DE102020210404B4

DE102020210404B4 - Verfahren zum Betrieb eines Analysegeräts, Verwendung einer Kartusche und Analysegerät

Info

Publication number: DE102020210404B4
Application number: DE102020210404.2A
Authority: DE
Inventors: Frank Schwemmer; Oliver Strohmeier; Mark Keller; Thomas Van Oordt
Original assignee: Spindiag GmbH
Current assignee: Spindiag GmbH
Priority date: 2020-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2022-07-14
Anticipated expiration: 2040-08-15
Also published as: DE102020210404A1; US20230191407A1; WO2022033822A1; JP2023537143A; EP4196269A1; CN116133753A; KR20230044538A

Abstract

Verfahren zum Betrieb eines Analysegeräts für die Durchführung eines Analyseprozesses, insbesondere mittels einer Polymerase-Kettenreaktion, wobei verfahrensgemäß- eine Kartusche (1) mit einer mikrofluidischen Kanal- und Kammerstruktur (4) bereitgestellt wird, wobei wenigstens ein Folienbeutel (50) enthaltend eine Prozessflüssigkeit in einer Stickpack-Kammer (52,54) der Kartusche (1) angeordnet ist,- in einem Öffnungsschritt die oder die jeweilige Stickpack-Kammer (52,54) auf eine Temperatur von 80 bis 130 Grad Celsius erwärmt wird, und- in dem Öffnungsschritt die Kartusche (1) mit einer Drehzahl von 20 bis 80 Hz rotiert wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Betrieb eines Analysegeräts. Außerdem betriff die Erfindung eine Verwendung einer Kartusche, insbesondere in einem solchen Verfahren. Ferner betrifft die Erfindung ein solches Analysegerät.
Rotationsbasierte Analyseverfahren werden im medizinischen Bereich unter Nutzung sogenannte Kartuschen, die eine insbesondere mikrofluidische Kanal- und Kammerstruktur aufweisen, angewendet. Meist kommen sie zum Einsatz, um Erbgut, meist in Form von DNA (Desoxyribonukleinsäure oder englisch: desoxyribonucleic acid) oder RNA (Ribonukleinsäure bzw. ribonucleic acid), - neben wissenschaftlichen Erbgutanalysen und dergleichen - zur Untersuchung auf vorliegende Krankheiten zu analysieren oder zum Nachweis von Krankheitserregern überhaupt zu detektieren. Dazu müssen ausgehend von einer Probe - z. B. einem Abstrich, einer Blutprobe oder dergleichen - spezifische Bereiche darin enthaltenen Erbguts (DNA oder RNA) vervielfältigt werden. Im Fall des Nachweises oder der Analyse von RNA in einer Probe (z. B. zum Nachweis eines Virus) wird diese zunächst durch die sogenannte „reverse transcription“ in DNA umgeschrieben und anschließend vervielfältigt.
Zur Vervielfältigung der DNA wird üblicherweise die sogenannte Polymerase-Kettenreaktion (kurz: PCR) in einem flüssigen Reaktionsansatz angewendet. Die DNA liegt typischerweise in Form einer Doppelhelix-Struktur, bestehend aus zwei komplementären DNA Einzelsträngen, vor. Bei der PCR wird die DNA zunächst durch eine erhöhte Temperatur des flüssigen Reaktionsansatzes zwischen typischerweise 90-96 Grad Celsius in zwei Einzelstränge aufgetrennt („Denaturierungs-Phase“).
Anschließend wird die Temperatur wieder gesenkt („Annealing-Phase“, typischerweise in einen Bereich von 50-70 °C), um eine spezifische Anlagerung von sogenannten Primer-Molekülen an die Einzelstränge zu ermöglichen. Die Primer-Moleküle sind komplementäre, kurze DNA-Stränge, die an einer definierten Stelle an den Einzelsträngen der DNA anbinden. Die Primer-Moleküle (auch kurz: „Primer“) dienen als Startpunkt für ein Enzym, der sogenannten Polymerase, das in der sogenannten Elongations-Phase die Grundbausteine („dNTPs“) komplementär zur vorliegenden DNA-Sequenz des Einzelstranges auffüllt. Dabei entsteht ausgehend von dem Primer Molekül wieder eine doppelsträngige DNA. Die Elongation wird typischerweise bei der gleichen Temperatur wie bei der Annealing-Phase oder bei einer leicht erhöhten Temperatur, typischerweise zwischen 65 und 75 °C, durchgeführt. Nach der Elongation wird die Temperatur wieder für die Denaturierungsphase erhöht.
Dieses Zyklieren der Temperatur im flüssigen Reaktionsansatz zwischen den zwei bis drei Temperaturbereichen wird „PCR-Thermocycling“ genannt und typischerweise in 30 und 50 Zyklen wiederholt. In jedem Zyklus wird der spezifische DNA-Bereich vervielfältigt. Typischerweise wird das Thermocycling des flüssigen Reaktionsansatzes in einem Reaktionsgefäß durch die Kontrolle der äußeren Temperatur umgesetzt. Das Reaktionsgefäß befindet sich dabei z. B. in einem Thermoblock, in dem das PCR-Thermocycling durch Heizen und Kühlen eines sich mit dem Reaktionsgefäß in thermischen Kontakt befindlichen Festkörper umgesetzt wird und dabei Wärme aus der Flüssigkeit zu- und abführen. Alternative Heiz- und Kühlkonzepte zur Umsetzung des PCR-Thermocyclings sind unter anderem die Temperaturkontrolle von Fluiden (insbesondere Luft und Wasser), welche das Reaktionsgefäß umströmen sowie strahlungsbasierte Konzepte, z. B. durch Einbringung von Wärme durch IR-Strahlung oder Laserstrahlung. Im Fall der rotationsbasierten Verfahren wird als Reaktionsgefäß bspw. eine Kammer in der vorstehend genannten Kartusche eingesetzt und entsprechend aufgeheizt. Zusätzlich wird die Kartusche, die meist etwa scheibenartig ausgebildet ist, rotiert.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Analyseverfahren weiter zu verbessern.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Betrieb eines Analysegeräts mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Des Weiteren wird diese Aufgabe gelöst durch eine Verwendung einer Kartusche gemäß den Merkmalen des Anspruchs 7. Außerdem wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Analysegerät mit den Merkmalen des Anspruchs 9. Vorteilhafte und teils für sich erfinderische Ausführungsformen und Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüche und der nachfolgenden Beschreibung dargelegt.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Betrieb eines Analysegeräts, das wiederum für die Durchführung eines Analyseprozesses (oder: Analyseverfahrens), insbesondere mittels einer Polymerase-Kettenreaktion, eingerichtet und vorgesehen ist. Verfahrensgemäß wird dabei eine Kartusche, die insbesondere einen Probenträger darstellt und die eine mikrofluidische Kanal- und Kammerstruktur aufweist, bereitgestellt. Dabei ist wenigstens ein Folienbeutel (im Folgenden auch als „Stickpack“ bezeichnet) enthaltend eine Prozessflüssigkeit in einer sogenannten (sowie vorzugsweise entsprechend einem der gegebenenfalls mehreren Stickpacks zugeordneten) Stickpack-Kammer der Kartusche (konkret der Kanal- und Kammerstruktur) angeordnet. In einem Öffnungsschritt (des hier beschriebenen Betriebsverfahrens) wird die oder die jeweilige (insbesondere jeweils einen Stickpack enthaltende) Stickpack-Kammer auf eine Temperatur von 80 bis 130 Grad Celsius erwärmt. Außerdem wird in diesem Öffnungsschritt die Kartusche mit einer Drehzahl von 20 bis 80 Hz rotiert.
Der oder der jeweilige Stickpack wird mithin vorzugsweise dazu genutzt, Prozessflüssigkeit in der Kartusche für den Analyseprozess vorzuhalten. Der Stickpack bietet dabei den Vorteil einer vergleichsweise einfachen Handhabung bei der Bestückung der Kartusche. Letztere ist dabei insbesondere durch einen Grundkörper gebildet, in dem die Kanal- und Kammerstruktur ausgebildet ist. Dieser Grundkörper wird nach der Bestückung mit dem und dem jeweiligen Stickpack und gegebenenfalls weiteren, optional auch trockenen Prozessmedien, zumindest teilweise abgedeckt, d. h. verschlossen, insbesondere mittels einer Siegelfolie versiegelt - vorzugsweise bis auf eine Zugangsöffnung für das Einbringen des Probenmaterial und eine gegebenenfalls vorhandene Entlüftungsöffnung. Bei den Prozessmedien handelt es sich bspw. um getrocknete Fluoreszenz-Farbstoffen, die mit einem bestimmten Material reagieren und so mittels einer Fluoreszenzdetektion eine Auswertung des Analyseprozesses ermöglichen, oder um sogenannte Primer oder dergleichen. Alternativ werden derartige Prozessmedien auch als „Analysestoffe“ bezeichnet. Trockene Prozessmedien sind in ihrer Handhabung vergleichsweise einfach, da diese regelmäßig nicht fließfähig sind. Des Weiteren ermöglicht die vorstehend beschriebene Vorgehensweise in dem Öffnungsschritt, also die Kombination einer vergleichsweise hohen Temperatur und einer vergleichsweise hohen Drehzahl eine vorteilhafterweise schnelle Öffnung des oder des jeweiligen Stickpacks. Dies spart wiederum Prozesszeit ein.
