JP2019528810A - 疾患材料の検出、捕捉、または除去のための流体デバイス - Google Patents

Abstract

本開示は、生体液中の疾患材料を検出、捕捉、および／または除去する流体デバイスに関する。本発明はまた、敗血症をクレームに係るデバイスの使用により治療／予防する方法にも関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年７月７日出願の米国特許仮出願第６２／３５９，３２２号、２０１６年１０月１３日出願の米国特許仮出願第６２／４０７，７６７号、２０１７年２月３日出願の米国特許仮出願第６２／４５４，２３５号、および２０１７年３月３０日出願の米国特許仮出願第６２／４７８，９０４号の利益を主張し、これらのそれぞれが、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

米国連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、米国国防総省により供与されたグラント第Ｗ８１ＸＷＨ−１３−１−０３９７号を受けて米国政府の助成で成された。米国政府は本発明に対して一定の権利を保有する。

本開示は、疾患を引き起こす材料を生体液から検出、捕捉、および／または除去する流体デバイスに関する。

多くの疾患、ならびに疾患関連細胞および疾患関連分子は、血液で運ばれる。例えば、循環血液中における細菌の存在により、敗血症になるおそれがある一連の局所性および全身性調節機構が開始する。敗血症は、感染に対する調節不全の宿主応答によって引き起こされる生命を脅かすような臓器機能障害と定義されており、年間１００万を超える米国人が罹患し、関連死亡率が２５〜５０％である。敗血症は、米国における危篤状態患者の死因の首位であり、米国は治療に年間２００億ドルを超える費用を必要とする。平均余命が増加し、侵襲的手技の数が拡大するにつれて、敗血症の発生率が高まっている。現在、特異的な敗血症治療は存在していない。敗血症の治療は、主に早期認知ならびに適切な抗生物質、補液、および血管作動性医薬品の急速投与に依拠する。早期の有効な抗生物質療法が必要不可欠であり、患者の転帰を改善する。しかし、敗血症−関連死亡率は、容認できないほど、かつ持続的に高いままであり、新たな敗血症療法が差し迫って求められていることは明らかである。
体外サイトカイン濾過、組み換えヒト活性化プロテインＣ、コルチコステロイド、ヒト組み換えラクトフェリン、および免疫調節など、敗血症の実験的補助治療を評価する多くの研究が行われてきた。免疫調節は広く予測されていたが、患者母集団の異質性および敗血症の病原性の複雑さによって、これらの実験的手法の進歩が限定された。インターロイキン−１（ＩＬ−１）または腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）など単一のメディエーターのブロックにより、敗血症生存率の改善の見込みはほとんど示されなかった。サイトカイン除去は、動物試験において有望な結果を示した。しかし、様々な結果は、サイトカイン除去の直接的影響ではなく他の下流機構を調節する結果であると考えられる。エンドトキシンのクリアランスの利点は、動物試験においても有効性を示したが、敗血症患者の転帰の改善はまだ実証されていない。

磁性ナノ粒子を使用した機械的細菌除去によって、敗血症齧歯類モデルの生存率が改善されると報告された。細菌標的化リガンドを使用したナノ粒子の表面改質は、重要ないくつかの病原性細菌の効率的で再現性がある捕捉を導くことができる。しかし、これらの手法は、大型生物系の治療のスケールアップにおける潜在的な制約、および血液とナノ粒子の接触に関する規制のハードルがどうなるか不確かな点が問題になっている。ナノ粒子を用いた細菌細胞のインキュベーションの後に分離する必要もある。このインキュベーション時間によって、細菌が複製して数を増やすことが可能になる。さらに、血液中に存在している磁性ナノ粒子は、臓器中に拡散し、生体適合性の問題を引き起こすことがある。単一分子のアクチベーター／阻害物質または細菌源の単離に対処する処置が、敗血症の複雑さに十分に対処するとは考えられない。

菌血症または敗血症の現行の治療方法は、抗生物質の使用も含む。しかし、病原体は、抗菌薬回避能力または多剤耐性を急速に獲得しつつあり、全身性の抗生物質投与は、多数の負の副作用を伴う。様々な吸着剤および他の従来の膜濾過法を使用して、血液から疾患材料を検出または濾過し、細胞サイズ、変形性、および密度の差を利用して、標的細胞を濾取してきた。しかし、これらの技法は多大な時間と労力を必要とし、マルチステップの試料調製が必要とされる。マルチステップの試料調製は、汚染を受けやすい方法であり、ポイントオブケア治療の目的に十分なほど効率的ではない。膜濾過法は、頻繁な目詰まりという問題を提起し、クリーニングを必要とする。さらに、濾過および遠心技法は、患者に戻す必要がある健全な細胞に対してストレスを引き起こす。したがって、後に患者に戻す健全な細胞の本来の細胞表現型を維持しながら、疾患材料および疾患細胞を除去するように、血液試料を処理する、より単純でより効率的な技法が求められている。

本明細書に開示される流体デバイスおよび方法は、上記その他の必要性に対処する。

本発明者らは、ヒト全血から病原体とエンドトキシンとを除去し、それによって敗血症における調節不全の生物学的応答の根本的な２つの原因に対処することができるデバイスを設計した。このデバイスは、単一の敗血症関連メディエーターを血液から除去することに依拠する以前の敗血症療法の限界を克服することができる。抗生物質耐性株を含めて病原体およびエンドトキシンの除去は、敗血症の治療の新たな典型となる。

本明細書に記載されるデバイスおよび方法によって、患者の血液量全体などの生体液を単一の治療時にデバイスに数回通して処理することができる。これにより、疾患を引き起こす材料の血流における負荷は、血液をデバイスに数回循環させることによって大いに低減することができる。細菌を血流から除去すると、感染因子の遠位部位への拡散を低減することができる。これにより、臓器または膿瘍内に存在する病原体の数は低減し、炎症性メディエーターのレベルは低下する。

疾患を引き起こす材料の全負荷を低減させると、疾患進行を直接抑制することができ、したがって、この治療により、例えば感染を引き起こす細菌種を同定するのに使用可能な時間を大幅に延ばし、最適な抗生物質療法を始めることができる。さらに、流路壁に官能化されたリガンドが、死んでいる病原体と生きている病原体の両方に結合するので、抗生物質療法をこの細菌除去療法と二元的に行うことができるからである。１回の通過で多数の細菌がデバイス内に捕捉されるので、デバイスを使用して、病原体同定および抗生物質感受性決定を加速するのを助けることもできる。

さらに、流路壁を適切なタンパク質特異的または細胞特異的リガンドで官能化することによって、このデバイスをさらに改変して、タンパク質（サイトカインなど）および他のタイプの細胞（循環腫瘍細胞など）を全血から除去することもできる。

さらに、デバイスに依拠して、疾患を引き起こす材料を患者の血流から実質的に除去する代わりに、デバイスを使用して、疾患を引き起こす材料を単離および同定することもできる。このように単離および同定に焦点を絞ることによって、迅速な処方および１クールの治療の開始が可能になり得る。

疾患を引き起こす材料（例えば、細菌）を生体液から検出、捕捉、および／または除去するためのデバイスが本明細書に開示される。

また、そのようなデバイスがそのような疾患を引き起こす材料のそのような生体液からの分離において使用される治療方法も本明細書に開示される。

さらに、その後のさらなるクールの治療を処方することができるように、そのようなデバイスが生体液に由来する疾患を引き起こす材料の同定において使用される治療方法が本明細書に開示される。

さらに詳細には、
少なくとも１つの入口と、
少なくとも１つの出口と、
少なくとも１つの入口と少なくとも１つの出口の間の多方向流路であって、内壁を含む多方向流路と、
多方向流路の内壁の少なくとも一部分を被覆するリガンドと
を含む流体デバイスが本明細書に開示される。

また、疾患材料を生体液から捕捉および除去する方法であって、
生体液を流体デバイスに導入するステップであって、流体デバイスが少なくとも１つの入口と、少なくとも１つの出口と、少なくとも１つの入口と少なくとも１つの出口の間の多方向流路とを含む、ステップと、
前記生体液を前記流体デバイスに流して、前記疾患材料を流体デバイス内の流路の内壁に沿って官能化された疾患材料標的化リガンドに集約および曝露するステップと、
疾患材料と流路の内壁に結合している疾患材料標的化リガンドとの結合により、疾患材料を捕捉するステップと、
前記疾患材料を前記生体液から除去するステップと
を含む方法も開示される。

さらに、血液で運ばれる疾患材料を血液から体外で捕捉および除去し、処置された血液を患者に戻す方法であって、
ポンプで患者から血液を流体デバイスに送り込むステップであって、前記流体デバイスが少なくとも１つの入口と、少なくとも１つの出口と、少なくとも１つの入口と少なくとも１つの出口の間の多方向流路とを含む、ステップと、
前記血液を前記流体デバイスに流して、前記血液で運ばれる疾患材料を流体デバイス内の流路の内壁に沿って官能化された疾患材料標的化リガンドに集約および曝露するステップと、
疾患材料を集約および捕捉するステップであって、流体デバイスによって課せられる力が疾患材料を疾患材料標的化リガンドで官能化された流路の壁の近くに集約させ、次いでそのリガンドが前記疾患材料に結合する、ステップと、
前記疾患材料を前記血液から除去して、処置された血液を生成するステップと、
前記処置された血液を前記患者に戻すステップと
を含む方法が本明細書に開示される。

さらに、血液で運ばれる疾患材料を血液から捕捉および検出する方法であって、
血液を流体デバイスに流し込んで、前記血液で運ばれる疾患材料を流体デバイス内の流路の内壁に沿って官能化された疾患材料標的化リガンドに集約および曝露するステップであって、流体デバイス内の流路が螺旋状流路を含む、ステップと、
疾患材料を捕捉するステップであって、流体デバイスによって課せられる力が疾患材料を疾患材料標的化リガンドで官能化された螺旋状流路の壁の近くに集約させ、次いでそのリガンドが前記疾患材料に結合する、ステップと、
前記疾患材料に結合する光学活性な疾患材料標的化マイクロビーズを流体デバイスに流すステップと、
流体デバイスを光学読取装置で読み取るステップと
を含む方法が開示される。

さらに、流体デバイスを流れてきた生体液を含む組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｔｅｒ）であって、流体デバイスが少なくとも１つの入口と、少なくとも１つの出口と、少なくとも１つの入口と少なくとも１つの出口の間の多方向流路とを含み、前記流路が内壁を含み、前記内壁の少なくとも一部分がリガンドで被覆されており、そのようなリガンドが疾患材料に結合し、前記生体液から除去する、組成物が開示される。

さらに、疾患材料を血液から体外で捕捉および除去し、処置された血液を身体に戻す方法であって、
ポンプで血液を患者から螺旋ベースの流体装置に送り込むステップと、
前記血液を前記螺旋ベースの流体装置に流して、前記疾患材料を螺旋状流体装置の内壁に沿って官能化された疾患材料標的化リガンドに集約および曝露するステップと、
疾患材料を集約および捕捉するステップであって、螺旋ベースの流体装置によって課せられたサイズベースの慣性力が疾患材料を疾患材料標的化リガンドで官能化された螺旋状流路の壁の近くに集約させ、次いでそのリガンドが前記疾患材料に結合する、ステップと、
前記疾患材料を前記血液から除去するステップと、
前記血液を前記患者に戻すステップと
を含む方法が本明細書に開示される。

さらに、疾患材料を血液から捕捉および検出する方法であって、
血液を流体装置に流し込んで、前記疾患材料を流体装置の内壁に沿って官能化された疾患材料標的化リガンドに集約および曝露するステップと、
疾患材料を集約および捕捉するステップであって、流体装置によって課せられたサイズベースの慣性力が疾患材料を疾患材料標的化リガンドで官能化された螺旋状流路の壁の近くに集約させ、次いでそのリガンドが前記疾患材料に結合する、ステップと、
前記疾患材料に結合する光学活性な疾患材料標的化マイクロビーズを流体装置に流すステップと、
流体装置を光学読取装置で読み取るステップと
を含む方法が本明細書に開示される。

