KR20070052958A

KR20070052958A - Ｏｎ－ｃｈｉｐ 폴리머 밸브를 가진 ＰＣＲ용 플라스틱 칩

Info

Publication number: KR20070052958A
Application number: KR1020050110789A
Authority: KR
Inventors: 권순철; 이주원; 조준형
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 2005-11-18
Filing date: 2005-11-18
Publication date: 2007-05-23
Also published as: TW200734456A; US20070117201A1; WO2007058433A1; WO2007058433A8

Abstract

본 발명은 폴리머 밸브를 가진 PCR용 플라스틱 칩에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 나노리터 단위의 소량의 샘플을 마이크로 챔버 내에서 일정한 온도로 유지하고 온도구배에 민감하게 사이클링할 수 있는 폴리머 밸브를 가지는 PCR용 플라스틱칩에 관한 것이다.

본 발명의 PCR 용 플라스틱 칩은 종래의 PCR 칩에 비하여 PCR 챔버를 소형화하여 적은 양의 시료로도 반응을 수행할 수 있으며, PCR 챔버의 표면적이 넓어짐에 따라 가열/냉각에 소요되는 시간이 줄어 반응시간을 줄일 수 있으며, 하나 이상의 PCR 챔버를 장착하여 한꺼번에 다양한 유전자를 증폭할 수 있다.

온 칩 밸브, 플라스틱 칩, 마이크로 사출성형, 열접합

Description

Ｏｎ－ｃｈｉｐ 폴리머 밸브를 가진 ＰＣＲ용 플라스틱 칩{Plastic Chip for PCR Having On-chip Polymer Valve}

도 1은 플라스틱 폴리머 원료로부터 미세유동 채널을 가진 플라스틱 칩을 마이크로 사출 성형하는 제조공정을 나타낸 모식도이다.

도 2는 본 발명의 PCR용 플라스틱 칩의 모식도이다.

도 3은 마이크로 플라스틱 챔버에서 PCR 온도 사이클링시에 챔버 속의 용액의 온도와 외부 마이크로 히터의 온도변화를 측정한 그래프이다.

도 4는 본 발명의 PCR용 플라스틱 칩을 이용하여 플라스미드를 주형으로 PCR을 실시한 결과를 기존 벤치탑머신(bench top machine)을 이용한 PCR 결과와 비교한 것이다.

도 5는 본 발명의 PCR용 플라스틱 칩을 이용하여 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 실시한 결과를 기존 벤치탑머신(bench top machine)을 이용한 PCR 결과와 비교한 것이다.

유전자를 증폭하는 기술은 플라스틱 튜브를 이용하는 것으로부터 마이크로 채널을 가진 칩의 형태로 발전되었다. 단시간에 여러 종류의 유전자를 한 번에 판별하려는 이유에서, 마이크로 칩 상에서의 유전자 증폭은 반도체 제조공정을 이용한 실리콘기판 (Lagally, E.T. et al., Lab on a Chip, 1:102, 2001) 이나 PDMS (Hong, J. W. et al., Electrophoresis, 22:328, 2001)를 재료로 한 칩에서 많이 시도되어왔다. 이러한 방법은 플라스틱 튜브를 이용하는 방법에 비하여, 사용되는 시료의 양과 총 증폭시간을 상당히 단축시켰지만, 반도체 제조공정을 이용함으로써 일회용칩으로 사용되기에는 칩 가공단가에 대한 경제성이 많이 떨어지는 단점이 있었다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 플라스틱 폴리머를 미세성형하여 마이크로 채널을 형성시켜 유전자 증폭에 사용하는 기술이 개발되었다 (Koh, C.G. et al., Analytical Chemistry, 75:4591, 2003).

그러나, 상기와 같은 마이크로 채널을 사용하는 경우에는 PCR 반응시 고온에 의하여 챔버 내의 반응용액이 증발하거나 누수되는 단점이 있었으며, 이를 극복하기 위하여 마이크로 채널을 효율적으로 개폐할 수 있는 밸브의 개발이 요구되어 왔 다.

