JP2013208127A - マイクロ反応容器及びマイクロ反応容器を用いたポリメラーゼ連鎖反応方法 - Google Patents

Abstract

【課題】極微量試料液を用いてＰＣＲ法を行うマイクロ反応容器であって、簡易かつ有効な試料液中の水分蒸発防止を可能とするマイクロ反応容器及びその方法を提供する。
【解決手段】マイクロ流路の試料液供給部及び反応後の増幅反応生成物の排出部の両空間を、効果的に密封できる栓を有するマイクロ反応容器であって、マイクロ反応容器の中央部側から外縁部側に向かって、試料液供給部と、該試料液供給部に接続されるマイクロ流路と、及び該マイクロ流路の前記供給部とは異なる側に接続される試料液排出部とを有し、並びに前記試料液供給部及び試料液排出部の空間を塞ぐ栓を有する。該容器を使用しポリメラーゼ連鎖反応方法を行う。
【選択図】図１

Description

本発明は、各種生物学的材料の微量分析に関し、ポリメラーゼ連鎖反応による微量の生物学的試料の分離、ＤＮＡ増幅、及び検出用に使用できるマイクロ反応容器、並びに該マイクロ反応容器を用いたポリメラーゼ連鎖反応を行う方法に関する。

生物学的材料の遺伝情報を検出するために、ＤＮＡ及びＲＮＡといった核酸の分析法が近年急速に進歩している。特に、遺伝情報が書き込まれているＤＮＡを増幅する方法の中で、極微量の検体から正確な情報が得られることから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用した方法が注目を集めている。なお、以後、ポリメラーゼ連鎖反応をＰＣＲと、該反応を利用したＤＮＡ又は遺伝子増幅方法をＰＣＲ法と称する。

ＰＣＲ法は分子生物学における検体の分離、検出のみならず、医療、親子鑑定、あるいは犯罪捜査等、様々な分野や場面で重要な役割を担うようになってきている。ＰＣＲ法は、標的とする特定のＤＮＡの短い断片を選択的に増幅させる方法であり、微量な試料からでも目的領域を増幅できるという特徴を持つ。

このように有用性が注目されているＰＣＲ法の概略は、２本鎖ＤＮＡの９５℃前後での１本鎖への変性と、６０〜７０℃程度での、該１本鎖ＤＮＡとプライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチドとのアニーリングを繰り返すことによる、目的領域の増幅である。このように水の沸点近い温度での反応が繰り返されるため、従来のＰＣＲ法では、ＰＣＲチューブと呼ばれる約２００μＬの蓋つき樹脂製チューブに試料液（水溶液）を入れ、該試料液の蒸発防止のため、液の上面をミネラルオイルで覆って反応が行われている（非特許文献１）。しかし、加熱時に試料液中に微量の該オイルが混入したり、オイルだけでは水の蒸発を完全には防止できず、蒸気圧で蓋が外れたりするなどの問題があった。

また、マイクロ流路と称される、断面積が微小で細長い流路中でＰＣＲ法を行う技術も開発されている。この方法は、流路中にマイクロチャンバーあるいはマイクロウェルと呼ばれる微小の反応場を持ち、その中で反応が行われる。この方法では、マイクロチャンバーの両端をマイクロバルブで閉じて反応が行われる（非特許文献２）。しかし、チャンバーの出入り口やチャンバー自体が微小であるため、圧力制御などにはコンピュータ制御システムが必要である。

マイクロ流路及びチャンバーが従来よりさらに微小であり、また当該流路及びチャンバーを複数有することにより、極微小量の検体試料を複数条件で同時に分析、検出できるマイクロ反応容器（マイクロウェルアレイ）を本出願人らは開発し特許出願している（特許文献１）。このようなマイクロ反応容器においては、その流路及びチャンバーが極端に微小であるから前記マイクロバルブでの制御は困難であり、当該流路及びチャンバーが複数存在する場合には、当該制御はほとんど不可能に近い。したがって、前記ＰＣＲチューブの場合と同様、ミネラルオイルにより蒸発を防止せざるを得なかった。

特開２００８−１８５４２３号公報

ＰＣＲ−ＳｅｌｅｃｔＴＭ ｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｌｏｎｔｅｃｊ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、２００８年９月２４日、Ｃａｔ．Ｎｏ．６３７４０１、ＰＴ１１１７−１（ＰＲ８９２６０７）、ｐ．２２−２３ 野間慶一、松浦宏紀、富澤祐一、山村昌平、民谷栄一、高村 禅、「テーパー状マイクロ流路を用いた１細胞からの核酸解析」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒｓ、２００８年、Ｖｏｌ．２４ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａ、ｐ．１０９−１１１

