CN112300940A - 一种基于微流控技术构建的牙周软组织仿生芯片及其应用 - Google Patents
一种基于微流控技术构建的牙周软组织仿生芯片及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112300940A CN112300940A CN202011192879.6A CN202011192879A CN112300940A CN 112300940 A CN112300940 A CN 112300940A CN 202011192879 A CN202011192879 A CN 202011192879A CN 112300940 A CN112300940 A CN 112300940A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- micro
- soft tissue
- channel
- liquid inlet
- liquid outlet
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
- C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/14—Scaffolds; Matrices
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/069—Vascular Endothelial cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/09—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/28—Vascular endothelial cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physiology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于微流控芯片技术构建的牙周软组织仿生芯片及其应用,属于微流控芯片领域。该微流控芯片主要由上下8个细胞培养池,进出样口和微流控液体通道构成;多腔室的设计可实现细胞高通量,提高芯片利用效率。该方法主要有以下步骤:1)芯片基质胶灌注;2)芯片细胞接种及培养;3)芯片牙周软组织血管屏障功能监测。本发明的一种微流控芯片有八个腔室,上、下流体可在分隔八个腔室的多孔膜上发生四次物质交换,从而能高仿真度的模拟牙周软组织中牙龈上皮屏障的细胞迁移过程和屏障破坏过程,同时还可以模拟牙周软组织界面的构建,应用于细胞共培养、构建细胞屏障、细胞迁移等研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种仿生芯片,具体涉及一种基于微流控芯片技术构建的牙周软组织仿生芯片及其应用。
背景技术
牙周病是一种细菌生物膜相关的炎症性疾病,由局部微生物的转移引起,它会引起牙周组织的逐渐破坏,最终导致牙齿脱落。由于牙周病涉及许多全身性疾病,如糖尿病、心血管疾病、吸入性肺炎、痴呆等,因此预防牙周病对促进人体健康至关重要。然而,牙周炎通过龈下菌斑生物膜中的微生物及其产物引起全身炎症及免疫反应可能使总体系统性疾病风险增高。而牙周软组织中结合上皮屏障作为对抗外来侵入者的第一道防御线,它的体外模拟对牙周病的研究至关重要。结合上皮屏障是使牙龈上皮细胞与血管内皮细胞紧密相连的结构,主要附着在牙槽骨上,防止口腔中的异物以及病菌进入牙周深层组织而对牙周有保护作用。该屏障主要由牙龈上皮细胞表面龈沟液液体层、牙龈上皮层、细胞外基质以及毛细血管内皮细胞层构成。目前,体外建立牙龈上皮屏障是开展牙周软组织生理或病理相关机制研究的前提和基础,然而,现有研究手段主要依赖于孔板和动物实验,但这种方式与体内细胞所处的三维微环境完全不同,也难以反映体内牙周软组织包括的多细胞空间排列、龈沟液以及血液流动等复杂的三维组织结构与周围微环境。
微流控芯片技术是涉及工程学、物理、化学、生物、纳米科学等众多学科的交叉研究领域,通过微通道、微泵、微阀等结构和技术手段,实现在微、纳尺度上对流体的精准操控,可在芯片微通道内进行多种细胞培养和流体刺激,构建与生理环境接近并具有时空分辨特点的三维微环境,已成为组织器官构建的重要创新技术。特别是微流控技术在多种微通道集成、流体界面形成及复杂细胞微环境模拟方面的功能特点,尤其适合于构建包含细胞、基质和流体等多因素共同构成的牙周软组织结合上皮屏障,是建立体外研究体系的理想平台。该方面研究国内外尚无报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于微流控芯片技术构建的牙周软组织仿生芯片及其应用,特别针对模拟构建牙周软组织屏障的主要细胞组成和基质的三维排布,该方法具有接近体内牙周软组织细胞和基质组成的特点。该芯片可以实现多种细胞的体外联合培养,动态监测免疫细胞释放细胞因子及进一步影响血管内皮细胞和牙龈上皮细胞生物学行为和机制,同时可实现对免疫细胞在牙周软组织屏障动态观察,应用于筛选药物、分析药效,为研究该疾病提供了体外研究平台。
