WO2010040758A1 - Vorrichtung und verfahren zur ausführung mehrerer paralleler pcr-reaktionen im durchflussverfahren - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to an apparatus and a method for carrying out a plurality of parallel polymerase chain reactions (PCR) in the flow-through method, as well as to uses thereof.
- PCR polymerase chain reactions
- PCR for amplifying a sequence segment of nucleic acids is an established standard method of molecular biology and is described, inter alia, in US Pat. No. 4,683,195.
- the amplification of several sequence sections of nucleic acids of a sample are referred to by default as so-called multiplex PCR.
- the nucleic acid-containing sample is subjected to repeated temperature cycles together with the so-called master mix and reagents by standard methods.
- the master mix and certain additives, here called reagents consist of a mixture of nucleotides, primers, ions and a thermostable DNA polymerase in suitable buffer solutions.
- reagents consist of a mixture of nucleotides, primers, ions and a thermostable DNA polymerase in suitable buffer solutions.
- Multipiex-PCR a simultaneous determination of several different target sections in a sample is possible. This often leads to a mutual negative influence on the different PCR reactions and master mix. In such a case, a separation of the different PCR reactions is necessary.
- Stationary chip thermo-cyclers use chambers made of silicon, glass or polymers, which are filled in the flow and emptied after PCR.
- thermo-cyclers realize the PCR by means of continuous flow of the sample to be amplified through different temperature zones.
- Typical embodiments are silicon heating chip thermo-cyclers with integrated heating, which have been further developed into stationary surface chip thermo-cyclers and in which the PCR reactions take place on planar chip surfaces with integrated heating in a flow chamber (I.Schneegaß et al., Miniaturized flow-through PCR with different template types in a Silicon chip thermocycler, Lab on a Chip, 2001. 1 (1): p.42-49.).
- a PCR with external temperature control and pinch closure of the inflow channels is described in a chamber of a cartridge according to the stationary principle.
- the heating of the PCR chamber is realized by an external heat source, without special measures for accelerating the temperature transition are described.
- the PCR chamber with integrated heating in the form of a sample vessel is placed on a cartridge for capillary electrophoresis (AT Wooley et al., Functional Integration of PCR amplification and capillary electrophoresis in a microfabricated DNA analysis device Chem. 1996; 68: 4081).
- Various flow-through thermal cyclers realize the PCR by moving the sample to be amplified into different temperature zones.
- a capillary-shaped tube is circulated through water baths with the different PCR temperatures and the PCR product is removed after appropriate amplification (M. Curcio and Roeraade, J., Continuous segmented-flow polymerase chain reaction for high-throughput miniaturized DNA amptification, Ana! Chem, 2003. 75 (1): p.1-7).
- a meandering channel is passed 25 times over various PCR-adequate temperature zones and in this way the sample is amplified with 25 PCR cycles (I. Schneegass et al., Miniaturized flow-through PCR with different template Types in a Silicon Chip Thermocycler Lab on a Chip, 2001. 1 (1): p.42-49).
- array PCR An arrangement of 10 independently arranged silicon reactors with integrated heating and integrated optical detection, referred to as array PCR, is given by P. Belgrader et al. Rapid pathogen detection using a microchip PCR array instrument, Clinical Chemistry 44: 10, 2191-2194 (1998) and describes its application in a simultaneous PCR. The reactors are not operated in the flow.
- the object of the present invention is to reduce or overcome one or more disadvantages of the prior art.
- the object is achieved by providing a device for carrying out a plurality of parallel PCR reactions in the flow-through method, comprising:
- valves at inlet and outlet openings, which are independently closable and which are mounted such that a liquid flow can be regulated in the carrier from an inlet opening to an outlet opening, wherein the valves each have a valve seat which is recessed into the carrier as a recess, that the valve seat is located on an externally accessible surface of the carrier and the valve seat has a shape, in which a shape-responsive external actuator can be used substantially accurately, has; and
- the described device is particularly suitable for distributing samples in the same device to different PCR reaction spaces, adding the necessary specific reagents and, after parallel amplification, recombining or separately utilizing the products.
- the device according to the invention allows a rapid heating and cooling of the PCR reaction spaces
- the device of the invention can be prepared by cost-effective, industrially proven and volume-capable method
- the device according to the invention is interchangeable.
- carrier and “carrier element” are used interchangeably.
- a device according to the invention can be supplied with at least one inlet opening to the at least two reaction spaces a sample liquid.
- two different PCR reactions can now be carried out using the same sample material and within one and the same device.
- one or more different reagents and buffer components are introduced into one or more reaction chambers of a device.
- a first reaction space of a device according to the invention Primer for an amplificate A and in a second reaction chamber of the same device primer for an amplificate B be submitted. If such a device is now loaded with a sample solution containing all other necessary components for a PCR reaction, such as buffer constituents, an approach results in the first reaction space which leads to the amplification of a portion of the DNA present in the sample, the amplificate A, while in reaction space two an approach arises, which leads to the amplification of another part of the DNA present in the sample, the amplificate B.
- Using a single sample solution can be carried out in a single device several parallel PCR reactions. This is particularly advantageous when amplificates are to be generated and, if appropriate, their frequency should be set in relation to one another, but the necessary amplification parameters for the two amplificates influence one another.
- gene expression levels normalized to an unchanged gene are often determined, preferably as differential gene expression analyzes as internal standard multiplex PCR.
- the device according to the invention now makes it possible to carry out such multiplex PCR reactions without it being necessary to prepare individual sample batches and without the two amplificates being able to influence one another.
- the device according to the invention has a carrier.
- This carrier can in principle consist of any material in which one or more inlet openings, one or more outlet openings, at least two reaction chambers, connecting channels and closable valves can be displayed.
- the support comprises a material selected from silicon, silicon compounds, glass, ceramics, metal, paper, one or more polymers or combinations thereof. In particular, materials that can withstand temperatures that commonly occur during a PCR temperature cycle are used.
- the carrier can be made of one piece or consist of several parts or be composed.
- the backing may have coatings on parts or all of its surfaces. These coatings may have functionalized surfaces depending on the intended use of the device and location in the carrier.
- the carrier preferably has a flat planar shape, particularly preferably the carrier has a cuboid shape in its basic form. If the carrier is in cuboid shape, then the cuboid in a preferred form has a width of 5 to 50 mm, a height of 1 to 5 mm and / or a length of 50 to 200 mm.
- the carrier has at least one inlet opening.
- This inlet opening is arranged so that a liquid can be supplied via the inlet opening of the device.
- the inlet opening is connected via gleichsungskanäie with at least one of the reaction spaces of the carrier.
- the carrier may include one or more inlet ports at any locations on the cuboid, which may be coupled or connected to other microfluidic devices, if desired.
- a plurality of inlet openings can be directly connected to a single reaction space.
- it may also be provided only on an inlet opening on a carrier, which is then functionally connected to a plurality of reaction spaces of the carrier.
- the inlet opening may be connected to the reaction spaces in such a way that one or more reaction spaces can be supplied with liquid in series one behind the other or one or more reaction spaces can be supplied with liquid in parallel next to one another.
- the carrier has at least one outlet opening, which is connected in a functional manner by connecting channels to a reaction space such that the contents of a reaction space can be carried out via the outlet opening out of the carrier and out of the device.
- a Ausiassö réelle may be connected to a plurality of reaction spaces of a carrier, so that the content of these Reaktio ⁇ sschreib on a common outlet opening can be removed from the device.
- the contents of the reaction chambers may also be transferred or forwarded to other fluidic devices.
- the carrier has at least two or more reaction spaces.
- reaction spaces are cavities or cavities, in the carrier or bounded by the carrier and a film or membrane, which serve to carry out a PCR reaction in their interior.
- the reaction spaces may have different shapes, dimensions and / or surfaces.
- the reaction chambers of the device according to the invention are designed so that a liquid in the interior of a reaction chamber as effectively as possible and schnei! can be heated or cooled by an external heat exchanger.
- the specific embodiments of a reaction space will be apparent to one skilled in the art without difficulty for the purpose for which it is intended to serve.
- Each reaction space may be accessible via its own independent inlet and / or outlet opening or a plurality of reaction spaces may be functionally connected in series or in parallel next to one another with a common inlet and / or outlet opening.
- at least two reaction spaces can be connected to one another such that a liquid flow from an inlet opening through a first reaction space, then through a second reaction space to an outlet opening is made possible.
- Two or more reaction spaces may have a common inlet opening and / or outlet opening.
- the carrier has connecting channels which allow a flow of liquid from an inlet opening via at least one reaction space to an outlet opening.
- connecting channels can connect such inlet and outlet openings with one or more reaction spaces, as well as a plurality of reaction spaces with each other functionally connect to each other in such a way that a liquid flow is passed successively through several successive reaction chambers in series.
- the connecting channels may have, in part or in whole, surfaces with special properties.
- the carrier has valves which are respectively attached to inlet and outlet ports of the device. Each inlet or outlet opening is controlled by a valve. All valves are normally open and are closed by mechanical pressing of the elastic foil into valve seats by means of an identical actuator or punch. This allows reversible closure and opening between inlet or outlet port and the PCR reaction chamber.
- the special design of the valve seats allows a safe and pressure-tight closure, the flow direction has no influence by the special design of these valves.
- the individual inlet and outlet openings are individually and independently closable.
- the valves are mounted in such a way that a liquid flow in the carrier can be regulated from an inlet opening to an outlet opening.
- Each of these valves has a valve seat, which is recessed in the carrier in such a way that the valve seat is located on an externally accessible surface of the carrier. This positioning of the valve seat allows the control of the valve from the outside and results in that in a valve according to the invention can be dispensed with structural designs that have an internal control of the valve to the destination.
- the valve does not have to be adapted to a specific flow direction and can be used equally for different directions of flow.
- valve seat has a shape into which a shape-responsive actuator can be inserted substantially accurately.
- An actuator is understood here to mean a device which allows the control of a valve from the outside by generating a mechanical pressure.
