答して活性酸素種を生じる能力を、NBT試験によって測定した。図19Aに示すように、渦巻き処理および分画遠心分離の両方によって単離されたPMNは、不活性なままであったが、1μMのPMAが存在すると、NBTを減少させることができた。外部刺激に対する白血球の高い感受性を考え、発明者らは、異なるRBC除去技術が、PMNに対する伝統的な活性化マーカーである細胞表面マーカー(図19B)、CD18の発現レベルに与える影響を比較した。渦巻き処理およびMP−RMを用いた遠心分離の両方においては、PMN活性化に対する影響は無視できる程度であったが、一方、RBC溶血法においては、活性化したPMNの割合は著しく増加し、表現型および遺伝子発現プロファイルに対し潜在的に影響を与える可能性があった。
台形渦巻き状流路内における非対称な速度場が、慣性集束現象に影響を与えるという実験的な証明によって示されるように、同様の寸法の長方形断面と比較して分離能が高い分離を提供する台形断面渦巻きを用いて、新規の、ハイスループットなRBC除去技術が開発され、曲線慣性マイクロ流体選別機を最適化するためのパラメータとして、(幅および深さ以外に)流路断面の形状を用いることの可能性が示された。このサイズ別分離技術によって、血液細胞を非生理学的条件に長時間さらす必要がなくなり、これによって、分離中の細胞の表現型の人為的な変化が最小限になる。詰まりおよび低スループットが、たいていの、膜を利用する(ブルイル,A.(Bruil, A.)ら『ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテリアル・リサーチ(Journal of Biomedical Materials Research)』1991年;25巻;12号:1459〜1480頁を参照)、またはミクロンサイズの支柱を利用する(パナロ,N.J.(Panaro, N.J.)ら『バイオモレキュラー・エンジニアリング(Biomolecular Engineering)』2005年;21巻;6号:157〜162頁を参照)サイズ別マイクロ流体分離方法の主な短所であるが、上述の装置の比較的大きい寸法によって、詰まりの問題もなく大量の試料を処理することが可能になる。上述の渦巻き状マイクロ流路は、DLD技術およびPFF技術などの他の種類の連続的細胞分離方法と比較して、豊富なRBC(約2%HCTまで)を収容する大きい流路寸法を有して、速い操作流速(mL/minの範囲)で機能し、これによって、ハイスループットとなり、血液試料を処理するのに適している。再現性高く、全細胞数の90%より多くなるようにWBCを濃縮する性能および能力もまた、単独または分画遠心分離と組み合わせて用いるときに、様々な体液からRBCを完全に除去するためのよい選択となる。流路断面および他の構造的特徴をさらに最適化することによって、この技術を、他の多くの主要な細胞分離の問題に適用することができる。
長方形断面および台形断面を有するサイズ別粒子分離用渦巻き状マイクロ流路
渦巻き状慣性マイクロ流体システムにおいて、流路断面の深さおよび幅の両方に沿った粒子の集束流れの位置を三次元的に観察する方法を、以下に説明する。その結果によって、粒子が、マイクロ流路断面の上壁および底壁付近に集束することが確認され、集束機構および分離機構についての明確な見識が明らかになる。力の平衡についてのこのような詳細な理解に基づいて、流路の外側半分により強いディーン渦を生じる、台形断面を有する新規の渦巻き状マイクロ流路が導入される。このような装置で集束する粒子は、粒子サイズおよび流速に影響を受けやすく、サイズ依存的な臨界流速において、内側半分から外側半分の平衡位置に急激に移行することが、実験によって示される。粒子の平衡位置は、異なる集束機構に基づいてよく分離されているので、長方形断面を有する渦巻き状マイクロ流路にわたって、より高い分離分解能が実現される。
図20は、80μm×600μm(H×W)の長方形断面を有する渦巻き状流路における、15.5μm粒子の集束位置を、上面視および側面視によって示す。上面視において、粒子の集束位置は、流れが増大するにつれて、内壁から外壁に向かって徐々に移動する。側面視において、深さ方向に沿って2つの明確な帯が観察され、これによって、上壁および底壁付近に2つの異なる集束位置が示される。幅方向に沿った集束位置の段階的な変化とは対照的に、深さ方向に沿った集束位置は、おおむね流速に依存せず、流速が0.5〜7.5mL/minの範囲の場合に、上壁および底壁から22.0%±1.1%の流路深さに固定されたままとなる。この結果は、直線状長方形断面流路または直線状円形断面流路における、以前のシミュレーションおよび実験研究に一致する。ディーン流れ分布のシミュレーションから、ディーン流れは、その方向を28±0.5%変化させることがわかり、これによって、集束位置(深さ)におけるディーン抗力は、常に内壁に向いていることが示される。これらの結果によって、渦巻き状流路を移動する粒子の集束機構に対する重要な見識が得られる。力の平衡について詳細を以下に論じる。
図22は、長方形断面および台形断面を有する渦巻き状流路における、蛍光粒子の集束位置の流速依存性を示す。粒子径は、それぞれ5.78μm、9.77μm、15.5μm、および26.25μmであった。長方形流路の断面は、それぞれ80μm×600μm(H×W)および120μm×600μm(H×W)であった。台形流路の幅は、600μmに固定し、流路の内側および外側の深さは、それぞれ80μmおよび130μmである。図22に示す結果によって、長方形流路においては、粒子は、低流速では内側流路壁付近に集束し、その後、集束位置は、流速が上がるにつれて外壁に向かって徐々に移動することが示される。所与の流速において、様々なサイズの粒子は、流路断面内の異なる位置を占めていた。クンタゴウダナハリは、この現象を利用して、流路の末端において複数の排出口を有する分岐によって、サイズ別の分離を実証した。しかしながら、粒子間の集束位置の違いは大きくないので、濃縮懸濁液の分離における分離能およびスループットは制限される。