本明細書に組み込まれ、その一部を成す添付の図は、以下に記載されるいくつかの態様を示す。

本発明の範囲内の様々な多方向流体デバイスの概略図を含む。図１Ａは、１つの入口および３つの出口を設けた６ループ二重螺旋状流路を含む、粒子／細菌捕捉用多方向流体デバイスの概略図である。図１Ｂは、マイクロ流路の内壁に結合している細菌標的化リガンドであるコリスチン−ＰＥＧ−シラン（Ｃｏｌ−ＰＥＧ−Ｓｉ）との相互作用により細菌を分離する多方向流路の概略図である。 リガンドであるコリスチン−ＰＥＧ−シランが結合している多方向流路の内壁および細菌の捕捉におけるその使用を示す図である。図２Ａは、コリスチン−ＰＥＧ−シラン（Ｃｏｌ−ＰＥＧ−Ｓｉ）で被覆された流路内壁の概略図である。図２Ｂは、５つのアミン基を含み、それらの１つがＰＥＧにコンジュゲートするのに使用され、Ｃｏｌ−ＰＥＧ−Ｓｉリガンドが生じ、それによって残りの４つのアミン基をマイクロ流路内の細菌細胞と相互作用および結合させる、コリスチン分子を示す。図２Ｃは、Ｃｏｌ−ＰＥＧ−Ｓｉによる細菌捕捉、引き続いてＡｔｔｏ ４８８アミン色素への曝露の後に蛍光顕微鏡検査を使用して画像処理したマイクロ流路を示す。 ２μｍのポリスチレン粒子集約を促進するマイクロ流路アスペクト比（ＡＲ）を示す図である。この粒径は、大部分の細菌細胞のサイズに匹敵する。平均混合画像は、流速０．２ｍＬ／分で２μｍの粒子平衡が表されていることを示す。マイクロ流路の寸法は、幅２５４μｍ×高さ１５μｍからなる流路の全長にわたって一致している。概略図は、三つ叉に分岐している出口に到達する直前のマイクロ流路横断面内の２μｍのポリスチレン粒子のおよその位置を示す（点線は、流路壁のおよその位置を示す）。 クレームに係る流体デバイスによる細菌細胞の単離を示す画像を示す図である。ここで、せん断調節慣性力の影響を受けた細菌（蛍光標識されたアシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）細胞）は、官能化されたマイクロ流路壁に沿って平衡を保ち、リガンド（Ｃｏｌ−ＰＥＧ−Ｓｉ）に結合する。これは、細菌がマイクロ流路中心の両側に移動されたままであるので、示された特定の領域：（Ａ）入口流路に続く第１のループ、（Ｂ）ループの中心、および（Ｃ）流路の三つ叉に分岐している出口に到達する直前の流路において明らかである（白色点線は流路壁を示す）。実験は、蛍光標識された細菌を流速０．２ｍＬ／分で流路に流すことによって行った。次いで、流路を脱イオン水で４回洗浄し、次いで蛍光顕微鏡を使用して画像処理した。細菌は、上記の画像によって示されているように、洗浄ステップ後も流路壁に結合したままであった。 図５Ａは、細菌単離にとって有用である二重螺旋状マイクロ流路構成を示す図である。この構成は、ただ１つの入口および均等に分けられた３つの出口を含む。図５Ｂは、二重螺旋状マイクロ流路の出口部を示す顕微鏡画像である。 疾患材料（すなわち、桿形細胞）を含む血液が、ポンプで患者からチューブを通って、疾患材料を捕捉するように設計された疾患材料標的化リガンドで流路壁に沿って官能化されているクレームに係る流体装置に送られることを示す図である。クレームに係る流体装置により処理した後、健全な材料を含む血液が患者に戻される。 流体装置の流路内の力の概略図である。ここで、流路が湾曲しているため、反対方向に回転する２つのディーン力が主流方向に対して直交している。ディーン力は、流路の中心において所望の健全な材料（すなわち、赤色、血球）の再循環を引き起こす。疾患材料（すなわち、緑色、疾患材料）は慣性揚力を受け、健全な材料が流路中心の内腔において遊離のままであるとき、その慣性揚力は、標的疾患材料をリガンドで官能化された流路壁の近くに集約させる。 本発明の実施形態に従って、疾患材料を標的および捕捉するように設計された螺旋形流体装置の別図である。 健全な材料（すなわち、血球）が流路中心の内腔において遊離のままであるとき、慣性力が標的疾患材料、この場合には細菌をリガンドで官能化された流路壁の近くにどのように集約させるかを描く、螺旋形流体装置の別図である。 本発明の範囲内の螺旋ベースの流体デバイスの壁の近くへの疾患材料の集約を捉えている、蛍光顕微鏡を使用して得られた画像である（左図）。健全な材料は、流れ条件下で螺旋ベースの流体装置流路の中心内に残存する（右図）。 本発明の実施形態に従って、疾患材料標的化リガンドで官能化された粒子（例えば、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノファイバーまたはマイクロファイバー）から構成された流体装置壁のある壁の拡大図である。 本発明の実施形態による支柱を含む螺旋ベースの流体装置の拡大図である。 細菌分離効率を最大にする二重螺旋状流体設計を示す図である。（ａ）Ｓ字ジャンクションにおいて連結して、１つの入口および１つの出口を設けた二重螺旋状流路を形成する２つの６ループ螺旋状マイクロ流路からなる、製作されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）流体デバイスを示す。（ｂ）マスター鋳型を作り出すのに使用される二重螺旋状流体モジュールのＣＡＤ図を示す。 クレームに係るデバイスの二重螺旋状流路構成内に集約するマイクロ粒子および細菌を示す図である。画像は連続流速０．２ｍＬ／分で取得されたものである。（ａ）２μｍの粒子の集約；（ｂ）１０μｍの粒子の集約；および（ｃ）二重螺旋状マイクロ流体デバイスの内外の両壁に沿って集約している標識されたＡ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８。 クレームに係るデバイスの実施形態の１構成について細菌捕捉能力の定量化の例を示す図である。ＰＢＳ中に添加し、０．２ｍｌ／分でコリスチン化およびＰＥＧ化された二重螺旋状マイクロ流体デバイスに流したときのグラム陰性細菌分離株の病原体捕捉能力。ａ、Ａ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８。ｂ、肺炎桿菌（K. pneumoniae） ＡＴＣＣ７００６０３。ｃ、コリスチン耐性Ａ．バウマニ（A. baumannii） 「患者２」。ｄ、コリスチン耐性Ａ．バウマニ（A. baumannii） １９６０６Ｒ。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝３）として記す。^＊Ｐ＜０．０１。 クレームに係る流体デバイスの二重螺旋状構成を使用する生体外血液浄化を示す図である。ａ、ヒト全血中に添加し、０．２ｍｌ／分でコリスチン化およびＰＥＧ化されたデバイスに流したときのＡ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８に対する捕捉能力。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝３）として記す。^＊Ｐ＜０．０１。ｂおよびｃ、コリスチン化デバイスに０．２ｍＬ／分で通し、続いて洗浄した後のヒト全血からの緑色蛍光標識されたＡ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８捕捉。ｄ、コリスチン化デバイスに０．２ｍＬ／分で通し、コリスチンで官能化されたデバイスにおいてグラム陰性病原体への特異性を確認した後の緑色蛍光標識された黄色ブドウ球菌（S. aureus） ＡＴＣＣ２９２１３捕捉の欠如。 本発明の範囲内のあるコリスチン化二重螺旋状流体デバイスの全細菌捕捉能力を示す図である。そのようなデバイスが捕捉することができる最大細菌負荷は、示された細菌株それぞれに関して報告されている。ＰＢＳに添加されているＡ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８は、対照として役立った。Ａ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８の捕捉は、枯草菌（B. subtilis） １Ａ５７８の捕捉とは有意差があった。しかし、Ａ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８の捕捉は、列挙されたいずれか他の細菌分離株とは有意差がなかった。列挙された他のすべての細菌分離株（血液中の肺炎桿菌（K. pneumoniae） ＡＴＣＣ７００６０３、Ａ．バウマニ（A. baumannii） １９６０６Ｒ、Ａ．バウマニ（A. baumannii） 「患者２」、およびＡ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８）の最大捕捉能力は、枯草菌（B. subtilis） １Ａ５７８の最大捕捉能力とも有意差があった。一元配置ＡＮＯＶＡと、その後に続くポストホックテューキーの多重比較検定を用いて、データを比較した。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝３）として記す。^＊Ｐ＜０．０１。 図１７におけるその使用よりも大きい二重螺旋状流体デバイスの細菌捕捉能力を示す図である。ＰＢＳ中に添加したＡ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８を、０．６ｍＬ／分でコリスチン化およびＰＥＧ化された二重螺旋状マイクロ流体デバイス（長さ（Ｌ）長さ３２８ｍｍ×幅（Ｗ）７５０μｍ×高さ（Ｈ）１５μｍ）に流した。マイクロ流体デバイスのＡ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８捕捉能力を、示された時間にわたって定量化した。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝３）として記す。^＊Ｐ＜０．０１。 マイクロ流路壁へのコリスチン固定化の概略的な記述を示す図である。ＮＨＳを使用して、シラン−ＰＥＧ−ＮＨＳをコリスチンの同様な反応性を示す５つのＬ−α−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）残基の１つにＤａｂ^３２のアミン側鎖を介してカップリングさせた。シラン−ＰＥＧ−ＮＨＳのＮＨＳ基は、コリスチン抗生物質の同等に反応性を示すいずれか単一のアミン残基にカルボジイミド化学的性質により共有結合し、コリスチン−ＰＥＧ−シランが生じる。コリスチン−ＰＥＧ−シランのシラン末端は、ＰＤＭＳベースの流路壁へのシロキサン結合を形成し、コリスチンが流路の内腔にまで広がる。 マイクロ流路内におけるコリスチン修飾の確証を与える図である。ａ、コリスチンのアミン基の蛍光標識は、ＡＴＴＯ ４８８ ＮＨＳエステル色素で実施された。ＡＴＴＯ ４８８ ＮＨＳエステル色素をコリスチン化デバイスに添加し、次いでＰＢＳで洗浄した。染色は、マイクロ流路内にコリスチンが存在することを示す。ｂ、ＤＭＳＯ中ＡＴＴＯ ４８８ ＮＨＳエステルの標準希釈液を使用して、標品蛍光曲線を作成した。ｃ、ＡＴＴＯ ４８８ ＮＨＳエステル染色されたコリスチン化デバイスおよびＡＴＴＯ ４８８ ＮＨＳエステル ＰＥＧ化デバイスから発生された蛍光を標準曲線と比較した。コリスチン化二重螺旋状デバイス内に１．７６μｇのコリスチンが存在していることが決定された。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝３）として記す。 二重螺旋状マイクロ流路構成を有するクレームに係る発明内のデバイス内におけるコリスチンリガンドの保持を示す図である。コリスチンＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、コリスチン化デバイスからのコリスチン遊離を分析した。ＰＢＳ緩衝液を、０．２ｍＬ／分でコリスチン化マイクロ流体デバイスに連続的に流した。示された時点で流体を出口から捕捉して、流路壁からの起こり得るコリスチン脱離を分析した。連続流れ下で、３００ｎｇのコリスチンが流路から２時間の間に遊離された。これらのコリスチンレベルは無毒性である。重要なことには、約４０分後に、出口流れにおいて検出できるほどのコリスチンは存在しなかったので、使用前にデバイスからカップリングしていないコリスチンを除去するための洗浄が実行可能になる。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝３）として記す。 グラム陽性細菌捕捉の評価を描く図である。ＰＢＳ中に添加し、０．２ｍｌ／分でコリスチン化およびＰＥＧ化された二重螺旋状マイクロ流体デバイスに流したときのグラム陽性枯草菌（B. subtilis） １Ａ５７８の病原体捕捉能力。捕捉の欠如は、コリスチンのグラム陰性病原体に対する特異性を示す。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝３）として記す。 エンドトキシン捕捉能力の定量化を提示する図である。エンドトキシンを、エンドトキシンを含まない水中に（１ＥＵ／ｍｌ）添加し、０．２ｍｌ／分でコリスチン化およびＰＥＧ化された二重螺旋状流体デバイスに流した。時間と共にエンドトキシンの捕捉量を評価した。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝３）として記す。 疾患材料（すなわち、桿形細胞）を含む血液が、ポンプでチューブを通って、疾患材料を捕捉するように設計された疾患材料標的化リガンドで流路壁に沿って官能化されている螺旋ベースの流体装置に送られることを示す図である。 螺旋ベースの流体装置流路内の力の概略図である。流路が湾曲しているため、反対方向に回転する２つのディーン力が主流方向に対して直交している。ディーン力は、流路の中心において所望の健全な材料（すなわち、赤色、血球）の再循環を引き起こす。健全な材料が流路中心の内腔において遊離のままであるのだが、疾患材料（すなわち、緑色、疾患材料）は慣性揚力を受け、その慣性揚力が標的疾患材料をリガンドで官能化された流路壁の近くに集約させる。 本発明の実施形態に従って、疾患材料を標的および捕捉するように設計されたポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製流体デバイスの図である。 疾患材料標的化リガンドから構成される流体装置壁の形成を示す図である。本発明の実施形態による（Ａ）コリスチンおよび（Ｂ）バンコマイシン疾患材料標的化リガンドの形成。 ポリカーボネートから製作された本発明のスケールアップしたバージョンの図である。 本発明の流体デバイスの代替実施形態を示す図である。供試体または生体液は、例えばチュービングとすることができるヘリカル状に巻きつけられた流路にポンプで送られる／流される。流路は疾患材料標的化リガンドで被覆されており、病原体などの疾患材料の捕捉が可能になる。

本明細書に開示されるのは、疾患を引き起こす材料を検出および捕捉するための流体デバイスおよび方法である。いくつかの態様において、本明細書に開示されるのは、螺旋ベースの流体装置内の所望の血液材料から離して特定の疾患材料を集約および分離して、現行のフィルター膜方法に伴う目詰まりの問題を避けることによって、望ましくない疾患材料を血液から除去するためのシステムおよび方法である。