- the actuator and associated valve seat are matched to one another such that the surface of the actuator used for mechanical pressing fits substantially accurately into the valve seat of a valve, taking into account the angular direction of the mechanical press-in process and must be taken into account between the actuator and valve seat still a foil comes to rest.
- Actuator, valve seat and film are preferably coordinated so that a valve at Pressed actuator is closed by a film such that a liquid flow through this valve is completely and pressure resistant for the purposes of the PCR reaction can be interrupted.
- the device according to the invention has at least one elastic film which covers at least part of the surface of the carrier.
- the film covers one or more valve seats in such a way that a cavity is formed over the valve seat between the film and the carrier.
- the elastic film is mounted so that the film by mechanical pressing means of a, the valve seat formegioen, external actuator, in the direction of the valve seat stretches and can attach to the surface of the valve seat.
- the film is made of a material which is sufficiently elastic to allow a preferred multiple stretching of the film to a surface of a valve seat, without the film no longer withstands the load.
- the film is such that a liquid which is to be handled in the inventive device, the film can not penetrate readily. Suitable materials are known to the person skilled in the art.
- a film substantially covers an entire surface of a carrier. This can be particularly useful, especially for manufacturing reasons.
- such a film may cover one or more surfaces of the carrier.
- Reaction spaces and / or connection channels of the device according to the invention can be completely enclosed by the support.
- reaction spaces and / or connection channels can be arranged completely inside the carrier.
- Reaction spaces and / or connection channels can also be only partially enclosed by the carrier. In these cases, not the entire extent of the Reaktio ⁇ sraums and / or the connecting channel of Sumateria! limited.
- One Tei! This limitation is caused by another material.
- This other material may for example be a film and / or a membrane. In particular, this material may be a film that also covers a valve seat of the wearer. In this case, the reaction spaces and / or Vietnamesesungskanäie one or more sides, predominantly or limited only in certain sections of a film or membrane.
- the support in the region of the reaction spaces is as thin as possible and offers a large Auflagefiambae for an external heat exchanger, in particular, the average thickness of the support in the region of a reaction space may be smaller than the corresponding , Thickness of the support averaged over the whole surface of the support.
- one or more reaction spaces may already contain one or more reagents before a sample solution is supplied to the apparatus.
- reagent can be understood for this purpose to be any material and / or compound or mixture of compounds which can be used in a PCR reaction.
- reagents may be conventional additives to a PCR reaction and / or primer or primer pairs.
- the purpose of this reagent template in single or multiple reaction chambers is, if necessary, to spend different reagents in the respective reaction chambers before adding the sample.
- the individual PCR mixtures in the different reaction chambers are then completed by adding a common sample mix to all reaction chambers, which contains all other necessary components of the PCR approach.
- the reagent or reagents may be presented in liquid, gaseous, solid and / or gypsum form in one or more reaction spaces.
- At least one reagent may be present in at least one reaction space, preferably in solid or gel form.
- the presented reagent or reagents may be different in at least two reaction spaces.
- the presented reagent may have a protective layer which delays a solution of the reagent in a liquid.
- a protective layer may contain paraffin.
- such a protective layer may only be used at higher temperatures, e.g. be melted during the first temperature cycle, and only then releases the reagents contained therein.
- the carrier with reaction chambers and connecting channels can be realized with a wide variety of materials using technically customary production methods. Preference is given to structuring polymers by milling, engraving, molding or anodizing polymerization. Silicon, Siiiziumeducationen and glass can be structured production-friendly by etching or with lasers. Even ceramics or special paper can be structured in an analogous way by forming and embossing techniques or lasers. Coatings, sandwich arrangements and material combinations make it possible to realize special properties for parts or for the entire device according to the invention. Thus, diffusion barriers can be achieved with metal foils or be adjusted with known hydrophobic or hydrophilic coatings, the wetting properties. Also for adsorptive properties, known coatings e.g. used with silanes or suitable polymers.
- Reaction chambers, connection channels and parts or the whole surface of the support can be covered with foil.
- This can be done unilaterally or bilaterally by means of technologically introduced methods.
- a Lamination of the carrier with an optionally elastic film inexpensively executed over the entire surface and achieved by thermal bonding or gluing. But it can also be welded by laser.
- the elasticity of the films can be chosen so that both a dimensionally stable coverage of the channels and reaction chambers is achieved, as well as the positive pressing of external actuators is given in the valve seats as a sealing conclusion.
- the reaction spaces are directly or indirectly connected to the inlet and outlet ports.
- This may for example be an opening directly, as shown in Fig. 2c, or e.g. via tubes or cannulas that are anchored directly in the carrier and provide access to a connecting channel.
- the selected strength of the films may allow their penetration at the inlet and outlet ports with needles, cannulas or the like. As a result, the inlet and outlet openings are opened.
- the openings can also be introduced in advance in the production by drilling, laser cutting or punching in the films. Pressurized on the openings and sealing liquid feeds known design allow the connection with external liquid reservoirs. By means of externally generated hydraulic pressure liquids can be transported in a known manner usually from reservoirs in the device according to the invention.
- such reservoirs with liquids can also be arranged in the device itself with access to the egg ⁇ lassö Maschinenen. Since the inlets and outlets are each assigned an individually controllable valve, each reaction space can be closed after filling with samples and possibly with reagents (FIG. 4). This closure is necessary for heating to 94 ° C. to prevent the escape of liquid or vapor during the PCR reaction. When introducing samples into successive reaction chambers, the sample must pass through one or more chambers without dissolving the reagents placed there in advance, so that they are not dragged into other cavities (see Fig. 3b).
- the dried in the channels or reaction chambers reagents are particularly protected to prevent uncontrolled dissolution, for example, they can be provided with protective layers or be incorporated in total in gels.
- a protective layer of paraffin which is only melted at the higher temperatures in the first PCR cycle and makes the reagents effective, is favorable.
- An equally effective delay in the dissolution of solid reagents can be achieved by slow-dissolving gels or sugar layers or water-soluble polymers.
- the special design of the inlets and outlets with the valves allows short changes of direction of the liquid flow during the introduction of the samples.
- the change of direction of the liquid flow promotes the dissolution of the liquids and also the effective mixing of liquids.
- the laminar flow occurring in microstructures, which impedes mixing, is decisively restricted.
- the corners and edges cause a turbulence of the liquids.
- Liquid PCR samples and different reagents can be mixed prior to introduction into the reaction spaces or can be introduced successively. Mixing is usually achieved during heating during the first PCR reaction. If this is not enough, short-term changes of direction of the liquid flow can cause effective mixing.
- Reagents can be presented in solid form in the reaction chambers or in the connecting channels or separate cavities beforehand. This is preferably done before lamination of the carrier element with films.
- Also contemplated by the present invention is the combination of solid and liquid components of the reagents for the PCR, e.g. in a rebuffering step
- a sample or product is transported into a cavity or a reaction space in which buffer constituents are stored in solid form.
- a rebuffering step for example, a sample or product is transported into a cavity or a reaction space in which buffer constituents are stored in solid form.
- PCR products can be separately withdrawn or pooled.
- the PCR products are removed in a controlled manner.
- the products can be removed one after the other with the aid of the valves or reunited or forwarded for subsequent instrumental analysis.
- the device according to the invention is particularly suitable for use of dry and previously stored in the channels and cavities reagents, ie to provide a complete module cost.
- the invention also relates to a method for carrying out a plurality of parallel PCR reactions in the flow-through method, comprising the steps of: i) providing a device according to the invention; ü) filling the reaction spaces of the device via one or more
- one or more reaction spaces of the device by hydraulic pressure, e.g. filled with Probenmtx and / or with one or more reagents and / or freed from the contents of the reaction spaces.
- the same and / or different reagents can be introduced together or in succession into individual or several reaction spaces of the device.
- reaction spaces of the device may contain different reagents before proceeding to step iv).
- the present invention also relates to uses of a device according to the invention or a method according to the invention for the parallel amplification of different target sequences when using the same starting sample or for carrying out PCR reactions, in particular multiplex PCR reactions.
- the invention allows a freely selectable number and form of PCR reaction chambers with associated inlets and outlets and valves to combine.
- the arrangement according to the invention allows a PCR sample to be divided into two or more PCR reaction spaces by filling them in parallel or in succession with sample liquid.
- the reagents necessary for the PCR can each be added in advance to the sample quantity intended for a reaction space and then introduced hydraulically, for example, by external pumps or injections.
- the reagents can be introduced solid or liquid into the reaction spaces or connecting channels or upstream cavities during the manufacture of the device according to the invention and, after drying, covered with the films, for example by gluing or sealing.
- the inventive solution and combination of different PCR reactions in spatially separated and closed by the valves reaction chambers safely prevents mixing or interference.
- FIG. 1 View element for parallel flow PCR
- FIG. 2a Cross-section element for flow PCR
- FIG. 2b Cross-section element for flow-through PCR with scaffold
- Fig. 4 temperature profile in the interior of a PCR reaction chamber of the element according to the invention during external heating and cooling
- FIG. 1 shows an embodiment of a device according to the invention in a perspective plan view, showing how the carrier element 1 is completely covered with a film 2 on a surface.
- the supply and discharge of samples and liquids takes place through inlet or Ausiassötechnischen with integrated valves 3a to 3d.
- An inflow or outflow can also be realized by the attachment of tubes in the carrier 1 itself with access to chambers or channels.
- the parts 7a and 7b represent heat transfer medium in plate form, which can be pressed from the outside formschlüsstg to the device according to the invention.
- FIG. 2 a shows a cross-section A - A 'according to FIG. 3 a through a further embodiment of a device according to the invention, where the cavities 4 a 1 and 4 a 2 as well as 4 b 1 and 4 b 2 each belong to a cavity 4 a and 4 b which serve as PCR reaction spaces in the carrier element 1 are incorporated.
- the material of the carrier 1 under the bottom of these cavities 4a and 4b is inventively reduced to the constructive and manufacturing engineering minimum to achieve a rapid heat transfer to the external heat exchangers 7a and 7b.
- the film 2 on the cavities 4a and 4b provides coverage of the PCR reaction spaces and also allows a quick heat transfer to the external heat exchangers 7a and 7b. This is achieved in particular by that the heat exchanger 7 a and 7 b of the material structuring on the underside of the carrier element is adapted in a form-fitting manner (FIG. 1).
