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Technisches Gebiet
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Die
Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zur
Ausführung mehrerer paralleler Polymerase-Ketten-Reaktionen
(Polymerase chain reaction, PCR) im Durchflussverfahren, sowie auf
Verwendungen derselben.
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Stand der Technik
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Bei
der Ausführung von PCR-Reaktionen, beispielsweise zur biochemischen
Analytik, ist es zunächst wünschenswert diese
in kostengünstigen Durchflusseinrichtungen zu realisieren
und zu automatisieren. Dabei ist es insbesondere erforderlich, Proben
auf Reaktionsräume aufzuteilen und mit unterschiedlichen
Reagenzien kontrolliert zusammenzuführen. Des Weiteren
ist es wünschenswert, die zeitaufwendigen PCR-Reaktionen
zu beschleunigen.
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Bisher
werden unterschiedliche PCR-Reaktionen, wenn sie sich gegenseitig
negativ beeinflussen, in getrennten Gefäßen durchgeführt
oder es werden jeweils separate mikrofluidische Einrichtungen verwendet.
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Die
Realisierung mehrfacher unterschiedlicher PCR-Reaktionen mit der
gleichen Probe erfordert mit herkömmlicher Technik besondere
apparative Aufwendungen und schränkt somit Automatisierungsmöglichkeiten
stark ein.
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Die
PCR zur Vervielfältigung eines Sequenzabschnittes von Nukleinsäuren
ist ein eingeführtes Standardverfahren der Molekularbiologie
und u. a. beschrieben in
US 4
683 195 .
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Die
Amplifizierung mehrerer Sequenzabschnitte von Nukleinsäuren
einer Probe werden standardmäßig als so genannte
Multiplex-PCR bezeichnet. Damit können mehrere verschiedene
Nukleinsäuresequenzen oder Zielsequenzen gleichzeitig in einem
Reaktionsgefäß oder Reaktionsraum amplifiziert
werden. Nicht selten kommt es dabei zu unerwünschten Konkurrenzreaktionen
der verwendeten Primer oder gegenseitigen Beeinflussungen.
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Für
die PCR-Reaktion, also der Amplifizierung bestimmter Abschnitte
von Nukleinsäuren, wird nach Standardverfahren die nukleinsäurehaltige
Probe zusammen mit dem so genannten Mastermix und Reagenzien wiederholten
Temperaturzyklen unterworfen. Der Mastermix und bestimmte Zusätze,
hier Reagenzien genannt, bestehen aus einem Gemisch von Nukleotiden,
Primern, Ionen sowie einer thermostabilen DNA-Polymerase in geeigneten
Pufferlösungen. Nach jeweils einer Temperatursequenz, beispielsweise
in den Schritten 94°C (Denaturierung der DNA-Stränge),
55°C (Primer-Annealing), 72°C (Elongation) hat
sich die Zahl der zu amplifizierenden DNA-Abschnitte (Zielsequenzen)
verdoppelt. Mit üblichen Laborgeräten erfordern
40 solcher Zyklen in der Regel mehr als eine Stunde Zeit.
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Mit
der so genannten Multiplex-PCR ist eine gleichzeitige Bestimmung
mehrerer verschiedener Zielabschnitte in einer Probe möglich.
Dabei kommt es häufig zu einer gegenseitigen negativen
Beeinflussung der unterschiedlichen PCR-Reaktionen und Mastermixes.
In solchem Falle wird eine Separierung der unterschiedlichen PCR-Reaktionen
notwendig.
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Die
Ausführung von PCR-Reaktionen mit Durchflussverfahren ist
derzeit auf die Erprobung zahlreicher Lösungsansätze
ausgerichtet. Im Stand der Technik wird die Durchfluss-PCR in mikrofluidischen
Vorrichtungen in Form unterschiedlicher Durchflusszellen, Kartuschen
(auch Cartridges genannt) beschrieben.
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In
einer Übersicht beschreiben und bewerten I. Schneegaß und
Köhler, J. M., Flow-through PCR in chip thermocyclers.
Reviews in Molecular Biotechnology, 2001, 82(2): p. 101–121,
die sogenannten stationären Chipthermocycler und die Durchfluss-Chipthermocycler.
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Stationäre
Chipthermocycler benutzen Kammern aus Silizium, Glas oder Polymeren,
die im Durchfluss befüllt und nach PCR entleert werden.
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Durchfluss-Chipthermocycler
realisieren die PCR mittels kontinuierlichen Flusses der zu amplifizierenden
Probe durch verschiedene Temperaturzonen.
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Eine
typische Ausführung sind Silizium-Kammer-Chipthermocycler
mit integrierter Heizung, die zu stationären Oberflächen-Chipthermocycler
weiterentwickelt wurden und bei denen die PCR-Reaktionen auf planaren
Chipoberflächen mit integrierter Heizung in einer Durchflusskammer
ablaufen (I. Schneegaß et al., Miniaturized flow-through
PCR with different template types in a silicon chip thermocycler.
Lab an a Chip, 2001. 1(1): p.42–49.).
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Eine
spezielle Ausführung dieser Methode beschreiben L.
C. Waters et al., Microchip Device for Cell Lysis, Multiplex PCR
Amplification, and Electrophoretic Sizing. Anal. Chem., 1998. 70(1):
p. 158–162, indem sie eine ganze Kartusche für
die Elektrophorese mit der PCR-Probe in einer separierten Kammer
in einem konventionellen Thermocycler amplifizieren.
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In
WO 2007147712 wird in
einer Kammer einer Kartusche nach dem stationären Prinzip
eine PCR mit externer Temperatursteuerung und Quetschverschluss
der Zuflusskanäle beschrieben. Die Heizung der PCR-Kammer
wird durch eine externe Wärmequelle realisiert, ohne dass
besondere Maßnahmen zur Beschleunigung des Temperaturübergangs
beschrieben sind.
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In
einer speziellen Ausführung der stationären Durchflussmethode
wird die PCR-Kammer mit integrierter Heizung in Form eines Probengefäßes
auf eine Kartusche für die Kapillarelektrophorese aufgesetzt
(A. T. Wooley et al., Functional integration of PCR amplification
and capillary electrophoresis in a microfabricated DNA analysis
device. Anal. Chem. 1996; 68: 4081).
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Verschiedene
Durchfluss-Chipthermocycler realisieren die PCR durch das Verbringen
der zu amplifizierenden Probe in verschiedene Temperaturzonen. Im
einfachsten Falle wird dazu ein kapillarförmiger Schlauch
durch Wasserbäder mit den unterschiedlichen PCR-Temperaturen
im Kreis geführt und das PCR-Produkt nach entsprechender
Amplifikation entnommen (M. Curcio und Roeraade, J., Continuous
segmented-flow polymerase chain reaction for high-throughput miniaturized
DNA amplification. Anal Chem, 2003. 75(1): p. 1–7).