次に、本発明の実施形態について詳細に言及し、それらの例を図面および実施例で説明する。しかし、本発明は様々な多くの形態で実施することができ、本明細書に記載される実施形態に限定されるものと解釈すべきではない。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される科学技術用語はすべて、当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。以下の定義は、本明細書で使用される用語の十分な理解のために提示する。

クレームに係るデバイス内の流路構成要素に関して本明細書では、「多方向」は、流路の方向が少なくとも１回変化することを意味する。そのような方向変化は、疾患を引き起こす材料と流路の内壁を裏打ちするリガンドの接触を増加させるのに必要である。クレームに係るデバイスの多方向流路は、複数の方向変化を含むことが好ましい。これは、多数の構成の使用により成し遂げることができ、それらの一部は、本明細書で具体的に開示されている。多方向流路の例としては、二重螺旋（例えば、図１、図８）または曲線（図４Ｂ、図１６Ｂ）の使用が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、クレームに係る発明は、他の例として、やはり本発明の範囲内である部分円またはヘリックスが挙げられるので、例示された構成に限定されないと理解されたい。

本明細書では、「リガンド」は、疾患を引き起こす材料と複合体を形成するいずれかの物質を意味する。

先に述べたように、流体デバイスは、
流体デバイスへの少なくとも１つの入口と、
少なくとも１つの出口と、
少なくとも１つの入口と少なくとも１つの出口の間の多方向流路であって、内壁を含む多方向流路と、
多方向流路の内壁の少なくとも一部分を被覆するリガンドと
から構成される。

デバイスのサイズは、その機能に対して重大な意味をもたない。しかし、デバイスは、多方向流路の被覆された内壁の利用可能領域（したがって、流路の長さ）がその所期の使用法に適しているようなサイズに作られるべきである。これは、デバイスのサイズを調整し、または複数のデバイスを直列および／もしくは平行構成で利用することによって成し遂げることができる。流路が一平面中にのみ存在しているいくつかの構成において、デバイスの高さは非常に小さく、例えばわずか約１５μｍであり得る。

以下の示唆されたサイズ範囲に限定しようとするものではないが、多方向流路の長さはサイズが一般に０．０００５〜１０００ｃｍの範囲であり得る。好ましくは、デバイスは、サイズが０．１〜５００ｃｍの範囲である。最も好ましくは、デバイスはサイズが０．１〜１００ｃｍの範囲である。デバイスの全サイズは重大な意味をもたず、主に多方向流路の特定の構成によって決定される。

クレームに係るデバイス内の多方向流路はまた、その所期の使用に一致したサイズに作られるべきである。例えば、そこでの使用を意図した流体が全細胞または細胞断片を含むのなら、流路の直径は、目詰まりの問題を回避しつつ、それらの通過に適応し、予測される流路のリガンド被覆との相互作用を可能にするようなサイズにしなければならない。例えば、所期の流体が疾患を引き起こすより小さい材料を含むのなら、流路の直径はサイズを小さくすることができる。以下の示唆されたサイズ範囲に限定しようとするものではないが、デバイス内の流路の直径は、サイズが一般に０．００１〜１０００ｃｍの範囲であり得る。好ましくは、デバイスは、サイズが０．００１〜１００ｃｍの範囲である。最も好ましくは、デバイスはサイズが０．０１〜３０ｃｍの範囲である。図に示すかつ／または実施例で述べるデバイスの一部は、直径約０．５ｃｍの流路を利用する。

クレームに係るデバイスは、多方向流路に対して少なくとも１つの入口および少なくとも１つの出口を有する。さらに、入口および出口の数の選択は、重大な意味をもたず、むしろ、デバイスの性能がその所期の用途に最適化されるように変えてもよい。入口の数は、入口の以下の範囲にこだわるつもりはないものの、典型的に１から３まであり得る。好ましくは、デバイスは１〜２つの入口を含む。最も好ましくは、デバイスは唯１つの入口を有する。出口については、デバイスは典型的に１〜５つの出口を有する。好ましくは、１〜３つの出口を有する。最も好ましくは、デバイスは１つの出口を有する。

クレームに係るデバイスは、いずれかの生体適合性材料から構成することができる。好ましい生体適合性材料は、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ＰＥＥＫポリマー、ポリエチレン、ペルフルオロアルコキシ、ガラス、ポリ（エーテルケトンケトン）、ポリスチレン、ポリオレフィンコポリマー、グラフェン、金属、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリアセタール、ポリウレタン、ポリアリールエーテルスルホン、ポリビニルピロリドン、ポリエステル、ポリビニルクロリド、シクロオレフィンコポリマー、ポリアミド、ポリスルホン、フルオロポリマー、エチレン酢酸ビニル発泡ＰＴＦＥ（ｅＰＴＦＥ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリグリコリド−ｃｏトリメチレンカーボネート（ＰＧＡ−ＴＭＣ）、ＰＧＡ−カプロラクトン、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、他のプラスチック、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ＳＵ−８、ポリイミド、パラリン、またはそれらの組合せである。最も好ましい生体適合性材料は、シリコーンおよびポリカーボネートである。

クレームに係るデバイスは、多数の技術の使用によって作製することができる。例えば、三次元印刷、リソグラフィー、射出成形、ブロー成形、注入成形、超音波溶接、高周波溶接、加熱工具または板溶接、溶剤接着、レーザー溶接、回転溶接、赤外線溶接、振動溶接、接着接合、および機械加工によって作製することができる。一部の実施形態において、好ましい機械加工方法は、旋削、孔あけ、中ぐり、リーマー仕上げ、放電加工および／またはフライス削りである。材料を機械加工して、流路（単数または複数）全体として機械加工することまたは半分を機械加工し、取り付けできることなどによって、所望の寸法の封入容器を作り出すことができる。流路（単数または複数）については、シリコーンを据え付けることができ、入口（単数または複数）および出口（単数または複数）をキャップで閉じることができる。機械加工は、様々なグレードのポリカーボネートを含めて様々な生体適合性材料について行うことができる。次いで、多方向流路（単数または複数）の内壁の少なくとも一部分を通常の手段によって被覆しているリガンドでデバイスを被覆することができる。

クレームに係るデバイスを使用して、がん細胞、循環腫瘍細胞、ペプチド、βアミロイド、タンパク質、酵素、毒素、患部細胞、がん細胞、感染性微生物、細胞、寄生虫、真菌、ウイルス、微生物、細菌、細菌毒素、リポ多糖、サイトカイン、ＩＬ−Ιβ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、腫瘍壊死因子、プロカルシトニン、病原体関連分子パターン、Ｃ反応性タンパク質、定数感知タンパク質もしくは受容体、または肝不全に関連している小さいもしくはタンパク質結合型の生体分子、あるいはそれらの組合せなど疾患を引き起こす多くのタイプの材料を除去および／または検出することができる。

流体デバイスは、疾患を引き起こす材料および血液などの生体液から除去されることが望まれている他の材料を捕捉するように、多方向流路の内壁の少なくとも一部分に沿ってリガンドで官能化されている。本発明の実施において有用なリガンドとしては、抗体、ペプチド、タンパク質、抗生物質、ポリマー、アプタマー、リガンド、腫瘍壊死因子、接着受容体、Ｅ−セレクチン、サイトカイン、化学療法剤、定数感知タンパク質または受容体、および生物学的作用物質を含む結合材料が挙げられる。

リガンドを、通常の手段によって多方向流路の内壁に被覆することができる。流路の内壁は、デバイスの所期の使用に応じて単一のタイプのリガンドまたはその混合物で被覆することができる。内壁の被覆の範囲も様々であり得る。例えば、マイクロ流路の内壁の全長またはその一部分のみを被覆することができる。

多方向流路の使用は、疾患を引き起こす材料とマイクロ流路の内壁を裏打ちするリガンドとの接触を増加させることになるように見えるので、本技術の実施において重要である。以下に限定しようとするものではないものの、下記のディーン渦力は、クレームに係るデバイスの多方向流路内で作用していると理論上想定される。

薄層状のポアズイユ流において、双曲線形の速度プロファイルは、流路の重心において最大速度および流路の壁においてゼロ速度を有する。粒子に作用する揚力（Ｆ_Ｌ）は、壁誘起揚力（Ｆ_１）およびせん断誘起揚力（Ｆ_２）によって支配されている。これらの揚力は連携して作用して、流路壁と中心線の間に粒子平衡位置を生じる。そこでは、逆方向性の揚力が等しく、粒子の狭帯域を生成する。粒子を流路中心および壁から離れて移動させる正味の揚力（Ｆ_Ｌ）は、Ｆ_Ｌ＝ｆ_Ｌ（Ｒｅ，ｘ_Ｌ）ρＵ_ｍ ^２ａ^４／Ｄ_ｈ ^２として推定され、ここで、揚力係数（ｆ_Ｌ）は、流路のレイノルズ数Ｒｅ（Ｒｅ＝ρＵ_ｍＤ_ｈ／μ）と流路の横断面内の粒子位置（ｘ_Ｌ）の関数である。Ｄ_ｈはマイクロ流路の水力直径であり、ρおよびμは流体の密度および粘度であり、Ｕ_ｍは最大の流体速度であり、ａは粒子径である。

しかし、湾曲したマイクロ流体流路において、流体の不均一な慣性によって、流路の上部半分および底部半分において二次横断流またはディーン渦流が発生する（図１）。湾曲したマイクロ流路のディーン渦流を特徴付けるのに使用される無次元ディーン数（Ｄｅ）を、Ｄｅ＝（ρＵ_ｆＤ_ｈ／μ）√（Ｄ_ｈ／２Ｒ）と定義することができ、ここで、Ｒは曲率の半径であり、Ｕ_ｆは平均流体速度^３１である。ストークス抵抗を仮定して、これらの流れのために粒子に加えられるディーン抗力（Ｆ_Ｄ）の大きさは、Ｆ_Ｄ約５．４＊１０^−４μπＤｅａによって推定することができる。

流れにおける粒子の平衡位置は、第一に揚力とディーン抗力の間の相互作用によって決定される。本発明の一部の実施形態において使用される二重螺旋状幾何形状を作製して、流速０．２ｍＬ／分に曝露させると、疾患を引き起こす材料がマイクロ流路内壁の近くの平衡位置を占有する。これによって、材料が、リガンドで官能化されたマイクロ流路壁にごく接近してくることが可能になり、疾患を引き起こす材料を捕捉することになる。これを成し遂げるために、二重螺旋状マイクロ流路を、寸法的に例えば長さ（Ｌ）４０６ｍｍ、幅（Ｗ）３００μｍ、高さ（Ｈ）１５μｍで、各方向について６つの螺旋状ループを有するように設計した（図１３）。これは、湾曲した幾何形状における細菌およびエンドトキシンの流体力学的分離および捕捉を成し遂げることを意図したものである。記載された二重螺旋状マイクロ流路は、低アスペクト比（Ｈ／Ｗ＝０．０５）を有する。マイクロ流路の低アスペクト比によって、疾患を引き起こす材料は急速に最終平衡位置に移動せざるを得ない。

二重螺旋状マイクロ流路内で連続流れ条件下におけるサイズが２μｍの粒子（ａ／Ｈ 約０．１３；Ｆ_Ｌ＞Ｆ_Ｄ）および１０．２μｍの粒子（ａ／Ｈ 約０．６７；Ｆ_Ｌ＞Ｆ_Ｄ）は、２μｍの粒子がディーン力よりも慣性揚力の影響を受け、したがってマイクロ流路内で平衡することを実証する（図１４ａおよび１４ｂ）。ａ／Ｈ≧０．０７を満足する粒子は、マイクロ流路内で単一の平衡位置を集約および占有することができる。流路設計の低アスペクト比は、より小さい粒子が流路内壁の近くに集約することを促進すると考えられる。２μｍの粒子と比べて、サイズが１０μｍの大きい粒子は、大きい壁誘起揚力を経験するため流路の中心近くで平衡する。

非球状粒子の集約位置は、粒子の最大横断面寸法に依存している。桿状（球桿）細菌であるＡ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８は、典型的に長さ２μｍおよび幅０．５μｍである。したがって、２μｍの粒子の集約を評価した（図１４ａ）。しかし、非球状細菌細胞は、慣性により集約および分類されながら、自由に回転し、強い回転誘起揚力を経験することがある。１０より大きいレイノルズ数では、球状および桿状粒子は共に、一般に同じ集約動向に従う。しかし、本設計の場合など低アスペクト比のマイクロ流路において、桿状粒子は２つの平衡領域に集約する（図１４ｃ）。細菌は、桿状粒子に課せられる回転力のため、流路壁に近いとき振動する。壁近傍集約を行う揚力は、回転誘起と組み合わさって、コリスチンで官能化された流路内壁および外壁の両方との直接接触をおそらく可能にする。

螺旋ベースの設計（螺旋状流路）の使用は、本発明の一部の実施形態において行われるように、サイズに依存している慣性力をさらに課して、クレームに係るデバイスに通した生体液から疾患材料を捕捉することを助ける。