- Fig. 2b shows another embodiment of a device according to the invention.
- the cross-section A - A 'according to FIG. 3 a shows the cavities 4 a and 4 b incorporated as PCR reaction spaces in the carrier element 1.
- the bilateral coverage of the PCR reaction spaces with foils 2a and 2b in turn allows rapid heat transfer to the external heat exchangers 7a and 7b.
- the mechanical stabilization is achieved with the support elements 6a to 6c of any materials.
- Fig. 2c shows the cross section of a part of a device according to the invention in the region of the inlets and outlets with integrated valves 3.
- an external Stempeis / actuator 8 by pressing an external Stempeis / actuator 8, the film of the carrier element is pressed into a valve seat 9 and the path of a liquid from the inlet 3 to the PCR reaction chamber 4 safely shut off.
- the valve opens by the elasticity of the film 2a.
- FIG. 3a shows the diagram of a device according to the invention in a carrier element 1 with cavities arranged in parallel as reaction chambers 4a and 4b, the connecting channels 5a to 5d and the inlet and outlet openings with integrated valves 3a to 3d.
- Each of the inlet or outlet openings can be opened or closed independently with an integrated valve.
- each PCR reaction space can be filled independently with liquid samples and PCR reagents.
- various PCR reagents may be preliminarily introduced into the chambers in solid form. The PCR products are available separately after amplification.
- Fig. 3b the diagram of an arrangement of a device according to the invention in a support member 1 with in series cavities 4a and 4b, the connecting channels 5a, b and c and the inlet and Ausiassö réelleen 3a and 3b is shown.
- One port with integrated valve serves as inlet and the second as outlet.
- the PCR reaction spaces fill up successively with sample liquid, wherein the different PCR reagents in the individual reaction chambers were introduced beforehand in solid form. When filling the first chamber, these reagents are overflowed by the liquid without it dissolving.
- FIG. 4 shows the measured temperature inside a PCR reaction space of a device according to the invention during the PCR reaction and in external heating and cooling, the steep edges of the temperature curves and the short time required for a complete PCR temperature cycle compared to conventional PCR Cyclemes show the beneficial effect of using films to limit the reaction spaces.
- a method and apparatus for flow-through PCR using a device comprising: a) a support member having channels and two or more PCR reaction spaces covered by films or membranes, b) selectively closable inlets and outlets for said reaction spaces and having following operations:
- Carrier element optional use of liquid or solid reagents for PCR.
- the supports may consist of polymers or silicon or silicon compounds or gias or ceramics or metals or paper or combinations thereof.
- PCR reaction spaces, cavities and connecting channels are incorporated in the carrier element.
- PCR reaction spaces, cavities and connecting channels and the carrier element are covered on one or both sides with a foil.
- Supporting elements 3a, 3b, ... 3n inlet / outlet with valve, 4a, 4a1, 4a 1, 4b, 4b1, 4b2 cavity / PCR reaction space, 5a, 5b, ... 5n connecting channel, 6a, 6b, 6c Supporting element a, 7b external heat exchanger
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Abstract
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Ausführung mehrerer paralleler PCR-Reaktionen im Durchflussverfahren, umfassend: 1) einen Träger, der a) mindestens eine Einlassöffnung, b) mindestens eine Auslassöffnung; c) mindestens zwei Reaktionsräume, d) Verbindungskanäle, die einen Flüssigkeitsstrom von einer Einlassöffnung über mindestens einen Reaktionsraum hin zu einer Auslassöffnung erlauben, und e) Ventile an Einlass- und Auslassöffnungen, die unabhängig voneinander verschließbar sind und die derart angebracht sind, dass ein Flüssigkeitsstrom im Träger von einer Einlassöffnung zu einer Auslassöffnung geregelt werden kann, wobei die Ventile jeweils einen Ventilsitz aufweisen, der derart in den Träger als Vertiefung eingelassen ist, dass sich der Ventilsitz an einer von außen zugänglichen Oberfläche des Trägers befindet und der Ventilsitz eine Form aufweist, in die ein formentsprechender externer Aktuator im Wesentlichen passgenau einsetzbar ist, aufweist; und 2) eine elastische Folie, die mindestens einen Teil der Oberfläche des Trägers bedeckt und einen Ventilsitz eines Ventils e) derart überdeckt, so dass zwischen Folie und Träger ein Hohlraum entsteht und die elastische Folie, durch mechanisches Einpressen der Folie über einem Ventilsitz durch einen dem Ventilsitz formentsprechenden, externen Aktuator, einer Oberfläche des Ventilsitzes anlagerbar ist und dadurch ein Ventil e) verschließbar ist.
Description
Vorrichtung und Verfahren zur Ausführung mehrerer paralleler PCR-Reaktionen im Durchflussverfahren
Technisches Gebiet
Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Ausführung mehrerer paralleler Polymerase-Ketten-Reaktionen (Polymerase chain reaction, PCR) im Durchfiussverfahren, sowie auf Verwendungen derselben.
Stand der Technik
Bei der Ausführung von PCR-Reaktionen, beispielsweise zur biochemischen Analytik, ist es zunächst wünschenswert diese in kostengünstigen Durchflusseinrichtungen zu realisieren und zu automatisieren. Dabei ist es insbesondere erforderlich, Proben auf Reaktionsräume aufzuteilen und mit unterschiedlichen Reagenzien kontrolliert zusammenzuführen. Des Weiteren ist es wünschenswert, die zeitaufwendigen PCR-Reaktionen zu beschleunigen.
Bisher werden unterschiedliche PCR-Reaktionen, wenn sie sich gegenseitig negativ beeinflussen, in getrennten Gefäßen durchgeführt oder es werden jeweils separate mikrofluidische Einrichtungen verwendet.
Die Realisierung mehrfacher unterschiedlicher PCR-Reaktionen mit der gleichen Probe erfordert mit herkömmlicher Technik besondere apparative Aufwendungen und schränkt somit Automatisierungsmöglichkeiten stark ein.
Die PCR zur Vervielfältigung eines Sequenzabschnittes von Nukleinsäuren ist ein eingeführtes Standardverfahren der Molekularbiologie und u.a. beschrieben in US 4 683 195.
Die Amplifizierung mehrerer Sequenzabschnitte von Nukleinsäuren einer Probe werden standardmäßig als so genannte Multiplex-PCR bezeichnet. Damit können mehrere verschiedene Nukleinsäuresequenzen oder Zielsequenzen gleichzeitig in einem Reaktionsgefäß oder Reaktionsraum amplifiziert werden. Nicht selten kommt es dabei zu unerwünschten Konkurrenzreaktionen der verwendeten Primer oder gegenseitigen Beeinflussungen.
Für die PCR-Reaktion, also der Amplifizierung bestimmter Abschnitte von Nukleinsäuren, wird nach Standardverfahren die nukleinsäurehaltige Probe zusammen mit dem so genannten Mastermix und Reagenzien wiederholten Temperaturzyklen unterworfen. Der Mastermix und bestimmte Zusätze, hier Reagenzien genannt, bestehen aus einem Gemisch von Nukleotiden, Primern, Ionen sowie einer thermostabilen DNA-Polymerase in geeigneten Pufferlösungen. Nach jeweils einer Temperatursequenz, beispielsweise in den Schritten 940C (Denaturierung der DNA-Stränge), 550C (Primer-Annealing), 720C (Elongation) hat sich die Zahl der zu amplifizierenden DNA-Abschnitte (Zielsequenzen) verdoppelt. Mit üblichen Laborgeräten erfordern 40 solcher Zyklen in der Regel mehr als eine Stunde Zeit.
Mit der so genannten Multipiex-PCR ist eine gleichzeitige Bestimmung mehrerer verschiedener Zielabschnitte in einer Probe möglich. Dabei kommt es häufig zu einer gegenseitigen negativen Beeinflussung der unterschiedlichen PCR-Reaktionen und Mastermixes. In solchem Falle wird eine Separierung der unterschiedlichen PCR- Reaktionen notwendig.
Die Ausführung von PCR-Reaktionen mit Durchflussverfahren ist derzeit auf die Erprobung zahlreicher Lösungsansätze ausgerichtet. Im Stand der Technik wird die Durchfluss-PCR in mikrofluidischen Vorrichtungen in Form unterschiedlicher Durchflusszellen, Kartuschen (auch Cartridges genannt) beschrieben.
In einer Übersicht beschreiben und bewerten I. Schneegaß und Köhler, J. M., Flow- through PCR in chip thermocyclers. Reviews in Molecular Biotechnology, 2001 ,
82(2): p. 101-121 , die sogenannten stationären Chipthermocycler und die Durchfluss-Chipthermocycler.
Stationäre Chipthermocycler benutzen Kammern aus Silizium, Glas oder Polymeren, die im Durchfluss befüllt und nach PCR entleert werden.
Durchfluss-Chipthermocycler realisieren die PCR mittels kontinuierlichen Flusses der zu amplifizierenden Probe durch verschiedene Temperaturzonen.
Eine. typische Ausführung sind Silizium-Karnmer-Chipthermocycler mit integrierter Heizung, die zu stationären Oberfiächen-Chipthermocycler weiterentwickelt wurden und bei denen die PCR-Reaktionen auf planaren Chipoberflächen mit integrierter Heizung in einer Durchflusskammer ablaufen (I.Schneegaß et al., Miniaturized flow- through PCR with different template types in a Silicon chip thermocycler. Lab on a Chip, 2001. 1 (1): p.42-49.).
Eine spezielle Ausführung dieser Methode beschreiben L. C. Waters et al., Microchip Device for Cell Lysis, Multiplex PCR Amplification, and Electrophoretic Sizing. Ana!. Chem., 1998. 70(1): p. 158-162, indem sie eine ganze Kartusche für die Elektrophorese mit der PCR-Probe in einer separierten Kammer in einem konventionellen Thermocycler amplifizieren.