しかしながら、ミネラルオイルによる蒸発防止には、前記ＰＣＲチューブの場合と同様に、加熱時に試料液中に該オイルが混入するという問題がある。さらに、試料溶液量がＰＣＲチューブを使用する場合に比較して格段に少ない本出願人らのマイクロ反応容器では、その影響はＰＣＲチューブの場合より大きく、極微量試料液中の水分の有効な蒸発防止という課題は依然として解決されていない。

そこで、本発明の目的は、極微量試料液を用いてＰＣＲ法を行うマイクロ反応容器であって、簡易かつ有効な試料液中の水分蒸発防止を可能とするマイクロ反応容器を提供することにある。さらに、該反応容器を使用することにより、試料液中の水分蒸発を防いで正確かつ効率的にポリメラーゼ連鎖反応を行う方法を提供することにある。

前記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、マイクロ流路の試料液供給部及び反応後の増幅反応生成物の排出部の両空間を、効果的に密封できる栓を有するマイクロ反応容器を開発して本発明を完成した。さらに、該容器を使用した新規なポリメラーゼ連鎖反応方法も完成させた。

すなわち、本発明の第１の発明によれば、マイクロ反応容器であって、該マイクロ反応容器の中央部側から外縁部側に向かって、試料液供給部と、該試料液供給部に接続されるマイクロ流路と、及び該マイクロ流路の前記供給部とは異なる側に接続される試料液排出部とを有し、並びに前記試料液供給部及び試料液排出部の空間を塞ぐ栓を有する、生物学的材料のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うマイクロ反応容器が提供される。

第２の発明によれば、前記試料液供給部及び前記試料液排出部の空間の容積が、前記マイクロ流路の容積より大きいマイクロ反応容器が提供される。

第３の発明によれば、前記栓が、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、天然ゴム、合成ゴム、又はセラミックスから選択される少なくとも一種の材質からなり、前記マイクロ流路内の圧力上昇によっても栓が外れることの無い耐圧性栓であるマイクロ反応容器が提供される。

第４の発明によれば、前記マイクロ反応容器は、ディスク状の形状を有し、該ディスクの中央部側から外縁部側に向かって、前記試料液供給部、前記マイクロ流路及び前記試料液排出部を有し、並びに前記マイクロ流路が渦巻状であるか、又は多数の屈曲点を有するものであることが好適である。

第５の発明によれば、前記試料液供給部、前記マイクロ流路及び前記試料液排出部が複数形成されているものであることが好適である。

第６の発明によれば、前記生物学的材料が、細菌、細胞、真菌、ウイルス、又は遺伝子であることが好適である。

第７の発明によれば、容器の中央部側から外縁部側に向かって、試料液供給部と、該試料液供給部に接続されるマイクロ流路と、及び該マイクロ流路の前記供給部とは異なる側に接続される試料液排出部とを有するマイクロ反応容器の、前記試料液供給部に、生物学的材料の試料液を供給する工程と、前記マイクロ流路中に前記試料液を移動させる工程と、前記試料液供給部及び前記試料液排出部に栓をする工程とを有する、ポリメラーゼ連鎖反応を行う方法が提供される。

第８の発明によれば、容器がディスク状の形状を有し、該ディスクの中央部側から外縁部側に向かって、前記試料液供給部、前記マイクロ流路及び前記試料液排出部を有し、並びに前記マイクロ流路が渦巻状であるか、又は多数の屈曲点を有するマイクロ反応容器を使用する、ポリメラーゼ連鎖反応を行う方法が提供される。

第９の発明によれば、前記試料液供給部、前記マイクロ流路及び前記試料液排出部が複数形成されているマイクロ反応容器を使用する、ポリメラーゼ連鎖反応を行う方法が提供される。

第１０の発明によれば、前記試料液供給部及び前記試料液排出部に栓をした後、当該栓を押圧部品で押圧する栓の脱落防止措置を施して、ポリメラーゼ連鎖反応を行うことが好適である。

第１１の発明によれば、前記マイクロ反応容器のマイクロ流路中に試料液が供給されている全ての前記試料液供給部及び前記試料液排出部に栓をし、当該栓の全てを一つの押圧部品で押圧可能な加熱制御装置を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応を行うことが好適である。

本発明によれば、ミネラルオイルを使用しないので、当該オイルの試料液中への混入が無く、ＰＣＲが阻害されずに正確かつ効率的に反応が行われるという効果を奏する。また、マイクロバルブを必要としないため、反応容器も含めたマイクロ反応装置を軽量かつ単純な構造とすることができ、かつＰＣＲ法を簡易、迅速、及び低費用で実施することができる。

