CN107312713A - 一种微流控芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微流控芯片及其应用。该芯片设为多层结构，其多层结构具体为：从上至下依次包括上层基板、上层弹性多孔膜、中层基板、下层弹性多孔膜、下层基板；上层通道、下层通道和中间层通道分别与上层弹性多孔膜、下层弹性多孔膜形成柔软的管腔结构。当上下层通道内的流体压力和中间层通道内的流体压力不一致时，上下两层弹性多孔膜会因压力差发生变形。从而本发明可高仿真度的模拟人体内柔软管腔，以及带管腔结构的器官和组织，进而可进行生物标记物的测试，实现对药物、化妆品、保健品、环境毒物的有效评价。

Description

一种微流控芯片及其应用

技术领域

本发明属于微流控技术领域，具体涉及一种微流控芯片及其应用。

背景技术

微流控芯片(Microfluidics)又称芯片实验室(Lab-on-a-chip)，是在微米量级空间操控流体的一种科学与技术，可将生物和化学实验室的基本功能微缩到一个数平方厘米的芯片上，是21世纪最为重要的前沿技术之一，被认为是解决创新药物、化妆品和保健品研发成本过高、周期过长等关键问题，革新原有技术体系的关键技术，正面临着重大的发展机遇和挑战。

器官微流控芯片(Organ on a chip)是微流控芯片的一个亚类，它是在一块几平方厘米薄片内培养一种或多种功能细胞，从而模拟器官的一种仿生技术，器官芯片里的“器官”非常微小，但是具备真实器官的基本生理功能。器官芯片能仿真地模拟器官原因在于：(1)它不但同时培养器官所包含的多种细胞，而且细胞的空间排列可以模仿器官的生理结构；(2)它可以重建器官在体内的生理环境，比如流体剪切力、信号分子浓度梯度。可以说器官芯片从“组成”、“结构”和“环境”三方面对器官进行了模拟，仿真程度很高。

每一种人体器官都对应一种器官芯片，譬如模拟肝脏的有肝芯片，模拟肾脏的有肾芯片，模拟胰脏的有胰岛芯片，模拟心脏的有心脏芯片等，同一块器官芯片内也可以包含多种“器官”，譬如肠-肝芯片，肾-心脏芯片等。

器官芯片的用途是代替真实的人体或动物的器官进行化学品的测试，常见的化学品包括药物、保健品、化妆品和环境毒物。它可以测定药物的药效、毒性和药代，可以测定保健品在肠道的吸收、肝脏里的代谢和对肠道菌群的保护作用，可以测定化妆品在皮肤内的吸收以及对皮肤的刺激性，还可以测定环境毒物对某一特定脏器的损害作用。

体内的很多器官带有管腔结构，譬如肠具有肠腔，血管具有管腔，肾具有肾小管管腔、肾小球管腔和集合管管腔，心脏具有心房和心室，子宫具有宫腔，牙龈具有牙龈沟，食道具有食管，胃具有胃腔，淋巴具有淋巴管，肺具有气管，眼具有泪腺，等等。即使不含管腔结构的器官，如肌肉、脂肪、肿瘤、大脑等，因为带有血管也相当于具有管腔结构。这些管腔结构具有两个特点：一是具有一定的变形性，它们是柔软的，并不是刚性的；二是，管腔壁上有功能细胞，有时功能细胞还不止一层。

现有模拟管腔结构的器官芯片，主要分为三类：一是利用单层弹性多孔薄膜结合细胞培养模拟管壁结构，例如，在“Remi Villenave，Donald E.Ingber.Human Gut-On-A-Chip Supports Polarized Infection of Coxsackie B1Virus In Vitro.PLOSONE.2017”中模拟了肠壁，技术手段为在单层弹性PDMS多孔薄膜上培养肠上皮细胞——该模拟的肠壁是柔软可变行的，但没有形成肠腔的结构，因此功能不完整，譬如物质交换量少，细胞新陈代谢产物少，难以达到检测限；二是利用单层硬质多孔薄膜结合细胞培养模拟管壁结构，例如，在“Dong Jin，Tingjiao Liu.Application of a microfluidic-basedperivascular tumor model for testing drug sensitivity in head and neckcancers and toxicity in endothelium.The Royal Society of Chemistry.2016”中模拟了血管，技术手段为在单层硬质多孔薄膜上培养血管内皮细胞，在下层三维培养组织细胞——由于硬质多孔薄膜在压力作用下会发生不可逆形变，会导致细胞发生损伤，影响细胞功能，并且细胞受力情况与体内受力环境不符合；三是利用双层硬质多孔薄膜结合细胞培养模拟管腔结构，例如，在“Young Bok Kang,Moses Noh.Liver Sinusoid on a Chip：Long-Term Layered Co-Culture of Primary Rat Hepatocytes and Endothelial Cellsin Microfluidic Platforms.Biotechnology and Bioengineering.2015”中模拟了肝血窦，技术手段为在芯片上层硬质多孔薄膜的上侧培养星状细胞，在芯片上层硬质多孔薄膜的下侧培养血管内皮细胞，在芯片的中间管腔培养枯否细胞，在芯片下层硬质多孔薄膜的上侧培养胆管上皮细胞，在芯片下层硬质多孔薄膜的下侧培养肝实质细胞——该结构为硬质多孔薄膜构成的管腔结构，其腔体并不是柔软的，在压力作用下会发生不可逆形变，不具备体内机械物理环境，与体内仿真度不高，物质交换与真实情况不符。