In WO2007147712 wird in einer Kammer einer Kartusche nach dem stationären Prinzip eine PCR mit externer Temperatursteuerung und Quetschverschluss der Zuflusskanäle beschrieben. Die Heizung der PCR-Kammer wird durch eine externe Wärmequelle realisiert, ohne dass besondere Maßnahmen zur Beschleunigung des Temperaturübergangs beschrieben sind.
In einer speziellen Ausführung der stationären Durchflussmethode wird die PCR- Kammer mit integrierter Heizung in Form eines Probengefäßes auf eine Kartusche für die Kapällarelektrophorese aufgesetzt (AT. Wooley et ai., Functional Integration of PCR amplification and capillary electrophoresis in a microfabricated DNA analysis device. Anal. Chem. 1996;68:4081).
Verschiedene Durchfluss-Chipthermocycler realisieren die PCR durch das Verbringen der zu amplifizierenden Probe in verschiedene Temperaturzonen. Im einfachsten Falle wird dazu ein kapitlarförmiger Schlauch durch Wasserbäder mit den unterschiedlichen PCR-Temperaturen im Kreis geführt und das PCR-Produkt nach entsprechender Amplifikation entnommen (M. Curcio und Roeraade, J., Continuous segmented-flow Polymerase chain reaction for high-throughput miniaturized DNA amptification. Ana! Chem, 2003. 75(1): p. 1-7).
Bei einem Glas-Silizium-Durchfluss-Chipthermocycler wird ein mäanderförmiger Kanal 25 mal über verschiedene PCR-adequate Temperaturzonen geführt und auf diese Weise die Probe mit 25 PCR-Zyklen ampliftziert (I. Schneegaß et al., Miniaturized flow-through PCR with different template types in a Silicon chip thermocycler. Lab on a Chip, 2001. 1 (1): p.42-49).
Eine weitere Variante der Durchfluss-PCR beschreiben G. Munchow, et al. in Automated chipbased device for simple and fast nucleic acid amplification. Expert Review of Molecular Diagnostics, 2005, 5(4): p. 613-620 , wobei eine Probe in einer Kapillare in sequentielle Zonen verschiedener Temperatur entsprechend den PCR- Zyklen hydraulisch verbracht wird.
Eine als Array-PCR bezeichnete Anordnung von 10 unabhängig nebeneinander angeordneten Silizium-Reaktoren mit integrierter Heizung und integrierter optischer Detektion geben P. Belgrader et al. Rapid pathogen detection using a microchip PCR array Instrument, Clinical Chemistry 44: 10 2191-2194 (1998) an und beschreiben dessen Anwendung in einer simultanen PCR. Die Reaktoren werden nicht im Durchfluss betrieben.
Keine der bisher beschrieben Durchflusslösungen benutzt parallele PCR- Reaktionsräume oder Vorrichtungen um eine singuläre Probe unabhängigen PCR- Reaktionen zu unterziehen.
Allen beschriebenen Durchfluss-Lösungen nach der stationären Methode ist gemeinsam, dass keine Vorkehrungen getroffen wurden, um die erforderlichen
langen PCR-Reaktionszeiten, die durch die Zeiten zur Aufheizung und Abkühlung der PCR-Reaktionsräume bedingt sind besonders zu verkürzen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es einen oder mehrere Nachteile des Standes der Technik zu vermindern oder zu überwinden. Insbesondere ist es Aufgabe der Erfindung, eine kostengünstige und einfach herzustellende Vorrichtung für die Durchffuss-PCR bereitzustellen und neue und verbesserte Verfahren insbesondere für die Durchführung komplexer PCR-Reakttonen zu schaffen.
Erfindungsgemäße Lösung
Die Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellen einer Vorrichtung zur Ausführung mehrerer paralleler PCR-Reaktionen im Durchflussverfahren, umfassend:
1) einen Träger, der a) mindestens eine Einlassöffnung, b) mindestens eine Auslassöffnung; c) mindestens zwei Reaktionsräume, d) Verbindungskanäle, die einen Flüssigkeitsstrom von einer Einlassöffnung über mindestens einen Reaktionsraum hin zu einer Auslassöffnung erlauben, und e) Ventile an Einlass- und Auslassöffnungen, die unabhängig voneinander verschließbar sind und die derart angebracht sind, dass ein Flüssigkeitsstrom im Träger von einer Einlassöffnung zu einer Auslassöffnung geregelt werden kann, wobei die Ventile jeweils einen Ventilsitz aufweisen, der derart in den Träger als Vertiefung eingelassen ist, dass sich der Ventilsitz an einer von außen zugänglichen Oberfläche des Trägers befindet und der Ventilsitz eine Form aufweist, in die ein formentsprechender externer Aktuator im Wesentlichen passgenau einsetzbar ist, aufweist; und
2) eine elastische Folie, die mindestens einen Teil der Oberfläche des Trägers bedeckt und einen Ventilsitz eines Ventils e) derart überdeckt, so dass zwischen Folie und Träger ein Hohlraum entsteht und die elastische Folie, durch mechanisches Einpressen der Folie über einem Ventilsitz durch einen dem Ventilsitz
formentsprechenden, externen Aktuator, einer Oberfläche des Ventilsitzes anlagerbar ist und dadurch ein Ventil e) verschließbar ist.
Die beschriebene Vorrichtung ist insbesondere geeignet, Proben in der gleichen Vorrichtung auf verschiedene PCR-Reaktionsräume zu verteilen, die notwendigen spezifischen Reagenzien hinzuzufügen und nach paralleler Amplifizierung die Produkte wieder zu kombinieren oder getrennt zu verwerten.
Insbesondere werden folgende Verbesserungen realisiert:
- die Vorrichtung mit mehreren Reaktionsräumen (Kavitäten) für die PCR ist einfach und kostengünstig hersteilbar;
- das Aufteilen einer analytischen Probe auf verschiedene Reaktionsräume und die Zugabe der jeweils spezifischen Reagenzien ist realisiert;
- die PCR-Reaktionen in den unterschiedlichen Reaktionsräumen beeinflussen sich nicht gegenseitig;
- die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt ein rasches Aufheizen und Abkühlen der PCR-Reaktionsräume;
- die erfindungsgemäße Vorrichtung kann durch kostengünstige, industriell erprobte und volumenfähige Verfahren hergestellt werden;
- in der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden keine mechanisch bewegten Teile eingesetzt;
- die erfindungsgemäße Vorrichtung ist austauschbar.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe „Träger" und „Trägerelement" austauschbar verwendet.
Einer erfindungsgemäßen Vorrichtung kann über mindestens eine Einlassöffnung den mindestens zwei Reaktionsräumen eine Probenflüssigkeit zugeführt werden. In den beiden Reaktionsräumen können nun, unter Verwendung des gleichen Probenmaterials und innerhalb ein und derselben Vorrichtung zwei unterschiedliche PCR-Reaktionen durchgeführt werden.
Dazu sind in ein oder mehreren Reaktionsräume einer Vorrichtung ein oder mehrere unterschiedliche Reagenzien und Pufferbestandteile eingebracht. So können beispielsweise in einem ersten Reaktionsraum einer erfindungsgemäßen Vorrichtung
Primer für ein Amplifikat A und in einem zweiten Reaktionsraum derselben Vorrichtung Primer für ein Amplifikat B vorgelegt sein. Wird eine solche Vorrichtung nun mit einer Probeπlösung, die alle weiteren notwendigen Bestandteile für eine PCR-Reaktion, wie z.B. Pufferbestandteile, enthält, beladen, so ergibt sich im ersten Reaktionsraum ein Ansatz, der zur Amplifikation eines Teiles der in der Probe vorhandenen DNA führt, das Amplifikat A, während in Reaktionsraum zwei ein Ansatz entsteht, der zur Amplifikation eines anderen Teiles der in der Probe vorhandenen DNA führt, das Amplifikat B. Unter Verwendung einer einzigen Probenlösung können so in einer einzigen Vorrichtung mehrere parallele PCR- Reaktionen durchgeführt werden. Dies ist besonders dann vorteilhaft, wenn Amplifikate erzeugt werden sollen und ggf. deren Häufigkeit in einer Probe ins Verhältnis gesetzt werden sollen, die notwendigen Amplifikationsparameter für die beiden Amplifikate sich aber gegenseitig beeinflussen. In der modernen Molekularbiologie werden häufig Genexpressionsstärken normiert auf ein unverändertes Gen bestimmt, bevorzugt als differentielle Genexpressionsanalysen als Multiplex-PCR mit internem Standard. Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt nun, solche Multiplex-PCR-Reaktionen durchzuführen, ohne dass einzelne Probenansätze hergestellt werden müssen und ohne dass sich die beiden Amplifikate gegenseitig beeinflussen können.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist einen Träger auf. Dieser Träger kann grundsätzlich aus jedem Material bestehen in welchem eine oder mehrere Einlassöffnungen, eine oder mehrere Auslassöffnungen, mindestens zwei Reaktionsräume, Verbindungskanäle und verschließbare Ventile darstellbar sind. Bevorzugt weist der Träger ein Material auf, welches ausgewählt ist aus Silizium, Siiiziumverbindungen, Glas, Keramik, Metall, Papier, einem oder mehreren Polymeren oder Kombinationen davon. Insbesondere werden Materialien verwendet, die Temperaturen, die üblicherweise während eines PCR-Temperaturzyklus vorkommen, widerstehen können.
Dem Fachmann sind Verfahren zur Herstellung eines solchen Trägers bekannt. Bestimmte Materialien können sich besonders für bevorzugte Verfahren zur Herstellung des Trägers eignen. So eignen sich Polymere besonders gut zur Fertigung von Trägern durch Fräsen, Gravieren, Abformen oder aufbauende Polymerisation. Dagegen sind Glas, Silizium und Siliziumverbindungen besonders
geeignet zur Strukturierung mittels Ätzen oder Laserbehandlung. Auch Keramik oder Papiere können durch Form- und/oder Prägetechniken oder Laserbehandlung in ähnlicher Weise strukturiert werden.
Der Träger kann aus einem Stück gefertigt sein oder aus mehreren Teilen bestehen oder zusammengesetzt sein.