異なる2つのサイズの粒子を分離する場合、理想的な筋書きは、異なるサイズの粒子が、互いにできる限り離れた位置に集束することである。これによって、分離分解能が増大するだけでなく、異なるサイズの粒子間の相互作用を最小化することによって、粒子濃度が高い試料(例えば、血液分離の場合、ヘマトクリットが高い細胞溶液)を処理することが可能になる。図22の結果によって、台形断面流路は、これらの要件を満たしていることが示される。次に、様々なサイズの粒子の実際の分離を示す試験を行った。
湾曲マイクロ流路において粒子にかかる力を解析するために、図20および図21に示すように、座標系(x、y、z)を規定する。流路曲線に沿った方向(主流の方向)は、x軸に沿っている。流路深さに沿った方向は、y軸であり、流路に沿った半径方向(幅方向)は、z軸である。
長方形断面流路において、FDDとFLとの平衡の結果、粒子は、特定の位置(典型的には、湾曲流路の内側)に集束する。いずれかの力が変化すると、平衡は崩れ、粒子は、断面における新しい集束位置に移行することとなる。集束位置の変化は、流路断面の形状を変化させることによって容易に実現させることができる。例えば、内側が浅く外側が深い断面を有する台形流路は、主流を流路断面の外側に向けて移行させる。これによって、外側により強いディーン流れが生じ、内側により弱いディーン流れが生じる(図26)。長方形断面流路および台形断面流路の内側半分におけるディーン流れ場には、大きな違いが存在し、後者では、ディーン流れ速度がy軸に沿って大きい成分を有する(すなわち、長方形流路の場合のように、最小揚力平面およびディーン流れ場は、互いに平行でない)。このことは、台形断面流路において、対応する最小揚力平面に粒子が位置する場合、粒子が、y軸方向に沿って流路の中央に向くFDDの成分の影響を受けることを意味する。このように、粒子は、台形流路において、最小揚力平面からさらに離れて(中央に向かって)平衡となる。このことは、0.5〜3.0mL/minの範囲の流速で、長方形流路における「ゼロディーン流れ平面」に実に近い流路の25.5〜27.1%の局部的な深さに、粒子が集束することを示す実験データによって支持される。実際は、台形流路においては、流路の外側のディーン渦核以外に、真の「ゼロディーン流れ平面」はない。
装置の設計および製造
圧力によって長方形流路を通る流れは、流路断面の重心において速度が最大で、壁表面において速度がゼロである双曲線状となる。このような不均一な流れ場に懸濁された粒子は、慣性揚力をかなり受けて、マイクロ流路断面内の特定の位置に集束する。湾曲流路において、流体は、半径方向外向きの遠心加速度をうけて、流路の上半分および下半分に、ディーン渦として知られる、反対方向に回転する2つの渦で特徴付けられる横断流れを生じる(図27Aを参照)。
側面視による粒子集束の観察のために、縦横比が低い長方形断面を有する渦巻き状流路を製造した。マイクロ流路は、幅が600μmで深さが80μmであり、縦横比は7.5(幅/深さ)であった。流体とPDMS流路との間の屈折率の違いが大きい場合、界面における屈折が大きいために、PDMSの厚い部分を通る流路内の蛍光粒子の撮像は困難である。これを克服するために、ジメチルスルホキシド(DMSO)を1:1の体積比でエタノールと混合し、298.15Kで屈折率が1.42、密度が0.9805g/ml、かつ粘度が0.978mPa・sである混合物を生成した。混合物の屈折率は、PDMSの屈折率(1.43)と同様であり、屈折に基づく散乱を除去することによって、撮像を向上させる。溶液は、1週間の長期の浸漬後、ポリスチレン(PS)粒子(バングス・ラボラトリー社(Bangs Laboratories, Inc.)、米国)およびタイゴンチューブを溶解することが示された。しかしながら、短期間の実験の場合、流体の混合物は、粒子およびチューブに何ら影響を与えず、実験における理想的な水の代替となる。
湾曲流路における流体のディーン流れ場を、市販の計算流体力学(CFD)ソフトウェアであるコムソル(COMSOL)4.2a(バーリントン、マサチューセッツ州)を用いてシミュレートした。異なる断面形状を有する湾曲マイクロ流路部を、半径7.5mmの120°の円弧としてモデル化した。流路部における流体の密度および動粘性係数のパラメータは、水と同様に設定した。このシミュレーションで用いた層流の式は、
湾曲流路における粒子の力の平衡の解析
周囲の流体とともに流れる粒子は、以下の公知の力:抗力FD、遠心力FC、浮揚力すなわち圧力傾度力FB、相対速度の変化による2つの非定常力である付加的な質量力または仮想の質量力FAおよびバセット履歴力FH、重力FG、ならびに慣性揚力FLの影響を受ける。各力については、慣性流れの状況にある、懸濁された粒子にかかっているものとして論じる。