デバイスを通る流速は、多方向流路の長さおよび直径、それに通すことになっている生体液、ならびにデバイスの所期の機能に応じて通常の技法により最適化することができる。本明細書に例示されるデバイスの一部の使用において、約０．２ｍＬ／分〜約２００ｍＬ／分の流速を利用した。

クレームに係るデバイスの複数のバージョンを直列または平行構成に配置することも本発明の範囲内である。そのようなデバイスは、サイズ、リガンド被覆などが同一でも異なっていてもよい。

先に指摘したように、クレームに係るデバイスは、少なくとも１つの入口および少なくとも１つの出口を含む。生体液をデバイスの入口（単数または複数）に供給することも、流体をその出口（単数または複数）から除去することも、通常の手段で成し遂げることができる。流体をデバイスに導入するのに適したポンプを使用することができ、容器、入れ物、試験管などの適当な回収手段を使用して、出口（単数または複数）から出現する流体を回収することができる。

図６に示すようなものなど、本発明の一部の実施形態において、生体液（この場合、患者の血液）を、血液ポンプで移し、クレームに係るデバイスに流す。デバイスから出現した後に回収するのではなく、その代わりに患者の血液を患者に再導入する。流路の壁は、この例示的な場合において、細菌標的化リガンドで官能化されており（図６）、それによって細菌の捕捉および除去が可能になる。この実施形態において、細菌標的化リガンドはポリマーベースのものであり、図２ａで例示されるように、シラン（Ｓｉ）−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリミキシンＥ（コリスチン）から構成される。次いで、螺旋ベースの流体装置の出口から得られる血液は疾患材料を含んでおらず、患者に戻される。

一部の実施形態において、流体デバイスは、疾患材料標的化リガンドで官能化された支柱（図１２）を含む。一実施形態において、健全な血球や他の材料など疾患を引き起こさない材料が通過するのに十分な余地をとっておくことによって、目詰まりを防止ししながらも、所望の粒子が支柱に衝突および結合する可能性を高めるように、支柱の位置を定める。支柱の位置を定めることができる有用なパターンおよび配置が多数あり、いずれかのそのような配置での使用のために本発明の実施形態が熟考される。

一部の実施形態において、螺旋ベースの流体装置またはリガンド（または支柱）の表面は、細菌などの細胞を捕捉するナノ粒子またはマイクロ粒子である（図１１）。ナノ粒子で官能化された表面は、疾患材料標的化リガンドで官能化されたナノメートルスケールの粒子を有する。マイクロ粒子表面は、疾患材料標的化リガンドで官能化されたマイクロメートルスケールの粒子を有する。

一部の実施形態において、処置に続いて、クレームに係る流体デバイスを使用して、捕捉された疾患材料を蛍光標識もしくは画像処理または血球計算などの他の技法により分析することができる。同様に、ＥＬＩＳＡ、抗原または分析物の存在を決定するために視認できる変色を引き起こす蛍光発生性または発色性のレポーターまたは基質を使用して、試料を分析してもよい。一部の実施形態において、熱を血液に加えて、望ましくない疾患材料を破壊してもよい。一部の実施形態において、医薬品、薬物、化学製品またはそれらのいずれかの組合せを、クレームに係るデバイスの使用に対するアジュバントとして使用することができる。

本発明の別の実施形態において、捕捉された疾患材料を、クレームに係るデバイスから、そのような疾患材料とリガンドの間の結合を切断する通常の手段（その流路を緩衝塩で洗い流すなど）により除去することができる。次いで、回収された疾患材料を培養および／またはその他の方法で試験することができる。本方法は、例えば、その同定および患者の治療プロトコールの処方において助けとなり得る。そのような材料の単離、回収およびその後の培養を、患者に関連していない多数の他の目的にも使用することができる。

本発明のさらに別の実施形態において、捕捉された疾患材料を、クレームに係るデバイスから、そのような疾患材料とリガンドの間の結合を切断する通常の手段（その流路を緩衝塩または溶解バッファーで洗い流すなど）により除去することができる。回収された疾患材料が細菌、真菌またはマイコバクテリアである場合、疾患材料のアイデンティティーは、材料を公知の手段により溶解し、次いで溶解した試料に対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を使用することによって決定することができる。本方法は、患者の治療プロトコールの迅速な処方を可能にする疾患材料の速やかな同定または患者に関連していない多数の他の目的においても助けとなり得る。

図７に示すように、一部の実施形態において、慣性ベースの分離を使用する流体デバイスを使用して、健全な材料を血液中の疾患材料から分離する。具体例として、細菌は血球より小さい。一部の実施形態において、シラン−ポリエチレングリコール−ポリミキシンＥなどの細菌標的化リガンドは、螺旋ベースの流体装置流路の壁または支柱に官能化され、それによって疾患材料（すなわち、細菌）を捕捉することが可能になる。具体例として、細菌は、白血球や赤血球など血液中の他の細胞より小さい。例えば、細菌は、０．５〜２ミクロンの直径を有することがあり、したがって９０％大きい血球が流路の中心に留まることを可能にしながら、より小さい細菌サイズの細胞をリガンドで官能化された流路壁の近くに押しやるように螺旋を設計することができる。一部の実施形態において、螺旋ベースの流体装置は、微細加工材料で作製される。微細加工材料としては、ＰＤＭＳまたはポリイミドのような他の材料が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、螺旋ベースの流体装置はＰＭＭＡで作製される。電荷ベースの相互作用により細菌への親和性が高い特異的リガンドを使用して、細菌を捕捉する。

本発明の一部の実施形態において、クレームに係る流体デバイスの球体、支柱、または壁（またはそれらのいずれかの組合せ）は、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）などのアニオン性細菌を捕捉するために、シラン−ポリエチレングリコール−ポリミキシンＥなど抗生物質類似体を有するカチオン性ポリマーベースのリガンドで官能化されている。捕捉した後、撮像して、特異的蛍光抗体コンジュゲートで染色することによって、疾患進行をさらに診断することができる。細菌捕捉のための抗体標的としては、ＬＰＳ、ＯｍｐＡ、リポタイコ酸、ＧｒｆＡ、およびクランピング因子Ａが挙げられるが、これらに限定されない。

一部の実施形態において、流体装置は、ポリマーベースのリガンドなどの疾患材料標的化リガンド（図２ａ）で官能化された螺旋状流路（図８）から構成される。螺旋状流路は、プラスチック、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（図５ａ）、ＳＵ−８、ポリイミド、パラリン、金属、または他の材料からなる材料から構成されるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、螺旋の内部表面は、リガンド、例えばシランベースのポリマーリガンドに対して受容性を示すように修飾される。一部の実施形態において、螺旋ベースの流体装置は、ペプチドで官能化されている。一部の実施形態において、患者の血液は、関連する生物学的微生物、細胞、タンパク質、抗体、またはペプチドが装置の表面でリガンドに付着されるように螺旋ベースの流体装置を流れる。一部の実施形態において、血液は、螺旋ベースの流体装置から約０．２ｍＬ／分〜約２００ｍＬ／分の流速で一貫して流し戻すことができる。代替の実施形態において、血液は、疾患材料を回収するのに要する時間に応じてより長いまたはより短い時間の後に螺旋ベースの流体装置から流し戻すことができる。

一部の実施形態において、捕捉された材料（細菌など）を含む螺旋ベースの流体装置（図４）は、蛍光色素で先に蛍光標識される。例えば、ＳＹＴＯ ９色素を使用して、螺旋ベースの流体装置において捕捉された細菌を標識する（図４）。次に、蛍光細菌を定量化する。一部の実施形態において、自動化システムを使用して、細菌を定量化する。ソフトウェアおよび／またはＣＣＤカメラを定量化システムに組み込んで、細菌を計数することができる。一部の実施形態において、全装置内の細菌を定量化する。一部の実施形態において、単一の横断面積内の細菌を定量化し、捕捉された細菌細胞の全数をただ１回の細菌計数から外挿する。一部の実施形態において、流体が除去されると捕捉後に定量化を行う。捕捉された細胞を標識および定量化するのに使用される様々な方法が存在し、本発明で説明される。また、様々な材料も捕捉および定量化することができ、本発明で説明される。

一部の実施形態において、螺旋ベースの流体装置を連続的に流れることがある。代替実施形態において、血液を特定の時間ポンプで螺旋ベースの流体装置に送り、次いで流れを特定の時間止め、次いで流れを再開し、このステップを繰り返す。

一部の実施形態において、捕捉する螺旋ベースの流体装置を放射線に曝露して、細菌または他の疾患材料を死滅させる。一部の実施形態において、細菌標的化ポリマーリガンドを、螺旋ベースの流体装置流路の内部表面に沿って官能化する。細菌は、螺旋ベースの流体装置を流れるとき、疾患材料標的化リガンドで官能化された流路の表面の近くに集約される。次いで、リガンド捕捉も抗生物質剤と組み合わせて使用される場合、細菌は付着または／および死ぬ。一部の実施形態において、抗がん薬または他の化学製品もしくは薬物が使用される。一部の実施形態において、必ずしも細胞傷害性を示すとは限らない薬物は、装置の表面で官能化される。これらの薬物は、細菌表面タンパク質またはがん細胞など、除去の標的とされる細胞壁で発現された特異的タンパク質を標的とする。

一部の実施形態において、温熱療法を使用して、血液から疾患材料を除去することで助けとなり得る。一部の実施形態において、血液をポンプで螺旋ベースの流体装置に送り、次いで標的疾患材料を破壊または不活性化するのに指定された温度に加熱する。装置の加熱は、実際の流れの条件下でまたは血液の流れなしで行うことができる。一部の実施形態において、次いで、螺旋ベースの装置を医学的に許容された温度に冷却する。複数のチャンバ、流路、またはコンパートメントを、加熱および冷却用に指定および適用することができる。

一部の実施形態において、内側の螺旋状流路は、疾患材料標的化リガンドで官能化される。そのリガンドは、タンパク質、抗体、ペプチド、ポリマー、アポトーシスを誘導する物質、死受容体に結合する物質、腫瘍壊死因子、接着受容体、Ｅ−セレクチン、およびサイトカイン、定数感知タンパク質受容体を含むリガンドの群から選択される。以上で記載されていないが使用することができる様々なリガンドが存在する。

一部の実施形態において、本発明を使用して、ウイルス、微生物、細菌、転移細胞、材料、がん幹細胞、ペプチド、タンパク質、酵素、毒素、患部細胞、がん細胞、および定数感知タンパク質を除去することもできる。一部の実施形態において、本発明は、敗血症、心内膜炎、および高ラクテートレベルを含めて感染症を低減する助けとなり得る。本発明は、抗体またはペプチドなどの生物学的リガンドを利用して、微生物、細菌、ウイルス、エンドトキシン、感染性微生物、がん細胞、循環腫瘍細胞、ペプチド、および血液から除去されることが望まれている他の疾患材料を捕捉することができる。

本開示はまた、血液からの疾患材料の検出および捕捉にも関する。具体的には、本開示は、本明細書に記載される流体装置内で官能化された疾患材料標的化リガンドを使用して、全血から除去されることが望まれている疾患材料を捕捉することに関する。

一部の実施形態において、血液を流体装置に流した後、次いで光学活性マイクロビーズを流体装置に添加して、流路内で捕捉された疾患材料を標識する。

一部の実施形態において、マイクロビーズで標識された流体装置を、光学読取装置を使用して光学読み取りする。結果を使用して、疾患材料が血液中に存在しているかどうかを決定し、さらに疾患材料を同定し、疾患材料負荷を定量化する。

一部の実施形態において、血液は、チューブを通して流体装置に流し込まれる。一部の実施形態において、螺旋ベースの流体装置は疾患材料標的化リガンドを含む。一部の実施形態において、リガンドは、細菌など除去の標的となっている疾患材料の表面マーカーに特異的な抗生物質または抗体である。細菌などの疾患材料は、螺旋ベースの流体装置を流れるとき、慣性力によって流路の壁に沿って押しやられる。流路の壁は、この例示的な場合において、細菌標的化リガンドで官能化されており（図２）、それによって細菌の捕捉および除去が可能になる（図４）。一部の実施形態において、細菌標的化リガンドは、ポリマーベースのものであり、図２で示されるように、シラン（Ｓｉ）−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリミキシンＥ（コリスチン）から構成される。一実施形態において、リガンドであるコリスチン−ＰＥＧ １０００−シラン（Ｃｏｌ−ＰＥＧ−Ｓｉ）は、細菌を捕捉するように設計された。天然のカチオン性デカペプチドであるコリスチンは、臨床状況で使用される強力な広域スペクトル抗微生物薬である。カチオン性コリスチン分子とすべてのグラム陰性病原体の負に帯電した脂質Ａ成分が静電気的かつ疎水的に相互作用し、Ｃｏｌ−ＰＥＧ−Ｓｉによる細菌の捕捉が可能になる。流路表面にコンジュゲートしているコリスチンの量は、細菌結合速度を改善するように慎重に設計された。コリスチンを標的化リガンドとして利用すると、この文脈で使用されてきた合成、遺伝子組み換え、または生体高分子のリガンドに優る多くの利点がもたらされる。１つの利点は、コリスチンが、臨床状況で１０年間使用されてきた容易に入手可能な認可済み抗生物質であることである。この設計は、遺伝子組み換えまたは新規の生体高分子リガンドの使用に比べて開発を単純化し、規制面の考察を促進する。次いで、光学活性な疾患材料標的化マイクロビーズを、流体流路に添加する。光学活性マイクロビーズは、標的疾患材料に結合する。次いで、光学読取装置を使用して、デバイスを読み取る。