Des Weiteren kann der Träger auf Teilen oder allen seinen Oberflächen Beschichtungen aufweisen. Diese Beschichtungen können je nach Verwendungszweck der Vorrichtung und Lage im Träger funktionalisierte Oberflächen aufweisen.
Der Träger hat bevorzugt eine flache planare Form, besonders bevorzugt weist der Träger in seiner Grundform eine Quaderform auf. Ist der Träger in Quaderform, so weist der Quader in einer bevorzugten Form eine Breite von 5 bis 50 mm, eine Höhe von 1 bis 5 mm und/oder eine Länge von 50 bis 200 mm auf.
Der Träger weist mindestens eine Einlassöffnung auf. Diese Einlassöffnung ist so angebracht, dass über die Einlassöffnung der Vorrichtung eine Flüssigkeit zugeführt werden kann. Dazu ist die Einlassöffnung über Verbindungskanäie mit mindestens einem der Reaktionsräume des Trägers funktional verbunden. Der Träger kann eine oder mehrere Einlassöffnungen an beliebigen Stellen des Quaders aufweisen, die gegebenenfalls mit anderen mikrofluidischen Vorrichtungen gekoppelt oder verbunden sein können. Dabei können mehrere Einlassöffnungen mit einem einzigen Reaktionsraum direkt verbunden sein. Es kann aber auch nur eine Einlassöffnung auf einem Träger vorgesehen sein, die dann mit mehreren Reaktionsräumen des Trägers funktional verbunden ist. in diesem Fall kann die Einlassöffnung derart mit den Reaktionsräumen verbunden sein, dass ein oder mehrere Reaktionsräume in Reihe hintereinander mit Flüssigkeit versorgt werden können oder ein oder mehrere Reaktionsräume parallel nebeneinander mit Flüssigkeit versorgt werden können.
Der Träger weist mindestens eine Auslassöffnung auf, die durch Verbindungskanäle mit einem Reaktionsraum derart funktional verbunden ist, dass der Inhalt eines Reaktionsraumes über die Auslassöffnung aus dem Träger und aus der Vorrichtung ausgeführt werden kann. Eine Ausiassöffnung kann mit mehreren Reaktionsräumen eines Trägers verbunden sein, so dass der Inhalt dieser Reaktioπsräume über eine
gemeinsame Auslassöffnung aus der Vorrichtung entfernt werden kann. Gegebenenfalls können die Inhalte der Reaktionskammern auch in andere fluidische Vorrichtungen überführt oder weitergeleitet werden.
Der Träger weist mindestens zwei oder mehr Reaktionsräume auf. Als Reaktionsräume werden für die Zwecke der Erfindung Kavitäten oder Hohlräume, im Träger oder begrenzt durch den Träger und eine Foüe oder Membran, bezeichnet, die dazu dienen, dass in ihrem Inneren eine PCR-Reaktion ausgeführt wird. Zu diesem Zweck können die Reaktionsräume unterschiedliche Formen, Dimensionen und/oder Oberflächen aufweisen. Die Reaktionsräume der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind so gestaltet, dass eine Flüssigkeit im Inneren eines Reaktionsraums möglichst effektiv und schnei! durch einen externen Wärmeüberträger erwärmt oder abgekühlt werden kann. Die spezifischen Ausgestaltungen eines Reaktionsraumes ergeben sich für den Fachmann ohne Schwierigkeiten aus dem Zweck, für den er dienen soll. Jeder Reaktionsraum kann über eine eigene unabhängige Einlass- und/oder Auslassöffnung zugänglich sein oder mehrere Reaktionsräume können in Reihe oder parallel nebeneinander mit einer gemeinsamen Ein- und/oder Auslassöffnung funktional verbunden sein. Insbesondere können mindestens zwei Reaktionsräume derart miteinander verbunden sein, dass ein Flüssigkeitsstrom von einer Einlassöffnung durch einen ersten Reaktionsraum, dann durch einen zweiten Reaktionsraum hin zu einer Ausiassöffnung ermöglicht ist. Zwei oder mehr Reaktionsräume können eine gemeinsame Einlassöffnung und/oder Auslassöffnung aufweisen.
Der Träger weist Verbindungskanäle auf, die einen Ftüssigkeitsstrom von einer Einlassöffnung über mindestens einen Reaktionsraum hin zu einer Auslassöffnung erlauben. Dabei können Verbindungskanäle sowohf Ein- und Auslassöffnungen mit einem oder mehreren Reaktionsräumen verbinden, als auch mehrere Reaktionsräume untereinander derart miteinander funktional verbinden, dass ein Flüssigkeitsstrom nacheinander durch mehrere aufeinanderfolgende Reaktionsräume in Reihe hindurchgeleitet wird. Die Verbindungskanäle können in Teilen oder im Ganzen Oberflächen mit besonderen Eigenschaften aufweisen.
Der Träger weist Ventile auf, die jeweils an Einlass- und Auslassöffnungen der Vorrichtung angebracht sind. Dabei wird jede Ein- oder Auslassöffnung durch ein Ventil gesteuert. Alle Ventile sind normal offen und werden verschlossen durch mechanisches Anpressen der elastischen Folie in Ventilsitze durch einen formgleichen Aktuator oder Stempel. Dies gestattet reversibles Verschließen und Öffnen zwischen Ein- oder Auslassöffnung und der PCR-Reaktionskammer. Die besondere Ausbildung der Ventilsitze erlaubt ein sicheres und druckfestes Verschließen, wobei die Flussrichtung durch die spezielle Ausbildung dieser Ventile keinen Einfluss hat.
Durch diese Ventile sind die einzelnen Ein- und Auεlassöffnungen einzeln und unabhängig voneinander verschließbar. Dabei sind die Ventile derart angebracht, dass ein Flüssigkeitsstrom im Träger von einer Einlassöffnung zu einer Auslassöffnung geregelt werden kann.
Jedes dieser Ventile weist einen Ventilsitz auf, der derart in den Träger als Vertiefung eingelassen ist, dass sich der Ventilsitz an einer von außen zugänglichen Oberfläche des Trägers befindet. Diese Positionierung des Ventilsitzes erlaubt die Steuerung des Ventils von außen und führt dazu, dass bei einem erfindungsgemäßen Ventil auf bauliche Ausgestaltungen verzichtet werden kann, die eine interne Steuerung des Ventils zum Ziel haben. Das Ventil muss nicht an eine bestimmte Flussrichtung angepasst werden und kann für verschiedene Fiussrichtungen in gleichem Maße verwendet werden.
Weiter weist der Ventilsitz eine Form auf, in die ein formentsprechender Aktuator im Wesentlichen passgenau einsetzbar ist. Unter einem Aktuator wird dabei ein Mittel verstanden, welches die Steuerung eines Ventils von außen durch Erzeugung eines mechanischen Drucks erlaubt. Dabei sind Aktuator und dazugehöriger Ventilsitz derart aufeinander abgestimmt, dass die Oberfläche des Aktuators, die zum mechanischen Einpressen verwendet wird, im Wesentlichen passgenau in den Ventilsitz eines Ventils passt, wobei die Winkelrichtung des mechanischen Einpressvorgangs zu berücksichtigen ist und in Betracht gezogen werden muss, dass zwischen Aktuator und Ventilsitz noch eine Folie zum Liegen kommt. Aktuator, Ventilsitz und Folie sind bevorzugt so aufeinander abgestimmt, dass ein Ventil bei
eingepresstem Aktuator durch eine Folie derart geschlossen wird, dass ein Flüssigkeitsstrom über dieses Ventil vollständig und druckfest für die Zwecke der PCR-Reaktion unterbrechbar ist.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist mindestens eine elastische Folie auf, die mindestens einen Teil der Oberfläche des Trägers bedeckt. Insbesondere überdeckt die Folie einen oder mehrere Ventilsitze derart, dass zwischen Folie und Träger ein Hohlraum über dem Ventilsitz entsteht. Dabei ist die elastische Folie so angebracht, dass sich die Folie durch mechanisches Einpressen mittels einem, dem Ventilsitz formentsprechenden, externen Aktuator, in Richtung des Ventilsitzes dehnt und sich der Oberfläche des Ventilsitzes anlagern kann. Durch erfolgte Anlagerung der elastischen Folie an eine Oberfläche des Ventilsitzes ist ein Ventil verschließbar ausgestaltet.
Die Folie ist dabei aus einem Material hergestellt, welches ausreichend elastisch ist, um ein bevorzugt mehrfaches Dehnen der Folie bis auf eine Oberfläche eines Ventilsitzes zu erlauben, ohne dass die Folie der Belastung nicht mehr standhält. Daneben ist die Folie derart beschaffen, dass eine Flüssigkeit, die in der erfind ungsgemäßen Vorrichtung gehandhabt werden soll, die Folie nicht ohne weiteres durchdringen kann. Geeignete Materialien sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt bedeckt eine Folie im Wesentlichen eine ganze Oberfläche eines Trägers. Dies kann insbesondere aus fertigungstechnischen Gründen besonders sinnvoll sein.
Insbesondere kann solch eine Folie eine oder mehrere Oberflächen des Trägers bedecken.
Reaktionsräume und/oder Verbindungskanäle der erfindungsgemäßen Vorrichtung können vollständig vom Träger umschlossen sein. Mit anderen Worten, Reaktionsräume und/oder Verbindungskanäie können vollständig im Inneren des Trägers angeordnet sein.
Reaktionsräume und/oder Verbindungskanäle können auch nur teilweise vom Träger umschlossen sein. In diesen Fällen wird nicht die gesamte Ausdehnung des Reaktioπsraums und/oder des Verbindungskanals von Trägermateria! begrenzt. Ein
Tei! dieser Begrenzung wird von einem anderen Material bewirkt. Dieses andere Material kann beispielsweise eine Foüe und/oder eine Membran sein. Insbesondere kann es sich bei diesem Material um eine Foüe handeln, die auch einen Ventilsitz des Trägers bedeckt. Dabei können die Reaktionsräume und/oder Verbindungskanäie einseitig oder mehrseitig, überwiegend oder nur in bestimmten Abschnitten von einer Folie oder Membran begrenzt werden.