本発明のマイクロ反応容器の一例を概略的に示す図である。 図１の、実線で四角に囲った部分を拡大した、本発明のマイクロ流路及びチャンバーを概略的に表す図である。 図２の、点線で四角に囲った部分を拡大した、マイクロ流路及びチャンバーをさらに拡大して概略的に表す図である。 試料液がマイクロ流路及びチャンバーに注入され、各チャンバーに生物学的材料が保持される様子を概略的に表す図である。 １本のマイクロ流路を概略的に表す図である（チャンバーは省略）。 図５に示したマイクロ流路の試料供給部と排出部に栓をした状態を概略的に表す図である。 反応例１での、ＰＣＲサイクル数と蛍光強度の関係を表すグラフ図である。 反応例２での、蛍光強度の分布をチャンバー数ごとにまとめたグラフ図である。

以下、本発明の実施の形態について、その代表的な例を詳細に説明する。本発明のマイクロ反応容器の応用目的、好ましいマイクロ反応容器の構造及び形状等、並びに本発明のＰＣＲの実施方法の特徴等について、順を追って図を参照しながら説明する。

本発明のマイクロ反応容器を用いたＰＣＲでは、極微量の生物学的材料中から、標的とする遺伝情報を持つＤＮＡ断片を増幅単離することは一つの目的である。また、他の目的として、分析検体（試料）中の生物学的材料の正確な量的分析も挙げられる。この場合、図２に示すように、マイクロ反応容器はその流路中に多数のマイクロチャンバー（マイクロウェル）を有し、試料液をこの流路中に流した際に、生物学的材料を各チャンバーに分画し、リアルタイムＰＣＲによって標的ＤＮＡを検出する。そして、生物学的材料を含有するマイクロチャンバーを計数することにより、試料溶液中の生物学的材料の数を計数する。このとき、マイクロチャンバーへの生物学的材料の分画が、ポアソン分布に従うことを利用して、元の試料液中の生物学的材料の濃度等を定量する。本発明のマイクロ反応容器の上記のような応用目的から、本発明の生物学的材料は、細菌、細胞、真菌、ウイルス、又はＤＮＡ若しくは遺伝子であることが好ましい。

マイクロ反応容器の素材としては、熱可塑性樹脂若しくは熱硬化性樹脂等の高分子材料、セラミックス、ガラス、シリコン又は金属等の任意の素材が使用できる。密閉性、微細加工性の点でガラス、シリコン、高分子材料、又はこれらの組み合わせが好ましい。高分子材料としては、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシロキサン類を使用することができる。なお、これらの素材は、マイクロ流路及びマイクロチャンバーの状況を、肉眼的又は光学的に観察するために透明であるのが好ましい。

また、該反応容器の形態としては、薄い板状であることが好ましく、当該板としては種々の形状をとることができる。例えばディスク状、三角形、四角形（例えば正方形）、正六角形、正八角形等の多角形の形状が挙げられ、特に遠心力により試料液を流路に沿って流す場合等には、ディスク状の形状が好ましい。

マイクロ反応容器は、試料液が充填されるマイクロ流路を有し、該流路はマイクロ反応容器に一つであっても、複数であってもよい。一つのマイクロ反応容器で、多数のサンプルを同時に分析したり、あるいは、希釈倍率の異なる一連の試料液を調製して分析したりすることができるので、複数の独立した流路を有することが好ましい。また、出来るだけ多くの流路を形成するために、複数の独立した流路は、対称的あるいは均等的な位置（又は配置）関係で該反応容器中に形成されるのが好ましい。

マイクロ流路中には、生物学的材料が収められるマイクロチャンバーを有することが好ましく、ポアソン分布に従った分画を可能にする点で、一つの流路に複数個のチャンバーを有することがより好ましい。なお、単に生物学的材料中から標的とする遺伝情報を持つＤＮＡ断片を増幅して単離するだけの目的であれば、流路中でＰＣＲが行われればよいので、チャンバーを有さなくてもよい。このようにチャンバーは有しても有さなくてもよいので、マイクロ流路とは、チャンバーを有さない流路のみ、及びチャンバーと流路を合わせたもの、を総称するものとする。すなわち、別途チャンバーについて言及していない場合は、この両者のいずれをも指すものとする。

ポアソン分布を活用して、生物学的材料の正確な定量的分析を行う場合は、一つのマイクロ流路中のチャンバー数は、１０個以上、好ましくは１００個以上、より好ましくは３００個以上、特に５００個以上であることが好適である。マイクロ反応容器の大きさ及び形状の実用性の面で、５０００個以下が好ましい。