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Bei
einem Glas-Silizium-Durchfluss-Chipthermocycler wird ein mäanderförmiger
Kanal 25 mal über verschiedene PCR-adequate Temperaturzonen geführt
und auf diese Weise die Probe mit 25 PCR-Zyklen amplifiziert (I.
Schneegaß et al., Miniaturized flow-through PCR with different
template types in a silicon chip thermocycler. Lab an a Chip, 2001. 1(1):
p, 42–49).
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Eine
weitere Variante der Durchfluss-PCR beschreiben G. Munchow,
et al. in Automated chipbased device for simple and fast nucleic
acid amplification. Expert Review of Molecular Diagnostics, 2005,
5(4): p. 613–620, wobei eine Probe in einer Kapillare
in sequentielle Zonen verschiedener Temperatur entsprechend den
PCR-Zyklen hydraulisch verbracht wird.
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Eine
als Array-PCR bezeichnete Anordnung von 10 unabhängig nebeneinander
angeordneten Silizium-Reaktoren mit integrierter Heizung und integrierter
optischer Detektion geben P. Belgrader et al. Rapid pathogen
detection using a microchip PCR array instrument, Clinical Chemistry
44: 10 2191–2194 (1998) an und beschreiben dessen
Anwendung in einer simultanen PCR. Die Reaktoren werden nicht im Durchfluss
betrieben.
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Keine
der bisher beschrieben Durchflusslösungen benutzt parallele
PCR-Reaktionsräume oder Vorrichtungen um eine singuläre
Probe unabhängigen PCR-Reaktionen zu unterziehen.
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Allen
beschriebenen Durchfluss-Lösungen nach der stationären
Methode ist gemeinsam, dass keine Vorkehrungen getroffen wurden,
um die erforderlichen langen PCR-Reaktionszeiten, die durch die Zeiten
zur Aufheizung und Abkühlung der PCR-Reaktionsräume
bedingt sind besonders zu verkürzen.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es einen oder mehrere Nachteile des
Standes der Technik zu vermindern oder zu überwinden. Insbesondere
ist es Aufgabe der Erfindung, eine kostengünstige und einfach
herzustellende Vorrichtung für die Durchfluss-PCR bereitzustellen
und neue und verbesserte Verfahren insbesondere für die
Durchführung komplexer PCR-Reaktionen zu schaffen.
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Erfindungsgemäße Lösung
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Die
Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellen einer Vorrichtung
zur Ausführung mehrerer paralleler PCR-Reaktionen im Durchflussverfahren,
umfassend:
- 1) einen Träger, der
a)
mindestens eine Einlassöffnung,
b) mindestens eine
Auslassöffnung;
c) mindestens zwei Reaktionsräume,
d)
Verbindungskanäle, die einen Flüssigkeitsstrom
von einer Einlassöffnung über mindestens einen
Reaktionsraum hin zu einer Auslassöffnung erlauben, und
e)
Ventile an Einlass- und Auslassöffnungen, die unabhängig
voneinander verschließbar sind und die derart angebracht
sind, dass ein Flüssigkeitsstrom im Träger von
einer Einlassöffnung zu einer Auslassöffnung geregelt
werden kann, wobei die Ventile jeweils einen Ventilsitz aufweisen,
der derart in den Träger als Vertiefung eingelassen ist, dass
sich der Ventilsitz an einer von außen zugänglichen
Oberfläche des Trägers befindet und der Ventilsitz
eine Form aufweist, in die ein formentsprechender externer Aktuator
im Wesentlichen passgenau einsetzbar ist,
aufweist; und
- 2) eine elastische Folie, die mindestens einen Teil der Oberfläche
des Trägers bedeckt und einen Ventilsitz eines Ventils
e) derart überdeckt, so dass zwischen Folie und Träger
ein Hohlraum entsteht und die elastische Folie, durch mechanisches
Einpressen der Folie über einem Ventilsitz durch einen
dem Ventilsitz formentsprechenden, externen Aktuator, einer Oberfläche
des Ventilsitzes anlagerbar ist und dadurch ein Ventil e) verschließbar
ist.
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Die
beschriebene Vorrichtung ist insbesondere geeignet, Proben in der
gleichen Vorrichtung auf verschiedene PCR-Reaktionsräume
zu verteilen, die notwendigen spezifischen Reagenzien hinzuzufügen und
nach paralleler Amplifizierung die Produkte wieder zu kombinieren
oder getrennt zu verwerten.
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Insbesondere
werden folgende Verbesserungen realisiert:
- – die
Vorrichtung mit mehreren Reaktionsräumen (Kavitäten)
für die PCR ist einfach und kostengünstig herstellbar;
- – das Aufteilen einer analytischen Probe auf verschiedene
Reaktionsräume und die Zugabe der jeweils spezifischen
Reagenzien ist realisiert;
- – die PCR-Reaktionen in den unterschiedlichen Reaktionsräumen
beeinflussen sich nicht gegenseitig;
- – die erfindungsgemäße Vorrichtung
erlaubt ein rasches Aufheizen und Abkühlen der PCR-Reaktionsräume;
- – die erfindungsgemäße Vorrichtung
kann durch kostengünstige, industriell erprobte und volumenfähige
Verfahren hergestellt werden;
- – in der erfindungsgemäßen Vorrichtung
werden keine mechanisch bewegten Teile eingesetzt;
- – die erfindungsgemäße Vorrichtung
ist austauschbar.
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Für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe „Träger” und „Trägerelement” austauschbar
verwendet.
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Einer
erfindungsgemäßen Vorrichtung kann über
mindestens eine Einlassöffnung den mindestens zwei Reaktionsräumen
eine Probenflüssigkeit zugeführt werden. In den
beiden Reaktionsräumen können nun, unter Verwendung
des gleichen Probenmaterials und innerhalb ein und derselben Vorrichtung
zwei unterschiedliche PCR-Reaktionen durchgeführt werden.