Um eine möglichst schnelle Temperaturübertragung in die Reaktionsräume der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu erlauben, ist der Träger im Bereich der Reaktionsräume möglichst dünn und bietet möglichst eine großflächige Auflagefiäche für einen externen Wärmeübertrager, insbesondere kann die durchschnittliche Dicke des Trägers im Bereich eines Reaktionsraumes kleiner sein als die entsprechende, über die ganze Fläche des Trägers gemittelte Dicke des Trägers.
Dem Fachmann ist bewusst, dass eine möglichst erfolgreiche und schnelle Wärmeübertragung erreicht werden soll. Um diesen Zweck erreichen zu können, müssen die erfindungsgemäße Vorrichtung und der verwendete externe Wärme Übertrag er aufeinander abgestimmt sein. Dies ist dem Fachmann ohne Schwierigkeiten und ohne unzumutbaren Aufwand möglich.
In einer besonderen Ausführungsform können ein oder mehrere Reaktionsräume bereits ein oder mehrere Reagenzien beinhalten, bevor der Vorrichtung eine Probenlösung zugeführt wird. Unter dem Begriff Reagenz kann für diesen Zweck jedes Material und/oder jede Verbindung oder jedes Gemisch von Verbindungen verstanden werden, welches in einer PCR-Reaktion eingesetzt werden kann. Bevorzugt kann es sich bei Reagenzien um übliche Additive zu einer PCR-Reaktion handeln und/oder um Primer oder Primer-Paare. Sinn und Zweck dieser Reagenz- Vorlage in einzelnen oder mehreren Reaktionsräumen ist es, ggf. unterschiedliche Reagenzien bereits vor Probenzufuhr in die jeweiligen Reaktionsräume zu verbringen. Die einzelnen PCR-Ansätze in den verschiedenen Reaktϊonsräumen werden dann komplettiert durch Zugabe eines gemeinsamen Probenmixes zu allen Reaktionsräumen, der alle weiteren notwendigen Bestandteile des PCR-Ansatzes enthält.
Das Reagenz oder die Reagenzien können in flüssiger, gasförmiger, fester und/oder Gei-förmiger Form in einen oder mehrere Reaktionsräume vorgelegt werden.
Insbesondere kann in mindestens einem Reaktionsraum mindestens ein Reagenz vorliegen, bevorzugt in fester oder gelartiger Form.
Das vorgelegte Reagenz oder die vorgelegten Reagenzien können in mindestens zwei Reaktionsräumen unterschiedlich sein.
Um eine vorzeitige Lösung eines vorgelegten Reagenz in einem Probenmix bereits bei der Beladung der Vorrichtung mit einem gemeinsamen Probenmix zu verhindern, kann das vorgelegte Reagenz eine Schutzschicht aufweisen, die eine Lösung des Reagenz in einer Flüssigkeit verzögert. Beispielsweise kann eine solche Schutzschicht Paraffin enthalten. Beispielsweise kann eine solche Schutzschicht erst bei höheren Temperaturen, wie z.B. während des ersten Temperaturzykius, aufgeschmolzen werden und setzt erst dann die darin enthaltenen Reagenzien frei.
Der Träger mit Reaktionsräumen und Verbindungskanälen ist mit verschiedensten Materialien mit technisch üblichen Fertigungsverfahren realisierbar. Bevorzugt bietet sich an, Polymere durch Fräsen, Gravieren, Abformen oder aufbauende Polymerisation zu strukturieren. Silizium, Siiiziumverbindungen und Glas lassen sich fertigungsfreundlich durch Ätzen oder auch mit Lasern strukturieren. Auch Keramik oder spezielles Papier können durch Form- und Prägetechniken oder Laser in analoger Weise strukturiert werden. Beschichtungen, Sandwichanordnungen und Materialkombinationen ermöglichen dabei spezielle Eigenschaften für Teile oder für die ganze erfindungsgemäße Vorrichtung zu realisieren. So können Diffusionssperren mit Metalifolien erreicht werden oder mit bekannten hydrophoben oder hydrophilen Beschichtungen die Benetzungseigenschaften eingestellt werden. Auch für adsorptionshemmende Eigenschaften werden bekannte Beschichtungen z.B. mit Silanen oder geeigneten Polymeren verwendet.
Reaktionsräume, Verbindungskanäle und Teile oder die ganze Oberfläche des Trägers können mit Folie abgedeckt werden. Dies kann mittels technologisch eingeführter Verfahren einseitig oder beidseitig geschehen. Beispielsweise wird eine
Laminierung des Trägers mit einer ggf. elastischen Folie kostengünstig ganzflächig ausgeführt und durch thermische Verbindung oder Kleben erreicht. Sie kann aber auch durch Laser aufgeschweißt werden. Die Elastizität der Folien kann dabei so gewählt werden, dass sowohl eine formstabile Abdeckung der Kanäle und Reaktionsräume erreicht wird, als auch das formschlüssige Einpressen externer Aktuatoren in die Ventilsitze als dichtender Abschluss gegeben ist.
in gleicher Weise wie durch Folien, lässt sich z.B. durch Membranen, bei denen die Dicke des Trägerelementes im Bereich der Reaktionsräume bis auf das konstruktive und fertigungstechnische Minimum verringert wird, die Wärmekapazität an diesen Stellen erheblich reduzieren. Dies erlaubt einen raschen Wechsel der PCR- typischen Temperaturen mit alternierender Heizung und Kühlung und führt zu entscheidend verkürzten PCR-Zyklen und im Ergebnis zu kurzen Analysezeiten.
Die Reaktionsräume sind direkt oder indirekt mit den Ein- und Auslassöffnungen verbunden. Dies kann beispielsweise direkt eine Öffnung sein, wie in Fig. 2c dargestellt, oder z.B. über Röhrchen oder Kanülen erfolgen, die direkt im Träger verankert sind und den Zugang zu einem Verbindungskanal herstellen. Die gewählte Festigkeit der Folien kann ihre Penetration an den Ein- und Auslassöffnungen mit Nadeln, Kanülen oder ähnlichem gestatten. Dadurch werden die Ein- und Auslassöffnungen geöffnet. Die Öffnungen können auch vorab bei der Fertigung mittels Bohren, Lasern oder Stanzen in die Folien eingebracht werden. Mit Druck auf die Öffnungen aufgesetzte und abdichtende Flüssigkeitszuführungen bekannter Ausführung ermöglichen dabei die Verbindung mit externen Flüssigkeitsreservoiren. Mittels extern erzeugtem hydraulischem Druck können Flüssigkeiten in bekannter Weise meist aus Reservoiren in die erfindungsgemäße Vorrichtung transportiert werden.
In einer besonderen Ausführung können solche Reservoire mit Flüssigkeiten auch in der Vorrichtung selbst mit Zugang zu den Eiπlassöffnungen angeordnet sein. Da den Ein- und Auslässen jeweils ein individuell kontrollierbares Ventil zugeordnet ist, kann jeder Reaktionsraum nach Befüllen mit Proben und ggf. mit Reagenzien verschlossen werden (Fig. 4). Dieser Verschluss ist für das Erhitzen auf 940C notwendig, um während der PCR-Reaktion das Austreten von Flüssigkeit oder Dampf zu verhindern.
Bei der Einbringung von Proben in hintereinander liegende Reaktionsräume muss die Probe eine oder mehrere Kammern passieren, ohne dass sich die dort vorab platzierten Reagenzien dabei auflösen, damit sie nicht in andere Kavitäten verschleppt werden (vgl. Fig. 3b). Dazu werden die in den Kanälen oder Reaktionsräumen eingetrockneten Reagenzien zur Verhinderung einer unkontrollierten Auflösung besonders geschützt, z.B. können sie mit Schutzschichten versehen werden oder insgesamt in Gele eingelagert sein. Günstig ist z.B. eine Schutzschicht aus Paraffin, die erst bei den höheren Temperaturen im ersten PCR- Zyklus aufgeschmolzen wird und die Reagenzien wirksam werden lässt. Eine ebenso wirksame Verzögerung des Auflösens von fest vorgelegten Reagenzien kann durch sich langsam auflösende Gele oder Zuckerschichten oder wasserlösliche Polymere erreicht werden.
Die spezielle Ausbildung der Ein- und Auslässe mit den Ventilen ermöglicht kurze Richtungswechsel des Flüssigkeitsstromes beim Einbringen der Proben. Der Richtungswechsel des Flüssigkeitsstromes fördert die Auflösung der Flüssigkeiten und auch die effektive Vermischung von Flüssigkeiten. Dabei wird insbesondere die in Mikrostrukturen auftretende laminare Strömung, die eine Vermischung behindert, entschieden eingeschränkt. Hier bewirken die Ecken und Kanten eine Verwirbelung der Flüssigkeiten.
Flüssige PCR-Proben und unterschiedliche Reagenzien können vor Einbringung in die Reaktionsräume vermischt werden oder auch nacheinander eingebracht werden. Eine Vermischung wird meist beim Aufheizen während der ersten PCR-Reaktion erreicht. Genügt dies nicht, so können kurzzeitige Richtungswechsel des Flüssigkeitsstromes eine effektive Vermischung bewirken.
Reagenzien können in fester Form in die Reaktionsräume oder in die Verbindungskanäle oder separate Kavitäten vorab vorgelegt werden. Dies erfolgt bevorzugt vor der Laminierung des Trägerelementes mit Folien. Gebräuchlich zur Herstellung solcher Reservoire mit festen Reagenzien sind die Lyophylisierung von flüssig eingebrachten Reagenzien oder die kontrollierte Trocknung z.B.
Gefriertrocknung. Auch die portionierte Befüllung mit festen oder gelartigen Reagenzien ist möglich.
Erfindungsgemäß bietet sich auch die Kombination fester und flüssiger Komponenten der Reagenzien für die PCR an, wie z.B. bei einem Umpufferungsschritt Hierbei wird beispielsweise eine Probe oder Produkt in eine Kavität oder einen Reaktionsraum transportiert, in dem Pufferbestandteile in fester Form gelagert sind. Durch kurze Richtungswechsel des Flüssigkeitsstromes wird deren Auflösung und auch die effektive Vermischung von Flüssigkeiten und die Auflösung von Stoffen in gleicher Weise gefördert, wie das Schütteln eines Gefäßes.