マイクロ流路の一方の端には試料液を供給するための供給部が、もう一方の端には過剰な試料液又はＰＣＲ後のＤＮＡが増幅された試料液等を排出する排出部が、設けられている。１本のマイクロ流路の基本構成は、上記した一つの試料液供給部、一つの流路、１又は複数のチャンバー、及び一つの排出部からなり、供給部及び排出部のみで大気へ開放されている。すなわち、流路及びチャンバーは容器の本体内部に形成されている。ただし、単にマイクロ流路と称した場合は、前記供給部と前記排出部を除く部分を指すものとする。このことを表す簡略的な模式図を図５に示す（ただしチャンバーは省略）。好ましいマイクロ反応容器は、このような基本構成のマイクロ流路が複数、対称的あるいは均等的な位置関係で該反応容器中に形成される。例えば、上記基本構成の複数のマイクロ流路が、マイクロ反応容器に点対称の形で配置される。本発明のマイクロ反応容器の最良の形態の一つを図１に示す。

ポアソン分布で生物学的材料を分画する点において、上記したように一つのマイクロ流路中に多数のマイクロチャンバーが存在することが好ましいため、流路はある程度の長さを確保することが必要である。したがって、図１のようにいわゆるジグザグの多数の屈曲点を持つ流路、あるいは渦巻き状になっている流路であることが好ましい。

上記してきた本発明のマイクロ反応容器の製造方法として、例えば次のような方法を挙げることができる。例えば、流路とチャンバーのパターンを有する前記材質のシート又はプレートと、試料液の供給部及び排出部を有する平坦なシート又はプレートとを貼り合わせることにより製造することができる。また、該供給部及び排出部は、流路とチャンバーのパターンを有するシート又はプレートに形成されていてもよい。あるいは、流路、チャンバー、供給部、及び排出部のパターンが、２枚のシート又はプレートに分割して作成されたもの（例えば略面対称の形）を、貼り合わせてマイクロ反応容器を製造してもよい。光学的な観察及び解析に適する点で、該マイクロ反応容器の厚さは１ｍｍ〜３ｍｍが好ましい。

これらの流路とチャンバー等のパターンを有するシートは、金型でプレスしたり、金型に熱可塑性樹脂等の流動性の素材を流し込むことで形成してもよく、厚膜のリソグラフィーにより凸型のパターンを形成し、該パターン上に熱可塑性樹脂等の流動性の素材を流し込んで形成してもよく、シート又はプレートに直接、機械加工やフォトリソグラフィーを用いたエッチングにより形成してもよい。

本発明の流路の幅及び深さは、どちらも１０〜２００μｍである。あるいは、流路の断面が円形である場合は、その直径が１０〜２００μｍである。また、その長さは、１０ｍｍ〜１０００ｍｍであり、実用的には５０ｍｍ〜５００ｍｍである。

本発明のチャンバーは、その縦、横、及び高さ、又は直径が、前記流路の幅及び深さ、又は直径の１．３〜３倍程度が好ましい。一つのチャンバーの容積としては、本発明の生物学的材料を扱う点で、５０ｐＬ〜１０ｎＬが好ましい。該チャンバーが、流路に沿って等間隔に略数珠状に形成されている。その例を図２及び３に示す。図３は図２の拡大図である。

本発明の流路及びチャンバーのサイズが上記の通りであるので、１本のマイクロ流路における、試料供給部及び試料排出部の容積を含まない、流路とチャンバー部のみの容積は、０．５ｎＬ〜５μＬである。分析の定量性を高める点では、１．５ｎＬ以上であることが好ましく、極微量試料の分析に有効であるという本発明の応用目的の点で、２μＬ以下が好ましい。

多数のサンプルを同時に分析したり、あるいは、希釈倍率の異なる一連の試料液を調製して分析したりするという、本発明のマイクロ反応容器の利点を生かす点で、前記マイクロ流路は、一つのマイクロ反応容器に４〜１００本形成されることが好ましい。マイクロ反応容器の大きさ及び形状の実用性の面で、８〜６０本がさらに好ましい。

以上のようにして形成されたマイクロ流路中に、増幅すべきＤＮＡを含む生物学的材料、及びＰＣＲ法に必要なＤＮＡポリメラーゼ等の反応試薬を含む試料液を、試料液供給部から供給する。供給方法としては、マイクロシリンジ又はマイクロピペット等を使用するのが一般的である。なお、試料液の供給のし易さの点で、該供給部の開口部の上面部の面積は０．５〜３ｍｍ^２が好ましい。また、排出部の面積も同程度である。

したがって、試料液供給部及び排出部の容積は、各々０．３μＬ〜７μＬ程度となり、場合によっては、前記「流路とチャンバー部のみの容積」より大きいものとなる。

試料液供給部から注入された試料液は、流路及びチャンバーに導入される。このとき、試料液の該導入には毛細管力、遠心力、又は重力等を用いることができ、好ましくは、遠心力が用いられる。遠心力としては、例えば５００〜７，０００ｒｐｍで、１秒間〜３分間行えば、流路及びチャンバーを試料液で満たすことができる。このように、遠心力を用いて流路及びチャンバーに試料液を充填する場合は、マイクロ反応容器の中央部側に試料液供給部が配置され、外縁部側に排出部が配置されるのが好ましい。