发明内容

针对上述现有技术中的不足——三种管腔结构设计均有不合理之处，本发明要解决的技术问题是提供一种用于模拟人体内柔软管腔，以及带管腔结构的器官和组织的微流控芯片及其应用。本发明模拟管腔结构的器官芯片具有双层柔软性薄膜的结构，可以在压力的作用下，管腔两侧均产生形变，高仿真度的模拟体内管腔结构。搭配上不同的细胞(细菌)，即可模拟不同的管腔。例如，在器官芯片内培养肠上皮细胞，即可模拟出肠腔；培养上血管内皮细胞，即可模拟血管，这种模拟的血管再搭配其他细胞，即可模拟带血管的组织或器官。

为实现上述目的提供一种微流控芯片，本发明采用了以下技术方案：

一种微流控芯片，该芯片设为多层结构，所述多层结构包括形成柔软管腔结构的双层弹性多孔膜，其中，上层弹性多孔膜的上下侧之间及下层弹性多孔膜的上下侧之间进行物质和能量交换。

优选的，该芯片的多层结构为：从上至下依次包括上层基板、上层弹性多孔膜、中层基板、下层弹性多孔膜、下层基板；

所述上层基板下表面设有上凹槽，上凹槽与上层弹性多孔膜形成一个封闭的上层通道，该通道的各个内壁用于培养不同的细胞或细菌；

所述中层基板部分镂空，其镂空的部分与上层弹性多孔膜和下层弹性多孔膜围成一个封闭的中间层通道，该通道的各个内壁用于培养不同的细胞或细菌；

所述下层基板的上表面设有下凹槽，下凹槽与下层弹性多孔膜形成一个封闭的下层通道，该通道的各个内壁用于培养不同的细胞或细菌。

在本技术方案中，上层通道、下层通道和中间层通道分别与上层弹性多孔膜、下层弹性多孔膜形成柔软的管腔结构。当上下层通道内的流体压力和中间层通道内的流体压力不一致时，上下两层弹性多孔膜会因压力差发生变形，从而可模拟人体内柔软管腔。

进一步的，所述上凹槽的截面为矩形、半圆形或半椭圆形。

进一步的，所述下凹槽的截面为矩形、半圆形或半椭圆形。

进一步的，该芯片的多层结构：上层基板、上层弹性多孔膜、中层基板、下层弹性多孔膜、下层基板之间可拆卸连接。从而本技术方案具有便于多层结构之间进行拆装，应用维护方便的优势。

进一步的，所述下层基板、中层基板和上层基板的材料选用石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物、聚碳酸酯、聚酯、琼脂糖、壳聚糖或海藻酸钠中的任一种。

进一步的，所述弹性多孔膜的材料采用PDMS或聚偏氟乙烯。

本发明还提供了一种上述微流控芯片的应用，用于模拟人体内柔软管腔。

进一步的，所述芯片内所种植的细胞包括肠、心脏、肝、肾、胰岛、皮肤、口腔、胃、子宫、卵巢、眼睛、骨骼、血管、肺、肌肉、脂肪、肿瘤、淋巴和脑器官等所包含的细胞；芯片内所种植的细菌包括肠道菌群和胃菌群；从而该芯片可应用于模拟带管腔结构的器官和组织。

本技术方案使得本发明可进而应用于进行生物标记物的测试，实现对药物、化妆品、保健品、环境毒物的有效评价。

本发明的有益效果在于：

与现有技术相比，本发明在芯片上形成了具有弹性，柔软的，负载细胞(细菌)的腔室，可以在压力的作用下，管腔两侧均产生形变，从而能高仿真度的模拟真实人体内的管腔结构，或带管腔结构的组织或器官，进而可进行生物标记物的测试，实现对药物、化妆品、保健品、环境毒物的有效评价。

附图说明

图1是本发明的结构示意图。

图中：1a、下层基板，1b、中层基板，1c、上层基板，2a、下层弹性多孔膜，2b、上层弹性多孔膜，3、上层通道，3a、中层通道，3b、下层通道

图2是柔软弹性膜上HUVEC通透性表征图，从左至右是荧光素钠、普奈诺尔、40kD的葡聚糖和70kD的葡聚糖的血管内皮细胞通透率。

图2′是硬质膜上HUVEC通透性表征图，从左至右是荧光素钠、普奈诺尔、40kD的葡聚糖和70kD的葡聚糖的血管内皮细胞通透率。

图3是单药对HUVEC的作用图，PTX(0.5μg/ml)；CDDP(5μg/ml)；5-FU(400μg/ml)。图中Scale bar＝50μm。

图4是HUVEC对联合药物反应的效果图，PTX(0.5μg/ml)联合CDDP(5μg/ml)；5-FU(400μg/ml)联合CDDP(5μg/ml)。图中Scale bar＝50μm。

图5是柔软弹性膜上肾小管细胞对葡萄糖的重吸收量的示意图。

图5′是硬质膜上肾小管细胞对葡萄糖的重吸收量的示意图。

图6是柔软弹性膜上肾小管细胞分泌对氨基马尿酸的量的示意图。

图6′是硬质膜上肾小管细胞分泌对氨基马尿酸的量的示意图。

图7是利用本发明模拟动脉时，中间通道流体压力的波形图。

图8是利用本发明模拟动脉的舒张态(左)和紧张态(右)的示意图。

图9是利用本发明模拟大肠(或食道)时，中间通道细菌培养液压力的波形图。

图10是利用本发明模拟大肠(或食道)时，模拟的肠壁(或食道壁)在不同压力下的状态示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本技术领域的普通技术人员应该理解的是，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