外壁が高い台形流路の場合、流路断面の内側深さおよび外側深さ、幅、渦巻きの曲率半径、ならびに傾斜角など、集束位置および分離効率に影響を与える因子が多く存在する。上記で解析したように、流路の傾斜は、(i)低い内側において、高流速のときは、流路深さの増大によって、揚力および抗力の平衡が崩れ、その結果粒子が外側に移動し渦核に捕捉される、すなわち流速の閾値を決定すること、および(ii)ディーン渦核の位置、の2つの点で集束の挙動に影響を与える。傾斜角が大きいと、外側のディーンが強くなり、粒子の捕捉能が増大することになる。また、傾斜角が大きいと、流速の閾値を減少させ、粒子を内側から引き出す。粒子は、傾斜角が大きい流路の場合、低流速で外側へと移行し、このことは、図30に示す実験的観察や図22に示す観察によって確認される。
循環性腫瘍細胞を超高速に、かつ標識を用いずに分離する傾斜渦巻き状マイクロ流体技術
癌患者の末梢血中に見出される循環性腫瘍細胞(CTC)を計数し、特徴付けることによって、癌の診断および予後に利用可能な、潜在的情報源が提供される。本明細書では、臨床に関連する血液量から、CTCを、超高速に、かつ標識を用いずに濃縮する、台形断面を有する渦巻き状マイクロ流体装置について説明する。上記技術は、大きいCTCを内壁に対して集束させる慣性揚力とともに、曲線マイクロ流路に定常流下で存在する、固有のディーン渦流れを利用する。従来の長方形断面に対して台形断面を用いると、ディーン渦核の位置が変化して、分離を実現することができる。小さい血液成分は、外側流路壁の方に偏ったディーン渦によって捕捉されて、最終的に外側排出口で除去され、一方、大きいCTCは、内側流路壁付近で平衡となって、内側排出口から回収される。注入口を1つと排出口を2つ有する渦巻き状マイクロ流路を単独で用いると、7.5mLの血液に加えた癌細胞株の細胞(MCF−7、T24およびMDA−MB−231)を、8分以内で、80%より多く、極めて高い純度で(WBCは400〜680個/mL;WBCは対数減少値で約4log減少した)単離、回収することができた。推定上のCTCは、標準的なバイオマーカー(CK、CD45およびDAPI)を用いて、進行期の転移性乳癌および肺癌患者の試料(n=10)の100%から、CTCが3〜125個/mLの範囲の頻度で、検出かつ単離された。この手法によって、親和性に基づく従来のCTC単離技術の欠点を克服することができ、また、CTCについての基礎研究によって、治療を進め、患者の看護を向上することが可能になる。
装置の設計および製造
装置のデザインは、効率的な細胞の移動と集束のために、半径が8mmから24mmへと大きくなる、注入口が1つで排出口が2つの8ループ渦巻き状マイクロ流路からなる。台形断面において、流路断面の幅は600μmであり、内側の高さおよび外側の高さは、それぞれ80μmおよび130μmで最適化された。特定の流路寸法を有する鋳型は、ソリッドワークス(SolidWorks)ソフトウェアを用いて設計され、続くPDMS鋳造のために、メタクリル酸ポリメチル(PMMA)シートで、従来のマイクロ切削技術(ホィッツ・テクノロジー社(Whits Technologies)、シンガポール)によって製造された。脱泡PDMS(基剤および硬化剤であるダウ・コーニング社(Dow Corning Inc.)のシルガード(Sylgard)184を、10:1の比で混合)を鋳型で鋳造し、続いてオーブン内で、70℃で2時間焼成することによって、マイクロ流体装置を製造した。硬化後、PDMSを鋳型からはぎ取り、流体注入口および排出口用のアクセス孔(1.5mm)を、ユニ−コア(商標)パンチャー(Uni-CoreTM Puncher)(シグマ−アルドリッチ社(Sigma-Aldrich Co. LLC.)、シンガポール)を用いて開け、酸素プラズマ装置(ハリック・プラズマ社(Harrick Plasma)、米国)を用いて、PDMS装置を硬化PDMSの他の層に不可逆的に接着し、流路を完成させた。組み立てられた装置は、最終的に、70℃のオーブン内に30分間置かれ、さらに接着を強めた。
市販の緑色蛍光タンパク質(GFP)標識された2つのヒト癌細胞株、すなわち乳腺癌(MCF−7およびMDA−MB−231)、1つの膀胱癌細胞株(T24;HTB−4 ATCC、米国)および1つの肺癌細胞株(H159;HTB−4 ATCC、米国)を用いて、CTC分離を模した。濃縮されたCTCにおけるHER2のDNA FISH解析のコントロールとして、SKBR3細胞株も用いた。上記の細胞の平均細胞径は、約10〜約50μmの範囲である。細胞を、コーティングされたT25フラスコ(ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー社(Becton, Dickinson and Company)、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、米国)に播種し、10%ウシ胎児血清(FBS)(インビトロジェン社(Invitrogen)、米国)および1%ペニシリン−ストレプトマイシン(インビトロジェン社(Invitrogen)、米国)を追加した高グルコースダルベッコ変形イーグル培地(DMEM)(インビトロジェン社(Invitrogen)、米国)を用いて培養した。5%(v/v)CO2を含む37℃加湿雰囲気下で培養を続け、添加のために80%コンフルエントの時点で採取した。コンフルエントでない単層を、0.01%トリプシンおよび5.3mM EDTA溶液(ロンザ社(Lonza)、スイス)を用いて解離させた。他に言及しない限り、すべての実験において、健康な提供者から得た全血および患者の試料は、RBC溶血バッファー(G−バイオサイエンス社(G-Bioscience)、米国)を用いて、室温で5分間、連続的に混合しながら溶血させた。PBSバッファーを用いて希釈することによって、溶解を停止させ、1000gで5分間遠心分離して、細胞ペレットを得た。細胞ペレットを、所望の濃度までPBSを用いて再懸濁した。