Unter dem Begriff „mikrofluidisch“ oder „mikrofluidische Kanal- und Kammerstruktur“ wird hier und im Folgenden insbesondere verstanden, dass die Abmessungen der Strukturelemente, vorzugsweise zumindest der Kanäle, zumindest in eine Richtung - insbesondere in Tiefen- oder Breitenrichtung - im Bereich von 30 bis 700 Mikrometer liegen. Im Fall der Kanäle liegen die Abmessungen vorzugsweise in zwei Richtungen - nämlich in Tiefen- und Breitenrichtung - in dieser Größenordnung. Kammern können dabei zum Teil auch größere Abmessungen aufweisen.
Bevorzugt wird im Öffnungsschritt eine Temperatur von etwa 60 bis 120 °C, bspw. um etwa 95 °C, gewählt bei einer Drehzahl von wenigstens 30 Hz, vorzugsweise um etwa 60 Hz. Dadurch kann der Stickpack innerhalb von etwa 5 Sekunden geöffnet werden.
Als Stickpack wird in einer bevorzugten Verfahrensvariante ein Beutel aus einer sogenannten Peelfolie herangezogen. Dieser Beutel weißt wiederum eine vorzugsweise heißgesiegelte Auftrennnaht (oder auch: „Peelnaht“) auf. Anders ausgedrückt ist der Stickpack thermisch verschlossen worden. Somit ist eine thermisch unterstützte Öffnung vorteilhaft. Unter einer „Peelfolie“ wird hier und im Folgenden eine Folie verstanden, die dahingehend entworfen und ausgebildet ist, eine vergleichsweise leichtgängig aufzutrennende Verbindung mit sich selbst und/oder auch mit anderen Materialien einzugehen. Somit ist die Nahtfestigkeit der Auftrennnaht vorteilhafterweise ohnehin niedriger als bei einer verschweißten Naht einer herkömmlichen Folie. Als Material für die Peelfolie kommt insbesondere ein Polypropylen oder ein Polyethylen zum Einsatz.
In einer weiteren bevorzugten Verfahrensvariante wird die oder die jeweilige Stickpack-Kammer lokal begrenzt erwärmt. Dies hat den Vorteil, dass Probenmaterial oder zusätzliche Prozessmedien durch die Erwärmung während des Öffnungsschritts nicht beeinflusst werden. Des Weiteren kann so der Energiebedarf des Verfahrens möglichst gering gehalten werden.
In einer zweckmäßigen Verfahrensvariante werden das Volumen der Stickpack-Kammer und das Flüssigkeitsvolumen des jeweiligen Folienbeutels derart gewählt, dass das Flüssigkeitsvolumen im unverdrängten Zustand gleich oder weniger als etwa ein Viertel des Volumens der Stickpack-Kammer beträgt (oder: einnimmt). Als „unverdrängter Zustand“ wird hier und im Folgenden insbesondere verstanden, dass das Flüssigkeitsvolumen des Stickpacks innerhalb der Stickpack-Kammer angeordnet ist und noch nicht durch einen Kanal aus der Stickpack-Kammer abgeleitet wurde.
In einer bevorzugten Weiterbildung der vorstehenden Verfahrensvariante wird für die Stickpack-Kammer ein Volumen von etwa 1000 bis 1500 Mikroliter herangenzogen. Als Flüssigkeitsvolumen des Stickpacks werden folglich etwa 150 bis 375, vorzugsweise bis etwa 250 Mikroliter herangezogen.
Zweckmäßigerweise ist die Stickpack-Kammer radial außenseitig zur Rotationsachse der Kartusche (d. h. der Rotationsachse, um die die Kartusche rotiert wird - diese muss nicht innerhalb der von der Kartusche abgedeckten Fläche liegen) angeordnet. Vorzugsweise ist die (oder die jeweilige) Stickpack-Kammer dabei zu einem Außenrand der Kartusche versetzt angeordnet. Dadurch wird - insbesondere bei einer etwa einer Halbkreisscheibe entsprechenden Kartuschengeometrie - ermöglicht, das vergleichsweise große Volumen der Stickpack-Kammer unter möglichst effizienter Flächenausnutzung anordnen zu können. Insbesondere da bei Durchführung des Analyseverfahrens die Kartusche rotiert wird, sammelt sich die aus dem Stickpack austretende Flüssigkeit fliehkraftbedingt auch am außenliegenden Rand der Stickpack-Kammer. Deshalb ist die oder die jeweilige Stickpack-Kammer mittels eines radial außenseitig an die Stickpack-Kammer angeschlossenen Kanals mit einer radial nach innen versetzt angeordneten, „nachfolgenden“ Kammer verbunden. Zur Entleerung der Stickpack-Kammer und zum Transfer der Flüssigkeit durch den radial außenseitig angebundenen Kanal in diese nachfolgende Kammer wird nun in einer zweckmäßigen Verfahrensvariante insbesondere bei - vorzugsweise im Verhältnis zum Öffnungsschritt des Stickpacks - gleichbleibender Temperatur die Drehzahl herabgesetzt. Aufgrund der erhöhten Temperatur für die Öffnung des Stickpacks kommt es in der Stickpack-Kammer zur einer Erhöhung des (Kammer-) Innendrucks, da sich das in der Stickpack-Kammer befindliche Gas - bspw. Luft oder auch ein Inertgas - temperaturbeding ausdehnt. Zusätzlich kann aufgrund des von der Art der (Stickpack-) Flüssigkeit und der Temperatur abhängigen Dampfdrucks der Innendruck aufgrund sublimierender Flüssigkeit weiter erhöht werden. Da die nachfolgende Kammer aber radial nach innen versetzt angeordnet ist, wirkt innerhalb des zu dieser Kammer führenden Kanals die Zentrifugalkraft (oder: Fliehkraft) der von dem Innendruck in der Stickpack-Kammer „verdrängten“ Flüssigkeit entgegen. Wird jedoch die Drehzahl verringert, nimmt die Zentrifugalkraft und somit der im Kanal die Flüssigkeit nach radial außen zwingende „Schweredruck“ oder „Zentrifugaldruck“ ab, so dass die Flüssigkeit getrieben vom Innendruck der Stickpack-Kammer auch entgegen der Zentrifugalkraft durch den Kanal in die nachfolgende Kammer fließen kann. Ist der Innendruck hinreichend hoch, kann so eine - zumindest nahezu, bspw. bis auf Kondensflüssigkeit - vollständige Entleerung der Stickpack-Kammer erreicht werden. Vorzugsweise ist der Kanal dabei radial innenseitig an die nachfolgende Kammer angebunden. Dadurch - sowie insbesondere auch dadurch, dass diese nachfolgende Kammer ein im Vergleich zum Flüssigkeitsvolumen des Stickpacks größeres Kammervolumen aufweist - wird vorteilhafterweise ermöglicht, dass die durch den Kanal transportierte Flüssigkeit von der Kanalmündung weglaufen kann. Dadurch wird das Risiko, dass die in der nachfolgenden Kammer stehende Flüssigkeit durch aus der Stickpack-Kammer nachströmende Luft „aufspritzt“, verringert. Der Innendruck in der Stickpack-Kammer wird dabei optional zeitabhängig, d. h. durch vergleichsweise langes Halten einer Temperatur bei hoher Drehzahl oder auch durchzusätzliches Erwärmen der Stickpack-Kammer vor Reduktion der Drehzahl gesteuert. Während des Flüssigkeitstransfers, sollte dagegen die Temperatur konstant gehalten werden, um ein Abkühlen der Stickpack-Kammer und somit ein Verschieben der Druckverhältnisse zu vermeiden.