本発明において、１個の流路に形成されたチャンバーの１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に９０％以上が生物学的材料を含有する試料液で満たされるように、試料液を供給するのが望ましい。ポアソン分布に基づき、分析の正確性を期する上においては、試料液が満たされる割合は高いほうが好ましい。

次に、本発明におけるＰＣＲ法の概略手順及び特徴点を図１及び３に基づいて説明する。図1に、本発明で使用する多数のマイクロ流路を形成したマイクロ反応容器1が示されている。このコンパクトディスク（ＣＤ）型マイクロ反応容器1の中央部に、生物学的材料を含有する試料液を注入するための試料液供給部５が形成され、該供給部５に接続される流路３、及び流路中に存在する多数のチャンバー４（図３に示す）、並びに該流路の前記供給部とは異なる側（外縁部側）に接続される排出部６が形成されている。供給部５からマイクロシリンジ等により試料液を注入して、流路３及びチャンバー４に導入する。

チャンバー４は、試料液が流路を流れるときに、該試料液で満たされるように形成される。１個のチャンバーの容積は、５０ｐＬ〜１０ｎＬと極微小であるため、生物学的材料を含有する試料液を十分に希釈しておけば、１個のチャンバーに０又は１個の生物学的材料が保持されるようにすることができる。ただし、極わずかに２個以上生物学的材料が１個のチャンバーに保持されることもある。

試料液を流路３等に導入後、供給部５及び排出部６の空間を栓によって塞ぎ（図６）、ＰＣＲ中の試料液の蒸発を防止する。従来は、栓ではなくミネラルオイルで供給部５及び排出部６を満たして蒸発を防いでいたが、上記した通り、試料液中にミネラルオイルが小量混入し、また、蒸発防止効果も不十分であったため、ＰＣＲにおいて不具合が発生することがあった。

本発明においては、図６に示したように、供給部５及び排出部６の空間を栓７によって塞ぎ、ＰＣＲ中の圧力上昇によっても当該栓が外れないため、ＰＣＲが良好に進行する。当該栓７の材質は、試料液に溶解あるいは浸食等されなければ、特に限定されないが、密閉性の点で、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、天然ゴム、合成ゴム、又はセラミックスであることが好ましい。密閉性と耐圧性の両立の点で、弾性を有する熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、天然ゴム若しくは合成ゴム、又は少なくとも１０℃〜５０℃において塑性変形可能な高分子材料が好ましい。

上記した通り、本発明のマイクロ反応容器においては、供給部５及び排出部６の容積が、流路３とチャンバー４を合わせた容積と同等またはそれより大きい場合がある。これは、極微量の試料液でＰＣＲを可能とする本発明の応用目的と、試料注入の容易性を両立させるために、必要であるともいえる。このような場合に、供給部５及び排出部６の大気に解放されている上面付近のみを塞ぐだけでは、ＰＣＲによる圧力上昇によって、流路３及びチャンバー４に存在する試料液が、供給部５及び排出部６に押し出されてしまうという不具合が発生する。したがって、供給部５及び排出部６の空間をほぼ完全に栓で塞ぐことが好ましく、この目的のために、形状に合わせて塑性変形し、かつ粘着性を有する高分子材料、例えばオレフィン系合成ゴムが栓の材質としてより好ましい。なお、高分子材料であるので、完全な塑性ではなく、わずかに弾性を有するものであってもよい。

以上のようにして、マイクロ反応容器１の全ての流路３及びチャンバー４に試料液を充填し、栓７をした後、サーマルサイクラー等の加熱制御装置によりＰＣＲの反応を行う。このとき、押圧部品により前記栓を上から押圧し、栓７が確実に脱落しないようにして該反応を行うことが、ＰＣＲの正確性を期す上で好ましい。マイクロ反応容器の加熱制御装置への設置の簡便さの点で、マイクロ反応容器に取り付けた全ての栓を、一つの押圧部品で押圧可能である加熱制御装置によりＰＣＲを行うことがより好ましい。

ＰＣＲが確実に進行していることの確認は、試料液の蛍光強度の変化を測定することにより行い、具体的には、リアルタイムＰＣＲによって、熱サイクル数の違いによる蛍光強度の変化を追跡して増幅反応の進行を確認することができる。