すべての実験において、渦巻き状バイオチップを、最初に、高速CCDカメラ(ファントムv9(Phantom v9)、ヴィジョンリサーチ社(Vision Research Inc.)、米国)を備えた倒立位相差顕微鏡(オリンパスIX71(Olympus IX71)に載置した。シリンジポンプ(PHD2000、ハーバード・アパラタス社(Harvard Apparatus)、米国)を用い、流速2mL/minで約2分間、開始バッファー(0.5%BSAを追加した1×PBS、2mM EDTA)で、バイオチップを準備した。試験の間、癌細胞および血液試料を10mLシリンジに満たし、可撓性のあるタイゴン(登録商標)チューブを通してマイクロ流路と接続されたシリンジポンプを用いて、装置に送り込んだ。すべての実験において、流速を1700μL/minに設定した。ファントム・カメラ・コントロール・ソフトウェアを用いて、流路の排出口で高速ビデオを撮影し、イメージJ(登録商標)(ImageJ)ソフトウェアを用いて解析した。
試料と選別されたCTCとの分離効率および濃縮比を計算するために、BDアキュリ(商標)(AccuriTM)C6フローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーを、注入口およびCTC排出口の両方に用いた。癌細胞および白血球(WBC)に一般的なマーカーに基づいた免疫蛍光染色を、区分および定量化に用いた。CTC排出口からの濃縮された細胞を、フロオレセインイソチオシアネート(FITC)結合パン−サイトケラチン(CK)(1:100、ミルテニーバイオテク・アジア・パシフィック社(MiltenyiBiotec Asia Pacific)、シンガポール)およびアロフィコシアニン(APC)結合CD45マーカー(1:100、ミルテニーバイオテク・アジア・パシフィック社(MiltenyiBiotec Asia Pacific)、シンガポール)で30分間染色し、癌細胞およびWBCをそれぞれ識別した。臨床試料の場合は、FITC結合パン−サイトケラチン(CK)(1:100、ミルテニーバイオテク・アジア・パシフィック社(MiltenyiBiotec Asia Pacific)、シンガポール)で染色することによって、CTCを識別した。パン−CKおよびヘキスト(核染色)陽性かつCD45陰性に染色され、癌細胞特有の形態を有する(すなわち、細胞質に対する核の比が高い)細胞は、CTCと識別される。CD45およびヘキスト陽性かつパン−サイトケラチン陰性に染色される細胞は、白血球と識別される。
健康な提供者からの血液と混合されたMDA−MB−231およびMCF−7のGFP標識細胞を、渦巻き状マイクロ流体技術で処理し、トリパンブルー(またはヨウ化プロピジウム(PI))排除アッセイにより、長期間の再培養を通して評価した。単離されたCTCは、ポリリジンコートされた2D細胞培養基板上に播種し、記載の通りに一晩培養した。その後、インサイチュで、ヨウ化プロピジウム(PI)染色によって、細胞を染色した。細胞を撮像し、PI陽性に染色されたものを計数して、溶血および処理後の細胞の生存率を求めた。生存細胞数を、渦巻き状バイオチップ処理をしない、溶血後の細胞と比較した。
ヒト全血試料を、健康な提供者および転移性肺癌および乳癌患者から得た。この試験は、施設内倫理委員会(IRB)によって許可されたプロトコールに従い、施設内倫理委員会および地元の倫理委員会に承認された。健康な提供者からの合計10血液試料をコントロールとして用い、肺癌および乳癌患者からの10試料をCTCの計数のために処理した。EDTA抗凝固剤を含むヴァキュテーナーチューブ(ベクトン・ディッキンソン社(Becton−Dickinson)、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、米国)に、血液試料を採取し、血液の凝固を防ぐために2〜4時間以内に処理した。すべての試料について、最初に、7.5mLの全血を、RBC溶血バッファーを用いて溶血し、チップで処理するのに先立ち、PBSに再懸濁した。チップで処理するのに先立ち、溶血させる代わりに、5〜10倍の範囲で全血を因子によって希釈することもできる。
SKBR3細胞株(HER2シグナルが増幅されている)およびMDA−MB−231細胞株(HER2シグナルは増幅されていない)、ならびに単離されたCTCについて、製造者のプロトコールにしたがって、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)を行った。サイトスピン(Cytospin)遠心分離機(サーモ・サイエンティフィック社(Thermo Scientific)、米国)を用いて、600rpmで6分間、細胞を遠心してスライド上に載せた。4%PFA中、室温で10分間スライドを固定し、エタノール系列(80%、90%、および100%)で脱水した。FISH解析のために、スライドを、37℃で40分間、RNase(4mg/mL)(シグマ社(Sigma)、米国)で処理し、1×PBS/0.2% Tween20(シグマ社(Sigma)、米国)で3回洗浄し、80℃で10分間、70%ホルムアミド/2×SCC(クエン酸緩衝液(saline sodium citrate)、パス・ヴィジョン(Path Vysion)、アボット社(Abbott)、米国)で変性させた。その後、氷冷エタノール系列で再び急冷脱水した。HER2/neu(アボット・ラボラトリー社(Abbott Laboratories)、イリノイ州、米国)プローブを、42℃に維持されたスライドに直接用いた。暗所、湿潤条件下、42℃で一晩、ハイブリダイゼーションを続けた。振盪させながら、45℃で、50%ホルムアミド/2×SSC、および2×SSCでスライドを洗浄し、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)抗体で対比染色し、50×50mm2のカバーグラス(フィッシャー・サイエンティフィック社(Fisher Scientific)、米国)で封入した。