Vorzugsweise wird die Drehzahl auf etwa 5 bis 20 Hz, insbesondere auf etwa 10 bis 15 Hz herabgesetzt. Diese Drehzahlwerte ermöglichen eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass die Stickpack-Kammer wie vorstehend beschrieben vollständig (zumindest nahezu) entleert werden kann. Konkret beeinflussen sich aber Drehzahl und Innendruck der Stickpack-Kammer gegenseitig, insbesondere in Abhängig der radialen Position des Kanaleinlaufs (d. h. an welcher radialen Position der Kanal an die Stickpack-Kammer angeschlossen ist) relativ zur radialen Position der Kanalmündung in die nachfolgende Kammer. Je größer der radiale Abstand zwischen Kanaleinlauf und Kanalmündung, desto höher ist der zum Transport der Flüssigkeit durch den Kanal erforderliche (Innen-) Druck. Allerdings darf auch die Drehzahl nicht beliebig verringert werden, da ansonsten die Flüssigkeit innerhalb der Stickpack-Kammer nicht mit hinreichender Sicherheit zum Kanaleinlauf hin „gedrückt“ wird.
Dadurch, dass die auf die Stickpack-Kammer nachfolgende Kammer radial innerhalb angeordnet oder zumindest mittels eines in einer Kurve zunächst nach radial innenseitig verlaufenden Kanals an die Stickpack-Kammer angebunden ist, wird vorteilhafterweise ermöglicht, dass die im Stickpack vorgelagerte Flüssigkeit auch nach dessen Öffnung zunächst in der Stickpack-Kammer verbleibt und mithin gezielt mittels des vorstehend beschriebenen Vorgehens (ggf. auch erst zu einem späteren Zeitpunkt) in die nachfolgende Kammer transferiert werden kann.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der hier und im Folgenden näher beschriebenen Kartusche in dem vorstehend beschriebenen Verfahren. Die Kartusche weist dabei die vorstehend beschriebene, insbesondere zumindest abgedeckte, vorzugsweise bis auf einen Zugang zur Einbringung von Probenmaterial und eine optionale Entlüftungsöffnung fluiddicht versiegelte, mikrofluidische Kanal- und Kammerstruktur auf. Diese Kanal- und Kammerstruktur umfasst die zumindest eine Stickpack-Kammer. Außerdem weist die Kartusche den wenigstens einen Stickpack auf, der die vorstehend beschriebene Prozessflüssigkeit enthält und der in der Stickpack-Kammer angeordnet, insbesondere fixiert, ist. Vorzugsweise ist der oder der jeweilige Stickpack dabei in die korrespondierende Stickpack-Kammer eingeklebt oder anderweitig ortsfest gehaltert. Außerdem weist die Kartusche eine flache, scheibenartige Struktur (Geometrie) auf. Bevorzugt ist die Struktur dabei einer Halbkreisscheibe angenähert. Wie vorstehend beschrieben ist die oder die jeweilige Stickpack-Kammer außerdem radial außenseitig zu einer Rotationsachse, um die die Kartusche bei Durchführung des Verfahrens rotiert wird, angeordnet. Die oder die jeweilige Stickpack-Kammer ist dabei mittels des radial außenseitig angeschlossenen Kanals mit der radial nach innen versetzt angeordneten („nachfolgenden“) Kammer verbunden. Alternativ kann diese nachfolgende Kammer aber auch an der gleichen radialen Position oder auch radial weiter außen angeordnet sein als der radial außenseitige Rand der Stickpack-Kammer. In diesem Fall beschreibt der diese beiden Kammern verbindende Kanal wie vorstehen beschrieben ausgehend von dem Kanaleinlauf der Stickpack-Kammer eine nach radial innen gerichtete Kurve. Diese ist dabei so bemessen (insbesondere soweit nach radial innen „gezogen“), dass die in diesem Kanal stehende Flüssigkeitssäule aufgrund der Zentrifugalkraft wie vorstehend beschrieben eine vorzeitige oder ungeregelte Entleerung der Stickpack-Kammer in die nachfolgende Kammer verhindert.
Das erfindungsgemäße Analysegerät ist zur Durchführung des insbesondere rotationsbasierten Analyseprozesses insbesondere mittels einer Polymerase-Kettenreaktion eingerichtet und vorgesehen. Dazu weist das Analysegerät eine Aufnahmevorrichtung für die vorstehend beschriebene Kartusche auf. Vorzugsweise umfasst diese Aufnahmevorrichtung einen automatischen Einzug, der insbesondere einem CD-Laufwerk ähnelt. Vorzugsweise umfasst die Aufnahmevorrichtung auch eine Trägerplatte, auf der die Kartusche abgelegt und fixiert wird. Diese Trägerplatte ist bevorzugt als Drehteller ausgebildet. Zur Rotation der Kartusche (vorzugsweise konkret des Drehtellers) umfasst das Analysegerät einen Drehantrieb. Des Weiteren umfasst das Analysegerät eine Heizvorrichtung zum, insbesondere lokal begrenzten, Wärmeeintrag in die Kartusche. Vorzugsweise ist diese Heizvorrichtung durch eine Anzahl von lokal auf der Trägerplatte angeordneten Heizelementen, bspw. Widerstandsheizplatten oder Peltierelemente, gebildet. Außerdem weist das Analysegerät ein Steuergerät auf, das dazu eingerichtet ist, das vorstehend beschriebene Verfahren zum Betrieb des Analysegeräts insbesondere selbsttätig durchzuführen.
Vorzugsweise ist das Steuergerät dabei zumindest im Kern durch einen Mikrocontroller mit einem Prozessor und einem Datenspeicher gebildet, in dem die Funktionalität zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Form einer Betriebssoftware (Firmware) programmtechnisch implementiert ist, so dass das Verfahren - gegebenenfalls in Interaktion mit einem Bediener - bei Ausführung der Betriebssoftware in dem Mikrocontroller automatisch durchgeführt wird. Der Controller kann im Rahmen der Erfindung alternativ aber auch durch ein nichtprogrammierbares elektronisches Bauteil, z.B. einen ASIC, gebildet sein, in dem die Funktionalität zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit schaltungstechnischen Mitteln implementiert ist.
Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand einer Zeichnung näher erläutert. Darin zeigen:

1 in einer schematischen Explosionsdarstellung eine Kartusche zur Verwendung in einem rotationsbasierten Analyseverfahren,
2 in einer schematischen Draufsicht auf eine Wärmeeintragsseite einen Grundkörper der Kartusche,
3, 4 in einer schematischen Draufsicht bzw. Seitenansicht eine Trägerplatte eines Analysegeräts, mit dem die Kartusche bestimmungsgemäß verwendet wird,
5 in Ansicht gemäß 3 die Trägerplatte mit einer teilmonierten Kartusche,
6 in Ansicht gemäß 4 die Trägerplatte mit der Kartusche im bestimmungsgemäßen Einsatzzustand,
7 in einer schematischen Ansicht auf eine Unterseite einen Abdeckkörper der Kartusche,
8-11 jeweils in einer schematischen Detailansicht zwei durch einen Kanal verbundene Kammern der Kartusche zur Veranschaulichung von Teilschritten des Analyseverfahrens, und
12-19 jeweils in Ansicht gemäß 2 den Grundkörper der Kartusche zur Veranschaulichung von weiteren Teilschritten des Analyseverfahrens.

Einander entsprechende Teile sind in allen Figuren stets mit gleichen Bezugszeichen versehen.
In 1 ist schematisch ein als „Kartusche“ - oder aufgrund der flachen, einer halbierten Kreisscheibe angenäherten Geometrie kurz auch als „Disk 1“ - bezeichneter Probenbehälter dargestellt. Diese Disk 1 dient zum Einsatz in einem rotationsbasierten Analyseverfahren, das im Folgenden näher beschrieben wird. Die Disk 1 weist einen Grundkörper 2 (auch als „Substrat“ bezeichnet) auf, der eine mikrofluidische Kanal- und Kammerstruktur 4 aufweist. Diese Kanal- und Kammerstruktur 4 weist wiederum mehrere im Folgenden näher beschriebene Kammern auf, die mittels jeweils zugeordneter Kanäle untereinander verbunden sind (vgl. 2). Im unmontierten Zustand bilden die Kammern und Kanäle jeweils „offenliegende“, becken- bzw. rinnenartige Vertiefungen in dem Grundkörper 2. Die Disk 1 weist daher auch eine Siegelfolie 6 (oder auch: „Siegelschicht“) auf, die auf den mikrofluidischen Grundkörper 2 heißgesiegelt wird und damit die Kanal- und Kammerstruktur 4 von einer im Folgenden als „Wärmeeintragsseite 8“ bezeichneten Seite her verschließt. Der Grundkörper 2 weist einen seitlichen Zugang 10 zur Kanal- und Kammerstruktur 4 auf, durch den hindurch Probenmaterial in die Kanal- und Kammerstruktur 4 eingebracht werden kann. Dieser Zugang 10 ist reversibel mittels einer Kapsel 12 verschließbar, um die Einbringung des Probenmaterials und ein nachfolgendes Wiederverschließen zu ermöglichen. Die Disk 1 weist außerdem einen Abdeckkörper, im Folgenden kurz als „Cover 14“ bezeichnet, auf, der auf einer „Oberseite 16“ (oder auch „rückseitig“ zur Wärmeeintragsseite 8) auf den Grundkörper 2 aufgesetzt und im vorliegenden Ausführungsbeispiel mittels Rasthaken 18 (s. 7) in korrespondierenden Aussparungen 20 des Grundkörpers 2 an diesem fixiert wird. Das Cover 14 weist ein erstes und ein zweites Auslesefenster 22 bzw. 24 auf, durch die hindurch der Inhalt darunterliegender Kammern des Grundkörpers 2 abgelesen und damit analysiert (bspw. mittels Fluoreszenzdetektion) oder zumindest kontrolliert werden kann.