一种微流控芯片

该芯片设为多层结构，所述多层结构包括形成柔软管腔的双层弹性多孔膜，其中，上层弹性多孔膜2b的上侧及下层弹性多孔膜2a的下侧之间进行物质和能量交换。该结构为柔软多孔膜构成的管腔结构，因其腔体是柔软的，在压力作用下会发生可逆形变，具备体内机械物理环境，与体内仿真度很高，物质、能量交换与真实情况相符。

具体的，该芯片的多层结构为：从上至下依次包括上层基板1c、上层弹性多孔膜2b、中层基板1b、下层弹性多孔膜2a、下层基板1a；

所述上层基板1c下表面设有上凹槽，上凹槽与上层弹性多孔膜2b形成一个封闭的上层通道3，该通道的各个内壁用于培养不同的细胞或细菌；

所述中层基板1b部分镂空，其镂空的部分与上层弹性多孔膜2b和下层弹性多孔膜2a围成一个封闭的中间层通道3a，该通道的各个内壁用于培养不同的细胞或细菌；

所述下层基板1a的上表面设有下凹槽，下凹槽与下层弹性多孔膜2a形成一个封闭的下层通道3b，该通道的各个内壁用于培养不同的细胞或细菌。

其中，根据模拟需要，上、下凹槽的截面可选为矩形、半圆形或半椭圆形或其它需要形状。

该芯片的多层结构：上层基板1c、上层弹性多孔膜2b、中层基板1b、下层弹性多孔膜2a、下层基板1a之间可拆卸连接。

其中，根据模拟需求，所述下层基板1a、中层基板1b和上层基板1c的材料选用石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物、聚碳酸酯、聚酯、琼脂糖、壳聚糖或海藻酸钠中的任一种；所述弹性多孔膜的材料采用PDMS或聚偏氟乙烯。

一种微流控芯片的应用

用于模拟人体内柔软管腔。

芯片内所种植的细胞包括肠、心脏、肝、肾、胰岛、皮肤、口腔、胃、子宫、卵巢、眼睛、骨骼、血管、肺、肌肉、脂肪、肿瘤、淋巴和脑器官所包含的细胞；芯片内所种植的细菌包括肠道菌群和胃菌群；从而该芯片应用于模拟带管腔结构的器官和组织。

本发明具体应用的实施例将在下面列出。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：毛细血管的模拟及药物血管毒性的研究

如图1所示，下层基板1a、中层基板1b和上层基板1c的材料为PDMS；上、下凹槽的截面为矩形；上层通道3、中层通道3a和下层通道3b的宽度均为50微米，高度均为50微米；在材料为PDMS的上层弹性多孔膜2b下表面培养人脐带血内皮细胞(HUVEC)，在材料为PDMS的下层PDMS弹性多孔膜2a的上表面培养人脐带血内皮细胞(HUVEC)，与体内相似，上下层的血管内皮细胞长成一层致密的细胞膜，细胞与细胞之间形成紧密连接，不漏液，上下层PDMS弹性多孔膜的厚度为8微米，则由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空结构所组成的管腔结构则模拟了人的毛细血管。上下层通道中流体的压力为10mbar，中层通道中模拟血液的压力为20mbar，上下层弹性PDMS多孔膜上的血管内皮细胞感受到的压力为20-10＝10mbar，模拟真实毛细血管在人体内感受到的压力。由于模拟的毛细血管是柔软的，在10mbar的压力下，PDMS多孔膜发生弹性形变，拉伸血管内皮细胞，但是不会破坏血管内皮细胞间的紧密连接，不影响血管内皮细胞膜的屏障作用和生理功能。

如附图2所示，该模拟的毛细血管具备真实毛细血管的通透性特性，分子量越大，渗透速度越慢(荧光素钠>普奈诺尔>40kD的葡聚糖>70kD的葡聚糖)。

作为柔软弹性膜的对比，如果是传统的硬质膜，则在压力作用下，硬质膜会发生不可逆形变，血管内皮细胞间会形成裂隙(crack)，影响血管内皮细胞膜的屏障作用和生理功能。如图2′所示，硬质膜上(荧光素钠、普奈诺尔、40kD的葡聚糖、70kD的葡聚糖)表观渗透率远大于PDMS弹性薄膜上的(荧光素钠、普奈诺尔、40kD的葡聚糖、70kD的葡聚糖)表观渗透率(图2)，所以可以看出在压力作用下，硬质膜会发生不可逆形变，血管内皮细胞间会形成裂隙，影响血管内皮细胞膜的屏障作用和生理功能。

本实施例模拟的毛细血管被用于药物血管毒性的研究，如附图3所示，高浓度的CDDP(f通道)和5-FU(d、e、f通道)导致HUVEC细胞之间出现间隙，而PTX对HUVEC的影响不明显。该结果提示高浓度的CDDP和5-FU可造成HUVEC屏障的破坏，在体内用药时可能会部分造成静脉炎的发生。

为了降低抗肿瘤药物的血管毒性，尝试了联合用药，降低每种药物的浓度，而维持药物总浓度不变，如附图4所示的结果发现，PTX与CDDP联合用药(f通道)，CDDP与5-FU联合用药(a、b、f通道)可见部分HUVEC细胞间隙有些许增加，其余各通道尚未见明显现象，连接尚紧密。结果说明抗肿瘤药物联合用药是降低药物的血管毒性的一条可行之路。