CTC培養の表現型の比を特徴付けるため、細胞を、フロオレセインイソチオシアネート(FITC)結合パン−サイトケラチン(CK)(1:100、ミルテニーバイオテク・アジア・パシフィック社(Miltenyi Biotec Asia Pacific)、シンガポール)、フロオレセインイソチオシアネート(FITC)結合CD44(1:100、ミルテニーバイオテク・アジア・パシフィック社(Miltenyi Biotec Asia Pacific)、シンガポール)、アロフィコシアニン(APC)結合CD24(1:100、ミルテニーバイオテク・アジア・パシフィック社(Miltenyi Biotec Asia Pacific)、シンガポール)、アロフィコシアニン(APC)結合CD45マーカー(1:100、ミルテニーバイオテク・アジア・パシフィック社(Miltenyi Biotec Asia Pacific)、シンガポール)、およびヘキスト(インビトロジェン(Invitrogen)社、米国)などの、様々な抗体とともにインキュベートした。染色試薬を、アッセイに直接加えること、またはトリプシン処理後の細胞懸濁液に加えることのどちらかによって、染色を行うことができた。4%パラホルムアルデヒド(PFA)(シグマ・アルドリッチ社(Sigma Aldrich)、米国)で固定した後、透過化処理(0.1%トリトン100x、サーモ・サイエンティフィック社(Thermo Scientific)、米国)しながら、氷上で30分間、細胞をインキュベートした。
設計原理
粒子が、渦巻き状マイクロ流路を流れるとき、層流速度分布が放物線状となる性質によって生じる、慣性揚力の影響下にある中立的浮揚粒子は、流れを横切って、流路の中央から流路壁の方に離れた平衡位置へと移動する。同時に、粒子は、曲線形状によって生じるディーン流れに沿ったディーン渦によって引き起こされる抗力も受ける。慣性力およびディーン力の組み合わせによって、流路幅内で、平衡位置が、内側マイクロ流路壁の一箇所に減少し、これによって、連続的な慣性集束を誘発する。どちらの力も粒子サイズの関数であるので、異なるサイズの粒子が、流路壁付近で、異なる横方向の位置を占め、また異なる集束程度を示し、これによって、サイズ別の分離が可能となる。長方形断面を有する渦巻き状マイクロ流路を利用することの主な課題の1つは、様々な粒径を有する粒子の平衡位置の間の空間が狭いということである。これは分離分解能に影響を与える。上記で論じたように、流路断面を台形形状に変更することで、分離分解能が大きく向上する。これは、主に、台形断面の非対称性が速度分布に影響を与え、図32Aに示すように、流路深さが深い外壁付近に、強いディーン渦が形成されることによる。そのため、慣性力と抗力が平衡を保つ状態で、流路幅の中央付近に小さい粒子が集束する長方形断面流路とは対照的に、変更された台形渦巻きの速度場によって、小さい粒子は、外壁付近の強いディーン渦核に捕捉される。内壁に大型の細胞が集束することによって、2つの細胞流れの間の空間が最大化され、ハイスループットかつ高分離能な選別を実現することができる。この独特な設計は、例えば、未処理の血液からの白血球の単離、または本明細書に示すような、血液からの超少量のCTCの濃縮など、小さいが大量に存在するバックグラウンドの細胞混合物から、直径は大きいが少量しか存在しない対象細胞を濃縮するのに、理想的に適している。図32Bは、試料を処理中の実験装置の写真を示す。CTCを連続的に回収することによって、免疫染色、qRT−PCR、FISHおよびシークエンシングなどの、続く後段の解析に用いる、従来の96穴プレートまたはメンブレンフィルターに、装置を連結することが容易になる。
CTCの単離に最適な技術は、最小の試料処理工程で、特定のマーカー(例えば、EpCAM)に頼ることなく、許容できる程度の純度で(すなわち、後段の分子アッセイの汚染耐性に応じて)最大数の生細胞を単離することを目指さなければいけない。純度を上げ、かつ渦巻き状チップを通過する細胞成分を最小化するために、従来の化学的なRBC溶血手法を用いて、濃縮されたCTCの数を最大化しつつ、システムのスループットを増大させた。RBCの溶血工程および密度勾配遠心工程によって、細胞の損失(10〜30%)を招き得ることが報告されているが、実験結果によって、工程全体において、細胞の損失は8%未満であることが示された。さらに、図33に示すように、溶血バッファーにさらすことによっても、細胞の形態およびサイズは変化しなかった。広範囲な特徴付けを行い、ラテックス粒子および癌細胞株を加えた健康な血液試料の両方を用いて、流路の縦横比、流速、および試料濃度などの様々なパラメータの影響を検討することによって、最適な装置設計を見出した。溶血血液中のWBCおよび血小板の濃度が比較的高いとき(>3%)、これらを完全に除去することが、有効な濃縮を実現するのに重要である。注入試料の細胞濃度が排出純度に与える影響を調べるために、異なる有核細胞濃度で血液を処理した。健康な提供者から採取された最初7.5mLの全血を、塩化アンモニウムを用いて化学的に溶血し、有核細胞画分を、処理用のPBSバッファーを用いて15mL(0.5倍濃度)、7.5mL(1倍濃度)および5mL(1.5倍濃度)となるように再懸濁した。