In einer optionalen (hier dargestellten) Variante weist die Disk 1 auch ein (hier zweiteiliges, vorzugsweise selbstklebendes) Label 26 auf, das auf das Cover 14 aufgebracht ist. Das Label 26 ist dabei so ausgestaltet, dass es das Auslesen durch die Auslesefenster 22 und 24 ermöglicht. In einer optionalen Variante weist das Label 26 transparente Bereiche auf, die die Auslesefenster 22 und 24 überdeckten. Zweckmäßigerweise sind diese transparenten Bereiche nicht mit Klebstoff versehen - d. h. von Klebstoff ausgespart -, damit die Fluoreszenzdetektion nicht durch womöglich lumineszierenden Klebstoff beeinflusst wird.
Im Cover 14 sind seitlich Rücksprünge 28 in einer Seitenwand 30 eingeformt, die eine Ausrichtung und Positionierung der Disk 1 in einem automatischen Einzug eines Analysegeräts ermöglichen.
Der Grundkörper 2 weist mehrere (hier konkret zwei) Durchbrüche 32 auf, die zur eindeutigen Ausrichtung und Positionierung der Disk 1 auf einer Trägerplatte (im Folgenden als „Drehteller 34“ bezeichnet, s. 3 bis 5) des Analysegeräts dienen. In diese Durchbrüche 32 greifen zur Positionierung und Fixierung in einer Drehebene 36, die parallel zur Oberfläche des Drehtellers 34 und zur Wärmeeintragsseite 8 (und somit zur flächigen Erstreckung) der Disk 1 liegt, Positionsstifte 38 des Drehtellers 34 ein.
Der Drehteller 34 des Analysegeräts dient zur Zentrifugation, d. h. zur Rotation der Disk 1 um eine Rotationsachse 40 (s. 4). Der Drehteller 34 ist dabei dazu eingerichtet, optional zwei Disks 1 aufnehmen zu können und ist deshalb um 180 Grad drehsymmetrisch aufgebaut (s. 3). Außerdem trägt der Drehteller 34 mehrere Heizelemente 42, die zur lokalen Erwärmung einzelner Kammern der Kanal- und Kammerstruktur 4 der Disk 1 dienen und deshalb in ihrer Außenkontur den entsprechenden Kammern angepasst sind. Die Heizelemente 42 sind vorliegend durch Widerstandsheizplatten gebildet.
In einem alternativen Ausführungsbeispiel sind die Heizelemente 42 durch Peltierelemente, die auch eine aktive Kühlung ermöglichen, gebildet.
Einzelne Kammern, Kanäle und weitere Elemente der Disk 1 werden im Folgenden anhand des nachfolgend beschriebenen Verfahrensablaufs näher beschrieben.
Zur Durchführung des Analyseverfahrens wird zumindest eine Disk 1, in die durch den Zugang 10 als Probenmaterialträger ein Tupfer 44 bis in eine Tupferkammer 46 der Kanal- und Kammerstruktur 4 eingeführt ist, wobei der Zugang 10 anschließend mittels der Kapsel 12 verschlossen wird, in das Analysegerät eingeführt und auf dem Drehteller 34 positioniert und abgelegt. Für den Fall, dass nur eine Disk 1 eingelegt wird, ist das Analysegerät dazu eingerichtet, den Drehteller 34 automatisch auszuwuchten (insbesondere indem Gegengewichte auf dem Drehteller 34 angeordnet werden). Zur Fixierung wird die Disk 1 mittels einer Vakuumpumpe an den Drehteller 34 angesaugt. Dazu dienen die Heizelemente 34 umlaufende Dichtkonturen 48. An diesen liegt die Disk 1 an und kann somit bereichsweise an den Drehteller 34 angesaugt werden. Dadurch wir zweckmäßigerweise ein enger Kontakt zwischen den Heizelementen 42 und den lokal zu erwärmenden Bereichen der Disk 1 ermöglicht.
Die Disk 1 enthält in einem initialen Zustand (d. h. ohne bereits eingebrachte Probe bzw. ohne Tupfer 44) vorgelagerte Flüssigreagenzien in verschlossenen Stickpacks 50 in einer ersten Stickpack-Kammer 52 und einer zweiten Stickpack-Kammer 54. Des Weiteren sind sogenannte Primer in Voramplifikations-Kammern 56 vorgelagert. Weitere Primer und sogenannte Sonden (auch als „Gensonden“ bezeichnet, üblicherweise in Form von Poly- oder Oligonukleotiden) sind in mehreren Auslesekammern 58 vorgelagert. Diese Auslesekammern 58 sind durch das Auslesefenster 24 des Covers 14 einsehbar. Die Primerpaare in den Voramplifikations-Kammern 56 sind - je nach konkretem Ziel des Analyseverfahrens und/oder des spezifischen Ablaufs - identisch oder unterschiedlich. Bspw. sind die Primer in den Auslesekammern 58 zu den Primern in den Voramplifikations-Kammern 56 paarweise identisch oder bspw. für eine im Stand der Technik bekannte „nested PCR“ („verschachtelte“ oder „geschachtelte“ PCR) vorgesehen und somit unterschiedlich ausgeführt.
In einer ersten, näherungsweise runden „Lyokammer 60“ und einer zweiten, ebenfalls näherungsweise runden Lyokammer 61 sind Lyophilisate vorgelagert, die bspw. Enzyme, Polymerase, dNTPs (desoxyNukleosidTriPhosphate), Salze und/oder weitere vorgelagerte Reagenzien (z. B. PCR-Additive, Nuklease Inhibitoren, Co-Faktoren der beteiligten Enzyme etc.) enthalten. Die Tupferkammer 46 enthält im vorliegenden Ausführungsbeispiel eine Lyse und Mittel zur Prozesskontrolle, z.B. Sporen, Pilze, Phagen oder künstlich hergestellte Targets. Eine mit der Tupferkammer 46 in Verbindung stehende Lysekammer 62 enthält ein Lysepellet sowie einen Magneten und ein Mahlmedium. Bei letzterem handelt es sich z.B. um Glas- und/oder Zirkoniapartikel. Diese Partikel sind optional mit EDTA beschichtet oder dieses ist zugegeben, um bei Blut als Probenmaterial die Gerinnung zu verhindern. Um Inhibitoren zu binden wird optional (Aktiv-)Kohle zugegeben. D. h. in einem solchen optionalen Fall ist (Aktiv-)Kohle ebenfalls vorgelagert.
Nach der Probennahme - alternativ zum Tupfer 44 (in steriler Form im medizinischen Bereich auch als „Swab“ bezeichnet) bspw. mittels einer Blutkapillare - wird mithin der Probenträger, hier also der Tupfer 44, in die Disk 1, konkret in die Tupferkammer 46 eingeführt und der Zugang 10 mit der Kapsel 12 verschlossen (vgl. 2). Die Kapsel 12 schließt dabei luftdicht ab, um den Austritt von gegebenenfalls in dem Probenmaterial enthaltenen Pathogenen zu vermeiden. In einem optionalen Ausführungsbeispiel weist die Disk 1, konkret der Grundkörper 2 ein Entlüftungsloch 64 auf, dem ein Filter und ein Kondenswasserfang 66 (in Form einer vergleichsweise kleinen Kammer) vorgeschaltet ist. Letzterer ermöglicht eine Befeuchtung des Filters mit Kondenswasser. Das Entlüftungsloch 64 kann in einem alternativen Ausführungsbeispiel aber auch entfallen.