本实施例具有以下优势：传统技术仅模拟一侧的毛细血管壁，物质交换仅在该侧发生，而本实施例模拟了毛细血管管腔，物质交换在两个侧面发生，交换面积更大。由于模拟的毛细血管管壁是柔软的，血管内皮细胞层在压力的作用下，也可以维持一层致密的细胞层，从而保持它的屏障作用和生理功能。该模拟的血管可以用于评价药物对血管壁的毒性作用。

实施例2：肾小管和管周血管的模拟

如图1所示，下层基板1a、中层基板1b和上层基板1c的材料为PDMS；上、下凹槽的截面为矩形；上、中和下层通道的宽度均为100微米，高度均为100微米；在上层PDMS弹性多孔膜的下表面培养肾小管上皮细胞，上表面培养血管内皮细胞，在下层PDMS弹性多孔膜的上表面培养肾小管上皮细胞，下表面培养血管内皮细胞，与体内相似，上下层的血管内皮细胞和肾小管上皮细胞分别长成一层致密的细胞膜，细胞与细胞之间形成紧密连接，不漏液，上下层PDMS弹性多孔膜的厚度为15微米，则由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空结构所组成的管腔结构则模拟了人的肾小管，而上层通道3和下层通道3b则模拟了管周血管。上层通道3和下层通道3b内的模拟血液的压力为10mbar，中层通道3a内模拟尿液的压力为40mbar。由于模拟的肾小管和管周血管是柔软的，在30mbar的压力下，PDMS多孔膜发生弹性形变，拉伸血管内皮细胞和肾小管上皮细胞，但是不会破坏血管内皮细胞间和肾小管上皮细胞间的紧密连接，不影响血管内皮细胞层和肾小管上皮细胞层的屏障作用和生理功能。如果是传统的硬质膜，则在压力作用下，硬质膜会发生不可逆形变，血管内皮细胞间或肾小管细胞间会形成裂隙，影响血管内皮细胞膜或肌肉细胞的屏障作用和生理功能。

模拟的肾小管和管周血管具有真实肾小管和管周血管的重吸收和分泌功能。当上层通道3、中层通道3a和下层通道3b都注入10mM的葡萄糖溶液，半个小时后，上层通道3和下层通道3b内葡萄糖的浓度为16.88mM，而中层通道3a中的葡萄糖浓度为3.12mM，说明大部分葡萄糖从模拟的肾小管内重吸收回模拟的管周血管，并且我们发现硬质膜通道上肾小管对葡萄糖的重吸收(如图5′所示)小于PDMS弹性薄膜通道肾小管对葡萄糖的重吸收(如图5所示)。

当上层通道3和下层通道3b内注入40微克/毫升的对氨基马尿酸溶液，半个小时后发现82.32％的对氨基马尿酸已经进入中层通道3a，而对照的硬质膜组百分比是75.68％，说明模拟的管周血管具有向模拟的肾小管分泌对氨基马尿酸的功能，并且硬质膜通道肾小管分泌对氨基马尿酸的量(如图6′所示)小于PDMS弹性薄膜通道肾小管分泌对氨基马尿酸的量(如图6所示)。

本实施例优点在于：模拟了肾小管和管周血管的生理结构(包括血管内皮细胞层和肾小管上皮细胞层)。由于模拟的肾小管和管周血管的管壁是柔软的，血管内皮细胞层和肾小管上皮细胞层在压力的作用下，也可以维持一层致密的细胞层，从而保持它的屏障作用和生理功能，从而为在体外研究肾小管和管周血管的分子生物学和细胞生物学奠定了坚实的基础。模拟的肾小管和管周血管具有真实肾小管和管周血管的重吸收和分泌功能。

实施例3：小动脉的模拟

如图1所示，下层基板1a、中层基板1b和上层基板1c的材料为PDMS；上、下凹槽的截面为矩形；上层通道3、中层通道3a和下层通道3b的宽度均为2毫米，高度均为500微米。在上层PDMS弹性多孔膜的下表面培养人脐带血内皮细胞(HUVEC)，上表面培养肌肉细胞，在下层PDMS弹性多孔膜的上表面培养人脐带血内皮细胞(HUVEC)，下表面培养肌肉细胞，与体内相似，上下层的血管内皮细胞和肌肉细胞分别长成一层致密的细胞膜，细胞与细胞之间形成紧密连接，不漏液，上下层PDMS弹性多孔膜的厚度为30微米，则由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空结构所组成的管腔结构则模拟了人的小动脉。上层通道3和下层通道3b内流体的压力为20mbar，中层通道3a内模拟血液的压力为方波，在20mbar和50mbar之间来回切换，如图7所示。上、下层弹性多孔膜由于两侧压力差产生周期性的脉动，模拟小动脉血管的脉动。弹性多孔膜舒张的状态和绷紧的状态如图8所示，分别模拟小动脉的舒张态(左)和紧张态(右)，处于舒张态时，上、中、下层的流体压力都是20mbar，此时，弹性多孔膜的孔径为10微米，处于紧张态时，上、中、下层的流体压力分别是20，50，20mbar，此时弹性多孔膜的孔径膨胀到14微米。由于模拟的小动脉是柔软的，有弹性的，因此可以在压力的作用下产生脉动的效果，而且在30mbar的压力下，PDMS多孔膜发生弹性形变，拉伸血管内皮细胞和肌肉细胞，但是不会破坏血管内皮细胞间和肌肉细胞间的紧密连接，不影响血管内皮细胞膜和肌肉细胞的屏障作用和生理功能。