回収した細胞をDAPIおよびCD45抗体を用いて染色して、混入したWBCの数を定量化した。図34Aは、異なる試料濃度において、CTC排出口から回収した細胞の合計数(DAPI+/CD45+)を示す。このグラフは、最少のWBCの混入を観察した(平均は、白血球が500個/mL;範囲は、白血球が400〜680個/mL)、細胞濃度が1倍以下(白血球が約3.5〜4×106/mL)のときに、この装置が最適に動作することを示す。したがって、臨床試料を処理するのに最適なものとして、7.5mLの血液試料の合計処理時間が約8分となる、0.5倍濃度を選択した。現在のところ、これは、CTC単離に用いるマイクロ流体プラットフォームによって実現された最も高いスループットであると考えられる。その上、バイオチップを多重化することによって、処理時間をさらに短くすることができる。
CTCは、血流中に極めて少ないので、様々な後段のアッセイのために、血液試料中の標的細胞を最大数単離することが重要である。この目的のために、異なる3つの細胞株(すなわち、MCF−7、T24およびMDA−MB−231)をこの研究に用い、CTCの単離および回収における台形渦巻き状バイオチップの性能を定量化した。CTC検出における本技術の汎用性を確認するために、これらの細胞株を選択した。上記の細胞の平均粒径は、約10〜約50μmの範囲である。モデルシステムは、健康な提供者から得た7.5mLの血液に、既知の数の細胞(約500細胞)を加えることによって構築された。RBCを溶血し、最適化された濃度(約0.5倍)に再懸濁した後、加えた細胞の超高速濃縮のために、試料を渦巻き状チップに通した。濃縮後、免疫蛍光染色による、落射蛍光顕微鏡下での計数、または一般的な表面マーカー(CK+/CD45−)を用いたフローサイトメトリー解析のいずれかによって、癌細胞を識別した。図34Bは、全血に加えた腫瘍細胞の捕捉効率の概要を示し、その平均回収率は、T24細胞株で80%、MCF−7細胞株で85%、MDA−MB−231細胞株で87%であった(n=3)。この装置を用いて捕捉された腫瘍細胞の生存率を確認するために、単離された細胞を、標準的な培養条件下で付着、増殖する2−D培養基で再培養した(図35を参照)。ヨウ化プロピジウム(PI)および/またはトリパンブルーによる染色などの機能アッセイを用いて、処理前後の細胞の生存率も確認した。この結果から、トリパンブルーによる染色が最低限であること(<10%)より、捕捉された細胞の生存率が高いことが示される(図34Cを参照)。さらに癌細胞の形態を解析することによって、複数の処理工程中において、細胞は、比較的変化しないことも確認された(データは示していない)。
台形渦巻き状バイオチップの臨床的有用性を確認するために、(i)健常者5人(コントロール)、(ii)転移性乳癌(MBC)患者5人、および(iii)非小細胞性肺癌(NSCLC)患者5人から、7.5mLの血液試料を採取した(表1)。
多くの異なる点において、腫瘍細胞の不均一性は明らかであって、以前から数多く報告されている。A.A.パウエル(A. A. Powell)、A.H.タラサズ(A. H. Talasaz)、H.ザング(H. Zhang)、M.A.コラム(M. A. Coram)、A.レディ(A. Reddy)、G.デング(G. Deng)、M.L.テリー(M. L. Telli)、R.H.アドバーニ(R. H. Advani)、R.W.カールソン(R. W. Carlson)、およびJ.A.モリック(J. A. Mollick)『 PLoS・ワン(PLoS One)』2012年;7巻;e33788頁を参照のこと。本明細書において、台形チップで単離されたCTCで発現されるHER2の変異が、HER2−腫瘍の患者の試料を用いて示された。パンテル(Pantel)らは、CTCにおけるHER2の状態は、原発腫瘍と比較して変化していることを示した。B.R.BAS ジェイガー(B. R. BAS Jaeger)、U アンデルガッセン(U Andergassen)、JK ノイゲバウアー(JK Neugebauer)、CA メルヒャー(CA Melcher)、C ショルツ(C Scholz)、C ハーゲンベック(C Hagenbeck)、K シュエラー(K Schueller)、R ローレンツ(R Lorenz)、T デッカー(T Decker)、G ハインリッヒ(G Heinrich)、T フェーム(T Fehm)、A シュネーバイス(A Schneeweiss)、W リヒテネッガー(W Lichtenegger)、MW ベックマン(MW Beckmann)、K パンテル(K Pantel)、HL ソマー(HL Sommer)、Kフリーゼ(K Friese)、およびW ヤンニ(W Janni)、第35回CTRC−AACRサンアントニオ乳癌シンポジウム年次大会にて一部発表;サンアントニオ、テキサス州、2012年を参照のこと。具体的には、HER2由来から得た試料の約30%で、HER2+CTCが観察される場合がある。DNA蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)を行って、単離されたCTCにおけるHER2の状態を評価した。単離されたCTCにおけるHER2シグナルを、図39に示すように、コントロール乳癌細胞株であるMDA−MB−231(HER2シグナルは増幅されていない)およびSKBR3(HER2シグナルが増幅されている)と比較した。1つの核において、HER2/17番染色体(Cen17)セントロメアシグナルの比が2より大きいときに、増幅されたHER2の発現を求めた。HER2/Cen−17シグナルの範囲を観察した。HER2/Cen−17比が1を示す細胞は、WBCまたはHER2非増幅CTCであると思われ、さらなる免疫染色によって識別することができる。しかしながら、HER2シグナルが増幅された細胞も検出され、このことは、CTCが明確に存在することを示している。これは、原発腫瘍と比べて、CTCにおいてHER2の状態が不均一であるという以前の発見と一致している。