一部の実施形態において、流体装置は、疾患材料標的化リガンドで官能化された支柱を含む。一部の実施形態において、健全な血球および材料が通過するのに十分な余地をとっておくことによって、目詰まりを防止ししながらも、所望の粒子が支柱に衝突および結合する可能性を高めるように、支柱の位置を定める。支柱の位置を定めることができる有用なパターンおよび配置が多数あり、いずれかのそのような配置での使用のために本発明の実施形態が熟考される。

一部の実施形態において、処置に続いて、流体装置を使用して、捕捉された疾患材料をＥＬＩＳＡにより分析することもでき、抗原または分析物の存在を決定するために視認できる変色を引き起こす蛍光発生性、または発色性のレポーターまたは基質を使用して、試料を分析することができる。

具体例として、細菌は血球より小さい。一部の実施形態において、シラン−ポリエチレングリコール−ポリミキシンＥなどの細菌標的化リガンドは、流体装置流路の壁または支柱に官能化され、それによって疾患材料（すなわち、細菌）を捕捉することが可能になる。具体例として、細菌は、白血球や赤血球など血液中の他の細胞より小さい。例えば、細菌は、０．５〜２ミクロンの直径を有することができ、したがって９０％大きい血球が流路の中心に留まることを可能にしながら、より小さい細菌サイズの細胞をリガンドで官能化された流路壁の近くに押しやるように螺旋を設計することができる。一部の実施形態において、螺旋ベースの流体装置は、微細加工材料で作製される。微細加工材料としては、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）またはポリイミドのような他の材料が挙げられるが、これらに限定されない。

電荷ベースの相互作用により細菌への親和性が高い特異的リガンドを使用して、細菌を捕捉する。本発明の一部の実施形態において、流体装置の球体、支柱、または壁（またはそれらのいずれかの組合せ）は、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）などの細菌を捕捉するために、シラン−ポリエチレングリコール−ポリミキシンＥなどの抗生物質類似体を有するポリマーベースのリガンドで官能化されている。捕捉した後、撮像して、特異的蛍光抗体コンジュゲートで染色することによって、疾患進行をさらに診断することができる。細菌捕捉のための抗体標的としては、ＬＰＳ、ＯｍｐＡ、リポタイコ酸、ＧｒｆＡ、およびクランピング因子Ａが挙げられるが、これらに限定されない。

一部の実施形態において、螺旋ベースの流体装置は、ポリマーベースのリガンドなどの疾患材料標的化リガンド（図２）で官能化された螺旋状流路（図８）から構成される。螺旋状流路は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（図５）、ＳＵ−８、ポリイミド、パラリン、金属、または他の材料からなる材料から構成される。一部の実施形態において、螺旋の内部表面は、リガンド、例えばシランベースのポリマーリガンドに対して受容性を示すように修飾される。一部の実施形態において、流体装置は、ペプチドで官能化されている。一部の実施形態において、血液は、関連する生物学的微生物、細胞、タンパク質、抗体、またはペプチドが装置の表面でリガンドに付着されるように流体装置を流れる。

一部の実施形態において、捕捉された材料（細菌など）を含む螺旋ベースの流体装置（図４）は、光学活性マイクロビーズで蛍光標識されている。例えば、コリスチンで官能化された蛍光マイクロビーズを流路に添加して、流体装置において捕捉された細菌を標識することができる。次に、蛍光標識された細菌を定量化する。一部の実施形態において、自動化システムを使用して、細菌を定量化する。ソフトウェアおよび／またはＣＣＤカメラを定量化システムに組み込んで、細菌を計数することができる。一部の実施形態において、全装置内の細菌を定量化する。一部の実施形態において、単一の横断面積内の細菌を定量化し、捕捉された細菌細胞の全数をただ１回の細菌計数から外挿する。一部の実施形態において、流体が除去されると捕捉後に定量化を行う。捕捉された細胞を標識および定量化するのに使用される様々な方法が存在し、本発明で説明される。また、様々な材料も捕捉および定量化することができ、本発明で説明される。

敗血症における治療様式としての使用には、より大きい生物系の血液量に適応するための流量増加とグラム陽性細菌を単離する方式とが必要である。本明細書に開示されるのは、元のデバイスに適用された同じ定量的手法および設計原理を使用してスケールアップする方法である（図８；図２６）。Ａ．バウマニ（A. baumannii）捕捉は、容積対表面積の比を一定に保持しながら、流体デバイスの横断面積を増加させた後等しい実効性で行われる。重要なことに、これを行って、グラム陽性細菌の捕捉剤を有するデバイスも含む。組合せデバイスは、グラム陽性、グラム陰性、または抗生物質耐性としての提示にかかわらず、細菌を除去する能力を提供し、したがって、血液試料からの陽性細菌培養または株同定なしに早期処置を可能にする。さらに、細菌およびエンドトキシンの同時除去によって、敗血症の治療にとって強力で、以前は未試験であった手法が提供される。この研究は、敗血症が唯一の例である生体液および血液感染症の処置への医用生体工学原理の拡大応用により達成される変革的影響を強調する。心内膜炎など他の同様に厳しい障害も、同様の手法によって利益を得ることができる。

次の例を以下で記載して、開示された主題によるデバイス、方法、および結果を説明する。これらの例は、本明細書に開示される主題のすべての態様を含むことを意図したものではなく、代表的な方法および結果を説明することを意図したものである。これらの例は、当業者に明らかである本発明の均等物および変形物を排除することを意図したものではない。

[実施例１]
細菌を捕捉および除去するための抗生物質で官能化されたマイクロ流体デバイス
本実施例において、流れている流体から細菌を単離するデバイスおよび方法を開発した。細菌で汚染された試料を、１つまたは複数の流路から構成されるマイクロ流体デバイス（図１Ａおよび１Ｂ）の少なくとも１つの入口に導入した。細菌に特異的に結合し、高親和性で流れている流体から捕捉する生体適合性リガンドであるコリスチン−ＰＥＧ １０００−シラン（Ｃｏｌ−ＰＥＧ−Ｓｉ）（図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃ）で、流路壁を連続的に官能化した。流路はそれぞれ、慣性力に影響を与えるように設計されたアスペクト比および湾曲を有し、その慣性力によって、細菌細胞および細菌サイズの粒子がマイクロ流路の壁に沿って押しやられた（図３）。これは、官能化された流路壁に沿って細菌を捕捉することになる（図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃ）。血球を含めて、他の細胞型はすべて、細菌標的化リガンドによって捕捉されず、流路の第２の部分に沿って自由に流された。これによって、汚染されていない流体が流路出口（単数または複数）を通って出ていった。マイクロ流路内のコリスチン表面提示の特徴付けを行い、その結果から、細菌とＣｏｌ−ＰＥＧ−Ｓｉとの急速な結合が明らかになった。

本実施例において、コリスチンで官能化された新規マイクロ流体デバイスは、インビボで安全性および有効性が証明された材料から構成される。これによって、血液で運ばれた病原体サブセットを感染系から除去および根絶することが可能になり、細菌の遠位部位への伝播がおそらく低減された。血流から循環細菌を選択除去すると、先天性免疫系の再均衡を助け、それによって、炎症性メディエーターレベルの低下、血管機能の改善、および血行動態の向上を導く。デバイスによって、磁石などの複雑な外力場の統合の必要性もなくなり、デバイスを操作しやすくなった。デバイスはナノ粒子を必要とせず、もっぱらＦＤＡに認可され、生体適合性である材料からなり、臓器におけるナノ粒子の蓄積などの負の副作用を避けた。システムは、高い処理スループットを有し、高い流速が可能であり、感染患者の血液をインパクトの強い時間枠で処理するのに適したものとなる。結果は、本実施例の螺旋状マイクロ流体デバイスが、目詰まりおよび細胞変形の誘起に関連した問題を克服することを示す。さらに、デバイスは、抗生物質の無効性および過剰使用に対抗する助けとなり、その後に多剤耐性細菌の脅威を低減することができる。

[実施例２]
血液で運ばれる病原体を急速検出および捕捉するための慣性ベースの流体プラットフォーム
慣性ベースの流体装置を使用した病原体およびエンドトキシンの体外抽出を、敗血症に関連した罹患率と死亡率を低減する次世代技術として使用することができる。

コリスチン−ＰＥＧ−シランリガンドの合成
ＮＨＳ−ＰＥＧ−シラン（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ポリエチレングリコール_１０００−シラン、Ｎａｎｏｃｓ，Ｉｎｃ．、ロット＃１６０４２９）（３０ｍｇ／ｍＬ）を、エタノール／水、ｐＨ５（５０／５０ｖ／ｖ％、酢酸でｐＨ調整）に溶解した。３５ｍｇ／ｍＬのコリスチン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ロット＃ＳＬＢＮ５１５８Ｖ）を、ＮＨＳ−ＰＥＧ−シラン溶液に添加した。溶液を３０秒間ボルテックスし、次いで２１℃で２時間反応させた。ＮＨＳを使用して、ヘテロ二官能性ＮＨＳ−ＰＥＧ−シランリンカーをコリスチンの同様な反応性を示す５つのＬ−α−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）残基の１つにカップリングさせ、コリスチン−ＰＥＧ−シランを得た。

ＰＥＧ−シランリガンド溶液調製
ＰＥＧ−シラン（ポリエチレングリコール_１０００−シラン、Ｎａｎｏｃｓ，Ｉｎｃ．、ロット＃１６０７０６ＯＨ）（３０ｍｇ／ｍＬ）を、エタノール／水、ｐＨ５（５０／５０ｖ／ｖ％、酢酸でｐＨ調整）に溶解した。溶液を３０秒間ボルテックスし、次いで２１℃で２時間インキュベートさせた。

デバイスの設計および製作
マイクロ流体デバイスパターンを設計し、ＡｕｔｏＣＡＤソフトウェア（ＡｕｔｏＣＡＤ ２０１４、ＡｕｔｏＤｅｓｋ，Ｉｎｃ．）で描いた。設計は、１つの入口および１つの出口を設けた６ループ二重螺旋状マイクロ流路からなるものであった。マイクロ流路は、６ループについて時計回りに回転し、Ｓ字ジャンクションを通って方向を変え、次いで反時計回りに回転して、二重螺旋を形成する。二重螺旋状マイクロ流路は、４０６ｍｍ（Ｌ）、３００μｍ（Ｗ）、１５μｍ（Ｈ）の寸法である。隣接している２つのループ間の間隔は５００μｍである。湾曲の最外半径は９．８ｍｍである。標準フォトリソグラフィー技法を使用して、ＳＵ８−２０１０（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ Ｃｏｒｐ．）層（ＷＳ−４００ Ｌｉｔｅ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓｐｉｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｌａｕｒｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．）で４インチのシリコンウェハ（Ｎｏｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）にスピンコーティングしたシリコンマスターから鋳型を生成した。９５℃で５分間ソフトベーキングした後、マスクアライナー（ＭＪＢ ３ Ｍａｓｋ Ａｌｉｇｎｅｒ、Ｓｕｓｓ ＭｉｃｒｏＴｅｃｈ）をＵＶ光（Ｎｏｖａｃｕｒｅ ２１００、Ｅｘｆｏ Ｉｎｃ．）およびネガ型フォトマスク（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｇｒａｐｈｉｃｓ，Ｉｎｃ．）と共に使用して、ＳＵ−８層をパターン形成した。続いて、９５℃で５分間の後露光ベーキングステップの後、ＳＵ−８現像薬（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ Ｃｏｒｐ．）を使用して、得られたウェハを現像した。最終のハードベーキングを１５０℃で５分間行った。ウェハをマスター鋳型として使用して、マイクロ流体流路を注入成形した。脱気したＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン、ＰＤＭＳベースと硬化剤を１０：１の比で混合、Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）を鋳型に注入成形し、６５℃で４時間ベーキングした。流路が埋め込まれたＰＤＭＳを、続いて安全かみそりの刃で切断し、マスター鋳型から取り出した。１．５ｍｍの生検用パンチ（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｍｉｌｔｅｘ）を使用して、ＰＤＭＳに１つの入口および１つの出口をあけた。次いで、ＰＤＭＳスラブを、酸素プラズマ処理（ＰＤＣ−００１ Ｐｌａｓｍａ Ｃｌｅａｎｅｒ、Ｈａｒｒｉｃｋ Ｐｌａｓｍａ）後のガラス基板（４３ｍｍ×５０ｍｍ、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）に結合させた。プラズマ処理およびガラス製カバースリップへの結合の直後に、外径１／１６インチのタイゴンマイクロボアチュービング（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ Ｃｏｒｐ．）を、入口ポートと出口ポートとから挿入した。コリスチン−ＰＥＧ−シランリンカーおよびシラン化学的性状を使用して、コリスチンを二重螺旋状マイクロ流体デバイス流路壁に繋ぎ止めた（図１９）。１ｍＬのルアーロック式使い捨てシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、コリスチン−ＰＥＧ−シラン溶液を、酸化ＰＤＭＳマイクロ流路に流した。十分に確立したシラン処理の原理に従って、コリスチン−ＰＥＧ−シラン溶液とマイクロ流路表面を６５℃で３０分間接触させた。ヘテロ二官能性のコリスチン−ＰＥＧ−シランリンカーの使用は、細菌およびエンドトキシンとのコリスチン相互作用の立体障害を低減することを意図したＰＥＧ分子スペーサーを含むマイクロ流路壁のコリスチン修飾を可能にするように設計された。生理学的なｐＨ値の範囲において、コリスチンの第一級アミン基はプロトン化され、したがって正に荷電された。コリスチンの正電荷によって、グラム陰性病原体およびエンドトキシンの負に荷電された外膜への結合が可能になる。まさに同様の手法を使用して、ＰＥＧ−シランで官能化されたデバイスも合成し、コリスチン修飾を欠いたＰＥＧ化対照群として使用した。リガンドを添加せずに、官能化されていない二重螺旋状マイクロ流体デバイスを得た。