지금까지 개발된 마이크로 채널의 개폐 방법에는 전자기장, 열, 공기압, 피에조(piezo) 등을 이용하며 다이아프램에 직접 적인 힘을 가함으로 다이아프램이 휘어서 마이크로 채널의 입구와 출구를 밀폐하는 다이아프램 (diaphragm) 밸브를 이용하는 방법(미국특허 6,168,948) 및 온도에 따라 상변화하는 폴리머 물질을 마이크로 채널에 고정시키고 외부의 히터를 이용하여 액체의 점도를 증가시켜 졸-겔 변환을 유도함으로 PCR 온도 사이클링 이전의 생화학 유체를 마이크로 채널의 일정부분에 가두어 두는 미세 유체 밸브(미국특허 6,382.254 및 대한민국 특허출원 2004-0075217)등이 있다. 그러나, 이러한 개폐방법들은 전자기장, 열, 피에조 등을 사용하여 복잡하고 경제적이지 못하였으며, 졸-겔 변환법은 반응용액의 기화와 누수를 완벽하게 막을 수 없는 단점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 온칩(on-chip)상에서 효율적으로 반응액의 기화와 누수를 막을 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 외부압력에 의하여 변형이 가능한 폴리머 막을 이용하는 것이 PCR 반응 시 용액의 기화와 누수를 효과적으로 막을 수 있다는 것을 확인하고, 폴리머 밸브가 장착된 PCR용 플라스틱 칩을 개발하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 온칩(on-chip) 폴리머 밸브를 가지는 플라스틱 PCR 칩을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 두개 이상의 미세유동 채널을 가지는 플라스틱 칩을 적층/압착하여 형성되고, 출구와 입구를 가지는 미세유동채널 형태의 반응 챔버 및 (b) 반응 챔버의 출구와 입구에 각각 장착되어 외부압력에 의해 미세유동 채널 내의 유체흐름을 개폐하는 폴리머밸브를 포함하는 PCR 용 플라스틱 칩을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 외부압력은 공압실린더에 의해 가해지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 반응 챔버의 표면에 온도 사이클링을 위한 외부 필름 히터가 압착된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리머 밸브는 폴리머 막 형태인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 폴리머 막의 재질은 탄성이 좋으면서 다양한 형상으로 캐스팅이 가능한 소재인 것이 좋으며, 바람직하게는 PDMS(polydimethysiloxane)를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 플라스틱은 사출, 압출 또는 식각이 가능한 폴리머인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 플라스틱의 재질은 PC(polycarnonate), COC(cyclic olefin copolymer) 및 PMMA(polymetamethylacrylate) 로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 PCR 용 플라스틱은 두개 이상의 반응챔버를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 PCR용 플라스틱 칩은 고온에서의 PCR용액의 기화 및 누수를 막기 위하여 마이크로 채널(PCR 챔버)을 차단하는 폴리머 밸브막을 설치하였으며, 외부 공압실린더(pneumatic cylinder)를 이용하여 폴리머 밸브막을 눌러 줌으로써 폴리머 밸브막이 on-chip 밸브로 작동하도록 하였다.

본 발명의 PCR용 플라스틱 칩을 사용하여 온도 사이클링을 하기 위해서는 외부 히터와 냉각팬을 사용할 수 있다.

본 발명의 PCR용 플라스틱 칩은 두개 이상의 마이크로 챔버를 포함할 수 있어, 한꺼번에 2개 이상의 유전자를 증폭할 수 있다.

도 1에 나타난 바와 같이, 미세유동 채널을 가진 플라스틱 칩은 마이크로 사출공정(microinjection molding)으로 제작한다. 사출 인써트(Insert)는 사출 플라스틱 평면에 구현하고자 하는 음각의 미세유동채널과 동일한 형상의 양각의 구조물을 가지고, 노광공정(photolithography), 미세기계가공(micromachining) 또는 표면 랩핑(lapping)으로 제조한다. 상기 사출 인써트를 금형틀에 고정시키고 폴리머 레진(resin)을 사출하면 미세유동채널을 가진 플라스틱 평판이 제조된다. 상기 미세유동 채널을 가진 평판을 여러 층으로 적층시키고 열접합(thermal lamination)방법이나 투명 점착제를 이용한 압착방법으로 접착시키면, 3차원 유동 챔버와 유동채널을 가진 칩이 구현된다 (도 1).

본 발명에 있어서, 상기 플라스틱 평판에 사용되는 재질은 PC(polycarnonate), COC(cyclic olefin copolymer) 또는 PMMA (polymetamethyl-acrylate) 등의 플라스틱 고분자를 사용하는 것이 바람직하며, 이들 고분자는 특별 한 표면처리 없이 PCR 반응에 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 폴리머 밸브는 외부 압력에 의해 PCR 챔버(chamber)의 출구와 입구를 유동적으로 여닫는 역할을 하며, 용액의 유동을 조절하여 PCR 챔버 내의 생화학 유체의 누수와 증발을 막는다.