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Dazu
sind in ein oder mehreren Reaktionsräume einer Vorrichtung
ein oder mehrere unterschiedliche Reagenzien und Pufferbestandteile
eingebracht. So können beispielsweise in einem ersten Reaktionsraum
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung Primer für
ein Amplifikat A und in einem zweiten Reaktionsraum derselben Vorrichtung
Primer für ein Amplifikat B vorgelegt sein. Wird eine solche
Vorrichtung nun mit einer Probenlösung, die alle weiteren notwendigen
Bestandteile für eine PCR-Reaktion, wie z. B. Pufferbestandteile,
enthält, beladen, so ergibt sich im ersten Reaktionsraum
ein Ansatz, der zur Amplifikation eines Teiles der in der Probe
vorhandenen DNA führt, das Amplifikat A, während
in Reaktionsraum zwei ein Ansatz entsteht, der zur Amplifikation
eines anderen Teiles der in der Probe vorhandenen DNA führt,
das Amplifikat B. Unter Verwendung einer einzigen Probenlösung
können so in einer einzigen Vorrichtung mehrere parallele
PCR-Reaktionen durchgeführt werden. Dies ist besonders
dann vorteilhaft, wenn Amplifikate erzeugt werden sollen und ggf.
deren Häufigkeit in einer Probe ins Verhältnis
gesetzt werden sollen, die notwendigen Amplifikationsparameter für
die beiden Amplifikate sich aber gegenseitig beeinflussen. in der
modernen Molekularbiologie werden häufig Genexpressionsstärken normiert
auf ein unverändertes Gen bestimmt, bevorzugt als differentielle
Genexpressionsanalysen als Multiplex-PCR mit internem Standard.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt nun,
solche Multiplex-PCR-Reaktionen durchzuführen, ohne dass
einzelne Probenansätze hergestellt werden müssen
und ohne dass sich die beiden Amplifikate gegenseitig beeinflussen
können.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung weist einen Träger
auf. Dieser Träger kann grundsätzlich aus jedem
Material bestehen in welchem eine oder mehrere Einlassöffnungen,
eine oder mehrere Auslassöffnungen, mindestens zwei Reaktionsräume,
Verbindungskanäle und verschließbare Ventile darstellbar
sind. Bevorzugt weist der Träger ein Material auf, welches
ausgewählt ist aus Silizium, Siliziumverbindungen, Glas,
Keramik, Metall, Papier, einem oder mehreren Polymeren oder Kombinationen
davon. Insbesondere werden Materialien verwendet, die Temperaturen,
die üblicherweise während eines PCR-Temperaturzyklus
vorkommen, widerstehen können.
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Dem
Fachmann sind Verfahren zur Herstellung eines solchen Trägers
bekannt. Bestimmte Materialien können sich besonders für
bevorzugte Verfahren zur Herstellung des Trägers eignen.
So eignen sich Polymere besonders gut zur Fertigung von Trägern
durch Fräsen, Gravieren, Abformen oder aufbauende Polymerisation.
Dagegen sind Glas, Silizium und Siliziumverbindungen besonders geeignet zur
Strukturierung mittels Ätzen oder Laserbehandlung. Auch
Keramik oder Papiere können durch Form- und/oder Prägetechniken
oder Laserbehandlung in ähnlicher Weise strukturiert werden.
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Der
Träger kann aus einem Stück gefertigt sein oder
aus mehreren Teilen bestehen oder zusammengesetzt sein.
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Des
Weiteren kann der Träger auf Teilen oder allen seinen Oberflächen
Beschichtungen aufweisen. Diese Beschichtungen können je
nach Verwendungszweck der Vorrichtung und Lage im Träger funktionalisierte
Oberflächen aufweisen.
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Der
Träger hat bevorzugt eine flache planare Form, besonders
bevorzugt weist der Träger in seiner Grundform eine Quaderform
auf. Ist der Träger in Quaderform, so weist der Quader
in einer bevorzugten Form eine Breite von 5 bis 50 mm, eine Höhe
von 1 bis 5 mm und/oder eine Länge von 50 bis 200 mm auf.
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Der
Träger weist mindestens eine Einlassöffnung auf.
Diese Einlassöffnung ist so angebracht, dass über
die Einlassöffnung der Vorrichtung eine Flüssigkeit
zugeführt werden kann. Dazu ist die Einlassöffnung über
Verbindungskanäle mit mindestens einem der Reaktionsräume
des Trägers funktional verbunden. Der Träger kann
eine oder mehrere Einlassöffnungen an beliebigen Stellen
des Quaders aufweisen, die gegebenenfalls mit anderen mikrofluidischen
Vorrichtungen gekoppelt oder verbunden sein können. Dabei
können mehrere Einlassöffnungen mit einem einzigen
Reaktionsraum direkt verbunden sein. Es kann aber auch nur eine
Einlassöffnung auf einem Träger vorgesehen sein,
die dann mit mehreren Reaktionsräumen des Trägers
funktional verbunden ist. In diesem Fall kann die Einlassöffnung derart
mit den Reaktionsräumen verbunden sein, dass ein oder mehrere
Reaktionsräume in Reihe hintereinander mit Flüssigkeit
versorgt werden können oder ein oder mehrere Reaktionsräume
parallel nebeneinander mit Flüssigkeit versorgt werden
können.
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Der
Träger weist mindestens eine Auslassöffnung auf,
die durch Verbindungskanäle mit einem Reaktionsraum derart
funktional verbunden ist, dass der Inhalt eines Reaktionsraumes über
die Auslassöffnung aus dem Träger und aus der
Vorrichtung ausgeführt werden kann. Eine Auslassöffnung
kann mit mehreren Reaktionsräumen eines Trägers
verbunden sein, so dass der Inhalt dieser Reaktionsräume über
eine gemeinsame Auslassöffnung aus der Vorrichtung entfernt
werden kann. Gegebenenfalls können die Inhalte der Reaktionskammern
auch in andere fluidische Vorrichtungen überführt
oder weitergeleitet werden.
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Der
Träger weist mindestens zwei oder mehr Reaktionsräume
auf. Als Reaktionsräume werden für die Zwecke
der Erfindung Kavitäten oder Hohlräume, im Träger
oder begrenzt durch den Träger und eine Folie oder Membran,
bezeichnet, die dazu dienen, dass in ihrem Inneren eine PCR-Reaktion
ausgeführt wird. Zu diesem Zweck können die Reaktionsräume unterschiedliche
Formen, Dimensionen und/oder Oberflächen aufweisen. Die
Reaktionsräume der erfindungsgemäßen
Vorrichtung sind so gestaltet, dass eine Flüssigkeit im
Inneren eines Reaktionsraums möglichst effektiv und schnell
durch einen externen Wärmeüberträger
erwärmt oder abgekühlt werden kann. Die spezifischen
Ausgestaltungen eines Reaktionsraumes ergeben sich für
den Fachmann ohne Schwierigkeiten aus dem Zweck, für den
er dienen soll. Jeder Reaktionsraum kann über eine eigene
unabhängige Einlass- und/oder Auslassöffnung zugänglich
sein oder mehrere Reaktionsräume können in Reihe
oder parallel nebeneinander mit einer gemeinsamen Ein- und/oder
Auslassöffnung funktional verbunden sein. Insbesondere
können mindestens zwei Reaktionsräume derart miteinander
verbunden sein, dass ein Flüssigkeitsstrom von einer Einlassöffnung
durch einen ersten Reaktionsraum, dann durch einen zweiten Reaktionsraum
hin zu einer Auslassöffnung ermöglicht ist. Zwei
oder mehr Reaktionsräume können eine gemeinsame
Einlassöffnung und/oder Auslassöffnung aufweisen.