如果是传统的硬质膜，则在压力作用下，硬质膜会发生不可逆形变，血管内皮细胞间或肌肉细胞间会形成裂隙，影响血管内皮细胞膜或肌肉细胞的屏障作用和生理功能。

本实施例具有以下优势：模拟了小动脉的生理结构(包括血管内皮细胞层和肌肉细胞层)进行模拟，由于模拟的小动脉管壁是柔软有弹性的，因此模拟了动脉的脉动。同样由于模拟的小动脉管壁是柔软的，动脉内皮细胞层和肌肉层在压力的作用下，也可以维持一层致密的细胞层，从而保持它的屏障作用和生理功能。进而为在体外研究小动脉的分子生物学和细胞生物学奠定了坚实的基础。

实施例4：大肠的模拟

如图1所示，下层基板1a、中层基板1b和上层基板1c的材料为PDMS；上、下凹槽的截面为矩形；上层通道3、中层通道3a和下层通道3b的宽度均为750微米，高度均为1毫米。在上层PDMS弹性多孔膜2b的下表面培养肠上皮细胞，上表面培养肌肉细胞，在下层PDMS弹性多孔膜2a的上表面培养肠上皮细胞，下表面培养肌肉细胞，再在上下两层肠上皮细胞表面接种肠道菌群，与体内相似，上下层的肠上皮细胞和肌肉细胞分别长成一层致密的细胞膜，细胞与细胞之间形成紧密连接，不漏液，上下层PDMS弹性多孔膜的厚度为70微米，则由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空结构所组成的管腔结构则模拟了人的大肠。上层通道3和下层通道3b内流体的压力为20mbar，中层通道3a内细菌培养液的压力为正弦波形，振幅为120mbar，如图9所示。上、下层弹性多孔膜由于两侧压力差产生周期性的脉动，模拟肠道的蠕动。弹性多孔膜在不同压力下的状态，如图10所示，分别模拟大肠蠕动时肠壁的状态。由于模拟的小动脉是柔软的，有弹性的，所以可以模拟出肠蠕动的状态，在100mbar的压力下，PDMS多孔膜发生弹性形变，拉伸肠上皮细胞和肌肉细胞，但是不会破肠上皮细胞间和肌肉细胞间的紧密连接，不影响肠细胞层和肌肉细胞层的屏障作用和生理功能。

如果是传统的硬质膜，则在压力作用下，硬质膜会发生不可逆形变，肠上皮细胞间或肌肉细胞间会形成裂隙，影响肠上皮细胞层或肌肉细胞层的屏障作用和生理功能。

使用该发明对大肠的生理结构(包括肠上皮细胞层、肌肉细胞层和肠道菌群层)进行模拟，由于模拟的大肠管壁是柔软有弹性的，因此可以模拟大肠的蠕动。同样由于模拟的大肠管壁是柔软的，肠上皮细胞层和肌肉层在压力的作用下，可以维持一层致密的细胞层，从而保持它的屏障作用和生理功能。进而为在体外研究肠道的吸收和代谢奠定了坚实的基础。

实施例5：子宫的模拟以及受精卵的体外培育研究

如图1所示，下层基板1a、中层基板1b和上层基板1c的材料为PDMS，上层通道3和下层通道3b的宽度均为500微米，高度均为1毫米，中层通道3a的宽度和高度均为5毫米，上下层PDMS弹性多孔膜的厚度为60微米，在上层弹性多孔膜2a的下表面培养子宫内膜上皮细胞在下层弹性多孔膜2a的上表面培养子宫内膜上皮细胞，则由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空部分所组成的管腔结构模拟了人的子宫。

将人工受精卵通入模拟的子宫，即图1中的中层通道3a，让其粘附在子宫内膜上皮细胞上，人工受精卵发育所需要的营养由上层通道3和下层通道3b内流动的培养液供给，流体的压力为5mbar，中层通道3a内培养液的压力也为5mbar，由于模拟的子宫具有子宫内膜上皮细胞，人工受精卵成长环境比较好，而且模拟的子宫具有易于拆卸的特点，人工受精卵很容易被取出，经统计，基于该发明模拟子宫培养的人工受精卵，在植回母体前的成活率高达70％，而传统的微液滴培养方法，植回母体前的成活率经统计只有20％。

本实施例的优点在于：模拟了子宫的生理结构，实现了人工受精卵的培养，由于模拟的子宫具有子宫内膜上皮细胞，而且易于拆卸，粘附的人工受精卵很容易取出，从而大大提高了人工受精卵体外培养的成功率，进而提高了试管婴儿的成功率，降低了试管婴儿的成本。

实施例6：食道和吞咽的模拟

如图1所示，上层通道3、中层通道3a和下层通道3b的宽度均为500微米；高度均为1毫米，在PDMS上层弹性多孔膜2b的下表面培养食道的上皮细胞，上表面培养平滑肌细胞，在PDMS下层弹性多孔膜2a的上表面培养食道的上皮细胞，下表面培养平滑肌细胞，上下层PDMS弹性多孔膜的厚度为30微米，则由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空结构所组成的管腔结构则模拟了人的食道腔。上层通道3和下层通道3b内流体的压力为20mbar，中层通道3a内培养液的压力以正弦波形的形式改变，振幅为120mbar，如图9所示。上、下层弹性多孔膜由于两侧压力差产生周期性的脉动，模拟了食道的吞咽过程。弹性多孔膜在不同压力下的状态，如图10所示，分别模拟食道吞咽时食道壁的状态。在100mbar的压力下，PDMS多孔膜发生弹性形变，拉伸食道上皮细胞和平滑肌细胞，促进食道上皮细胞分泌食道黏膜。如果是传统的硬质膜，则在压力作用下，硬质膜会发生不可逆形变，影响食道上皮细胞层或平滑肌细胞层的分泌黏膜的作用和生理功能。