Wahlweise können unterschiedliche PCR-Produkte getrennt entnommen oder vereinigt werden.
Nach der PCR sind die PCR-Produkte kontrolliert entnehmbar. Je nach Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung können die Produkte mit Hilfe der Ventile nacheinander entnommen oder für eine nachfolgende instrumenteile Analyse wieder vereinigt oder weitergeleitet werden.
Mit der erfindungsgemäßen Ausführung der Vorrichtung mit integrierten Ventilen und parallel nutzbaren PCR-Reaktionsräumen entsteht eine einfache Problemlösung zur Ausführung komplexer paralleler PCR in einer einzelnen, kostengünstig herzustellenden Vorrichtung. Darüber hinaus reduzieren die Maßnahmen zur Reduktion des Wärmewiderstandes der Reaktionsräume ganz erheblich die erforderliche Analyεezeit, wobei 40 PCR-Zyklen in ca. 30 min ausgeführt werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist in besonderer Weise geeignet, trockene und vorab in den Kanälen und Kavitäten bevorratete Reagenzien zu nutzen, also ein komplettes Modul kostengünstig bereitzustellen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Ausführung mehrerer paralleler PCR-Reaktionen im Durchfiussverfahren, umfassend die Schritte: i) Bereitstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
ü) Befüllen der Reaktionsräume der Vorrichtung über eine oder mehrere
Einlassöffnungen; iii) Verschließen der Ventile an den Ein- und Auslassöffnungen durch externe
Aktuatoren; iv) Aussetzen der Reaktionsräume der Vorrichtung einer zyklischen
Wiederholung von Temperaturabfolgen, die eine PCR-Reaktion erlauben; v) Entleeren der Reaktionsräume der Vorrichtung über eine oder mehrere
Auslassöffnungen.
Dabei können ein oder mehrere Reaktionsräume der Vorrichtung durch hydraulischen Druck z.B. mit Probenmtx und/oder mit einzelnen oder mehreren Reagenzien befüllt und/oder von Inhalten der Reaktionsräume befreit werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können in einzelne oder mehrere Reaktionsräume der Vorrichtung gleiche und/oder unterschiedliche Reagenzien zusammen oder nacheinander eingebracht werden.
Insbesondere können mindestens zwei der Reaktionsräume der Vorrichtung unterschiedliche Reagenzien enthalten, bevor mit Schritt iv) fortgefahren wird.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können zwischen Schritt ii) und iii) bereits in den Reaktionsräumen vorhandene Reagenzien gelöst werden, bevorzugt durch wiederholte Richtungsänderung des Flüssigkeitsstroms in der Vorrichtung.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verwendungen einer erfindungsgemäßen Vorrichtung oder eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur parallelen Amplifikation unterschiedlicher Zieisequenzen bei Nutzung der gleichen Ausgangsprobe oder zur Durchführung von PCR-Reaktionen, insbesondere von Multiplex-PCR-Reaktionen.
Insbesondere erlaubt die Erfindung eine frei wählbare Anzahl und Form von PCR- Reaktionsräumen mit zugeordneten Ein- und Auslässen sowie Ventilen zu kombinieren.
Die erfindungsgemäße Anordnung erlaubt es eine PCR-Probe auf zwei oder mehr PCR-Reaktionsräume aufzuteilen indem diese parallel oder hintereinander mit Probenflüssigkeit befüllt werden. Die zur PCR notwendigen Reagenzien können jeweils der für einen Reaktionsraum vorgesehenen Probenmenge vorab beigemischt werden und dann hydraulisch z.B. durch externe Pumpen oder Injektionen eingebracht werden. Alternativ können die Reagenzien fest oder flüssig in die Reaktionsräume oder Verbindungskanäle oder vorgelagerte Kavitäten während der Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingebracht und nach dem Trocknen mit den Folien bedeckt werden, z, B. durch kleben oder aufsiegeln.
Die erfindungsgemäße Lösung und Kombination von unterschiedlichen PCR- Reaktionen in räumlich getrennten und durch die Ventile abgeschlossenen Reaktionsräumen verhindert sicher eine Vermischung oder Beeinflussung.
Die erfindungsgemäße Begrenzung der PCR-Reaktionsräume zu den externen Wärmeübertragern durch dünne Folien oder spezielle dünne Membranen oder eine besonders dünne Trägerausführung führt zu entscheidend verkürzten PCR-Zyklen und im Ergebnis kurzen Analysezeiten.
Zur Herstellung der Vorrichtung werden industriell erprobte Fertigungsverfahren, wie z.B. Spritzgießen und Laminieren verwendet Sie sind damit kostengünstig und effektiv hersteilbar.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Figurenbeschreibung von Ausführungsbeispielen.
Figuren:
Es zeigen in jeweils schematischer Darstellung
Fig. 1 Ansicht Element zur parallelen Durchfluss-PCR
Fig. 2a Querschnitt Element zur Durchfluss-PCR
Fig. 2b Querschnitt Element zur Durchflυss-PCR mit Stützgerüst
Fig. 2c Detail: Schema Einlass mit Ventil im Querschnitt
Fig. 3a Schema Durchfluss-PCR mit Kavitäten parallel
Fig. 3b Schema Durchfluss-PCR mit Kavitäten in Reihe
Fig. 4 Temperaturprofil im Inneren eines PCR-Reaktionsraumes des erfindungsgemäßen Elementes während externer Heizung und Kühlung
Allgemeine Beschreibung der Funktionsweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens anhand von Ausführungsbeispielen:
In Fig. 1 ist eine Ausführungsform einer erftndungsgemäßen Vorrichtung in perspektivischer Aufsicht dargestellt, die zeigt wie das Trägerelement 1 auf einer Oberfläche ganzfiächig mit einer Folie 2 bedeckt ist. Die Zufuhr und Ableitung von Proben und Flüssigkeiten erfolgt durch Einlass- bzw. Ausiassöffnungen mit integrierten Ventilen 3a bis 3d. Ein Zu- bzw. Abfluss kann auch durch die Befestigung von Röhrchen im Träger 1 selbst mit Zugang zu Kammern oder Kanäle realisiert werden. Die Teile 7a und 7b stellen Wärme Überträger in Plattenform dar, die von außen formschlüsstg an die erfindungsgemäße Vorrichtung angedrückt werden können.
Fig. 2a zeigt einen Querschnitt A - A' entsprechend Fig. 3a durch eine weitere Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei die Kavitäten 4a1 und 4a2, sowie 4b1 und 4b2 jeweils zu einer Kavitat 4a und 4b gehören, die als PCR-Reaktionsräume im Trägerelement 1 eingearbeitet sind. Das Material des Trägers 1 unter dem Boden dieser Kavitäten 4a und 4b ist erfindungsgemäß bis auf das konstruktive und fertigungstechnische Minimum reduziert, um einen schnellen Wärmeübergang zu den externen Wärmeüberträgern 7a und 7b zu erzielen. Die Folie 2 auf den Kavitäten 4a und 4b schafft eine Abdeckung der PCR- Reaktionsräume und erlaubt ebenfalls einen schneiten Wärmeübergang zu den externen Wärmeüberträgern 7a und 7b. Dies wird insbesondere dadurch erreicht,
dass der Wärmeüberträger 7 a und 7b der Materialstrukturierung an der Unterseite des Trägerelementes formschlüssig angepasst wird (Fig. 1).
Fig. 2b zeigt eine andere Ausführung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. Der Querschnitt A - A' entsprechend Fig. 3a zeigt die Kavitäten 4a und 4b als PCR- Reaktionsräume im Trägerelement 1 eingearbeitet. Die beidseitige Abdeckung der PCR-Reaktionsräume mit Folien 2a und 2b erlaubt wiederum einen schnellen Wärmeübergang zu den externen Wärmeüberträgern 7a und 7b. Die mechanische Stabilisierung wird mit den Stützelementen 6a bis 6c aus beliebigen Materialien erreicht.
Fig. 2c zeigt den Querschnitt eines Teiles einer erfindungsgemäßen Vorrichtung im Bereich der Ein- und Auslässe mit integrierten Ventilen 3. Dabei wird durch das Anpressen eines externen Stempeis/Aktuators 8 die Folie des Trägerelementes in einen Ventilsitz 9 gepresst und der Weg einer Flüssigkeit vom Einlass 3 zum PCR- Reaktionsraum 4 sicher abgesperrt. Beim Entfernen des Stempels öffnet sich das Ventil durch die Elastizität der Folie 2a.
!n Fig. 3a ist das Schema einer erfindungsgemäßen Vorrichtung in einem Trägerelement 1 mit parallel angeordneten Kavitäten als Reaktionsräume 4a und 4b, den Verbindungskanälen 5a bis 5d und den Ein und Auslassöffnungen mit integrierten Ventilen 3a bis 3d dargestellt. Dabei ist jede der Ein- oder Auslassöffnungen unabhängig mit einem integrierten Ventil zu öffnen oder zu schließen. Mit dieser Anordnung kann jeder PCR-Reaktionsraum unabhängig mit flüssigen Proben und PCR-Reagenzien befüllt werden. Alternativ können verschiedene PCR-Reagenzien vorab in fester Form in die Kammern eingebracht werden. Die PCR-Produkte stehen nach erfolgter Amplifikation getrennt zur Verfügung.
In Fig. 3b ist das Schema einer Anordnung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung in einem Trägerelement 1 mit in Reihe angeordneten Kavitäten 4a und 4b, den Verbindungskanälen 5a, b und c und den Ein- und Ausiassöffnungen 3a und 3b dargestellt. Dabei dient eine Öffnung mit integriertem Ventil als Einlass und die zweite als Auslass. In dieser Anordnung füllen sich die PCR-Reaktionsräume
nacheinander mit Probenflüssigkeit, wobei die in den einzelnen Reaktionsräumen unterschiedlichen PCR-Reagenzien vorab in fester Form eingebracht wurden. Bei der Befüllung der ersten Kammer werden diese Reagenzien von der Flüssigkeit überströmt, ohne dass sie sich auflösen.