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Der
Träger weist Verbindungskanäle auf, die einen
Flüssigkeitsstrom von einer Einlassöffnung über
mindestens einen Reaktionsraum hin zu einer Auslassöffnung
erlauben. Dabei können Verbindungskanäle sowohl
Ein- und Auslassöffnungen mit einem oder mehreren Reaktionsräumen
verbinden, als auch mehrere Reaktionsräume untereinander derart
miteinander funktional verbinden, dass ein Flüssigkeitsstrom
nacheinander durch mehrere aufeinanderfolgende Reaktionsräume
in Reihe hindurchgeleitet wird. Die Verbindungskanäle können
in Teilen oder im Ganzen Oberflächen mit besonderen Eigenschaften
aufweisen.
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Der
Träger weist Ventile auf, die jeweils an Einlass- und Auslassöffnungen
der Vorrichtung angebracht sind. Dabei wird jede Ein- oder Auslassöffnung
durch ein Ventil gesteuert. Alle Ventile sind normal offen und werden
verschlossen durch mechanisches Anpressen der elastischen Folie
in Ventilsitze durch einen formgleichen Aktuator oder Stempel. Dies
gestattet reversibles Verschließen und Öffnen zwischen
Ein- oder Auslassöffnung und der PCR-Reaktionskammer. Die
besondere Ausbildung der Ventilsitze erlaubt ein sicheres und druckfestes
Verschließen, wobei die Flussrichtung durch die spezielle
Ausbildung dieser Ventile keinen Einfluss hat.
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Durch
diese Ventile sind die einzelnen Ein- und Auslassöffnungen
einzeln und unabhängig voneinander verschließbar.
Dabei sind die Ventile derart angebracht, dass ein Flüssigkeitsstrom
im Träger von einer Einlassöffnung zu einer Auslassöffnung
geregelt werden kann.
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Jedes
dieser Ventile weist einen Ventilsitz auf, der derart in den Träger
als Vertiefung eingelassen ist, dass sich der Ventilsitz an einer
von außen zugänglichen Oberfläche des
Trägers befindet. Diese Positionierung des Ventilsitzes
erlaubt die Steuerung des Ventils von außen und führt
dazu, dass bei einem erfindungsgemäßen Ventil
auf bauliche Ausgestaltungen verzichtet werden kann, die eine interne
Steuerung des Ventils zum Ziel haben. Das Ventil muss nicht an eine
bestimmte Flussrichtung angepasst werden und kann für verschiedene
Flussrichtungen in gleichem Maße verwendet werden.
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Weiter
weist der Ventilsitz eine Form auf, in die ein formentsprechender
Aktuator im Wesentlichen passgenau einsetzbar ist. Unter einem Aktuator wird
dabei ein Mittel verstanden, welches die Steuerung eines Ventils
von außen durch Erzeugung eines mechanischen Drucks erlaubt.
Dabei sind Aktuator und dazugehöriger Ventilsitz derart
aufeinander abgestimmt, dass die Oberfläche des Aktuators,
die zum mechanischen Einpressen verwendet wird, im Wesentlichen
passgenau in den Ventilsitz eines Ventils passt, wobei die Winkelrichtung
des mechanischen Einpressvorgangs zu berücksichtigen ist
und in Betracht gezogen werden muss, dass zwischen Aktuator und
Ventilsitz noch eine Folie zum Liegen kommt. Aktuator, Ventilsitz
und Folie sind bevorzugt so aufeinander abgestimmt, dass ein Ventil
bei eingepresstem Aktuator durch eine Folie derart geschlossen wird,
dass ein Flüssigkeitsstrom über dieses Ventil
vollständig und druckfest für die Zwecke der PCR-Reaktion
unterbrechbar ist.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung weist mindestens
eine elastische Folie auf, die mindestens einen Teil der Oberfläche
des Trägers bedeckt. Insbesondere überdeckt die
Folie einen oder mehrere Ventilsitze derart, dass zwischen Folie
und Träger ein Hohlraum über dem Ventilsitz entsteht.
Dabei ist die elastische Folie so angebracht, dass sich die Folie durch
mechanisches Einpressen mittels einem, dem Ventilsitz formentsprechenden,
externen Aktuator, in Richtung des Ventilsitzes dehnt und sich der
Oberfläche des Ventilsitzes anlagern kann. Durch erfolgte Anlagerung
der elastischen Folie an eine Oberfläche des Ventilsitzes
ist ein Ventil verschließbar ausgestaltet.
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Die
Folie ist dabei aus einem Material hergestellt, welches ausreichend
elastisch ist, um ein bevorzugt mehrfaches Dehnen der Folie bis
auf eine Oberfläche eines Ventilsitzes zu erlauben, ohne
dass die Folie der Belastung nicht mehr standhält. Daneben
ist die Folie derart beschaffen, dass eine Flüssigkeit,
die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung gehandhabt
werden soll, die Folie nicht ohne weiteres durchdringen kann. Geeignete
Materialien sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt bedeckt eine Folie
im Wesentlichen eine ganze Oberfläche eines Trägers. Dies
kann insbesondere aus fertigungstechnischen Gründen besonders
sinnvoll sein.
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Insbesondere
kann solch eine Folie eine oder mehrere Oberflächen des
Trägers bedecken.
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Reaktionsräume
und/oder Verbindungskanäle der erfindungsgemäßen
Vorrichtung können vollständig vom Träger
umschlossen sein. Mit anderen Worten, Reaktionsräume und/oder
Verbindungskanäle können vollständig
im Inneren des Trägers angeordnet sein.
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Reaktionsräume
und/oder Verbindungskanäle können auch nur teilweise
vom Träger umschlossen sein. In diesen Fällen
wird nicht die gesamte Ausdehnung des Reaktionsraums und/oder des
Verbindungskanals von Trägermaterial begrenzt. Ein Teil
dieser Begrenzung wird von einem anderen Material bewirkt. Dieses
andere Material kann beispielsweise eine Folie und/oder eine Membran
sein. Insbesondere kann es sich bei diesem Material um eine Folie
handeln, die auch einen Ventilsitz des Trägers bedeckt.
Dabei können die Reaktionsräume und/oder Verbindungskanäle
einseitig oder mehrseitig, überwiegend oder nur in bestimmten
Abschnitten von einer Folie oder Membran begrenzt werden.