癌医学の「理想」は、個別化治療の確立であり、個別化治療においては、治療は、固定化された状況から、患者個人個人の腫瘍の状態に合わせた治療へと移行する。循環性腫瘍細胞は、原発腫瘍の生検に代わる良い代替法であることが示されており、同等の遺伝子情報を伝達する。疾患ステージが異なる癌患者の末梢血においてCTCを検出することは、治療の有効性および患者の生存における予後マーカーとしての将来性を示し、強い臨床的関連性を示している。しかしながら、後段のアッセイによる、インビトロのCTCの系統立った特徴付けは、これらの細胞を検出しかつ濃縮する、信頼性が高く高感度な方法がないことによって遅れている。マイクロ流体技術の急速な発達にもかかわらず、ハイスループット、高純度、かつ高細胞生存性のCTC単離は、いまだ達成困難である。台形断面を有する渦巻き状マイクロ流路に慣性マイクロ流体技術を用いて、推定上のCTCの超高速な濃縮に、新規のマイクロ流体技術プラットフォームを応用することが、本明細書に示されている。この改善された装置は、より大きい(血液)体積の処理を実現し、CTCの捕捉効率および収率を向上させた。1.7mL/minという速い血液処理スピードに加えて、簡易ながら効率的な台形渦巻き状流路は、スケールアップした装置の生産を非常に容易にし、これによって、より大きいスケールの臨床研究を可能にする。上記のように、台形渦巻き状バイオチップは、ステージが進んだ転移性乳癌および肺癌患者10人のうち10人から(100%)CTCを単離することができ(CTCが3〜125個/mL)、免疫染色およびDNA FISH解析によって、広範囲な不均一性の研究が可能となった。単離されたCTCの生存率は、処理後も維持されており、これによって、培養が可能となり、かつ研究が広範囲となる。乳癌患者の末梢血から単離されたCTCの大部分は生きているが、培養開始数日後に増殖しなくなり、このことは、不活動状態にある細胞を標的とする新しい治療手法が必要であることを示唆している。その上、CTCを連続的に回収することによって、免疫染色、qRT−PCR、FISHおよびシークエンシングなどの、続く後段の解析に用いる、従来の96穴プレートまたはメンブレンフィルターに、装置を連結することが容易になる。
Claims (46)
- マイクロ流体装置であって、
i)少なくとも1つの注入口;
ii)径方向内側の辺、径方向外側の辺、底辺、および上辺によって規定される台形断面を有し、該断面は、a)高さが等しくない該径方向内側の辺および該径方向外側の辺、またはb)該径方向外側の辺と高さが等しい該径方向内側の辺、を有しており、該上辺は、それぞれ幅が該底辺と等しくない少なくとも2つの連続した直線部を有している、曲線マイクロ流路;および
iii)少なくとも1つの排出口
を備える、マイクロ流体装置。 - 前記断面において、(a)前記径方向内側の辺は、前記径方向外側の辺よりも高くなっている、または(b)前記径方向内側の辺は、前記径方向外側の辺よりも低くなっている、または(c)前記上辺は、段状の断面を形成する少なくとも1つの段を含んでいる、または(d)前記上辺は、前記径方向内側の辺と前記径方向外側の辺との間に、少なくとも1つの浅い領域を含んでいる、請求項1に記載のマイクロ流体装置。
- 前記台形断面は、直角台形の断面である、先行する請求項のいずれか1項に記載のマイクロ流体装置。
- 前記台形断面の上辺は、湾曲している、請求項1に記載のマイクロ流体装置。
- 前記台形断面の上辺は、凸状である、請求項4に記載のマイクロ流体装置。
- 前記台形断面の上辺は、凹状である、請求項4に記載のマイクロ流体装置。
- 前記台形断面の底辺は、湾曲している、請求項1に記載のマイクロ流体装置。
- 前記台形断面の底辺は、凸状である、請求項7に記載のマイクロ流体装置。
- 前記台形断面の底辺は、凹状である、請求項7に記載のマイクロ流体装置。
- 前記台形断面の径方向内側の辺の高さは、約20〜約200ミクロンの範囲である、先行する請求項のいずれか1項に記載のマイクロ流体装置。
- 前記台形断面の径方向外側の辺の高さは、約20〜約200ミクロンの範囲である、先行する請求項のいずれか1項に記載のマイクロ流体装置。
- 前記台形断面の底辺の幅は、約100〜約2000ミクロンの範囲である、先行する請求項のいずれか1項に記載のマイクロ流体装置。
- 前記台形断面の上辺の幅は、約100〜約2000ミクロンの範囲である、先行する請求項のいずれか1項に記載のマイクロ流体装置。
- 前記曲線マイクロ流路は、渦巻き状マイクロ流路である、先行する請求項のいずれか1項に記載のマイクロ流体装置。
- 前記曲線マイクロ流路は、蛇行状マイクロ流路である、請求項1〜13のいずれか1項に記載のマイクロ流体装置。
- 前記曲線マイクロ流路の曲率半径は、約2.5〜約25mmの範囲である、先行する請求項のいずれか1項に記載のマイクロ流体装置。
- 前記曲線マイクロ流路の長さは、約4〜約100cmの範囲である、先行する請求項のいずれか1項に記載のマイクロ流体装置。
- 前記少なくとも1つの注入口は、単一の注入口である、先行する請求項のいずれか1項に記載のマイクロ流体装置。