本实施例的优点在于：模拟了食道的生理结构(包括食道上皮细胞层、平滑肌细胞层和肠道菌群层)，而且由于模拟的食道管壁是柔软有弹性的，因此可以模拟食道的蠕动。同样由于模拟的食道管壁是柔软的，食道上皮细胞层和平滑肌层在压力的作用下，可以促进食道上皮细胞分泌黏膜，并促进食物的吞咽过程以及保护食物在吞咽过程中对食道上皮细胞的损伤。从而为在体外研究食道吞咽过程奠定了坚实的基础。

实施例7：皮肤和皮下血管的模拟

如图1所示，下层基板1a和中层基板1b的材料为PDMS，上层基板1c的材料为玻璃，上层通道3、中层通道3a和下层通道3b的宽度分别为750微米，高度分别为1毫米、100微米和100微米，在PDMS上层弹性多孔膜2b的上表面培养皮肤角质层细胞，下表面培养皮肤真皮层细胞，在PDMS下层弹性多孔膜2a的下表面培养血管内皮细胞，在由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空结构所组成的管腔结构中充入水凝胶，负载细胞的PDMS上层弹性多孔膜2b和水凝胶组合起来即模拟了皮肤，下层通道3b即模拟了皮下血管，模拟皮下血管3b中流动的培养液透过血管内皮细胞和水凝胶向真皮细胞和角质层细胞提供营养，维持皮肤的生理活性。上层通道3通入高压空气流，柔软的模拟皮肤可以感受高压空气流，从而促进角质层细胞的多层分化。

本实施例的优点在于：模拟了皮肤的生理结构(包括角质层、真皮层和皮下血管)，而且由于模拟的皮肤是柔软有弹性的，因此它可以感受高压空气流，从而促角质层分化。模拟的皮下血管可以向皮肤细胞提供营养，维持皮肤的生理特性。

实施例8：脑三叉神经血管的模拟

如图1所示，下层基板1a，中层基板1b和上层基板1c的材料为PDMS，上层通道3、中层通道3a和下层通道3b的宽度分别为750微米，高度分别为150微米、1毫米和150微米，在PDMS上层弹性多孔膜2b的上表面培养三叉神经节细胞，下表面培养血管内皮细胞，在PDMS下层弹性多孔膜2a的下表面培养三叉神经节细胞，上表面培养血管内皮细胞，在上层通道3与下层通道3b通入适于三叉神经节细胞的培养液，以维持细胞的活性与形态功能，在由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空结构所组成的管腔结构中充入脉动的培养液，由于多孔PDMS薄膜(图1中的2b与2a)的柔软性，脉动的培养液使得弹性多孔膜收缩舒张，模拟血管的收缩舒张，这种收缩舒张改变了血管内皮细胞膜的通透性，使得血管腔即图1中3a处的血浆蛋白外渗，与三叉神经节细胞相互作用，从而引起引起局部无菌性炎症，并可引起三叉神经核Fos蛋白的过度表达，从而模拟了三叉神经血管病理模型。

本实施例的优点在于：通过弹性多孔薄膜的柔软性的特点，施加不同压力，模拟血管在收缩舒张时的机械力学环境，更加仿真的模拟脑部三叉神经与血管的微环境，通过添加不同的刺激因素，方便的研究三叉神经血管系统引起的偏头痛的因素，与现有的细胞模型相比更加仿真，真实的反应出体内环境，与动物模型相比时间周期更短，更方便，为偏头痛病理模型建立提供良好的研究工具。

实施例9：肌肉拉伸模型的模拟

如图1所示，下层基板1a，中层基板1b和上层基板1c的材料为PDMS，上层通道3、中层通道3a和下层通道3b的宽度分别为500微米，高度分别为150微米、1毫米和150微米，在PDMS上层弹性多孔膜2b的上表面培养平滑肌细胞，下表面培养血管内皮细胞，在PDMS下层弹性多孔膜2a的下表面培平滑肌细胞，上表面培养血管内皮细胞，在上层通道3与下层通道3b通入适于平滑肌细胞的培养液，以维持细胞的活性与形态功能，在由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空结构所组成的管腔即图1中3a处充入脉动的培养液。由于多孔PDMS薄膜(图1中的2b与2a)的柔软性，脉动的培养液使得薄膜收缩舒张，模拟肌肉的拉伸过程，通过控制脉动的培养液的振幅大小，来控制平滑肌细胞的受力大小，当平滑肌细胞受力过大时，会出现平滑肌细胞损伤的现象，通过测定平滑肌细胞损伤特定蛋白表达来确定平滑肌细胞受力与细胞损伤关系，从而模拟了肌肉损伤的细胞模型。

本实施例的优点在于：通过弹性多孔薄膜的柔软性的特点，施加不同压力，模拟肌肉拉伸时的机械力学环境，与现有细胞模型不同的是，可以通过改变压力大小，定量的控制PDMS弹性多孔薄膜竖直方向的形变大小，这样可以方便的控制平滑肌细胞的受力大小。