본 발명의 폴리머 밸브는 방수 및 방열 성질을 가지고, 외부 압력에 의하여 변형되고, 압력이 없어지면 회복되는 성질을 가지는 폴리머 이라면 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 PDMS를 사용할 수 있다.

도 1에 나타난 바와 같이 PCR용 플라스틱 칩의 맨 위층은 투명한 폴리머 필름에 점착제를 코팅하여 한 쪽면에 점성이 있는 테이프(pressure sensitive tape) 형태로 구성되며, 미세유동 채널의 맨 위쪽면을 덮고 있어 폴리머 밸브를 공압실린더로 누를 때, 함께 변형하여 폴리머 밸브를 여닫는데 관여한다.

도 2는 최종 적층되어 열접합과 테이프접합으로 완성된, PDMS 온칩(on-chip) 밸브를 장착한 PCR용 플라스틱 칩의 단면도이다. 도 1에서 PCR 챔버를 형성하는 중간층과 바닥층은 열접합 방식으로 결합시켰으며, 높은 압력으로 두 층을 압착한 다음 폴리머 소재의 유리전이온도 (glass transition temperature)의 80% 수준까지 가열하여 한 두 시간을 유지한 후, 냉각시켜 제조하였다. PCR 챔버를 PCR 온도로 사이클링 할 때, 마이크로 히터는 PCR 챔버의 바닥면에 위치하여 위 쪽으로 열이 전달되는 방식을 취한다.

본 발명의 플라스틱 칩은 미세유동 채널에 의하여, 나노리터의 시료를 반응용액의 손실 없이 효율적으로 온도 사이클링 할 수 있다.

도 3은 PCR 온도 사이클링시, 히터의 온도와 PCR chamber속의 온도를 측정한 것으로 폴리머의 낮은 열전달율를 보안하기 위해 가열곡선에서 히터의 온도를 급상승 시키고 PCR 챔버 내부의 온도가 설정온도에 이르렀을 때, 순차적으로 설정온도를 낮추었다. 상기 방법에 의하여, 총 PCR에 소요되는 시간 중에서 가열하여 온도를 상승시키는 구간 (annealing extension, extension denaturation)에 소요되는 시간을 절약할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: PCR 용 플라스틱 칩의 제작방법

플라스틱 칩은 커버층의 컷팅, PDMS 밸브의 캐스팅 및 칩층의 사출성형으로 구성된 3가지 공정으로 제작된다(도 1).

최상층의 커버층 (2-w)은 두께 0.1 mm의 중간 플라스틱층 (2-y) 및 바닥 플라스틱층(2-z)과 동일한 소재의 폴리머 필름으로 가공하고 유체 입구와 출구는 laser로 절단(2-a)하여 제작하였다. 두 번째 층(2-x)은 최상층의 커버층 (2-w)과 중간 플라스틱층 (2-y)을 접합하는 역할을 하는 층으로, silicon 계열로 제작하여 고온에서도 강한 접합특성을 유지하는 양면 전사 점착제층으로 제작하였으며, 유체 입구와 출구도 레이져로 절단(2-b)하여 제작하였다. 중간 플라스틱층(2-y)과 바닥 플라스틱층(2-z)은 폴리머 사출성형 (2-d)을 이용하여 제작하였으며, (2-d)와 같이 PCR 챔버와 챔버를 연결하는 유체 통로 및 입출구의 형상을 금속 미세가공 및 표면 광택을 통해 사출 인터트 (Insert)로 가공한 다음, 금형틀에 삽입하여 플라스틱 슬라이드칩으로 사출성형하였다. 사출된 중간 플라스틱층(2-y)과 바닥 플라스틱층(2-z)은 열접합 (thermal lamination)으로 접합하거나, 두 번째 층 (2-x)과 같은 양면 전사 점작체층을 레이져로 가공하여 삽입한 다음 압착하여 접합하였다. 통상 중간층과 바닥층의 두께는 1.0 ~ 2.0mm 내외이고 PCR 챔버의 크기는 두께가 0.5 mm이다. PDMS 맴브레인(2-c) 중간층(2-y)의 유체 입출구와 같은 형상의 몰드(2-c)를 제작하여 PDMS (sylgard@184 silicon, Dow corning)의 기본용액(base soulution)과 컬링제(curing agent)를 10:1, 5:1, 혹은 3:1의 비율 등으로 원하는 탄성 강도에 따라 혼합한 다음, 몰드(2-c)에 붓고 고상으로 만든 후, 떼어내어 사출된 중간층(2-y)의 유체 입출구에 끼워 넣었다. 상기 공정을 통해 커버 층, 중간층 및 바닥층과 PDMS 멤브레인 밸브를 조합하여 PCR 온도 사이클링이 가능한 플라스틱 칩으로 제작하였다.