- 前記少なくとも1つの排出口は、2つの排出口である、先行する請求項のいずれか1項に記載のマイクロ流体装置。
- 粒子の混合物から1つ以上の粒子をサイズ別に分離する方法であって、該方法は、径方向内側の辺、径方向外側の辺、底辺、および上辺で規定され、該径方向内側の辺の高さが該径方向外側の辺よりも低い台形断面を有する曲線マイクロ流路を備えるマイクロ流体装置の少なくとも1つの注入口に、該マイクロ流路の断面の一部に沿って粒子サイズに基づいて粒子を単離する流速で、該混合物を導入する工程を含み、大きい粒子が該マイクロ流路の径方向内側の辺に沿って第1排出口へ流れ、小さい粒子が該マイクロ流路の別の部分に沿って少なくとも1つの他の排出口へ流れ、これによって該混合物から該粒子をサイズ別に分離する、方法。
- サイズ別に分離された粒子を、前記第1排出口から回収する工程をさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 前記流速は、約0.5〜約7.5mL/minの範囲である、請求項20または21に記載の方法。
- 前記粒子は、細胞である、請求項20〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞は、幹細胞である、請求項23に記載の方法。
- 前記流速は、約2.5mL/minであり、前記大きい粒子の直径は、約18〜約40ミクロンの範囲であり、前記小さい粒子の直径は、約10〜約20ミクロンの範囲である、請求項22に記載の方法。
- 前記流速は、約1.5mL/minであり、前記大きい粒子の直径は、約15〜約25ミクロンの範囲であり、前記小さい粒子の直径は、約5〜約10ミクロンの範囲である、請求項22に記載の方法。
- 前記流速は、約2.5〜約3.0mL/minの範囲であり、前記大きい粒子の直径は、約25〜約40ミクロンの範囲であり、前記小さい粒子の直径は、約5〜約15ミクロンの範囲である、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞の混合物は、血液試料である、請求項23に記載の方法。
- 前記大きい細胞は、CTCであり、前記小さい細胞は、血液細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記流速は、約8分で約7.5mLの血液をサイズ分離するのに適合している、請求項29に記載の方法。
- 前記大きい細胞は白血球であり、前記小さい細胞は血液細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記混合物は、骨髄試料である、請求項23に記載の方法。
- 幹細胞が、血液細胞から分離される、請求項32に記載の方法。
- 混合物から細胞を濃縮する方法であって、該方法は、請求項2(a)に記載のマイクロ流体装置の少なくとも1つの注入口に、該マイクロ流路の断面の該径方向内側の辺に沿って該細胞を単離して第1排出口へ導く流速で、該混合物を導入する工程を含み、これによって該混合物から該細胞を濃縮する、方法。
- 濃縮された細胞を、前記第1排出口から回収する工程をさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 前記流速は、約0.5〜約10mL/minの範囲である、請求項34または35に記載の方法。
- 混合物から微粒子を濾別する方法であって、該方法は、径方向内側の辺、径方向外側の辺、底辺、および上辺で規定され、該径方向内側の辺の高さが該径方向外側の辺よりも高い、台形断面を有する曲線マイクロ流路を備えるマイクロ流体装置の少なくとも1つの注入口に、該マイクロ流路の断面の該径方向内側の辺に沿って微粒子を単離して、第1排出口へ導く流速で、微粒子を含む混合物を導入する工程を含み、これによって該混合物から該微粒子を濾別する、方法。
- 前記混合物は、水である、請求項37に記載の方法。
- 単離された微粒子を、前記第1排出口から回収する工程をさらに含む、請求項37または38に記載の方法。
- 前記流速は、約0.5〜約10mL/minの範囲である、請求項37〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 混合物に細胞を分散させる方法であって、該方法は、請求項2(c)に記載のマイクロ流体装置の少なくとも1つの注入口に、前記段状断面の部分に沿って細胞を分散させる流速で、混合物を導入する工程を含み、細胞は、別々の排出口への分散前、分散途中、または分散後、辺に衝突せず、これによって該細胞を該混合物中に分散する、方法。
- 分散された細胞を、前記別々の排出口から回収する工程をさらに含む、請求項41に記載の方法。
- 前記流速は、約2〜約10mL/minの範囲である、請求項41または42に記載の方法。
- 細胞を液体に混合する方法であって、該方法は、径方向内側の辺、径方向外側の辺、底辺、および上辺で規定され、該上辺は、該径方向内側の辺と該径方向外側の辺との間に少なくとも1つの浅い領域を含む、台形断面を有する曲線マイクロ流路を備えるマイクロ流体装置のマイクロ流体装置の少なくとも1つの注入口に、該マイクロ流路に沿って細胞を混合して該混合物を第1排出口に導く流速で、液体および細胞を導入する工程を含む、方法。
- 前記混合物を、前記第1排出口から回収する工程をさらに含む、請求項44に記載の方法。
- 前記流速は、約0.1〜約2mL/minの範囲である、請求項44または45に記載の方法。
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