マイクロ流路壁へのコリスチンコンジュゲーションの確認
コリスチン化二重螺旋状マイクロ流体デバイス内のコリスチンの蛍光標識は、ＡＴＴＯ ４８８ ＮＨＳエステル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ロット＃ＢＣＢＱ４０１２Ｖ）を使用して行った。ＡＴＴＯ ４８８ ＮＨＳエステル（２ｍｇ／ｍＬ）を、使用直前にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。その蛍光剤をコリスチン化マイクロ流路に添加し、続いて室温で３０分間インキュベートすることによって標識した。次いで、染色されたマイクロ流路をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、ロット＃１８０６０４８）、ｐＨ７．４で洗浄した。同じプロトコールを、対照のＰＥＧ化マイクロ流路に対して使用した。次いで、蛍光染色したマイクロ流路を、蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ ＦＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して画像処理した。Ｉｍａｇｅ−Ｊソフトウェアを使用して、捕捉された画像の流路幅にわたって蛍光強度を定量化した。官能化されていないマイクロ流体デバイス内のＡＴＴＯ ４８８ ＮＨＳエステルの希釈液を参照として使用して、ＡＴＴＯ ４８８ ＮＨＳエステル標準蛍光較正曲線を作成した。コリスチン化マイクロ流路およびＰＥＧ化マイクロ流路の蛍光強度を、ＡＴＴＯ ４８８ ＮＨＳエステル標準曲線の蛍光強度と比較し、二重螺旋状マイクロ流路１つ当たりのコリスチン分子の数を定量化することが可能になった。

コリスチンの保持
コリスチン−ＰＥＧ−シランリガンドが流れ条件下で二重螺旋状マイクロ流体デバイスの表面から解体する可能性を、ＭａｘＳｉｇｎａｌ（登録商標）コリスチン酵素結合性免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）試験キット（ＢＩＯＯ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロット＃１０９５０１０８１４１５＄６２６３１１７０８２４９）を使用して評価した。ＰＢＳ、ｐＨ７．４を、０．２ｍＬ／分でコリスチン化二重螺旋状マイクロ流体デバイスに２時間流した。試料をデバイス出口から様々な時点（１、２、４、５、１０、２０、３０、４５、６０、１２０分）で回収し、分析した。各試料中の全コリスチン含有量を、コリスチンＥＬＩＳＡにより製造業者の指示書に従って定量化した。マイクロタイタープレートリーダーを使用して、吸光度を４５０ｎｍで測定し、これらの値を使用して、試料中のコリスチン濃度を較正曲線に従って算出した（アッセイ検出範囲、０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ）。コリスチンリガンド保持の特徴付けの結果によって、二重螺旋状マイクロ流体デバイスをそれぞれ、実験で使用する前に７０％エタノールで連続的に３０分間洗浄することが促され、捕捉調査時においてコリスチンの遊離は無視できるほどであった。

微生物培養
細菌培養物（すなわち、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８、コリスチン耐性アシネトバクター・バウマニ（Colistin-resistant Acinetobacter baumannii） １９６０６Ｒ^４１、コリスチン耐性アシネトバクター・バウマニ（Colistin-resistant Acinetobacter baumannii） 「患者２」、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae） ＡＴＣＣ７００６０３、枯草菌（Bacillus subtilis） １Ａ５７８ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus） ＡＴＣＣ２９２１３）をＬＢ寒天（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ロット＃ＳＬＢＲ１４０３Ｖ）に蒔き、３７℃で終夜増殖させた。次いで、各株の単一コロニーをＬＢ培地（１倍）（Ｇｉｂｃｏ、ロット＃１８０３２７２）に播種し、１５０ｒｐｍで振動させて３７℃で１８時間増殖させた。細胞濃度をＯＤ５９５分光測定（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５００、Ｔｅｃａｎ）で測定した。

慣性集約の可視化
平均直径１０．２μｍ±４μｍおよび２μｍ±０．３μｍのポリスチレンマイクロスフェア（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）を使用して、マイクロ流路内の粒子集約を分析した。１ｖｏｌ％のＴｗｅｅｎ−２０界面活性剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む１ｗ／ｖ％の懸濁液を用意して、粒子凝集を防止した。脱イオン（ＤＩ）水を使用して、等体積の懸濁液２つを０．１ｗ／ｖ％に希釈した。１ｍＬのルアーロック式チップシリンジおよび外径１／１６インチのタイゴン入口チュービングを通ってマイクロ流路の入口ポートに連結された注入シリンジポンプ（Ｎｅｘｕｓ ３０００、Ｃｈｅｍｙｘ Ｉｎｃ．）を使用して、蛍光粒子を個別に、官能化されていない二重螺旋状マイクロ流路に０．２ｍＬ／分で導入した。蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ ＦＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、二重螺旋状流路内の粒子の軌道および集約をリアルタイムで可視化した。この方法は、ＳＹＴＯ（登録商標）９緑色蛍光核酸標識（ＤＭＳＯ中５ｍＭ溶液、分子プローブ、ロット＃１６８７８７６Ａ）Ａ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８を使用して繰り返された。ＳＹＴＯ（登録商標）９を用いて５分間インキュベートした後、細菌を、ＲＮａｓｅ不含超純水（ＵＳＢ Ｃｏｒｐ．、ロット＃４２３５５１２）で３回洗浄し、約１０^７コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬの濃度に再懸濁した。注入シリンジポンプを使用して、蛍光標識された細菌懸濁液を０．２ｍＬ／分でＰＥＧ化二重螺旋状マイクロ流体デバイスに流した。蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ ＦＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、二重螺旋状流路内の細菌の軌道および集約をリアルタイムで可視化した。

感受性試験
細菌株のコリスチン最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を標準寒天平板希釈法で確認した。臨床検査標準協会の感受性限界点に従って、結果を解釈した。

細菌捕捉の可視化
「慣性集約の可視化」方法の節で既に記載したように、Ａ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８をＳＹＴＯ（登録商標）９で標識した。注入シリンジポンプを使用して、蛍光標識された細菌懸濁液を、０．２ｍＬ／分でコリスチン化およびＰＥＧ化された二重螺旋状マイクロ流体デバイスに流した。次いで、デバイスをＰＢＳ、ｐＨ７．４で４回洗浄して、弱く結合しているいずれの細菌も除去した。蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ ＦＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、マイクロ流路の蛍光画像を得た。この方法は、ＥＤＴＡ抗凝固処理されたヒト全血に添加された蛍光標識されたＡ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８および黄色ブドウ球菌（S. aureus） ＡＴＣＣ２９２１３を使用して繰り返された。バンダービルト大学被験者（Vanderbilt University Human Subjects）施設内倫理委員会（ＩＲＢ）（プロトコール番号１１１２５１）に従って十分な説明に基づく同意を得て、健常ドナーからヒト血液を得た。

細菌捕捉の定量化
コリスチン化およびＰＥＧ化された二重螺旋状マイクロ流体デバイスの病原体捕捉能力の試験は、まず、Ａ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８細菌懸濁液をＰＢＳ、ｐＨ７．４中約８×１０^７ＣＦＵ／ｍＬに調整することによって実施した。対照として働く最初の懸濁液の系列希釈により、約１０^２ＣＦＵ／ｍＬの濃度を得た。細菌試料をコリスチン化二重螺旋状マイクロ流体デバイスに０．２ｍｌ／分で注入し、試料をデバイス出口から異なる５つの時点（１、２、３、４および５分）で回収した。この方法を、ＰＥＧ化二重螺旋状マイクロ流体デバイスでも繰り返した。二重螺旋状マイクロ流体デバイスの出口から回収された溶液を対照群と同じように希釈した。病原体捕捉能力を定量化するために、回収された試料および対照をＬＢ寒天ペトリ皿に３回繰り返して蒔いた（１００μＬ）。プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、ペトリ皿に形成されたコロニーを計数した。最初の細菌および回収された細菌の数は、複製物から計数された平均コロニー数にそれらのそれぞれの希釈因子を掛けることによって算出した。回収された細菌の数を最初の細菌数（すなわち、無処置対照群）から差し引くことによって、捕捉された細菌の数を決定した。捕捉された細胞の数を最初の細胞の数で割ることによって、捕捉能力を算出した。ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の以下の細菌株の捕捉能力を定量化した：Ａ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８、コリスチン耐性Ａ．バウマニ（colistin-resistant A. baumannii） １９６０６Ｒ、コリスチン耐性Ａ．バウマニ（colistin-resistant A. baumannii） 「患者２」、肺炎桿菌（K. pneumoniae） ＡＴＣＣ７００６０３、および枯草菌（B. subtilis） １Ａ５７８。この方法を、ＥＤＴＡ抗凝固処理されたヒト全血に添加された蛍光標識されたＡ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８でも繰り返した。

エンドトキシン結合アッセイ
Ｐｉｅｒｃｅ ＬＡＬ発色性エンドトキシン定量化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロット＃ＲＧ２３６３２７）を製造業者のプロトコールに従って使用して、コリスチン化およびＰＥＧ化された二重螺旋状マイクロ流体デバイスのエンドトキシン捕捉能力をそれぞれ定量化した。簡潔に言えば、大腸菌（E. coli）エンドトキシン標準品（０１１：Ｂ４）をエンドトキシン不含水中に１ＥＵ／ｍＬ（エンドトキシン単位）の濃度で復元し、注入シリンジポンプを使用して、その溶液を０．２ｍｌ／分でコリスチン化二重螺旋状マイクロ流体デバイスに流した。試料をデバイス出口から異なる５つの時点（１、２、３、４および５分）で回収した。この方法を、ＰＥＧ化二重螺旋状流体デバイスで繰り返した。次いで、回収された試料を、製造業者のプロトコールに従ってエンドトキシン濃度について分析し、４５０ｎｍにおいて結果を読み取った。

血液学的検討
二重螺旋状マイクロ流体デバイスでの処置が血液学的パラメータを有意に変化させるかどうか決定するために、１ｍＬのＥＤＴＡ抗凝固処理されたヒト全血を、０．２ｍｌ／分で血液浄化デバイスに流した後、コリスチン化デバイス出口から回収した。この方法を、ＰＥＧ化デバイスで繰り返した。次いで、赤血球溶解を分析して、血漿中における遊離ヘモグロビンの放出を決定した。血漿ヘモグロビンを、十分に確立したプロトコールに従って測定した。デバイスに通した後、血液試料を遠心し（５００×ｇ）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ陽性対照に対する溶血（％）を決定するために、プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ Ｐｒｏ）を使用して、上澄液をヘモグロビン放出について４５１ｎｍで分光光度分析した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を脱イオンＨ_２Ｏに希釈して、２０ｖ／ｖ％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ洗浄剤濃度が得られ、それは、陽性対照として働いた。使用された陰性対照は、二重螺旋状マイクロ流体デバイスに流さなかった（すなわち、無処置の）ＥＤＴＡ抗凝固処理されたヒト全血であった。ヘモグロビン放出（％）を次式に従って算出した：ヘモグロビン放出（％）＝［（試料_{４５１ｎｍ}−陰性対照_{４５１ｎｍ}）／（陽性対照_{４５１ｎｍ}−陰性対照_{４５１ｎｍ}）］×１００％。各試料（すなわち、無処置、コリスチン化デバイス、ＰＥＧ化デバイス）の全血球計算をバンダービルト大学トランスレーショナルパソロジー共有資源コア（Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｒｅ）によって行った。