Nachdem die Disk 1 auf dem Drehteller 34 positioniert und fixiert ist, wird die Lyse des Probenmaterials gestartet, indem im Analysegerät angeordnete Magnete über die Disk 1 gefahren werden. Dadurch wird ein in Bezug auf ein Referenzsystem der Disk 1 veränderliches Magnetfeld erzeugt und der in der Lysekammer 62 angeordnete Magnet bewegt. Aufgrund der Bewegung des Magneten werden die in der Lysekammer 62 befindlichen Partikel des Mahlmediums aneinander gerieben, so dass Bakterien, Pilze, Viren, oder andere Analyten aufgeschlossen werden.
Diese mechanische Lyse wird in einem optionalen Verfahrensschritt durch Erwärmen der Lysekammer 62 mittels des entsprechende lokal zugeordneten Heizelements 42 thermisch unterstützt.
Währenddessen rotiert der Drehteller 34 und somit auch die Disk 1, so dass vergleichsweise große Probenpartikel aufgrund der Zentrifugation absedimentiert werden. Dadurch wird sowohl eine biochemische Inhibitionstoleranz erhöht als auch das Risiko einer Verstopfung von mikrofluidischen Kanälen der Kanal- und Kammerstruktur 4 verringert.
Optional kann die Probe bereits in diesem Anfangsschritt mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder eines isothermalen Verfahrens (bspw. loopmediated isothermal amplification, kurz: LAMP, oder Recombinase Polymerase Amplification, kurz: RPA) vervielfältigt werden. Denkbar ist auch eine unspezifische Amplifikation in diesem Anfangsschritt mittels sogenannter whole-genome amplification, z.B. basierend auf PCR oder MDA (multiple displacement amplification).
Allgemein wird aber zunächst durch die Bewegung des Magneten und der Partikel, optional unterstützt durch eine Konvektion basierend auf einem in der Lysekammer 62 durch die optionale einseitige Erwärmung auftretenden Temperaturgradienten, das Probenmaterial homogenisiert. Sollte zusätzlich eine biochemische Reaktion in der Lysekammer 62 vorgesehen sein, werden dadurch auch gleichzeitig die Reaktionsbedingungen in der Lysekammer 62 homogen gehalten, d. h. insbesondere eine stabile Temperaturverteilung eingestellt und/oder eine hohe stoffliche Durchmischung erreicht. Dies ist besonders relevant für Proben mit sehr geringer Konzentration, oder die nur schwierig zu lysieren sind. Eine dabei ebenfalls mögliche Scherung von DNA oder RNA kann eine spätere Amplifikation unterstützen, da dadurch Sekundärstrukturen verringert werden. Aufgrund der mechanischen Einwirkung des bewegten Magneten und die dadurch auf das Probenmaterial aufgebrachten Kräfte können nämlich DNA- bzw. RNA-Stränge (zufällig) zerschnitten („geschert“) werden. Durch Dauer und Intensität der mechanischen Einwirkung (d. h. also der „mechanischen Lyse“), bspw. der Bewegungsgeschwindigkeit des Magneten, kann dabei gesteuert werden, wie stark die Scherung erfolgt. Dabei ist jedoch darauf zu achten, dass DNA und RNA nicht zu stark geschert werden, da sonst keine Amplifikation mehr möglich ist.
Zusätzlich werden in einem weiteren Verfahrensschritt, konkret einem sogenannten „Öffnungsschritt“, die Stickpack-Kammern 52 und 54 lokal mittels der entsprechenden Heizelemente 42 auf etwa 90 °C aufgeheizt und anschließend (optional auch währenddessen) die Drehzahl des Drehtellers auf über 30 Hz, insbesondere in den Bereich von etwa 60 Hz erhöht. Bei dieser Zentrifugation mit mittlerer bis hoher Drehzahl werden die Stickpacks 50 aufgrund der Kombination von Erwärmung und Zentrifugalkraft innerhalb vergleichsweise kurzer Zeit von etwa 5 Sekunden geöffnet. Aufgrund der Erwärmung wird nämlich eine Aufreißnaht oder Peelnaht 67 der aus einer sogenannten Peelfolie gebildeten Stickpacks 50 thermisch geschwächt. In 8 und 9 ist dieser Vorgang schematisch und beispielhaft für beide Stickpacks 50 anhand der Stickpack-Kammer 54 näher dargestellt. Durch die Öffnung der Peelnaht 67 tritt die im Stickpack 50 vorgehaltene Flüssigkeit in die Stickpack-Kammer 54 aus (vgl. auch 12).
Während einer Rotation mit mindestens 25 Hz, insbesondere mit den vorstehend beschriebenen mehr als 30, vorzugsweise etwa 60 Hz, baut sich aufgrund der Erwärmung der Stickpack-Kammer 54 zudem auch ein Überdruck p im Innenraum der Stickpack-Kammer 54 auf (s. 9). Der Überdruck p wird dabei durch die Ausdehnung des in der jeweiligen Stickpack-Kammer 52 bzw. 54 enthaltenen Gases (aufgrund des idealen Gasgesetzes) sowie einem von der Stickpack-Flüssigkeit und der Temperatur in der Stickpack-Kammer 52 bzw. 54 abhängigen Dampfdruck (und somit einer Sublimation des Flüssigkeit) hervorgerufen. Aufgrund des Überdrucks p wird Flüssigkeit in den zur Lyokammer 61 führenden Kanal 68 gedrückt. Aufgrund der weitergehenden Rotation der Disk 1 wirkt der Flüssigkeit in dem Kanal 68 aber die in Radialrichtung R (die senkrecht zur Rotationsachse 40 steht) wirkende Zentrifugalkraft entgegen. In Abhängigkeit von der Drehzahl und somit der Zentrifugalkraft kann die Flüssigkeit im Kanal 68 somit nur um eine „Höhendifferenz“ h gegenüber dem Flüssigkeitsspiegel in der Stickpack-Kammer 54 ansteigen (s. schraffierte Fläche in 9). In diesem Zustand herrscht mithin ein Gleichgewicht zwischen Überdruck p in der Stickpack-Kammer 54 und einem fliehkraftbedingten „Gegendruck“ im Kanal 68.
Bei anschließender Verringerung der Drehzahl führt der Überdruck p in der Stickpack-Kammer 54 zu einer Verdrängung eines Großteils der Flüssigkeit (vorzugsweise von mehr als 90%) aus der Stickpack-Kammer 54 durch den Kanal 68 zur Lyokammer 61 (vgl. 10 und 11). Diese Verdrängung findet selbst bei einer Zentrifugation bei 10 bis 30 Hz robust entgegen der Zentrifugalkräfte innerhalb der Disk 1 statt. Die aus der Stickpack-Kammer 54 verdrängte Flüssigkeit löst ein in der Lyokammer 61 befindliches Lyophilisat auf, das Teile der Reagenzien zur späteren Hauptamplifikation enthält.
Entsprechend dem Vorgenannten erfolgt auch die Öffnung des Stickpacks 50 in der Stickpack-Kammer 52 und der Transfer der Flüssigkeit durch den Kanal 68 von der Stickpack-Kammer 52 in die Tupfer- bzw. Lysekammer 46 bzw. 62. Zwar liegt die Lysekammer 62 mit ihrem radial außenseitigen Rand etwa radial gleichauf mit der Stickpack-Kammer 52. Aber der in die Lysekammer 62 (bzw. in die Tupferkammer 46) führende Kanal 68 verläuft zunächst in einer Kurve von radial außen nach radial innen, so dass ein „direkter“ Überlauf der Flüssigkeit in die Tupfer- bzw. Lysekammer 46 bzw. 62 unterbunden ist. Der Transfer der Flüssigkeit aus der Stickpack-Kammer 52 erfolgt dabei vor oder während der vorstehend beschriebenen (mechanischen) Lyse in der Lysekammer 62, um hierbei bereits die Flüssigkeit des Stickpacks 50 der Stickpack-Kammer 52 nutzen zu können.
In 8 sind die geöffneten Stickpacks 50 sowie in der Stickpack-Kammer 54 schraffiert die aus dem Stickpack 50 ausgetretene Flüssigkeit dargestellt. Aus der Stickpack-Kammer 52 ist bereits ein Teil der Flüssigkeit in die Tupferkammer 46 und die Lysekammer 62 übergetreten. In 9 ist der Zustand der Stickpack-Kammern 52 und 54 nach Verdrängung der jeweiligen Flüssigkeit dargestellt.