실시예 2: 본 발명의 PCR용 플라스틱 칩을 이용한 DNA 온도 사이클링

실시예 1에서 제작한 플라스틱 칩에 PCR용 혼합용액을 넣고 PCR 챔버 바닥의 외부 필름 히터와 냉각용 공냉팬을 설치한 후, 공압실린더로 PDMS 멤브레인 온칩(on-chip) 밸브를 압착하여 PCR 온도 사이클링을 실시하였다. 필름히터에 열전대 (thermocouple)을 붙이고, PCR 챔버 속에도 열전대를 삽입하여, PCR 온도 사이클링 중의 필름히터 표면의 온도와 PCR챔버 내의 온도를 측정하였다 (도 3). 실제로 폴리머의 열전도율이 공기의 열전율과 비슷하여, 두께 0.5 mm의 PCR 챔버의 두께로 인해, 평균 4 ~ 8℃의 온도차를 볼 수 있었다. 본 실시예에서는 칩 디자인에 필름 히터를 외장형으로 하여 플라스틱 PCR 챔버 바깥 표면에는 패턴된 히터가 없는 것을 사용하였으며, 따라서, 히터를 PCR 챔버 외표면에 밀착시키는 플랫폼을 설치하였다. 이것은 플라스틱 칩의 경제성을 높이기 위함이다.

본 발명의 플라스틱 PCR 칩은 도 3에서 제작된 온도 사이클링 시스템을 통해 PCR공정에 필요한 온도구간과 각각의 시간설정에 적절하게 응답하였다.

실시예 3: 본 발명의 PCR 용 플라스틱 칩을 이용한 Plasmid DNA의 증폭

실시예 1에서 제작된 온칩(on-chip) 폴리머 밸브를 장착한 온도 사이클링 플라스틱 PCR칩과 실시예 2의 필름히터와 냉각팬을 사용한 PCR 온도 사이클링 시스템을 이용하여, pET21a(Novagen, 미국) 벡터의 1kb 단편을 하기의 프라이머를 사용하여 증폭하였다.

ManhsKAM Nde (forward)프라이머:

5'-AGAGAGCATATGCGTATTTTAACTCAAAATAACCCA-3'(서열번호 1)

ManhsKAM EcoR (reverse)프라이머:

5'-AGAGAATTCTTAACCGCCGTAAAGGGTCTTATTCGG-3'(서열번호 2)

PCR 조건은 전변성(pre-denaturation) 5분을 수행한 후.변성(denaturation) 30초, 어닐링(annealing) 30초, 확장(extension) 30초를 1사이클로 하여 30사이클 수행하였으며, 후 확장(post-extension)을 5분간 수행하였다 (도 3).

그 결과, 본 발명에 따른 PCR용 플라스틱칩 상에서도 PCR공정이 기존의 튜브를 사용한 벤치 탑 머신(bench top machine)에서 수행하는 것과 동일한 수준으로 이루어 진 것을 확인할 수 있었다 (도 4).

실시예 4: 본 발명의 PCR 용 플라스틱 칩을 이용한 인간 게놈 DNA의 증폭

실시예 1에서 제작된 온칩(on-chip) 폴리머 밸브를 장착한 온도 사이클링 플라스틱 PCR칩과 실시예 2의 필름히터와 냉각팬을 사용한 PCR 온도 사이클링 시스템을 이용하여, 인간 게놈 DNA의 베타 액틴(beta actin) 유전자 500bp를 하기 표 1에 나타낸 프라이머를 이용하여 증폭하였다(도 5).

프라이머	프라이머 서열	Tm(℃)	PCR 산물
포워드 프라이머	5'-AAT GAA AGG CAC ACT GTC TC-3 '(서열번호 3)	55.3	베타액틴
리버스 프라이머	5'-TTT CTT TCA AAG GCT GAG AG-3 ' (서열번호 4)	55.0	베타액틴

Blood Mini Kit (Qiagen, Inc)을 이용하여 정제한 게놈을 사용하였다. 플라스틱 PCR 칩을 이용한 베타 액틴 증폭 반응에 사용된 PCR 반응액의 조성을 표 2에 나타내었다.