デバイスのスケールアップ
既に記載した方法を使用して、最初の二重螺旋状マイクロ流体デバイスのより大きいバージョンを製作および官能化した。デバイスのスケールアップしたバージョンは、１つの入口および１つの出口を設けた４ループ二重螺旋状マイクロ流路からなるものであった。スケールアップしたバージョンの寸法は、長さ（Ｌ）３２３ｍｍ、幅（Ｗ）７５０μｍ、高さ（Ｈ）１５μｍであった。隣接している２つのループ間の間隔は５００μｍであり、湾曲の最外半径は１１．２ｍｍであった。スケールアップしたデバイスの寸法を、容積対表面積の比が最初のデバイス設計の比に匹敵するように調整した。スケールアップしたデバイスの細菌捕捉能力は、捕捉能力を小さい方のデバイスの捕捉能力と比較するように特徴付けられた。スケールアップしたデバイスを使用した「細菌捕捉の定量化」アッセイを、Ａ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８で行った。

統計分析
測定値はすべて、エラーバーが指し示すように少なくとも３通りの試料の平均値（ａｖｅｒａｇｅ ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）として報告されている。有意差は、Ｐ値＜０．０１によって定義されるように、一元配置ＡＮＯＶＡと、その後に続けてポストホックテューキーの多重比較検定を使用して決定した。

結果
マイクロ流路壁へのコリスチンコンジュゲーション
蛍光標識および化学量論的分析を使用して、１．７６μｇのコリスチンがコリスチン化二重螺旋状デバイスの壁に沿って官能化されたと推定された（図２０）。このデバイスの表面に結合しているコリスチンの量はヒトに無毒である。ＥＬＩＳＡを行って、二重螺旋状マイクロ流体デバイスから放出されたコリスチン含有分子の量を推定した。２時間の連続流れによって、流路から約３００ｎｇのコリスチンが放出された（図２１）。

二重螺旋状マイクロ流体デバイスにおける粒子の慣性集約
官能化されていない二重螺旋状マイクロ流体流路内で連続流れ条件下における蛍光ポリスチレンマイクロ粒子を画像処理した。体積流量０．２ｍｌ／分では、対応するＲｅ＝１４．９の場合、２μｍサイズの粒子はマイクロ流路の内壁の近くに集約され（図１４ａ）、１０．２μｍサイズの粒子はマイクロ流路幅の中心の近くに集約された（図１４ｂ）。混成の蛍光画像は、１０．２μｍ（赤色流）および２μｍ（緑色流）の粒子の軌道を示し、大きい方の粒子は、より大きい血球（すなわち、赤血球および白血球）の軌道に近づく。マイクロ粒子は、直径に応じて平衡位置で慣性集約した。細菌サイズの粒子が血球サイズの粒子からはっきり分離することは明白であった。Ａ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８は、直径２μｍの球状粒子より流路壁にはるかに近くに慣性集約した。さらに、細菌は、二重螺旋状デバイスの両方の側部表面の近くに現れた。これらの挙動は、正味の慣性揚力（Ｆ_Ｌ）およびディーン抗力（Ｆ_Ｄ）から誘導される慣性設計と一致したものであった。

表面修飾二重螺旋状マイクロ流体デバイスを使用する細菌細胞捕捉
コリスチン化およびＰＥＧ化された二重螺旋マイクロ流体デバイスの細菌捕捉能力を定性的および定量的に評価するための標準供試体として、Ａ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８細菌細胞を選択した。緑色の蛍光標識されたＡ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８は、マイクロ流体デバイスを０．２ｍＬ／分で通過し、続いて洗浄した後、コリスチン化マイクロ流路壁に結合された（図４）。おそらくコリスチン表面官能化がないため、ＰＥＧ化二重螺旋マイクロ流体デバイス内では、著しい細菌捕捉が行われなかった（図４）。

ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中Ａ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８懸濁液１ｍＬを、流速０．２ｍＬ／分でマイクロ流体デバイスに流すことによって、細菌捕捉能力を定量化した。デバイスを出る流体から培養することができたコロニーの減少によって確認されるように、コリスチン化二重螺旋マイクロ流体デバイス（図１５ａ）をただ１回通過させただけで、１０^７ＣＦＵを超える細菌細胞捕捉能力が達成された。肺炎桿菌（K. pneumoniae） ＡＴＣＣ７００６０３、別のグラム陰性のヒト病原体も、流れている流体から除去することに成功した（図１５ｂ）。コリスチン化二重螺旋状マイクロ流体デバイスも、流れている流体から、コリスチン耐性Ａ．バウマニ（colistin-resistant A. baumannii） 「患者２」およびコリスチン耐性Ａ．バウマニ（colistin-resistant A. baumannii） １９６０６Ｒを含めて、抗生物質耐性有機体を捕捉および除去した（図１５ｃおよび１５ｄ）。これらのコリスチン耐性株は、文献で十分に特徴付けられており、コリスチン耐性は、ＭＩＣ評価により再確認された（表１）。

コリスチン耐性Ａ．バウマニ（colistin-resistant A. baumannii）単離物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ；μｇ／ｍｌ）。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。

緑色蛍光Ａ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８のコリスチン化二重螺旋状マイクロ流路デバイスへの結合は、ＰＥＧ官能化によって強く支持されている（図１５ａ〜図１５ｄ）。コリスチン化およびＰＥＧ化されたデバイスは、グラム陽性枯草菌（B. subtilis） １Ａ５７８を捕捉せず、コリスチンで官能化されたデバイスにおけるグラム陰性病原体への特異性が確認された（図２２）。

体外血液浄化
ＥＤＴＡ抗凝固処理され、Ａ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８で実験的に汚染されている新鮮なヒト全血を使用して、二重螺旋状マイクロ流体デバイスの血液浄化能力を評価した。単一のコリスチン化二重螺旋状マイクロ流体デバイスは、流速０．２ｍｌ／分でデバイスを１回通過させて、約１０^７コロニー形成単位の細菌を全血から除去した（図１６ａ）。流れている血液からの細菌細胞捕捉も、蛍光顕微鏡を使用して確認された。緑色の蛍光標識されたＡ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８は、感染血液をマイクロ流体デバイスに０．２ｍＬ／分で通し、続いて洗浄した後、コリスチン化マイクロ流路壁に結合される（図１６ｂおよび１６ｃ）。しかし、ヒト全血に添加されたグラム陽性黄色ブドウ球菌（S. aureus） ＡＴＣＣ２９２１３は、コリスチン化マイクロ流路壁に結合せず、コリスチンで官能化されたデバイスにおけるグラム陰性病原体への特性が確認された（図１６ｄ）。ヒト全血をコリスチン化およびＰＥＧ化された二重螺旋状マイクロ流体デバイスに流しても、血液組成に検出可能な影響を及ぼすこともなく（表２）、赤血球溶血を誘導することもなかった（表３）。

０．２ｍＬ／分でコリスチン化およびＰＥＧ化された二重螺旋状流体デバイスに流した血液の赤血球数、白血球数、および血小板数は、対照群と有意差がなかった。マイクロ流体デバイスを通過してない未変化の血液を対照として使用した。一元配置ＡＮＯＶＡと、その後に続くポストホックテューキーの多重比較検定を用いて、データを比較した。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。^＊Ｐ＜０．０１、^＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

ヒト全血をコリスチン化およびＰＥＧ化された二重螺旋マイクロ流体デバイスに流した。血液をデバイスに通すと、溶血を引き起こさなかった。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（２０ｖ／ｖ％）を含有する血液を陽性対照として使用した。陰性対照は、二重螺旋状流体デバイスに通さなかった血液であった。一元配置ＡＮＯＶＡと、その後に続くポストホックテューキーの多重比較検定を用いて、データを比較した。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝５）として示す。^＊Ｐ＜０．０１、^＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

全細菌捕捉能力
コリスチン化二重螺旋状マイクロ流体デバイスは、約１０^７ＣＦＵの生Ａ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＣＣ１７９７８（図１５ａ）および同様な量の肺炎桿菌（K. pneumoniae） ＡＴＣＣ７００６０３（図１５ｂ）をＰＢＳからデバイスを作動させて５分以内に除去した。さらに、Ａ．バウマニ（A. baumannii）のコリスチン耐性株（すなわち、Ａ．バウマニ（A. baumannii） １９６０６ＲおよびＡ．バウマニ（A. baumannii） 「患者２」）を、野生型コリスチン感受性Ａ．バウマニ（A. baumannii）株と等しい有効性で捕捉した（図１７）。統計分析により、コリスチン化二重螺旋状マイクロ流体デバイスが、ＰＢＳにおける場合と有意差がない能力でグラム陰性細菌をヒト全血から捕捉したことが確認された（図１７）。

エンドトキシン捕捉の定量化
グラム陰性細菌の外膜の主成分の１つであるエンドトキシンも、敗血症の特徴である全身性炎症反応に寄与する。したがって、二重螺旋状マイクロ流体デバイスを使用した、流れている流体からのエンドトキシンの除去を評価した。エンドトキシンをエンドトキシン不含水に添加し、０．２ｍＬ／分で５分間、合計１ｍＬをデバイスに連続的に流した。エンドトキシンは、コリスチン化二重螺旋状マイクロ流体デバイスを通っている流体から急速に捕捉され、エンドトキシン捕捉効率は、１回の通過操作で１００％に近づいた（図２３）。一方、ＰＥＧ化デバイスを使用すると、エンドトキシンは効果的には捕捉されず、二重螺旋におけるエンドトキシン保持で重大な意味をもつコリスチンの必要性が明らかになった。

臨床移行のためのデバイスのスケールアップ
記載されたコリスチン化二重螺旋状マイクロ流体デバイスの捕捉能力は、約１０^７ＣＦＵであり（図１７）、敗血症患者を治療するための要件を３桁より高く上回っている。しかし、潜在的な臨床移行のためには、現行のデバイス設計に関連する流速を高めて、より大きい動物モデルおよびヒトの治療を可能にしなければならない。したがって、二重螺旋状流体設計のより大きいバージョンを開発して、現行の設計のスケールアップの実現可能性を明らかにした。スケールアップしたバージョンのコリスチン化二重螺旋状マイクロ流体デバイスは、最初の設計で使用されていた流速より３倍高い流速で作動し、１回の通過操作で１０^７を超えるＡ．バウマニ（A. baumannii） ＡＴＴＣ１７９７８ ＣＦＵを捕捉した（図８）。スケールアップしたデバイスの寸法は、適切な流体力学的粒子集約特性を維持しながら、容積対表面積の比が元のデバイスの比と同様となるように選択した。閉導管における体液輸送の支配的な原理を使用して、処置容積の増加に適した性能特性を備えたより大きい二重螺旋状デバイスを設計することができる。

コリスチン官能化の必要性は、野生型Ａ．バウマニ（A. baumannii）捕捉がコリスチンによって媒介されることを示唆する（図４、図１５ａおよび１５ｂ）。強いコリスチン耐性を示す独立して単離された２つのＡ．バウマニ（A. baumannii）株のコリスチン依存性捕捉は、抗生物質耐性細菌の捕捉および除去の未だに認識されていない手法を示唆する（図１５ｃおよび５ｄ）。この結果は、細菌外膜に結合しているコリスチンとは無関係であるように、コリスチン耐性と一致する。これらのコリスチン耐性株は、細胞エンベロープおよび膜の生合成に関与する多くの遺伝子の発現を増加させてきた。コリスチンで官能化された二重螺旋状デバイスが枯草菌（B. subtilis） １Ａ５７８などのグラム陽性細菌を捕捉できないことは、グラム陽性細菌がコリスチンに感受性を示さず、結合することができないので、捕捉機序がコリスチン認識であることをさらに支持する。敗血症に関連した合併症を誘発し得るグラム陰性細菌毒素であるエンドトキシンは、コリスチンで官能化されたデバイスに流すと、ほぼ１００％の捕捉効率で流体から除去された（図２３）。

血液からのロバストな細菌捕捉は、インビトロにおける血球を含まない細菌懸濁液の場合の捕捉と本質的に同一である（図１６および１７）。二重螺旋の設計は、細菌の結合が起こる領域から血液の有形成分を空間的に単離し、血球の存在下で低下しない細菌捕捉効率を担うと仮定される。敗血症のヒトは、感染時のいずれか特定の時間に血液中に最大１０^３ＣＦＵの細菌を含むと推定される。明らかにされたこの設計の能力は、敗血症のヒトの血液中の平均的な細菌数を３桁より高く上回っている。したがって、肺など感染の供給元から血液コンパートメントに入る追加の細菌に適応する本デバイスには、相当な捕捉能力が存在している。本設計の単純性およびロバスト性が、手法の臨床移行の可能性を支持する。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される科学技術用語はすべて、開示された発明が属する技術分野の技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に引用された刊行物およびそれらが引用された資料は、参照により具体的に組み込まれる。

当業者は、本発明の好ましい実施形態に対して多数の変更および修正を行うことができ、そのような変更および修正を本発明の趣旨から逸脱することなく行うことができると認識する。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのような均等な変形をすべて、本発明の真の趣旨および範囲内に入るものとして包含するよう意図されている。