In einem nachfolgenden Verfahrensschritt erfolgt der Transport der Flüssigkeit (des „Lysats“) aus der Lysekammer 62 in die nachfolgende (in 12 bis 19 rechts oberhalb der Lysekammer 62 dargestellte) Lyokammer 60, in der das Lysat das darin vorgelagerte Lyophilisat auflöst (s. 14). Dieses Lyophilisat kann optional neben den vorstehend genannten Amplifikationsreagenzien auch Nuklease-Inhibitoren zur Inaktivierung spezifischer Nukleasen sowie weitere Additive oder Co-Faktoren wie Dithiothreitol (DTT) enthalten. Der Transport des Lysats wird dabei - wiederum entgegen der Zentrifugalkraft der weiter erfolgenden Rotation der Disk 1 - durch eine Erwärmung der voraus angeordneten Stickpack-Kammer 52 und/oder der Lysekammer 62 und/oder einer Abkühlung der mit der Lyokammer 60 fluidtechnisch nachfolgend verbundenen Voramplifikations-Kammern 56, der (gegenüberliegenden) Stickpack-Kammer 54 und/oder der Auslesekammern 58 getrieben. Die Abkühlung der nachfolgenden Kammern bewirkt dabei einen Saugeffekt aufgrund eines Unterdrucks, die Erwärmung der vorausliegenden Kammer oder Kammern entsprechend umgekehrt aufgrund des Überdrucks ein Voranschieben der Flüssigkeit.
Die Lyokammer 60 ist mittels eines Überlaufkanals 70 an eine Überlaufkammer 72 angebunden. Beim Transport des Lysats aus der Lysekammer 62 in die Kammer 60 fließt überschüssiges Lysat durch den Überlaufkanal 70 in die Überlaufkammer 72. An die Überlaufkammer 72 sind Kontrollkammern 74 und 76 angeschlossen, die zur Überprüfung einer korrekten Befüllung der Disk 1 dienen. In die Überlaufkammer 72 abfließendes Lysat füllt von dort aus die Kontrollkammern 74 sowie die Kontrollkammern 76 (schematisch in 14 dargestellt). Die Füllung der Kontrollkammern 74 und 76 dient dazu, eine korrekte Befüllung der Disk 1 zu überprüfen. Insbesondere wird die Füllung der in 10 rechts dargestellten Kontrollkammer 74, die grob gesehen eine quadratische Geometrie aufweist, konkret der dieser radial außenseitig angeschlossenen Kontrollkammer 76, dahingehend aufgefasst, dass keine Unterfüllung der Disk 1 vorliegt. Die Füllung der links auf die etwa quadratische Kontrollkammer 74 strömungstechnisch nachfolgenden, etwa dreieckigen (vgl. 10) Kontrollkammer 74, konkret der dieser radial außenseitig angeschlossenen Kontrollkammer 76, wird dagegen dahingehend aufgefasst, dass eine Überfüllung der Disk 1 vorliegt. Das gesamte hier vorhandene Flüssigkeitsvolumen setzt sich aus dem Volumen des eingebrachten Probenmaterials, üblicherweise etwa 105 bis 170 Mikroliter, und des Stickpacks 50 der Stickpack-Kammer 52, etwa 140 bis 160 Mikroliter, zusammen. Die Füllung der entsprechenden Kontrollkammern 74 und 76 kann dabei durch einen Fluoreszenzdetektor durch das Auslesefenster 22 des Covers 14 zu einem spezifischen Zeitpunkt (bspw. zum Ende des gesamten Analyseverfahrens) oder auch während der Füllung der Lyokammer 60 kontinuierlich überwacht werden. Dadurch kann der Zeitpunkt, zu dem sich die Kontrollkammern 74 und 76, und somit auch Lyokammer 60, gefüllt haben, bestimmt werden. Dies ermöglicht wiederum, auf mögliche Fehlerquellen zurückzuschließen. In einem optionalen Ausführungsbeispiel ist in die Kontrollkammern 74 und/oder 76 ein eingetrockneter Fluoreszenzfarbstoff eingelagert, um ein stärkeres Signal zu erhalten.
In einem weiteren Verfahrensschritt wird anschließend mittels einer hohen Drehzahl von 40-60 Hz Flüssigkeit von der Lyokammer 60 durch einen Transferkanal 78 in die Voramplifikations-Kammern 56 transferiert. Sobald der Flüssigkeitsstand in den Voramplifikations-Kammern 56 eine Einmündung eines jeweiligen Auslasskanals 80 übersteigt, wird das eingeschlossene Luftvolumen im (radial nach innen weisenden) „Kopfraum“ der Voramplifikations-Kammern 56 und in jeweils einer über einen zugeordneten Kanal 82 nachgelagerten Kammer 84 komprimiert (s. 15).
Unter hoher Zentrifugation mit Drehzahlen von 40-80 Hz findet im darauffolgenden Verfahrensschritt eine Voramplifikation in den Voramplifikations-Kammern 56 statt. Der Überdruck in den Voramplifikations-Kammern 56 und den Kammern 84 bleibt aufgrund der hohen Zentrifugation während der Voramplifikation erhalten. Zunächst werden in den Voramplifikations-Kammern 56 vorgelagerte Primer, z.B. gespottet mit Trehalose, aufgelöst. Für den Fall, dass RNA detektiert werden soll, kann optional zunächst eine reverse Transkription für 30 Sekunden bis 10 oder bis 30 Minuten bei konstanten 35-70 °C durchgeführt werden, um vorhandene RNA in DNA umzuschreiben. Die Voramplifikation mittels PCR findet aber durch lokales und zyklisches Aufheizen und Abkühlen der Flüssigkeit in den Voramplifikations-Kammern 56 zwischen den Bereichen 50-75 °C und 80-100 °C statt. Die Voramplifikation umfasst 5-30 Voramplifikationszyklen. Jeder Zyklus umfasst dabei die Erwärmung auf 80-100 °C und die anschließende Abkühlung auf 50-75 °C.
Die (Voramplifikations-) Reaktion innerhalb der Voramplifikations-Kammern 56 wird durch eine hohe Konvektion unterstützt. Diese wird durch den einseitigen Wärmeeintrag in die Disk 1, konkret in die Voramplifikations-Kammern 56 von der Wärmeeintragsseite 8 her sowie die gleichzeitig erfolgende Rotation hervorgerufen. Dabei wird zunächst die Flüssigkeit in der Voramplifikations-Kammer 56 an der mittels eines Heizelements 42 geheizten Wärmeeintragsseite 8 aufgeheizt und bildet mithin eine erwärmte Grenzschicht. Dabei verringert sich die Dichte der Grenzschicht relativ zum Rest des Flüssigkeitsvolumens. Die erwärmte Flüssigkeit der Grenzschicht steigt im künstlichen, durch die Rotation der Disk 1 hervorgerufenen Schwerefeld, das in Radialrichtung R ausgerichtet ist, zunächst gegen die Radialrichtung R nach „innen“ und anschließend quer zur Radialrichtung R zur Oberseite 16 hin auf. Dort kühlt die Flüssigkeit ab und sinkt „schwerkraftbedingt“ an der Oberseite 16 entlang in Radialrichtung R nach außen und anschließend wieder zur Wärmeeintragsseite 8 hin ab. Es kommt durch den Wärmeeintrag also zu einer Konvektion und Strömung entlang der Radialrichtung R. Des Weiteren bildet sich durch die ebenfalls auftretenden Corioliskräfte eine tangentiale (d. h. senkrecht zur Radialrichtung R in Ebenenrichtung der Disk 1 stehende) Flusskomponente aus, welche die Durchmischung der Flüssigkeit zusätzlich unterstützt. Da die Konvektion durch das künstliche Schwerefeld bedingt ist, wird sie durch schnellere Rotation der Disk 1 erhöht. Die bei hohen Drehzahlen auftretende Konvektion führt so zu einer besonders effektiven Durchmischung der Reaktionskomponenten innerhalb der Voramplifikations-Kammern 56, was wiederum effiziente Amplifikationsbedingungen ermöglicht.
Ein Nebeneffekt ist allerdings, dass bei sehr hohem Wärmeaustrag auf der nicht geheizten Oberseite 16 der Disk 1 sich ein hoher Temperaturgradient von bspw. 10 °C (oder Kelvin) innerhalb des Flüssigkeitsvolumens der Voramplifikations-Kammer 56 von bspw. 10 Kelvin ausbilden kann, was nachteilig sein kann. Bereits das Cover 14, das eine Luftabschirmung bewirkt, führt zu einer signifikanten Verringerung des Temperaturgradienten auf etwa 4-5 Kelvin.