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Um
eine möglichst schnelle Temperaturübertragung
in die Reaktionsräume der erfindungsgemäßen
Vorrichtung zu erlauben, ist der Träger im Bereich der
Reaktionsräume möglichst dünn und bietet möglichst
eine großflächige Auflagefläche für
einen externen Wärmeüberträger. Insbesondere
kann die durchschnittliche Dicke des Trägers im Bereich
eines Reaktionsraumes kleiner sein als die entsprechende, über
die ganze Fläche des Trägers gemittelte Dicke des
Trägers.
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Dem
Fachmann ist bewusst, dass eine möglichst erfolgreiche
und schnelle Wärmeübertragung erreicht werden
soll. Um diesen Zweck erreichen zu können, müssen
die erfindungsgemäße Vorrichtung und der verwendete
externe Wärmeüberträger aufeinander abgestimmt
sein. Dies ist dem Fachmann ohne Schwierigkeiten und ohne unzumutbaren
Aufwand möglich.
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In
einer besonderen Ausführungsform können ein oder
mehrere Reaktionsräume bereits ein oder mehrere Reagenzien
beinhalten, bevor der Vorrichtung eine Probenlösung zugeführt
wird. Unter dem Begriff Reagenz kann für diesen Zweck jedes Material
und/oder jede Verbindung oder jedes Gemisch von Verbindungen verstanden
werden, welches in einer PCR-Reaktion eingesetzt werden kann. Bevorzugt
kann es sich bei Reagenzien um übliche Additive zu einer
PCR-Reaktion handeln und/oder um Primer oder Primer-Paare. Sinn
und Zweck dieser Reagenz-Vorlage in einzelnen oder mehreren Reaktionsräumen
ist es, ggf. unterschiedliche Reagenzien bereits vor Probenzufuhr
in die jeweiligen Reaktionsräume zu verbringen. Die einzelnen PCR-Ansätze
in den verschiedenen Reaktionsräumen werden dann komplettiert
durch Zugabe eines gemeinsamen Probenmixes zu allen Reaktionsräumen,
der alle weiteren notwendigen Bestandteile des PCR-Ansatzes enthält.
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Das
Reagenz oder die Reagenzien können in flüssiger,
gasförmiger, fester und/oder Gel-förmiger Form
in einen oder mehrere Reaktionsräume vorgelegt werden.
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Insbesondere
kann in mindestens einem Reaktionsraum mindestens ein Reagenz vorliegen,
bevorzugt in fester oder gelartiger Form.
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Das
vorgelegte Reagenz oder die vorgelegten Reagenzien können
in mindestens zwei Reaktionsräumen unterschiedlich sein.
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Um
eine vorzeitige Lösung eines vorgelegten Reagenz in einem
Probenmix bereits bei der Beladung der Vorrichtung mit einem gemeinsamen
Probenmix zu verhindern, kann das vorgelegte Reagenz eine Schutzschicht
aufweisen, die eine Lösung des Reagenz in einer Flüssigkeit
verzögert. Beispielsweise kann eine solche Schutzschicht
Paraffin enthalten. Beispielsweise kann eine solche Schutzschicht
erst bei höheren Temperaturen, wie z. B. während
des ersten Temperaturzyklus, aufgeschmolzen werden und setzt erst
dann die darin enthaltenen Reagenzien frei.
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Der
Träger mit Reaktionsräumen und Verbindungskanälen
ist mit verschiedensten Materialien mit technisch üblichen
Fertigungsverfahren realisierbar. Bevorzugt bietet sich an, Polymere
durch Fräsen, Gravieren, Abformen oder aufbauende Polymerisation
zu strukturieren. Silizium, Siliziumverbindungen und Glas lassen
sich fertigungsfreundlich durch Ätzen oder auch mit Lasern
strukturieren. Auch Keramik oder spezielles Papier können
durch Form- und Prägetechniken oder Laser in analoger Weise
strukturiert werden. Beschichtungen, Sandwichanordnungen und Materialkombinationen
ermöglichen dabei spezielle Eigenschaften für
Teile oder für die ganze erfindungsgemäße
Vorrichtung zu realisieren. So können Diffusionssperren
mit Metallfolien erreicht werden oder mit bekannten hydrophoben
oder hydrophilen Beschichtungen die Benetzungseigenschaften eingestellt
werden. Auch für adsorptionshemmende Eigenschaften werden
bekannte Beschichtungen z. B. mit Silanen oder geeigneten Polymeren
verwendet.
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Reaktionsräume,
Verbindungskanäle und Teile oder die ganze Oberfläche
des Trägers können mit Folie abgedeckt werden.
Dies kann mittels technologisch eingeführter Verfahren
einseitig oder beidseitig geschehen. Beispielsweise wird eine Laminierung
des Trägers mit einer ggf. elastischen Folie kostengünstig
ganzflächig ausgeführt und durch thermische Verbindung
oder Kleben erreicht. Sie kann aber auch durch Laser aufgeschweißt
werden. Die Elastizität der Folien kann dabei so gewählt
werden, dass sowohl eine formstabile Abdeckung der Kanäle
und Reaktionsräume erreicht wird, als auch das formschlüssige
Einpressen externer Aktuatoren in die Ventilsitze als dichtender
Abschluss gegeben ist.
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In
gleicher Weise wie durch Folien, lässt sich z. B. durch
Membranen, bei denen die Dicke des Trägerelementes im Bereich
der Reaktionsräume bis auf das konstruktive und fertigungstechnische
Minimum verringert wird, die Wärmekapazität an
diesen Stellen erheblich reduzieren. Dies erlaubt einen raschen Wechsel
der PCR-typischen Temperaturen mit alternierender Heizung und Kühlung
und führt zu entscheidend verkürzten PCR-Zyklen
und im Ergebnis zu kurzen Analysezeiten.
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Die
Reaktionsräume sind direkt oder indirekt mit den Ein- und
Auslassöffnungen verbunden. Dies kann beispielsweise direkt
eine Öffnung sein, wie in 2c dargestellt,
oder z. B. über Röhrchen oder Kanülen
erfolgen, die direkt im Träger verankert sind und den Zugang
zu einem Verbindungskanal herstellen. Die gewählte Festigkeit
der Folien kann ihre Penetration an den Ein- und Auslassöffnungen
mit Nadeln, Kanülen oder ähnlichem gestatten.
Dadurch werden die Ein- und Auslassöffnungen geöffnet.
Die Öffnungen können auch vorab bei der Fertigung
mittels Bohren, Lasern oder Stanzen in die Folien eingebracht werden.