＜実施形態＞
以下、好適な実施形態について図面に基づきさらに詳しく説明する。

マイクロ反応容器の作製
シリコン基板製のマイクロ反応容器を、深掘り反応性イオンエッチング（Ｄｅｅｐ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ：Ｄｅｅｐ−ＲＩＥ）を用いて、シリコンウェハーを掘ることで作製した。まず、フォトレジストであるＯＦＰＲ−８００をシリコンウェハーに均一に塗り広げ、ホットプレート上で９０℃で３分間プレベークした。マスクアライナーを使って流路パターンをマスクとして３５０ｎｍのＵＶを３０秒間照射し、レジストパターンを形成した。これをデベロッパーであるＮＭＤ−３液中で１分１５秒間現像し、さらに超純水で２回洗浄した。さらに、１２０℃で３分間ポストベークした。これをＤｅｅｐ−ＲＩＥの装置に入れ、シリコンウェハーに流路を掘るエッチングを行なった。最後に、アセトンでＯＦＰＲ−８００を洗浄除去し、該シリコンウェハーと、供給部、排出部及びベント部分に穴を開けたガラス板とを陽極接合によって張り合わせ、試料液供給部と排出部のみが大気に解放されている閉じた流路構造を有する、マイクロ反応容器を作製した（図１）。

図１に示す作製したマイクロ反応容器は、直径１０ｃｍ、厚さ１ｍｍのディスク上に、２４本の幅１００μｍ、深さ４６μｍの流路が、ディスクの中央部から外縁部へ向けてジグザグに形成されている。各流路には、幅３００μｍ、長さ２００μｍのマイクロチャンバーを、図２及び３に示したように房状に、２００μｍ程度の間隔で連続的に配置させた。各流路の両端には、直径１ｍｍの試料液供給部５及び排出部６を設けている。また、各供給部及び排出部を塞ぐ栓として、粘着力を有するポリブチレン系合成ゴムを作成した。当該栓は、例えば市販の「プリットひっつき虫（コクヨ株式会社製）」に類似する性質を有する。

＜ＰＣＲの反応例１＞
遺伝子試料液の調製及びマイクロ反応容器への注入
本反応例では、ＰＣＲ試薬にサルモネラ菌固有遺伝子であるｉｎｖＡを検出するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を使用した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔのＰＣＲ試薬を、２×Ｃｙｃｌｅａｖｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘｔｕｒｅ １５μＬ、ＳＩＮ Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘ ６μＬ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）３μＬ、及び遺伝子試料としてＰｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｉｎｖＡ溶液）６μＬを混合して試料液（３０μＬ）を調製した。当該試料液を、試料供給部５から流路及びチャンバー内に１．５μＬずつ注入し、図１の１８本のマイクロ流路を当該試料液で満たした。また、ネガティブコントロールとしてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔのＰＣＲ試薬を、２×Ｃｙｃｌｅａｖｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘｔｕｒｅ ５μＬ、ＳＩＮ Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘ ２μＬ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１μＬ、及び遺伝子試料の代わりに純水２μＬを混合してコントロール試料液（１０μＬ）を調製した。これを図１の別の６本のマイクロ流路及びチャンバー内に１．５μＬずつ注入し、マイクロ流路を当該コントロール試料液で満たした。なお、マイクロ流路1本を満たす液量は１．５μＬであり、２４本のマイクロ流路全てを満たす試料液の量は３６μＬであった。試料液充填後、全ての供給部５及び排出部６を、供給部及び排出部の空間の形状に合わせて塑性変形し、粘着力を有するポリブチレン系合成ゴムにより栓をした。

ＰＣＲ
上記の通り、図１の全てのマイクロ流路を、試料液（サルモネラ菌のｉｎｖＡ遺伝子入りのＰＣＲ試薬）で満たして栓をした後、一つの押圧部品で全ての栓を押圧できる加熱制御装置（サーマルサイクラー）を使用してＰＣＲを行った。反応条件は以下の通りである。まず９５℃で２分間の溶菌後、９５℃で５秒間、５５℃で１０秒間、７２℃で１０秒間のＰＣＲサイクルを、サイクル数を変えて実験を行った。ここで、加熱制御装置は、株式会社アステック製のＰＣ−８１６を使用した。反応は、リアルタイムで蛍光強度を測定することにより追跡した。蛍光強度測定は、励起光波長４６０ｎｍの落射光源で励起し、 蛍光波長５１０ｎｍを検出する５１０ＤＦ１０フィルタを使用して行った。蛍光強度の測定には、富士フィルム株式会社製イメージングアナライザーＬＡＳ−３０００を使用した。

反応結果の確認
その結果、２０サイクルでは蛍光強度は５００、４０サイクルでは２５００となり、サイクル数の増加により、蛍光強度も増加していることから、ＰＣＲによる遺伝子増幅が行われていることが確認できた（図７）。また、４０サイクルの熱サイクル後も、液体が蒸発することなく、蛍光強度も十分な増加が認められた。