Claims (63)

1. 少なくとも１つの入口と、
   少なくとも１つの出口と、
   前記少なくとも１つの入口と前記少なくとも１つの出口の間の多方向流路であって、内壁を含む多方向流路と、
   前記多方向流路の前記内壁の少なくとも一部分を被覆するリガンドと
   を含む流体デバイス。
2. 前記リガンドが、抗体、ペプチド、タンパク質、抗生物質、ポリマー、アプタマー、リガンド、腫瘍壊死因子、接着受容体、Ｅ−セレクチン、サイトカイン、化学療法剤、定数感知タンパク質または受容体、および生物学的作用物質からなる群から選択される、請求項１に記載のデバイス。
3. 前記リガンドが抗生物質である、請求項１に記載のデバイス。
4. 前記抗生物質がコリスチンである、請求項３に記載のデバイス。
5. 前記抗生物質がバンコマイシンである、請求項３に記載のデバイス。
6. 前記リガンドが抗体である、請求項１に記載のデバイス。
7. 前記出口が、少なくとも３つの出口流路を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のデバイス。
8. 前記デバイスが、光学読取装置にカップリングされている、請求項１から６のいずれか一項に記載のデバイス。
9. 血液で運ばれる疾患材料を血液から体外で捕捉および除去し、処置された血液を患者に戻す方法であって、
   ポンプで患者から血液を流体デバイスに送り込むステップであって、前記流体デバイスが少なくとも１つの入口と、少なくとも１つの出口と、前記少なくとも１つの入口と前記少なくとも１つの出口の間の多方向流路とを含む、ステップと、
   前記血液を前記流体デバイスに流して、前記血液で運ばれる疾患材料を前記流体デバイス内の前記流路の内壁に沿って官能化された疾患材料標的化リガンドに集約および曝露するステップと、
   前記疾患材料を集約および捕捉するステップであって、前記流体デバイスによって課せられる力が前記疾患材料を前記疾患材料標的化リガンドで官能化された前記流路の壁の近くに集約させ、次いで前記リガンドが前記疾患材料に結合する、ステップと、
   前記疾患材料を前記血液から除去して、処置された血液を生成するステップと、
   前記処置された血液を前記患者に戻すステップと
   を含む方法。
10. 前記疾患材料が、健全な材料とサイズ、剛性、接着性、分子構造、遺伝子構造、またはそれらの組合せが異なる、請求項９に記載の方法。
11. 前記血液が全血である、請求項９または１０に記載の方法。
12. 前記血液が、約０．１ｍＬ／分〜約２００ｍＬ／分の流速で導入される、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記疾患材料が、約４０％〜約１００％の範囲の効率で分離される、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記流路が、健全な材料に比べた疾患材料の前記サイズに基づいて前記流路の横断面の少なくとも一部分に沿って疾患材料を単離するように適合されているアスペクト比を規定する長さ、横断面、および水力直径を有する、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記疾患材料が、がん細胞、循環腫瘍細胞、ペプチド、βアミロイド、タンパク質、酵素、毒素、患部細胞、感染性微生物、細胞、寄生虫、真菌、ウイルス、微生物、細菌、細菌毒素、定数感知タンパク質もしくは受容体、リポ多糖、サイトカイン、ＩＬ−Ιβ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、腫瘍壊死因子、プロカルシトニン、病原体関連分子パターン、Ｃ反応性タンパク質、または肝不全に関連している小さいもしくはタンパク質結合型の生体分子を含む１つまたは複数の疾患材料である、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記流体デバイスを放射線に曝露して、前記疾患材料を死滅させるステップをさらに含む、請求項９から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 熱を前記流体デバイスに加えて、前記疾患材料を死滅させるステップをさらに含む、請求項９から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記処置された血液を前記患者に戻す前に、前記流体デバイスを冷却して、前記血液を正常体温まで冷却させるステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記疾患材料標的化リガンドによって捕捉され、標識された前記疾患材料を分析するステップをさらに含む、請求項９から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記流体デバイスにおいて捕捉された前記疾患材料の量を定量化するステップをさらに含む、請求項９から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記流体デバイスにおいて捕捉された前記疾患材料を疾患材料分析および同定のために蛍光標識するステップをさらに含む、請求項９から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記流体デバイスが、少なくとも１つの入口と、少なくとも１つの出口と、前記疾患材料を集約および除去するための螺旋状流路とから構成される、請求項９から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記流体デバイスの内部表面が、疾患材料を捕捉するように、前記疾患材料標的化リガンドで官能化されている、請求項９から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記流体デバイスが、異なる少なくとも２つの疾患材料標的化リガンドで官能化されており、これらのそれぞれが、血漿活性化材料に付着することができる、請求項９から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記流体デバイスが、複数の支柱から構成され、これらのそれぞれが、前記疾患材料標的化リガンドで官能化されている、請求項９から２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記流体デバイスの内部表面が、疾患材料標的化ナノ粒子で官能化されている、請求項９から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記流体デバイスの内部表面が、疾患材料標的化マイクロ粒子で官能化されている、請求項９から２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記流体デバイスの内部表面が、疾患材料標的化繊維で官能化されている、請求項９から２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 血液で運ばれる疾患材料を血液から捕捉および検出する方法であって、
    血液を流体デバイスに流し込んで、前記血液で運ばれる疾患材料を前記流体デバイス内の流路の内壁に沿って官能化された疾患材料標的化リガンドに集約および曝露するステップであって、前記流体デバイス内の前記流路が螺旋状流路を含む、ステップと、
    前記疾患材料を捕捉するステップであって、前記流体デバイスによって課せられる力が前記疾患材料を前記疾患材料標的化リガンドで官能化された前記螺旋状流路の壁の近くに集約させ、次いで前記リガンドが前記疾患材料に結合する、ステップと、
    前記疾患材料に結合する光学活性な疾患材料標的化マイクロビーズを前記流体デバイスに流すステップと、
    前記流体デバイスを光学読取装置で読み取るステップと
    を含む方法。
30. 前記疾患材料が、健全な材料とサイズ、剛性、接着性、分子構造、遺伝子構造、またはそれらの組合せが異なる、請求項２９に記載の方法。
31. 前記血液が全血である、請求項２９または３０に記載の方法。
32. 前記血液が、約０．１ｍＬ／分〜約２００ｍＬ／分の流速で導入される、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記疾患材料が、約４０％〜約１００％の範囲の効率で分離される、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記螺旋状流路が、健全な材料に比べた疾患材料の前記サイズに基づいて前記流路の横断面の少なくとも一部分に沿って疾患材料を単離するように適合されているアスペクト比を規定する長さ、横断面、および水力直径を有する、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記疾患材料が、がん細胞、循環腫瘍細胞、ペプチド、βアミロイド、タンパク質、酵素、毒素、患部細胞、感染性微生物、細胞、寄生虫、真菌、ウイルス、微生物、細菌、細菌毒素、定数感知タンパク質もしくは受容体、リポ多糖、サイトカイン、ＩＬ−Ιβ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、腫瘍壊死因子、プロカルシトニン、病原体関連分子パターン、Ｃ反応性タンパク質、または肝不全に関連している小さいもしくはタンパク質結合型の生体分子を含む１つまたは複数の疾患材料である、請求項２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記疾患材料標的化リガンドによって捕捉され、光学活性なマイクロビーズで標識された前記疾患材料を分析するステップをさらに含む、請求項２９から３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記流体デバイスにおいて捕捉された前記疾患材料の量を定量化するステップをさらに含む、請求項２９から３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記流体デバイスにおいて捕捉された前記疾患材料を疾患材料分析および同定のために蛍光標識するステップをさらに含む、請求項２９から３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記流体デバイスが、少なくとも１つの入口と、少なくとも１つの出口と、前記疾患材料をそこに導入された前記流体から集約および除去するための流路構成とから構成される、請求項２９から３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記流体デバイスの内部表面が、疾患材料を捕捉するように、前記疾患材料標的化リガンドで官能化されている、請求項２９から３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記流体デバイスが、少なくとも２つの疾患材料標的化リガンドで官能化されており、これらのそれぞれが、血漿活性化材料に付着することができる、請求項２９から４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記流体デバイスが、複数の支柱から構成され、これらのそれぞれが、前記疾患材料標的化リガンドで官能化されている、請求項２９から４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記流体デバイスの内部表面が、疾患材料標的化ナノ粒子で官能化されている、請求項２９から４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 前記流体デバイスの内部表面が、疾患材料標的化マイクロ粒子で官能化されている、請求項２９から４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記流体デバイスの内部表面が、疾患材料標的化繊維で官能化されている、請求項２９から４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 患者における敗血症を治療または予防する方法であって、
    ポンプで患者から血液を流体デバイスに送り込むステップであって、前記流体デバイスが少なくとも１つの入口と、少なくとも１つの出口と、前記少なくとも１つの入口と前記少なくとも１つの出口の間の多方向流路とを含む、ステップと、
    前記血液を前記流体デバイスに流して、血液で運ばれる疾患材料を前記多方向流路内の内壁に沿って官能化された疾患材料標的化リガンドに集約および曝露するステップと、
    前記疾患材料を集約および捕捉するステップであって、前記流体デバイスによって課せられる力が前記疾患材料を疾患材料標的化リガンドで官能化された前記流路の壁の近くに集約させ、次いで前記リガンドが前記疾患材料に結合する、ステップと、
    前記疾患材料を前記血液から除去して、処置された血液を生成するステップと、
    前記処置された血液を前記患者に戻すステップと
    を含む方法。
47. 前記疾患材料が、健全な材料とサイズ、剛性、接着性、分子構造、遺伝子構造、またはそれらの組合せが異なる、請求項４６に記載の方法。
48. 前記血液が全血である、請求項４６または４７に記載の方法。
49. 前記血液が、約０．１ｍＬ／分〜約２００ｍＬ／分の流速で導入される、請求項２６から４８のいずれか一項に記載の方法。
50. 前記疾患材料が、約４０％〜約１００％の範囲の効率で分離される、請求項２６から４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記流路が、健全な材料に比べた疾患材料の前記サイズに基づいて前記流路の横断面の少なくとも一部分に沿って疾患材料を単離するように適合されているアスペクト比を規定する長さ、横断面、および水力直径を有する、請求項２６から５０のいずれか一項に記載の方法。
52. 疾患材料を生体液から捕捉および除去する方法であって、
    前記生体液を流体デバイスに導入するステップであって、前記流体デバイスが少なくとも１つの入口と、少なくとも１つの出口と、前記少なくとも１つの入口と前記少なくとも１つの出口の間の多方向流路とを含む、ステップと、
    前記生体液を前記流体デバイスに流して、前記疾患材料を前記流体デバイス内の前記流路の内壁に沿って官能化された疾患材料標的化リガンドに集約および曝露するステップと、
    前記疾患材料と前記流路の前記内壁に結合している疾患材料標的化リガンドとの結合により、前記疾患材料を捕捉するステップと、
    前記疾患材料を前記生体液から除去するステップと
    を含む方法。
53. 前記流体デバイスが螺旋状流路を含む、請求項５２に記載の方法。
54. 前記生体液が血液である、請求項５２または５３に記載の方法。
55. 流体デバイスを流れてきた生体液を含む組成物であって、前記流体デバイスが少なくとも１つの入口と、少なくとも１つの出口と、前記少なくとも１つの入口と前記少なくとも１つの出口の間の多方向流路とを含み、前記流路が内壁を含み、前記内壁の少なくとも一部分がリガンドで被覆されており、そのようなリガンドが疾患材料に結合し、前記生体液から除去する、組成物。
56. 前記生体液が血液である、請求項５５に記載の組成物。
57. 前記流体デバイスが螺旋状流路を含む、請求項５５または５６に記載の組成物。
58. 疾患材料を生体液から捕捉および検出する方法であって、
    血液を、流路を含む流体デバイスに流し込むステップであって、前記流路が、前記流体デバイス内の前記流路の内壁に沿って官能化された疾患材料標的化リガンドを有する、ステップと、
    前記疾患材料の前記疾患材料標的化リガンドへの結合により前記疾患材料を捕捉するステップと、
    前記疾患材料を単離するステップと、
    前記疾患材料を培養するステップと
    を含む方法。
59. 前記生体液が血液である、請求項５８に記載の方法。
60. 前記流路が螺旋状流路である、請求項５８または５９に記載の方法。
61. 疾患材料を生体液から捕捉および検出する方法であって、
    血液を、流路を含む流体デバイスに流し込むステップであって、前記流路が、前記流体デバイス内の前記流路の内壁に沿って官能化された疾患材料標的化リガンドを有する、ステップと、
    前記疾患材料の前記疾患材料標的化リガンドへの結合により前記疾患材料を捕捉するステップと、
    前記疾患材料を単離するステップと、
    前記疾患材料を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）からなる群から選択される手順によって同定するステップと
    を含む方法。
62. 前記生体液が血液である、請求項６１に記載の方法。
63. 前記流路が螺旋状流路である、請求項６１または６２に記載の方法。