Mit Druck auf die Öffnungen aufgesetzte und abdichtende
Flüssigkeitszuführungen bekannter Ausführung
ermöglichen dabei die Verbindung mit externen Flüssigkeitsreservoiren.
Mittels extern erzeugtem hydraulischem Druck können Flüssigkeiten
in bekannter Weise meist aus Reservoiren in die erfindungsgemäße
Vorrichtung transportiert werden.
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In
einer besonderen Ausführung können solche Reservoire
mit Flüssigkeiten auch in der Vorrichtung selbst mit Zugang
zu den Einlassöffnungen angeordnet sein. Da den Ein- und
Auslässen jeweils ein individuell kontrollierbares Ventil
zugeordnet ist, kann jeder Reaktionsraum nach Befüllen
mit Proben und ggf. mit Reagenzien verschlossen werden (4). Dieser
Verschluss ist für das Erhitzen auf 94°C notwendig,
um während der PCR-Reaktion das Austreten von Flüssigkeit
oder Dampf zu verhindern.
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Bei
der Einbringung von Proben in hintereinander liegende Reaktionsräume
muss die Probe eine oder mehrere Kammern passieren, ohne dass sich die
dort vorab platzierten Reagenzien dabei auflösen, damit
sie nicht in andere Kavitäten verschleppt werden (vgl. 3b). Dazu werden die in den Kanälen
oder Reaktionsräumen eingetrockneten Reagenzien zur Verhinderung
einer unkontrollierten Auflösung besonders geschützt,
z. B. können sie mit Schutzschichten versehen werden oder
insgesamt in Gele eingelagert sein. Günstig ist z. B. eine
Schutzschicht aus Paraffin, die erst bei den höheren Temperaturen
im ersten PCR-Zyklus aufgeschmolzen wird und die Reagenzien wirksam
werden lässt. Eine ebenso wirksame Verzögerung
des Auflösens von fest vorgelegten Reagenzien kann durch
sich langsam auflösende Gele oder Zuckerschichten oder wasserlösliche
Polymere erreicht werden.
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Die
spezielle Ausbildung der Ein- und Auslässe mit den Ventilen
ermöglicht kurze Richtungswechsel des Flüssigkeitsstromes
beim Einbringen der Proben. Der Richtungswechsel des Flüssigkeitsstromes
fördert die Auflösung der Flüssigkeiten
und auch die effektive Vermischung von Flüssigkeiten. Dabei
wird insbesondere die in Mikrostrukturen auftretende laminare Strömung,
die eine Vermischung behindert, entschieden eingeschränkt.
Hier bewirken die Ecken und Kanten eine Verwirbelung der Flüssigkeiten.
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Flüssige
PCR-Proben und unterschiedliche Reagenzien können vor Einbringung
in die Reaktionsräume vermischt werden oder auch nacheinander
eingebracht werden. Eine Vermischung wird meist beim Aufheizen während
der ersten PCR-Reaktion erreicht. Genügt dies nicht, so
können kurzzeitige Richtungswechsel des Flüssigkeitsstromes
eine effektive Vermischung bewirken.
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Reagenzien
können in fester Form in die Reaktionsräume oder
in die Verbindungskanäle oder separate Kavitäten
vorab vorgelegt werden. Dies erfolgt bevorzugt vor der Laminierung
des Trägerelementes mit Folien. Gebräuchlich zur
Herstellung solcher Reservoire mit festen Reagenzien sind die Lyophylisierung
von flüssig eingebrachten Reagenzien oder die kontrollierte
Trocknung z. B. Gefriertrocknung. Auch die portionierte Befüllung
mit festen oder gelartigen Reagenzien ist möglich.
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Erfindungsgemäß bietet
sich auch die Kombination fester und flüssiger Komponenten
der Reagenzien für die PCR an, wie z. B. bei einem Umpufferungsschritt.
Hierbei wird beispielsweise eine Probe oder Produkt in eine Kavität
oder einen Reaktionsraum transportiert, in dem Pufferbestandteile
in fester Form gelagert sind. Durch kurze Richtungswechsel des Flüssigkeitsstromes
wird deren Auflösung und auch die effektive Vermischung
von Flüssigkeiten und die Auflösung von Stoffen
in gleicher Weise gefördert, wie das Schütteln
eines Gefäßes.
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Wahlweise
können unterschiedliche PCR-Produkte getrennt entnommen
oder vereinigt werden.
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Nach
der PCR sind die PCR-Produkte kontrolliert entnehmbar. Je nach Ausführung
der erfindungsgemäßen Vorrichtung können
die Produkte mit Hilfe der Ventile nacheinander entnommen oder für eine
nachfolgende instrumentelle Analyse wieder vereinigt oder weitergeleitet
werden.
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Mit
der erfindungsgemäßen Ausführung der Vorrichtung
mit integrierten Ventilen und parallel nutzbaren PCR-Reaktionsräumen
entsteht eine einfache Problemlösung zur Ausführung
komplexer paralleler PCR in einer einzelnen, kostengünstig
herzustellenden Vorrichtung. Darüber hinaus reduzieren die
Maßnahmen zur Reduktion des Wärmewiderstandes
der Reaktionsräume ganz erheblich die erforderliche Analysezeit,
wobei 40 PCR-Zyklen in ca. 30 min ausgeführt werden.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung ist in besonderer
Weise geeignet, trockene und vorab in den Kanälen und Kavitäten
bevorratete Reagenzien zu nutzen, also ein komplettes Modul kostengünstig
bereitzustellen.
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Die
Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Ausführung
mehrerer paralleler PCR-Reaktionen im Durchflussverfahren, umfassend
die Schritte:
- i) Bereitstellung einer erfindungsgemäßen
Vorrichtung;
- ii) Befüllen der Reaktionsräume der Vorrichtung über
eine oder mehrere Einlassöffnungen;
- iii) Verschließen der Ventile an den Ein- und Auslassöffnungen
durch externe Aktuatoren;
- iv) Aussetzen der Reaktionsräume der Vorrichtung einer
zyklischen Wiederholung von Temperaturabfolgen, die eine PCR-Reaktion
erlauben;
- v) Entleeren der Reaktionsräume der Vorrichtung über
eine oder mehrere Auslassöffnungen.
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Dabei
können ein oder mehrere Reaktionsräume der Vorrichtung
durch hydraulischen Druck z. B. mit Probenmix und/oder mit einzelnen
oder mehreren Reagenzien befüllt und/oder von Inhalten
der Reaktionsräume befreit werden.
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Im
erfindungsgemäßen Verfahren können in einzelne
oder mehrere Reaktionsräume der Vorrichtung gleiche und/oder
unterschiedliche Reagenzien zusammen oder nacheinander eingebracht
werden.