Zur weiteren Verringerung des Wärmeaustrags weist das Cover 14 in einem weiteren Ausführungsbeispiel einen Rahmensteg 86 auf, der die Voramplifikations-Kammern 56 ringartig umschließt und somit den Wärmeaustrag durch Konvektion auf der Oberseite 16 weiter verringert (s. 1 und 7). Dieser kann optional auch entfallen. Der Rahmensteg 86 ist an das Cover 14 angeformt, d. h. einstückig mit diesem verbunden. Der Rahmensteg 86 steht dabei in Richtung auf den Grundkörper 2 vor und endet mit geringem Abstand von etwa 100 µm zu dem Grundkörper. Durch diese weitergeführte Abschirmung der Voramplifikations-Kammern 56 durch das Cover 14 und den Rahmensteg 86 wird eine Temperaturdifferenz von etwa 2 Kelvin innerhalb der jeweiligen Voramplifikations-Kammer 56 ermöglicht. Somit erfolgt zwar eine vergleichsweise starke Konvektion in der jeweiligen Voramplifikations-Kammer 56, unter anderem aufgrund der Rotation. Zusätzlich wird aber auch eine vergleichsweise hohe Homogenität der Reaktionstemperatur innerhalb der Voramplifikations-Kammer 56 - zumindest im statischen Fall, d. h. bei einem Halten der Temperatur des Heizelements 42 für wenigstens etwa 10 bis 30 Sekunden oder dergleichen - erreicht. Erfahrungswerte haben bei der hier und im Folgenden beschriebenen Geometrie und den dabei angewendeten Parametern gezeigt, dass sich bereits ab etwa 15 Sekunden statische Bedingungen ergeben.
Auch für den Fall, dass in den Voramplifikations-Kammern 56 eine Reaktion erfolgt, die eine Interaktion, bspw. eine Bindung von Molekülen an eine Festphase, z.B. an Mikroarrays, erfordert, oder eine Reaktion, bei der die Konzentration der jeweiligen Reaktionspartner üblicherweise gering ist und deshalb ein Kontakt der jeweiligen Reaktionspartner untereinander einer vergleichsweise geringen Wahrscheinlichkeit unterliegt, kann die hohe Konvektion (und somit vergleichsweise starke Durchmischung) sowie die homogene Temperaturverteilung vorteilhaft sein.
Nach Abschluss der Voramplifikation wird die Drehzahl auf etwa 5 bis 20 Hz, konkret auf etwa 10 Hz, verringert. Dadurch kann das komprimierte Luftvolumen im Kopfraum der Voramplifikations-Kammern 56 und in den Kammern 84 expandieren. Dies führt wiederum zu einem Absenken der Flüssigkeitsspiegel innerhalb der Voramplifikations-Kammern 56, indem Flüssigkeit, die radial innerhalb der Einmündung der Auslasskanäle 80 steht, zumindest zum Großteil durch die expandierende Luft durch die Auslasskanäle 80 in eine weitere Kammer 88 verdrängt wird. Dies wird dadurch ermöglicht, dass die Auslasskanäle 80 einen geringeren Fluidwiderstand, konkret einen größeren Kanalquerschnitt, aufweisen als der in die Voramplifikations-Kammern 56 führende Transfer-Kanal 78.
Die Disk 1 weist dabei Entlüftungskanäle 90 auf, die unter anderem mit der Kammer 88 in Verbindung stehen und eine interne Entlüftung der Disk 1 in andere Kammern hinein ermöglichen. Somit kann Luft, die durch in die Kammer 88 einströmende Flüssigkeit komprimiert werden würde, über die Entlüftungskanäle 90 in Richtung der Lyokammer 60 entweichen.
In einem nachfolgenden Verfahrensschritt wird die Drehzahl der Disk 1 (bzw. des Drehtellers 34) auf einen Wertebereich von 10-20 Hz, vorzugsweise auf etwa 15 Hz, eingestellt, konkret erhöht. Die Flüssigkeit aus der Kammer 88 fließt dadurch über einen Siphon 92 in eine Messkammer 94, die radial außenliegend drei „Messfinger“ oder Kammerfortsätze unterschiedlichen Volumens aufweist. Diese Messfinger werden dabei nacheinander befüllt, so dass aufgrund des vorgegebenen (Messfinger-) Volumens eine Abmessung einzelner Teilvolumina erfolgt (s. 16). Der Durchfluss der Flüssigkeit durch die radial außenseitig an die Messfinger anschließenden Kanäle 96 ist dabei durch hohe fluidische Widerstände dieser Kanäle 96 limitiert, konkret indem deren Kanaldimension in mindestens eine Raumrichtung, konkret in einer Querschnittsrichtung, kleiner als 200 µm ist. Das Teilvolumen, das im folgenden Schritt jeweils durch die Kanäle 96 fließt, wird also im Wesentlichen durch das Volumen des jeweiligen vorgeschalteten Messfingers vorgegeben. Überschüssiges Flüssigkeitsvolumen fließt zu einem Überlauf 98.
Im nächsten Verfahrensschritt (s. 17) werden durch Erhöhung der Zentrifugation, also der Drehzahl, auf einen Bereich zwischen 30 und 80 Hz, konkret auf etwa 60 Hz, die abgemessenen Teilvolumina der Flüssigkeit in die jeweils nachfolgenden Kammern, d. h. in die in 17 links der Tupferkammer 46 dargestellte Lyokammer 61 und in eine weitere Kammer 100 getrieben.
In dieser Lyokammer 61 befindet sich nun ein „Hauptamplifikationspuffer“, welcher ursprünglich im in der Stickpack-Kammer 54 angeordneten Stickpack 50 vorgelagert war, ein in dieser Flüssigkeit mittlerweile aufgelöstes Lyophilisat, welches in der Lyokammer 61 vorgelagert war und das in der Flüssigkeit aus den Voramplifikations-Kammern 56 enthaltene „Preamplifikat“ welches über den Kanal 96 zugeführt wurde.
In einem nachfolgenden Verfahrensschritt wird die Disk 1 unter vergleichsweise schnellen Richtungswechseln, jeweils mit einer Änderungsrate von 5 bis 40 Hz/s, vorzugweise um etwa 30 Hz/s, zwischen Endwerten von -20 bis 40 und +20 bis 40 Hz rotiert. Die Vorzeichen deuten in diesem Fall die unterschiedlichen Rotationsrichtungen an. Die in der Lyokammer 61 befindlichen Komponenten werden durch die bei den Richtungswechseln auftretenden Beschleunigungen und dadurch im rotierenden System erzeugten Euler- und Corioliskräfte gemischt.
Parallel hierzu werden die Auslesekammern 58, diesen vorgelagerte Messkammern 102 und eine Überlaufkammer 104 mittels des entsprechend zugeordneten Heizelements 42 aufgeheizt. Die dadurch expandierende Luft kann über einen Ausgleichskanal 106 in die Kammer 100 entweichen. Zum Abschluss des Mischvorgangs werden die Richtungswechsel beendet und wieder eine konstante Drehzahl von etwa 20 Hz eingestellt. Anschließend werden die Auslesekammern 58, die Messkammern 102 und die Überlaufkammer 104 wieder abgekühlt. Dadurch entsteht ein relativer Unterdruck in den entsprechenden Kammern 58, 102 und 104 und der Füllstand in einem an die Lyokammer 61 nachfolgend angeschlossenen Siphonkanal 108 und dem an die Kammer 100 angeschlossenen Ausgleichskanal 104 steigt in Abhängigkeit von einem Verhältnis von Zentrifugaldruck und Luftdruckunterschied an. Sobald die Flüssigkeit den Scheitelpunkt 110 des Siphonkanals 108 übersteigt, wird die komplette Flüssigkeit aus der Lyokammer 61 in die nachfolgenden Messkammern 102 getrieben (s. 18). Ein Entlüftungskanal 112 zwischen der Lyokammer 61 und der Kammer 100 ermöglicht dabei einen Luftaustausch zwischen diesen beiden Kammern 61 und 100.
Die Flüssigkeit fließt dabei nacheinander in die einzelnen Messkammern 102 und wird dadurch abgemessen. Des Weiteren wird die Flüssigkeit in den Messkammern 102 zunächst durch jeweils ein zentrifugo-pneumatisches Ventil in Form jeweils eines Ventilkanals 114 zurückgehalten. Überschüssige Flüssigkeit fließt in die Überlaufkammer 104 ab. Die zentrifugo-pneumatischen Ventile basieren darauf, dass die Flüssigkeit durch den Gegendruck in der jeweils nachfolgenden Auslesekammer 58 im jeweiligen Ventilkanal 114 zurückgehalten wird und bei einer Drehzahl im mittleren Drehzahlbereich, hier konkret von etwa 15-25 Hz nicht in die nachfolgenden Auslesekammern 58 fließen kann.