PCR 조성물 항목		부피	농도
포워드 프라이머		2㎕	5.0nMole
리버스 프라이머		2㎕	5.0nMole
BSA(Bovine Serum Albumin)		2㎕	0.1㎍/㎕
주형 DNA		2㎕	80ng/㎕
증류수		2㎕
2X 프리믹스 용액	Taq DNA 폴리머라아제	10㎕	1 units/10㎕
	2X 반응버퍼		-
	MgCl2		4mM
	효소안정화제		-
	침강제		-
	로딩 염색시약		-
	dNTPs		각각 0.5mM
최종부피		20㎕

상기 PCR 반응액을 실시예 1에서 제조한 플라스틱 PCR칩의 챔버에 주입하여 도 3의 온도 사이클링 시스템을 이용하여 PCR을 수행하였다. 표 3에서는 본 실시예에서 사용한 PCR 조건을 나타내었으며, 총 소요시간은 가열/냉각 시간을 합하여 총 1시간 30분이내에 수행하였다.

대조군으로 벤치탑 PCR 사이클러 (MJ research, Inc.)를 사용하여, 표 2와 동일한 용액으로 표 3과 동일한 조건에서 PCR반응을 수행하였다.

PCR 사이클링 프로토콜
전변성(pre-denaturation)	5분
변성(denaturation)	30초	30 사이클
어닐링(annealing)	30초
확장(extension)	30초
후확장(post-extension)	5분

본 실시예을 통해 증폭한 플라스틱 PCR 칩 반응액과 PCR 반응액과 벤치탑 PCR 사이클러를 이용한 PCR 반응액을 아가로즈 젤(agarose gel)에서 전기영동한 결과를 도 5에 나타내었다. 레인 1은 DNA marker이고, 레인 2는 본 발명의 플라스틱 PCR칩을 이용하여 증폭된 500bp Genomic DNA 유전자이며, 레인 3은 bench top PCR machine을 이용하여 증폭된 500bp Genomic DNA 유전자이다.

도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 플라스틱 PCR칩을 이용한 인간 게놈 유전자의 증폭을 확인할 수 있으며, 플라스틱 칩 상의 PCR 챔버에 대한 형상의 변형과 표면 최적화를 통하여 더 좋은 PCR반응 효율을 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 온칩(on-chip) 폴리머 밸브를 가지는 플라스틱 PCR 칩을 제공하는 효과가 있다. 본 발명의 PCR 용 플라스틱 칩은 종래의 PCR 칩에 비하여 PCR 챔버를 소형화하여 적은 양의 시료로도 반응을 수행할 수 있으며, PCR 챔버의 표면적이 넓어짐에 따라 가열/냉각에 소요되는 시간이 줄어 반응시간을 줄일 수 있으며, 하나 이상의 PCR 챔버를 장착하여 한꺼번에 다양한 유전자를 증폭할 수 있다.

<110> LG CHEM, LTD. <120> Plastic Chip for PCR Having On-chip Polymer Valve <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agagagcata tgcgtatttt aactcaaaat aaccca 36 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagaattct taaccgccgt aaagggtctt attcgg 36 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aatgaaaggc acactgtctc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tttctttcaa aggctgagag 20

Claims

(a) 두개 이상의 미세유동 채널을 가지는 플라스틱 칩을 적층/압착하여 형성되고, 출구와 입구를 가지는 미세유동채널 형태의 반응 챔버; 및

(b) 반응 챔버의 출구와 입구에 각각 장착되어 외부압력에 의해 미세유동 채널 내의 유체흐름을 개폐하는 폴리머밸브를 포함하는 PCR 용 플라스틱 칩.
제1항에 있어서, 상기 외부압력은 공압실린더에 의해 가해지는 것을 특징으로 하는 플라스틱 칩.
제1항에 있어서, 상기 반응 챔버의 표면에 온도 사이클링을 위한 외부 필름 히터가 압착된 것을 특징으로 하는 플라스틱 칩.
제1항에 있어서, 상기 폴리머 밸브는 폴리머 막 형태인 것을 특징으로 하는 플라스틱 칩.
제4항에 있어서, 상기 폴리머 막의 재질은 PDMS(polydimethysiloxane)인 것을 특징으로 하는 플라스틱 칩.
제1항에 있어서, 상기 플라스틱은 사출, 압출 또는 식각이 가능한 폴리머인 것을 특징으로 하는 플라스틱 칩.
제1항에 있어서, 상기 플라스틱의 재질은 PC(polycarnonate), COC(cyclic olefin copolymer) 및 PMMA (polymetamethylacrylate) 로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 플라스틱 칩.
제1항에 있어서, 두개 이상의 반응챔버를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스틱 칩.