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Insbesondere
können mindestens zwei der Reaktionsräume der
Vorrichtung unterschiedliche Reagenzien enthalten, bevor mit Schritt
iv) fortgefahren wird.
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Im
erfindungsgemäßen Verfahren können zwischen
Schritt ii) und iii) bereits in den Reaktionsräumen vorhandene
Reagenzien gelöst werden, bevorzugt durch wiederholte Richtungsänderung
des Flüssigkeitsstroms in der Vorrichtung.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verwendungen einer erfindungsgemäßen
Vorrichtung oder eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur
parallelen Amplifikation unterschiedlicher Zielsequenzen bei Nutzung
der gleichen Ausgangsprobe oder zur Durchführung von PCR-Reaktionen,
insbesondere von Multiplex-PCR-Reaktionen.
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Insbesondere
erlaubt die Erfindung eine frei wählbare Anzahl und Form
von PCR-Reaktionsräumen mit zugeordneten Ein- und Auslässen
sowie Ventilen zu kombinieren.
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Die
erfindungsgemäße Anordnung erlaubt es eine PCR-Probe
auf zwei oder mehr PCR-Reaktionsräume aufzuteilen indem
diese parallel oder hintereinander mit Probenflüssigkeit
befüllt werden. Die zur PCR notwendigen Reagenzien können
jeweils der für einen Reaktionsraum vorgesehenen Probenmenge
vorab beigemischt werden und dann hydraulisch z. B. durch externe
Pumpen oder Injektionen eingebracht werden. Alternativ können
die Reagenzien fest oder flüssig in die Reaktionsräume
oder Verbindungskanäle oder vorgelagerte Kavitäten
während der Herstellung der erfindungsgemäßen
Vorrichtung eingebracht und nach dem Trocknen mit den Folien bedeckt
werden, z. B. durch kleben oder aufsiegeln.
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Die
erfindungsgemäße Lösung und Kombination
von unterschiedlichen PCR-Reaktionen in räumlich getrennten
und durch die Ventile abgeschlossenen Reaktionsräumen verhindert
sicher eine Vermischung oder Beeinflussung.
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Die
erfindungsgemäße Begrenzung der PCR-Reaktionsräume
zu den externen Wärmeüberträgern durch
dünne Folien oder spezielle dünne Membranen oder
eine besonders dünne Trägerausführung
führt zu entscheidend verkürzten PCR-Zyklen und
im Ergebnis kurzen Analysezeiten.
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Zur
Herstellung der Vorrichtung werden industriell erprobte Fertigungsverfahren,
wie z. B. Spritzgießen und Laminieren verwendet. Sie sind
damit kostengünstig und effektiv herstellbar.
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Weitere
Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden
Figurenbeschreibung von Ausführungsbeispielen.
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Figuren:
-
Es
zeigen in jeweils schematischer Darstellung
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1 Ansicht
Element zur parallelen Durchfluss-PCR
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2a Querschnitt Element zur Durchfluss-PCR
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2b Querschnitt Element zur Durchfluss-PCR
mit Stützgerüst
-
2c Detail: Schema Einlass mit Ventil im Querschnitt
-
3a Schema Durchfluss-PCR mit Kavitäten
parallel
-
3b Schema Durchfluss-PCR mit Kavitäten
in Reihe
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4 Temperaturprofil
im Inneren eines PCR-Reaktionsraumes des erfindungsgemäßen
Elementes während externer Heizung und Kühlung
-
Allgemeine
Beschreibung der Funktionsweise der erfindungsgemäßen
Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens
anhand von Ausführungsbeispielen:
In 1 ist
eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen
Vorrichtung in perspektivischer Aufsicht dargestellt, die zeigt
wie das Trägerelement 1 auf einer Oberfläche
ganzflächig mit einer Folie 2 bedeckt ist. Die
Zufuhr und Ableitung von Proben und Flüssigkeiten erfolgt
durch Einlass- bzw. Auslassöffnungen mit integrierten Ventilen 3a bis 3d.
Ein Zu- bzw. Abfluss kann auch durch die Befestigung von Röhrchen im
Träger 1 selbst mit Zugang zu Kammern oder Kanäle
realisiert werden. Die Teile 7a und 7b stellen Wärmeüberträger
in Plattenform dar, die von außen formschlüssig
an die erfindungsgemäße Vorrichtung angedrückt
werden können.
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2a zeigt einen Querschnitt A-A' entsprechend 3a durch eine weitere Ausführungsform einer
erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei die Kavitäten 4a1 und 4a2,
sowie 4b1 und 4b2 jeweils zu einer Kavität 4a und 4b gehören,
die als PCR-Reaktionsräume im Trägerelement 1 eingearbeitet
sind. Das Material des Trägers 1 unter dem Boden
dieser Kavitäten 4a und 4b ist erfindungsgemäß bis
auf das konstruktive und fertigungstechnische Minimum reduziert,
um einen schnellen Wärmeübergang zu den externen
Wärmeüberträgern 7a und 7b zu
erzielen. Die Folie 2 auf den Kavitäten 4a und 4b schafft
eine Abdeckung der PCR-Reaktionsräume und erlaubt ebenfalls
einen schnellen Wärmeübergang zu den externen
Wärmeüberträgern 7a und 7b.
Dies wird insbesondere dadurch erreicht, dass der Wärmeüberträger 7a und 7b der
Materialstrukturierung an der Unterseite des Trägerelementes
formschlüssig angepasst wird (1).
-
2b zeigt eine andere Ausführung
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. Der Querschnitt A-A'
entsprechend 3a zeigt die Kavitäten 4a und 4b als
PCR-Reaktionsräume im Trägerelement 1 eingearbeitet.
Die beidseitige Abdeckung der PCR-Reaktionsräume mit Folien 2a und 2b erlaubt
wiederum einen schnellen Wärmeübergang zu den
externen Wärmeüberträgern 7a' und 7b.
Die mechanische Stabilisierung wird mit den Stützelementen 6a bis 6c aus
beliebigen Materialien erreicht.
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2c zeigt den Querschnitt eines Teiles
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung im Bereich
der Ein- und Auslässe mit integrierten Ventilen 3.
Dabei wird durch das Anpressen eines externen Stempels/Aktuators 8 die
Folie des Trägerelementes in einen Ventilsitz 9 gepresst
und der Weg einer Flüssigkeit vom Einlass 3 zum
PCR-Reaktionsraum 4 sicher abgesperrt. Beim Entfernen des
Stempels öffnet sich das Ventil durch die Elastizität
der Folie 2a.
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In 3a ist das Schema einer erfindungsgemäßen
Vorrichtung in einem Trägerelement 1 mit parallel
angeordneten Kavitäten als Reaktionsräume 4a und 4b,
den Verbindungskanälen 5a bis 5d und den
Ein und Auslassöffnungen mit integrierten Ventilen 3a bis 3d dargestellt.