In Fig. 4 ist die gemessene Temperatur im Inneren eines PCR-Reaktionsraumes einer erfindungsgemäßen Vorrichtung während der PCR-Reaktion und bei externer Heizung und Kühlung dargestellt, Die steilen Flanken der Temperaturkurven und der geringe Zeitbedarf für einen kompletten PCR-Temperaturzyklus im Vergleich zu konventionellen PCR-Cyclem zeigen die vorteilhafte Auswirkung der Nutzung von Folien zu Begrenzung der Reaktionsräume.
Einige besondere Ausführungsformen:
Verfahren und Vorrichtung zur Durchfluss-PCR, unter Benutzung einer Vorrichtung bestehend aus: a) einem Trägerelement mit Kanälen und zwei oder mehr PCR- Reaktionsräumen, die von Folien oder Membranen bedeckt sind, b) selektiv verschließbaren Ein- und Auslässen für diese Reaktionsräume und aufweisend folgende Handhabungen:
Ein- und Ausbringen von Proben mit einem Flüssigkeitsstrom in die Reaktionsräume,
Ausführung von zwei oder mehr PCR-Reaktionen in einem
Trägereiement, wahlweise Nutzung flüssiger oder fester Reagenzien zur PCR.
Anordnung zur Durchführung des oben genannten Verfahrens, wobei die Träger aus Polymeren oder Silizium oder Siliziumverbindungen oder Gias oder Keramik oder Metallen oder Papier oder Kombinationen aus solchen bestehen können.
Vorgenannte Anordnung zur Durchführung des Verfahrens, wobei PCR- Reaktionsräume, Kavitäten und Verbindungskanäle in das Trägerelement eingearbeitet sind.
Vorgenannte Anordnung zur Durchführung des Verfahrens, wobei PCR- Reaktionsräume, Kavitäten und Verbindungskanäle und das Trägerelement einseitig oder beidseitig mit einer Folie abgedeckt sind.
Vorgenannte Anordnung zur Durchführung des Verfahrens, wobei die Dicke des Trägerelementes im Bereich der PCR-Reaktioπsräume auf Membranstärke verringert ist.
Vorgenannte Anordnung zur Durchführung des Verfahrens, wobei Ein- und Auslässe in der Folie oder Membran und/oder dem Trägerelement angeordnet sind.
Vorgenannte Anordnung zur Durchführung des Verfahrens, wobei den Ein- und Auslässen jeweils ein individuell kontrollierbares Ventil zugeordnet ist.
Vorgenannte Verfahren und Anordnung, wobei flüssige Proben und gegebenenfalls Reagenzien durch hydraulischen Druck in die Reaktionsräume eingebracht werden.
Vorgenannte Verfahren und Anordnung, wobei die Ein- und Auslässe durch externe Vorrichtungen geöffnet oder druckfest verschlossen werden.
Vorgenannte Verfahren und Anordnung, wobei durch geeignete Kanalführung und Ventilanordnung Proben wahlweise in die PCR-Reaktionsräume verteilt werden.
Vorgenannte Verfahren und Anordnung, wobei in die PCR-Reaktionsräume Proben und unterschiedliche Reagenzien zusammen oder nacheinander eingebracht werden.
Vorgenannte Verfahren und Anordnung, wobei in die PCR-Reaktionsräume oder Kanälen oder separaten Kammern unterschiedliche Reagenzien vollständig oder teilweise in fester oder gelartiger Form vorab vorgelegt wurden.
Vorgenannte Verfahren und Anordnung, wobei in fester oder gelartiger Form vorgelegte Reagenzien mit Schutzschichten versehen wurden, die ein Auflösen verzögern oder nur durch besondere Maßnahmen erlauben.
Vorgenannte Verfahren und Anordnung, wobei in PCR-Reaktionsräumen oder Kanälen oder separate Kammern Pufferbestandteile in fester Form vorab vorgelegt wurden, die ein Umpuffern von Proben oder Produkten bewirken.
Vorgenannte Verfahren und Anordnung, wobei durch geeignete Kanalführung und Ventilanordnung wahlweise unterschiedliche PCR-Produkte getrennt entnommen oder vereinigt werden.
Bezugszeichenliste
1 Trägerelement
2 elastische Folie
2a elastische Folie auf der Oberseite des
Trägerelements b elastische Folie auf der Unterseite des
Trägereiements , 3a, 3b, ... 3n Einlass-/Auslass mit Ventil , 4a, 4a1 , 4a 1 , 4b, 4b1 , 4b2 Kavität /PCR-Reaktionsraum , 5a, 5b, ... 5n Verbindungskanal , 6a, 6b, 6c Stützelement a, 7b externer Wärmeüberträger
externer Ventüaktuator
Ventilsitz
Claims
1. Vorrichtung zur Ausführung mehrerer paralleler PCR-Reaktioneπ im Durchflussverfahren, umfassend:
1) einen Träger, der a) mindestens eine Einlassöffnung, b) mindestens eine Auslassöffnung; c) mindestens zwei Reaktionsräume, d) Verbindungskanäle, die einen Fiüssigkeitsstrom von einer Einlassöffnung über mindestens einen Reaktionsraum hin zu einer Auslassöffnung erlauben, und e) Ventile an Einlass- und Ausiassöffnungen, die unabhängig voneinander verschließbar sind und die derart angebracht sind, dass ein Flüssigkeitsstrom im Träger von einer Einlassöffnung zu einer Auslassöffnung geregelt werden kann, wobei die Ventile jeweils einen Ventilsitz aufweisen, der derart in den Träger als Vertiefung eingelassen ist, dass sich der Ventilsitz an einer von außen zugänglichen Oberfläche des Trägers befindet und der Ventilsitz eine Form aufweist, in die ein formentsprechender externer Aktuator im Wesentlichen passgenau einsetzbar ist, aufweist; und
2) eine elastische Folie, die mindestens einen Teil der Oberfläche des Trägers bedeckt und einen Ventilsitz eines Ventils e) derart überdeckt, so dass zwischen Folie und Träger ein Hohlraum entsteht und die elastische Folie, durch mechanisches Einpressen der Folie über einem Ventilsitz durch einen dem Ventilsitz formentsprechenden, externen Aktuator, einer Oberfläche des Ventilsitzes anlagerbar ist und dadurch ein Ventil e) verschließbar ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass jeder Reaktionsraum eine eigene unabhängige Einlassöffnung und Auslassöffnung aufweist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens zwei Reaktionsräume derart miteinander verbunden sind, dass ein Flüssigkeitsstrom von einer Einlassöffnung durch einen ersten Reaktionsraum, dann durch einen zweiten Reaktionsraum hin zu einer Auslassöffnung ermöglicht ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens zwei Reaktionsräume eine gemeinsame Einlassöffnung und Auslassöffnung aufweisen.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein Material aufweist, welches ausgewählt ist aus Silizium, Siliziumverbindungen, Glas, Keramik, Metall, Papier, einem Polymer oder Kombinationen davon.
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Folie eine oder mehrere Oberflächen des Trägers ganz oder teilweise bedeckt.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Reaktionsräume und/oder Verbindungskanäle vollständig vom Träger umschlossen sind.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Reaktionsräume und/oder Verbindungskanäle teilweise vom Träger umschlossen sind.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Reaktionsräume und/oder Verbindungskanäle einseitig oder mehrseitig von einer Folie begrenzt werden.
10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die durchschnittliche Dicke des Trägers im Bereich eines Reaktionsraumes geringer ist als die entsprechende, über die ganze Fläche des Trägers gemittelte Dicke des Trägers.
11. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Reaktionsraum mindestens ein Reagenz vorliegt, bevorzugt in fester oder gelartiger Form.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass in den mindestens zwei Reaktionsräumen mindestens ein Reagenz unterschiedlich ist.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz eine Schutzschicht aufweist, die eine Lösung des Reagenz in einer Flüssigkeit verzögert.
14. Verfahren zur Ausführung mehrerer paralleler PCR-Reaktionen im Durchflussverfahren, umfassend die Schritte: i) Bereitstellung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13; ii) Befüllen der Reaktionsräume der Vorrichtung über eine oder mehrere
Einlassöffnungen; iii) Verschließen der Ventile an den Ein- und Auslassöffnungen durch externe
Aktuatoren; iv) Aussetzen der Reaktionsräume der Vorrichtung einer zyklischen
Wiederholung von Temperaturabfolgen, die eine PCR-Reaktion erlauben; v) Entleeren der Reaktionsräume der Vorrichtung über eine oder mehrere
Auslassöffnungen.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsräume der Vorrichtung durch hydraulischen Druck befüllt und/oder entleert werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass in die Reaktionsräume der Vorrichtung gleiche und/oder unterschiedliche Reagenzien zusammen oder nacheinander eingebracht werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei der Reaktionsräume der Vorrichtung unterschiedliche Reagenzien aufweisen, bevor mit Schritt iv) fortgefahren wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen Schritt ii) und iii) bereits in den Reaktionsräumen vorhandene Reagenzien gelöst werden, bevorzugt durch wiederholte Richtungsänderung des Flüssigkeitsstroms in der Vorrichtung.
19. Verwendung einer Vorrichtung gemäß Ansprüchen 1 bis 13 oder eines Verfahrens gemäß Ansprüchen 14 bis 18 zur parallelen Amplifikation unterschiedlicher Zielsequenzen bei Nutzung der gleichen Ausgangsprobe.
20. Verwendung einer Vorrichtung gemäß Ansprüchen 1 bis 13 oder eines Verfahrens gemäß Ansprüchen 14 bis 18 zur parallelen Amplifikation unterschiedlicher Zielsequenzen.
21. Verwendung einer Vorrichtung gemäß Ansprüchen 1 bis 13 oder eines Verfahrens gemäß Ansprüchen 14 bis 18 zur Durchführung von PCR-Reaktionen.
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