＜ＰＣＲの反応例２＞
菌体試料液の調製及びマイクロ反応容器への注入
サルモネラ菌の遺伝子だけでなく、サルモネラ菌そのものを検出するため、試料としてサルモネラ菌懸濁液を使用し、これを図３のマイクロ流路で、チャンバーに分離して１個又は２個の菌体が入るチャンバーがあるような条件で分離をしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ試薬は反応例１と同じものを用い、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔのＰＣＲ試薬を、２×Ｃｙｃｌｅａｖｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘｔｕｒｅ ５μＬ、ＳＩＮ Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘ ２μＬ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｒ−ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１μＬ、及び遺伝子試料の代わりにサルモネラ菌の菌体懸濁液２μＬを混合して試料液（１０μＬ）を調製した。試料液の終濃度を４００ｃｅｌｌ／μＬのサルモネラ菌が含まれるようにした。試料液を図１の２０本の流路に０．５μＬずつ注入してマイクロ流路に流し、チャンバー内で分離した。他の４本の流路には、反応例１と同様に純水で調製したコントロール試料液を流した。生物学的材料（サルモネラ菌）が１単位ずつチャンバーに分配保持される様子を図４に示す。分離された状態では、菌体を含む試料液はチャンバーごとに分離されており、1チャンバーの溶液量は約１．５ｎＬである。

ＰＣＲ
反応例１と同様にして栓をした後、反応例１と同じ加熱制御装置により、９５℃で２分間の溶菌後、９５℃で５秒間、５５℃で１０秒間、７２℃で１０秒間のＰＣＲサイクルを、４０サイクル行った。蛍光強度の測定も反応例１と同様にして行った。

反応結果の確認
反応結果について、６０チャンバーの蛍光強度を確認し、その蛍光強度の分布をチャンバー数ごとにまとめた（図８）。この図において蛍光強度２５００〜２７５０のチャンバーはサルモネラ菌が1個入っていたチャンバー、２７５０〜３０００は菌が２個入っていたチャンバー、３０００〜３２５０は菌が３個入っていたチャンバーである。なお２１００〜２５００のチャンバーは菌体が入っていなかったチャンバーである。また、この菌体濃度のときの分離に関するポアソン分布を、表１に示した。これらの結果から、試料液が極微量であっても、試料液が蒸発したり、チャンバー毎に分かれたサルモネラ菌が混合したりすることなく、単細胞からのＰＣＲによる遺伝子増幅が可能である事が確認された。また、遺伝子量は細胞数に依存しているため、ＰＣＲによる遺伝子増幅もそれに比例して行われたことが確認された。

食品中の菌検査の公定法では、数日の時間を必要とするが、本発明の方法によれば、細菌数の迅速な定量が可能である。食品以外にも医療分野での血液等の感染症診断、さらには犯罪捜査及びバイオテロを含む環境評価への応用も可能である。

１ マイクロ反応容器
２ マイクロ反応容器の基板
３ 流路
４ チャンバー
５ 試料液供給部
６ ＰＣＲ後の試料液排出部
７ 栓
８ 生物学的材料の１単位

本発明によれば、円板状のマイクロ反応容器を用いて生物学的材料のポリメラーゼ連鎖反応を行う方法であって、
前記マイクロ反応容器は、第１の部材と、当該第１の部材と平行に対向して配置された第２の部材とを有し、前記第１の部材と前記第２の部材との間に、当該円板状のマイクロ反応容器の中央部側から外縁部側に向かって、ジグザグした形状のマイクロ流路が形成され、当該マイクロ反応容器の中央部側の前記第２の部材に、前記マイクロ流路の入り口に試料を供給する、試料供給孔が形成され、当該マイクロ反応容器の外縁部側の前記第２の部材に、前記マイクロ流路の排出部から試料を排出させる、試料排出孔が形成されており、
当該ポリメラーゼ連鎖反応を行う方法は、
前記試料供給孔から前記マイクロ流路に生物学的材料の試料を供給する工程と、
前記マイクロ流路中に前記試料を移動させる工程と、
前記第２の部材に形成された前記試料供給孔および前記試料排出孔を塞ぎ、前記第１の部材まで到達する、第１の栓および第２の栓をする工程と、
ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程と、
を有する、方法が提供される。

好ましくは、前記第１および第２の栓は、それぞれ、前記試料供給孔および前記試料排出孔を塞ぐ時、前記試料供給孔および前記試料排出孔の形状に合わせて塑性変形し、粘着性を有する材料で形成されている。