Dabei ist jede der Ein- oder Auslassöffnungen unabhängig
mit einem integrierten Ventil zu öffnen oder zu schließen.
Mit dieser Anordnung kann jeder PCR-Reaktionsraum unabhängig mit
flüssigen Proben und PCR-Reagenzien befüllt werden.
Alternativ können verschiedene PCR-Reagenzien vorab in
fester Form in die Kammern eingebracht werden. Die PCR-Produkte
stehen nach erfolgter Amplifikation getrennt zur Verfügung.
-
In 3b ist das Schema einer Anordnung einer
erfindungsgemäßen Vorrichtung in einem Trägerelement 1 mit
in Reihe angeordneten Kavitäten 4a und 4b,
den Verbindungskanälen 5a, b und c und den Ein-
und Auslassöffnungen 3a und 3b dargestellt. Dabei
dient eine Öffnung mit integriertem Ventil als Einlass
und die zweite als Auslass. In dieser Anordnung füllen
sich die PCR-Reaktionsräume nacheinander mit Probenflüssigkeit,
wobei die in den einzelnen Reaktionsräumen unterschiedlichen
PCR-Reagenzien vorab in fester Form eingebracht wurden. Bei der
Befüllung der ersten Kammer werden diese Reagenzien von
der Flüssigkeit überströmt, ohne dass
sie sich auflösen.
-
In 4 ist
die gemessene Temperatur im Inneren eines PCR-Reaktionsraumes einer
erfindungsgemäßen Vorrichtung während
der PCR-Reaktion und bei externer Heizung und Kühlung dargestellt.
Die steilen Flanken der Temperaturkurven und der geringe Zeitbedarf
für einen kompletten PCR-Temperaturzyklus im Vergleich
zu konventionellen PCR-Cyclern zeigen die vorteilhafte Auswirkung
der Nutzung von Folien zu Begrenzung der Reaktionsräume.
-
Einige besondere Ausführungsformen:
-
Verfahren
und Vorrichtung zur Durchfluss-PCR, unter Benutzung einer Vorrichtung
bestehend aus:
- a) einem Trägerelement
mit Kanälen und zwei oder mehr PCR-Reaktionsräumen,
die von Folien oder Membranen bedeckt sind,
- b) selektiv verschließbaren Ein- und Auslässen
für diese Reaktionsräume und aufweisend folgende Handhabungen:
– Ein-
und Ausbringen von Proben mit einem Flüssigkeitsstrom in
die Reaktionsräume,
– Ausführung
von zwei oder mehr PCR-Reaktionen in einem Trägerelement,
– wahlweise
Nutzung flüssiger oder fester Reagenzien zur PCR.
-
Anordnung
zur Durchführung des oben genannten Verfahrens, wobei die
Träger aus Polymeren oder Silizium oder Siliziumverbindungen
oder Glas oder Keramik oder Metallen oder Papier oder Kombinationen
aus solchen bestehen können.
-
Vorgenannte
Anordnung zur Durchführung des Verfahrens, wobei PCR-Reaktionsräume,
Kavitäten und Verbindungskanäle in das Trägerelement eingearbeitet
sind.
-
Vorgenannte
Anordnung zur Durchführung des Verfahrens, wobei PCR-Reaktionsräume,
Kavitäten und Verbindungskanäle und das Trägerelement einseitig
oder beidseitig mit einer Folie abgedeckt sind.
-
Vorgenannte
Anordnung zur Durchführung des Verfahrens, wobei die Dicke
des Trägerelementes im Bereich der PCR-Reaktionsräume
auf Membranstärke verringert ist.
-
Vorgenannte
Anordnung zur Durchführung des Verfahrens, wobei Ein- und
Auslässe in der Folie oder Membran und/oder dem Trägerelement
angeordnet sind.
-
Vorgenannte
Anordnung zur Durchführung des Verfahrens, wobei den Ein-
und Auslässen jeweils ein individuell kontrollierbares
Ventil zugeordnet ist.
-
Vorgenannte
Verfahren und Anordnung, wobei flüssige Proben und gegebenenfalls
Reagenzien durch hydraulischen Druck in die Reaktionsräume eingebracht
werden.
-
Vorgenannte
Verfahren und Anordnung, wobei die Ein- und Auslässe durch
externe Vorrichtungen geöffnet oder druckfest verschlossen
werden.
-
Vorgenannte
Verfahren und Anordnung, wobei durch geeignete Kanalführung
und Ventilanordnung Proben wahlweise in die PCR-Reaktionsräume verteilt
werden.
-
Vorgenannte
Verfahren und Anordnung, wobei in die PCR-Reaktionsräume
Proben und unterschiedliche Reagenzien zusammen oder nacheinander
eingebracht werden.
-
Vorgenannte
Verfahren und Anordnung, wobei in die PCR-Reaktionsräume
oder Kanälen oder separaten Kammern unterschiedliche Reagenzien vollständig
oder teilweise in fester oder gelartiger Form vorab vorgelegt wurden.
-
Vorgenannte
Verfahren und Anordnung, wobei in fester oder gelartiger Form vorgelegte
Reagenzien mit Schutzschichten versehen wurden, die ein Auflösen
verzögern oder nur durch besondere Maßnahmen erlauben.
-
Vorgenannte
Verfahren und Anordnung, wobei in PCR-Reaktionsräumen oder
Kanälen oder separate Kammern Pufferbestandteile in fester
Form vorab vorgelegt wurden, die ein Umpuffern von Proben oder Produkten
bewirken.
-
Vorgenannte
Verfahren und Anordnung, wobei durch geeignete Kanalführung
und Ventilanordnung wahlweise unterschiedliche PCR-Produkte getrennt
entnommen oder vereinigt werden.
-
- 1
- Trägerelement
- 2
- elastische
Folie
- 2a
- elastische
Folie auf der Oberseite des Trägerelements
- 2b
- elastische
Folie auf der Unterseite des Trägerelements
- 3,
3a, 3b, ... 3n
- Einlass-/Auslass
mit Ventil
- 4,
4a, 4a1, 4a1, 4b, 4b1, 4b2
- Kavität/PCR-Reaktionsraum
- 5,
5a, 5b, ... 5n
- Verbindungskanal
- 6,
6a, 6b, 6c
- Stützelement
- 7a,
7b
- externer
Wärmeüberträgen
- 8
- externer
Ventilaktuator
- 9
- Ventilsitz
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- - US 4683195 [0005]
- - WO 2007147712 [0015]
-
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-
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PCR array instrument, Clinical Chemistry 44: 10 2191–2194
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