实施例10：心脏细胞力学特征测量模型的模拟

如图1所示，下层基板1a，中层基板1b和上层基板1c的材料为PDMS，上层通道3、中层通道3a和下层通道3b的宽度分别为500微米，高度分别为150微米、1毫米和150微米，在PDMS上层弹性膜2b的上表面培养心肌细胞，在PDMS下层弹性多孔膜2a的下表面培心肌细胞，在上层通道3与下层通道3b通入适于心肌细胞的培养液，以维持细胞的活性与形态功能，在由上下层弹性膜和中层基板镂空结构所组成的管腔即图1中3a处充入培养液。由于PDMS薄膜(即图1中的2b与2a)的柔软性，可以传递心肌细胞的跳动状态，从而可视化的测定管腔的培养液在管腔液面的变化来确定心肌细胞的跳动频率和跳动幅度大小。

本实施例的优点在于：通过PDMS弹性薄膜的柔软性的特点，将心肌细胞种植在弹性薄膜，心肌细胞自身会跳动，从而带动弹性薄膜的跳动，通过测定管腔液面的变化，巧妙的反应出心肌细胞的跳动状态。

实施例11：肿瘤微环境力学特征对肿瘤转移的影响模型的模拟

如图1所示，下层基板1a，中层基板1b和上层基板1c的材料为PDMS，上层通道3、中层通道3a和下层通道3b的宽度分别为500微米，高度分别为150微米、1毫米和150微米，在PDMS上层弹性多孔膜2b的上表面培养肿瘤细胞，下表面培养血管内皮细胞，在PDMS下层弹性多孔膜2a的下表面培肿瘤细胞，上表面培养血管内皮细胞，在上层通道3与下层通道3b通入适于肿瘤细胞的培养液，以维持细胞的活性与形态功能，在由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空结构所组成的管腔结构中充入脉动的培养液。由于多孔PDMS薄膜的柔软性，脉动的培养液使得薄膜收缩舒张，通过控制脉动的培养液的振幅大小，来控制肿瘤细胞的受力大小，从而观察在肿瘤细胞受力的情况下对肿瘤细胞转移速率变化的影响。

本实施例的优点在于：通过弹性多孔薄膜的柔软性的特点，施加不同压力，可以改变薄膜形变大小，通过压力的控制，来控制肿瘤细胞的受力大小，从而观察在肿瘤细胞受力的情况下对肿瘤细胞转移速率变化的影响。

实施例12：肝血窦的模拟

如图1所示，下层基板1a，中层基板1b和上层基板1c的材料为PDMS，上层通道3、中层通道3a和下层通道3b的宽度分别为500微米，高度分别为150微米、1毫米和150微米，在PDMS上层弹性多孔膜2b的上表面培养肝实质细胞和肝星状细胞，下表面培养血管内皮细胞，在PDMS下层弹性多孔膜2a的下表面培养肝实质细胞和肝星状细胞，上表面培养血管内皮细胞，在上层通道3与下层通道3b通入适于肝实质细胞和肝星状细胞的培养液，以维持细胞的活性与形态功能，在由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空结构所组成的管腔中充入的带有巨噬细胞的培养液。模拟肝血窦的生理结构，在中间管腔加入药物，取上层通道与下层通道中药物代谢产物，从而测试药物代谢和肝毒性。

本实施例的优点在于：模拟了肝血窦的生理结构，比现有细胞模型更加仿真，并且装置易于拆装，很容易的把里面的细胞拿出来检测相关指标，大大的降低了药物测试成本。

实施例13：支气管(肺泡)的模拟

如图1所示，下层基板1a，中层基板1b和上层基板1c的材料为PDMS，上层通道3、中层通道3a和下层通道3b的宽度分别为500微米，高度分别为150微米、1毫米和150微米，在PDMS上层弹性多孔膜2b的上表面培养血管内皮细胞，下表面培养肺上皮细胞，在PDMS下层弹性多孔膜2a的下表面培养血管内皮细胞，上表面培养肺上皮细胞，在上层通道3与下层通道3b通入适于血管内皮细胞的培养液，以维持细胞的活性与形态功能，在由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空结构所组成的管腔中充入脉动的无菌空气，模拟支气管的生理结构。脉动的无菌空气的通入，模拟呼吸时空气进入支气管的过程。

本实施例的优点在于：模拟了支气管的生理结构，由于PDMS弹性多孔膜的柔软性，脉动的无菌空气的通入，可以模拟呼吸的过程，可以在无菌空气中加入治疗哮喘的药物，测试药物能否通过肺上皮细胞进入血液中，从而确定药物的剂型。

实施例14：淋巴管-组织-血管系统的模拟

如图1所示，下层基板1a，中层基板1b和上层基板1c的材料为PDMS，上层通道3、中层通道3a和下层通道3b的宽度分别为500微米，高度分别为150微米、1毫米和150微米，在PDMS上层弹性多孔膜2b的上表面培养淋巴内皮细胞，在PDMS下层弹性多孔膜2a的下表面培养血管内皮细胞，在上层通道3通入带有淋巴细胞的培养液，下层通道3b通入适于血管内皮细胞的培养液，并且在下层通道3b的培养液中加入炎症因子，在由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空结构所组成的管腔结构中通入组织细胞和三维胶的混合物，模拟淋巴管-组织-血管系统。在下层通道3b的培养液中加入炎症因子，可以观察到当炎症发生时，血管内炎症因子增高，淋巴细胞从淋巴管中出来，通过组织，到达血管的过程。