In einem nachfolgenden Verfahrensschritt wird die Drehzahl soweit erhöht, typischerweise auf über 40 Hz, dass die (Flüssigkeits-) Menisken in den jeweiligen Ventilkanälen 114 aufgrund der sogenannten „Rayleigh Taylor Instabilität“ instabil werden und somit die Flüssigkeit zumindest größtenteils in die entsprechende Auslesekammer 58 übertragen wird (s. 19).
In einem weiteren Verfahrensschritt finden in den Auslesekammern 58 nun die Hauptamplifikationen statt. Dazu werden die jeweils in den Auslesekammern 58 vorgelagerten Primer und Sonden aufgelöst. Unterstützt wird das Auflösen der Primer und Sonden und die anschließende Amplifikation dabei durch eine hohe Konvektion innerhalb der Auslesekammern 58, die wie vorstehend für die Voramplifikationskammer 56 beschrieben hervorgerufen wird. Die Reaktion wird nach jedem Zyklus bei etwa 60 °C in allen Auslesekammern 58 mittels eines Fluoreszenzdetektors ausgelesen. Dieser detektiert die Fluoreszenz in verschiedenen Wellenlängen. Das Auslesen erfolgt dabei durch das Auslesefenster 24 im Cover 14. Der Vorgang entspricht somit einer sogenannten „Real-Time PCR“. Dabei kann in jeder der zwölf Auslesekammern 58 eine Multiplex-Reaktion ablaufen, z.B. 3-plex bis 10-plex. Ein entsprechender Signalanstieg des Fluoreszenzdetektors zeigt dabei ein detektiertes Target an.
Um die optische Auswertung mittels des Fluoreszenzdetektors nicht oder möglichst gering zu beeinflussen, weisen die Auslesekammern 58 radial innenseitig, außerhalb des mittels des Fluoreszenzdetektors betrachteten Bereichs, eine nicht näher dargestellte Vertiefung auf, die dazu dient, Luftblasen „aufzufangen“ und aus dem betrachteten Bereich zurückzuhalten. Eine in dieser Vertiefung angeordnete Luftblase müsste vergleichsweise stark deformiert werden, um in den betrachteten Bereich einzutreten. Hier wirkt vorteilhafterweise die Blasengrenzfläche, insbesondere beeinflusst durch die vorliegenden Oberflächenspannungsverhältnisse, entgegen.
Weiter optional ist auch das die Auslesekammern 58 überdeckende Auslesefenster 24, das in diesem Fall transparent verschlossen ist, mit einem Rahmensteg (vgl. 1) vergleichbar zum Rahmensteg 86 umrandet, so dass auch hier der Wärmeaustrag aus den Auslesekammer 58 verringert werden kann.
Alternativ zur Fluoreszenzdetektion kann die Auswertung auch über eine sogenannte Schmelzkurvenanalyse erfolgen, beispielsweise einer „high-resolution melt curve analysis“ oder einer „rapid melt curve analysis“. Dies würde ein noch deutlich höheres Multiplexing erlauben. In einem optionalen Ausführungsbeispiel wird in den Auslesekammern 58 eine „real-time PCR“ auf Basis von sogenannten interkalierenden Farbstoffen (z. B. unter der Marke oder dem Namen „EvaGreen“, „SYBR Green“, „BoxTo“ bekannte Farbstoffe) durchgeführt, wobei die entstehenden PCR Produkte nach Amplifikation über Schmelzkurven detektiert werden. Hierbei können pro Kammer bis zu 20 PCR Produkte detektiert und unterschieden werden (20 plex).
Der Gegenstand der Erfindung ist nicht auf die vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele beschränkt. Vielmehr können weitere Ausführungsformen der Erfindung von dem Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung abgeleitet werden. Insbesondere können die anhand der verschiedenen Ausführungsbeispiele beschriebenen Einzelmerkmale der Erfindung und deren Ausgestaltungsvarianten auch in anderer Weise miteinander kombiniert werden.
Bezugszeichenliste

1: Disk
2: Grundkörper
4: Kanal- und Kammerstruktur
6: Siegelfolie
8: Wärmeeintragsseite
10: Zugang
12: Kapsel
14: Cover
16: Oberseite
18: Rasthaken
20: Aussparung
22: Auslesefenster
24: Auslesefenster
26: Label
28: Rücksprung
30: Seitenwand
32: Durchbruch
34: Drehteller
36: Drehebene
38: Positionsstift
40: Rotationsachse
42: Heizelement
44: Tupfer
46: Tupferkammer
48: Dichtkontur
50: Stickpack
52: Stickpack-Kammer
54: Stickpack-Kammer
56: Voramplifikations-Kammer
58: Auslesekammer
60: Lyokammer
61: Lyokammer
62: Lysekammer
64: Entlüftungsloch
66: Kondenswasserfang
67: Peelnaht
68: Kanal
70: Überlaufkanal
72: Überlaufkammer
74: Kontrollkammer
76: Kontrollkammer
78: Transferkanal
80: Auslasskanal
82: Kanal
84: Kammer
86: Rahmensteg
88: Kammer
90: Entlüftungskanal
92: Siphon
94: Messkammer
96: Kanal
98: Überlauf
100: Kammer
102: Messkammer
104: Überlaufkammer
106: Ausgleichskanal
108: Siphonkanal
110: Scheitelpunkt
112: Entlüftungskanal
114: Ventilkammer
R: Rotationsrichtung
p: Überdruck
h: Höhendifferenz

Claims

Verfahren zum Betrieb eines Analysegeräts für die Durchführung eines Analyseprozesses, insbesondere mittels einer Polymerase-Kettenreaktion, wobei verfahrensgemäß - eine Kartusche (1) mit einer mikrofluidischen Kanal- und Kammerstruktur (4) bereitgestellt wird, wobei wenigstens ein Folienbeutel (50) enthaltend eine Prozessflüssigkeit in einer Stickpack-Kammer (52,54) der Kartusche (1) angeordnet ist, - in einem Öffnungsschritt die oder die jeweilige Stickpack-Kammer (52,54) auf eine Temperatur von 80 bis 130 Grad Celsius erwärmt wird, und - in dem Öffnungsschritt die Kartusche (1) mit einer Drehzahl von 20 bis 80 Hz rotiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei als Folienbeutel (50) ein Beutel aus einer Peelfolie mit einer heißgesiegelten Auftrennnaht (67) herangezogen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Stickpack-Kammer (52,54) lokal begrenzt erwärmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Volumen der Stickpack-Kammer (52,54) und das Flüssigkeitsvolumen des Folienbeutels (50) derart gewählt werden, dass das Flüssigkeitsvolumen im unverdrängten Zustand gleich oder weniger als etwa ein Viertel des Volumens der Stickpack-Kammer (52,54) beträgt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei für die Stickpack-Kammer (52,54) ein Volumen von etwa 1000 bis 1500 Mikroliter herangenzogen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Stickpack-Kammer (52,54) radial außenseitig zur Rotationsachse (40) der Kartusche (1) angeordnet ist sowie mittels eines radial außenseitig angeschlossenen Kanals (68) mit einer radial nach innen versetzt angeordneten Kammer (46,61) verbunden ist und wobei bei gleichbleibender Temperatur die Drehzahl herabgesetzt wird, um die Stickpack-Kammer (52,54) durch diesen Kanal (68) in die nachfolgende Kammer (46,61) zu entleeren.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Drehzahl auf etwa 5 bis 20 Hz, insbesondere auf etwa 10 bis 15 Hz herabgesetzt wird.
Verwendung einer Kartusche (1) in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Kartusche (1) - eine, insbesondere zumindest teilweise abgedeckte, mikrofluidische Kanal- und Kammerstruktur (4) aufweist, die zumindest eine Stickpack-Kammer (52,54) umfasst, - wenigstens einen Folienbeutel (50) aufweist, der eine Prozessflüssigkeit enthält und der in der Stickpack-Kammer (52,54) angeordnet, insbesondere fixiert, ist, und - eine flache, scheibenartige Struktur aufweist, wobei die Stickpack-Kammer (52,54) radial außenseitig zu einer Rotationsachse (40) der Kartusche (1) angeordnet ist sowie mittels eines radial außenseitig angeschlossenen Kanals (68), der eine nach radial innen gerichtete Kurve bildet, mit einer nachgeordneten Kammer (46,61) verbunden ist.
Analysegerät für die Durchführung eines Analyseprozesses, insbesondere mittels einer Polymerase-Kettenreaktion, aufweisend - eine Aufnahmevorrichtung für eine Kartusche (1), - einen Drehantrieb zur Rotation der Kartusche (1), - eine Heizvorrichtung (42) zum, insbesondere lokal begrenzten, Wärmeeintrag in die Kartusche (1), und - ein Steuergerät, das dazu eingerichtet ist, das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 durchzuführen.