好ましくは、前記第１および第２の栓がそれぞれ、熱可塑性樹脂からなる。

好ましくは、前記生物学的材料が、細菌、細胞、真菌、ウイルス、又はＤＮＡ若しくは遺伝子である。

また本発明によれば、生物学的材料のポリメラーゼ連鎖反応を行う方法に用いるマイクロ反応容器であって、当該マイクロ反応容器は、
第１の部材と、当該第１の部材と平行に対向して配置された第２の部材とを有し、
前記第１の部材と前記第２の部材との間に、当該円板状のマイクロ反応容器の中央部側から外縁部側に向かって、ジグザグした形状のマイクロ流路が形成され、
当該マイクロ反応容器の中央部側の前記第２の部材に、前記マイクロ流路の入り口に試料を供給する、試料供給孔が形成され、
当該マイクロ反応容器の外縁部側の前記第２の部材に、前記マイクロ流路の排出部から試料を排出させる、試料排出孔が形成されており、
前記試料供給孔から前記マイクロ流路に生物学的材料の試料を供給し、前記マイクロ流路中に前記試料を移動させた後、前記第２の部材に形成された前記試料供給孔および前記試料排出孔を塞ぎ、前記第１の部材まで到達する、第１の栓および第２の栓を有する、
マイクロ反応容器が提供される。

好ましくは、前記第１および第２の栓はそれぞれ、前記試料供給孔および前記試料排出孔を塞ぐ時、前記試料供給孔および前記試料排出孔の形状に合わせて塑性変形し、粘着性を有する材料で形成されている。

好ましくは、前記第１および第２の栓はそれぞれ、前記試料供給孔および前記試料排出孔を塞ぐ時、前記試料供給孔および前記試料排出孔の形状に合わせて塑性変形し、粘着性を有する材料で形成されている。

好ましくは、前記第１および第２の栓がそれぞれ、熱可塑性樹脂からなる。

Claims (11)

1. マイクロ反応容器であって、該マイクロ反応容器の中央部側から外縁部側に向かって、試料液供給部と、該試料液供給部に接続されるマイクロ流路と、及び該マイクロ流路の前記供給部とは異なる側に接続される試料液排出部とを有し、並びに前記試料液供給部及び試料液排出部の空間を塞ぐ栓を有する、生物学的材料のポリメラーゼ連鎖反応を行うマイクロ反応容器。
2. 前記試料液供給部及び前記試料液排出部の空間の容積が、前記マイクロ流路の容積より大きい、請求項1に記載のマイクロ反応容器。
3. 前記栓が、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、天然ゴム、合成ゴム、又はセラミックスから選択される少なくとも一種の材質からなり、前記マイクロ流路内の圧力上昇によっても栓が外れることの無い耐圧性栓である、請求項1又は２に記載のマイクロ反応容器。
4. 前記マイクロ反応容器は、ディスク状の形状を有し、該ディスクの中央部側から外縁部側に向かって、前記試料液供給部、前記マイクロ流路及び前記試料液排出部を有し、並びに前記流路が渦巻状であるか、又は多数の屈曲点を有する、請求項１〜３いずれか一項に記載のマイクロ反応容器。
5. 前記試料液供給部、前記マイクロ流路及び前記試料液排出部が複数形成されている、請求項１〜４いずれか一項に記載のマイクロ反応容器。
6. 前記生物学的材料が、細菌、細胞、真菌、ウイルス、又はＤＮＡ若しくは遺伝子である、請求項１〜５いずれか一項に記載のマイクロ反応容器。
7. 容器の中央部側から外縁部側に向かって、試料液供給部と、該試料液供給部に接続されるマイクロ流路と、及び該マイクロ流路の前記供給部とは異なる側に接続される試料液排出部とを有するマイクロ反応容器の、前記試料液供給部に、生物学的材料の試料液を供給する工程と、
   前記マイクロ流路中に前記試料液を移動させる工程と、
   前記試料液供給部及び前記試料液排出部に栓をする工程とを有する、
   ポリメラーゼ連鎖反応を行う方法。
8. 容器がディスク状の形状を有し、該ディスクの中央部側から外縁部側に向かって、前記試料液供給部、前記マイクロ流路及び前記試料液排出部を有し、並びに前記マイクロ流路が渦巻状であるか、又は多数の屈曲点を有するマイクロ反応容器を使用する、
   請求項７に記載のポリメラーゼ連鎖反応を行う方法。
9. 前記試料液供給部、前記マイクロ流路及び前記試料液排出部が複数形成されているマイクロ反応容器を使用する、
   請求項７又は８に記載のポリメラーゼ連鎖反応を行う方法。
10. 前記試料液供給部及び前記試料液排出部に栓をした後、当該栓を押圧部品で押圧して栓の脱落を防止する、請求項７〜９いずれか一項に記載のポリメラーゼ連鎖反応を行う方法。
11. 前記マイクロ反応容器のマイクロ流路中に試料液が供給されている全ての前記試料液供給部及び前記試料液排出部に栓をし、当該栓の全てを一つの押圧部品で押圧可能な加熱制御装置を使用して反応を行う、
    請求項７〜９いずれか一項に記載のポリメラーゼ連鎖反応を行う方法。

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