本实施例的优点在于：模拟了淋巴管-组织-血管的微环境，芯片易于拆装，多孔PDMS弹性薄膜孔径可控，易于物质交换，并且便于观察到淋巴细胞转移过程，实现了体外淋巴系统动态可视化。

实施例15：牙龈沟的模拟

如图1所示，下层基板1a，中层基板1b和上层基板1c的材料为PDMS，上层通道3、中层通道3a和下层通道3b的宽度分别为500微米，高度分别为150微米、1毫米和150微米，在PDMS上层弹性多孔膜2b的上表面培养血管内皮细胞，在PDMS下层弹性多孔膜2a的上表面培养成骨细胞，在上层通道3通入适于血管内皮细胞的培养液，并且在上层通道3的培养液中加入巨噬细胞，在下层通道3b通入适于成骨细胞的培养液，在由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空结构所组成的管腔(即图1中3a处)中通入带有LPS的培养液，模拟牙龈沟的微环境。在管腔中通入带有LPS的培养液，可以观察到上层通道3的培养液中的巨噬细胞进入下层通道3b中，导致成骨细胞炎症发生，模拟了牙周病发生过程。

本实施例的优点在于：模拟了牙龈沟的微环境，用于牙周病的研究，芯片易于拆装，方便评价各层细胞的活性与形态，多孔PDMS弹性薄膜孔径可控，易于物质交换，并且便于观察到巨噬细胞转移过程。

实施例16：脂肪糖尿病模型的模拟

如图1所示，下层基板1a，中层基板1b和上层基板1c的材料为PDMS，上层通道3、中层通道3a和下层通道3b的宽度分别为500微米，高度分别为150微米、150微米和150微米，下层弹性多孔膜2a和上层弹性多孔膜2b厚度为30微米，在上层通道3通入适于脂肪细胞与胰岛细胞的共培养液，在由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空结构所组成的管腔(即图1中3a处)加入带有脂肪细胞的悬浮培养液，在下层通道3b加入胰岛细胞及三维胶的混合物。由于下层弹性多孔膜2a和上层弹性多孔膜2b非常利于物质交换，所以可以观察到由上下层弹性多孔膜和中层基板镂空结构所组成的管腔的脂肪细胞分泌物对下层通道3b中胰岛细胞的胰岛素分泌相关的信号通路的影响，这种影响关系到糖尿病的发生。

本实施例的优点在于：模拟了脂肪糖尿病模型，由于PDMS弹性多孔膜的柔软性以及多孔性，使得三维胶与膜之间贴附紧密，有利于物质交换，使得实验现象明显，芯片易于拆装，方便评价各层细胞的活性与形态，以及胰岛细胞的蛋白表达通路。

Claims (9)

1.一种微流控芯片，其特征在于：该芯片设为多层结构，所述多层结构包括形成柔软管腔的双层弹性多孔膜，其中，上层弹性多孔膜(2b)的上下侧之间及下层弹性多孔膜(2a)的上下侧之间进行物质和能量交换。

2.根据权利要求1所述的一种微流控芯片，其特征在于该芯片的多层结构为：从上至下依次包括上层基板(1c)、上层弹性多孔膜(2b)、中层基板(1b)、下层弹性多孔膜(2a)、下层基板(1a)；

所述上层基板(1c)下表面设有上凹槽，上凹槽与上层弹性多孔膜(2b)形成封闭的上层通道(3)，该通道的各个内壁用于培养不同的细胞或细菌；

所述中层基板(1b)部分镂空，其镂空的部分与上层弹性多孔膜(2b)和下层弹性多孔膜(2a)围成一个封闭的中间层通道(3a)，该通道的各个内壁用于培养不同的细胞或细菌；

所述下层基板(1a)的上表面设有下凹槽，下凹槽与下层弹性多孔膜(2a)形成封闭的下层通道(3b)，该通道的各个内壁用于培养不同的细胞或细菌。

3.根据权利要求2所述的一种微流控芯片，其特征在于：所述上凹槽的截面为矩形、半圆形或半椭圆形。

4.根据权利要求2所述的一种微流控芯片，其特征在于：所述下凹槽的截面为矩形、半圆形或半椭圆形。

5.根据权利要求2所述的一种微流控芯片，其特征在于：该芯片的多层结构：上层基板(1c)、上层弹性多孔膜(2b)、中层基板(1b)、下层弹性多孔膜(2a)、下层基板(1a)之间可拆卸连接。

6.根据权利要求2所述的一种微流控芯片，其特征在于：所述下层基板(1a)、中层基板(1b)和上层基板(1c)的材料选用石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物、聚碳酸酯、聚酯、琼脂糖、壳聚糖或海藻酸钠中的任一种。

7.根据权利要求2所述的一种微流控芯片，其特征在于：所述弹性多孔膜的材料采用PDMS或聚偏氟乙烯。

8.权利要求1-7任一项所述的微流控芯片的应用，其特征在于：用于模拟人体内柔软管腔。

9.根据权利要求8所述的微流控芯片的应用，其特征在于：所述芯片内所种植的细胞包括肠、心脏、肝、肾、胰岛、皮肤、口腔、胃、子宫、卵巢、眼睛、骨骼、血管、肺、肌肉、脂肪、肿瘤、淋巴和脑器官所包含的细胞；芯片内所种植的细菌包括肠道菌群和胃菌群；从而该芯片应用于模拟带管腔结构的器官和组织。