为了实现上述发明目的,解决已有技术中所存在的问题,本发明提供了一种基于微流控芯片技术构建的牙周软组织仿生芯片,所述牙周软组织仿生芯片从上到下依次包括上层基板、多孔膜和下层基板,所述上层基板上设有2条平行的出液微通道a,上层基板上还设有进液微通道a,进液微通道a与出液微通道a垂直形成“土”字状结构,其中出液微通道a的4个端点上各设有一个出液口a,进液微通道a上不与出液微通道a相交的端点上设有第一进液口,2条出液微通道a上均分别设有两个腔室a,且每条出液微通道a上的两个腔室a以进液微通道a为对称轴分布在两侧;
下层基板上设有2条平行的出液微通道b,下层基板上还设有进液微通道b,进液微通道b与出液微通道b垂直形成“土”字状结构,其中出液微通道b的4个端点上各设有一个出液口b,进液微通道b上不与出液微通道b相交的端点上设有第三进液口,2条出液微通道b上均分别设有两个腔室b,且每条出液微通道b上的两个腔室b以进液微通道b为对称轴分布在两侧;
上层基板与下层基板紧密压紧后,所述进液微通道a与进液微通道b呈垂直角度,腔室a与腔室b在竖直方向上完全重合,且腔室a与腔室b之间均设有多孔膜多孔膜的大小形状与腔室相同;上层基板上还设有4个出液口c,出液口c位于出液口b的竖直方向上的正上方;上层基板上还设有第二进液口,第二进液口位于第三进液口的竖直方向上的正上方。
进一步地,上述技术方案中,第一进液口与进液微通道a之间连通;出液微通道a、腔室a与出液口a之间连通;进液微通道a与出液微通道a的交汇处连通;第三进液口与进液微通道b之间连通;出液微通道b、腔室b与出液口b之间连通;进液微通道b与出液微通道b的交汇处连通。
进一步地,上述技术方案中,所述腔室a和腔室b的形状包括圆形、矩形、半圆形或半椭圆形。
进一步地,上述技术方案中,所述上层基板和下层基板的材料包括石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物、聚碳酸酯、聚酯、琼脂糖、壳聚糖或海藻酸钠;所述多孔膜的材料包括PDMS、聚偏氟乙烯或聚碳酸酯。
进一步地,上述技术方案中,第二进液口和出液口c为通孔结构。
进一步地,上述技术方案中,所述上层基板,多孔膜和下层基板之间可拆卸连接,便于维护。
进一步地,上述技术方案中,所述多孔膜的上、下两表面可分别接种牙龈上皮细胞和血管内皮细胞;所述牙龈上皮细胞和血管内皮细胞的来源包括人或任何一种哺乳动物,或原代细胞、细胞系以及干细胞诱导分化的功能细胞。
本发明还提供了基于微流控芯片技术构建的牙周软组织仿生芯片的应用,利用牙周软组织仿生芯片构建牙周软组织血管屏障模型,应用于细胞共培养、构建细胞屏障、牙周软组织血管屏障以及功能监测,细胞迁移,药物筛选。
进一步地,上述技术方案中,所述牙周软组织血管屏障模型的构建方法,包括如下步骤:
1)基质胶包被多孔膜
将matrigel基质胶加入盛有多孔膜的培养皿中,将装有多孔膜和matrigel基质胶的培养皿放入细胞培养箱中孵育20-60min凝胶,凝胶过程结束后,磷酸盐缓冲液清洗至少3遍后待用;
2)细胞接种及牙周软组织血管屏障模型构建
血管内皮细胞制成悬液,以(1*10^5cell/ml-1*10^6cell/ml)的接种密度接种到包被好的多孔膜的一面上,于细胞培养箱中培养,待血管内皮细胞贴壁后,将接种有血管内皮细胞的多孔膜面朝向腔室b组装到牙周软组织仿生芯片上,夹紧固定上层基板和下层基板,通过第二进液口向下层基板注入细胞培养液,使细胞培养液通过第三进液口进入腔室b;将牙龈上皮细胞制成悬液,以(1*10^5cell/ml-1*10^6cell/ml)的接种密度通过第一进液口进入腔室a,将牙周软组织仿生芯片放入细胞培养箱中培养,每隔24h换一次液;得到牙周软组织血管屏障模型;
3)牙周软组织血管屏障模型功能监测
采用血管内皮细胞血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)检测牙周软组织血管屏障模型屏障功能的完整性(标准为血管内皮钙粘蛋白免疫荧光检测显示细胞间紧密连接形成),采用FITC标记的右旋糖酐(FITC-Dextran)监测牙周软组织血管屏障模型屏障的通透性(采用FITC标记的右旋糖苷检测,结果若出现70kDa分子量的葡聚糖的渗透速率最低,40kDa的次之,这种渗透速率的变化趋势符合待测物分子量的差异)。
本发明所述的牙周软组织仿生芯片,能高仿真度的模拟牙周软组织中牙龈上皮屏障的细胞迁移和屏障破坏过程,同时还可以模拟构建牙周软组织界面,应用于细胞共培养、构建细胞屏障、牙周软组织血管屏障以及功能监测,细胞迁移,药物筛选等研究。
发明有益效果
与已有技术相比,本发明的一种基于微流控技术的牙周软组织仿生芯片,形成了八个腔室,上、下流体可在分隔八个腔室的多孔膜上发生4次物质交换,从而能提高芯片的高通量,提高芯片利用率,高仿真度的模拟牙周软组织屏障的炎症发生时屏障自我防护和破坏过程,,同时还可以模拟牙周软组织界面的构建,应用于细胞共培养、构建细胞屏障、进行动态观察免疫细胞的迁移过程。另外本发明的芯片可拆卸链接,更加方便对多孔膜上的细胞进行成像检测。除此之外,上、下基板经过处理,可以重复利用,节约经济。
附图说明
图1为本发明的牙周软组织仿生芯片结构示意图。
图中,1、上层基板,1-1、进液微通道a,1-2、出液微通道a,1-3、出液口a,1-4、第一进液口,1-5第二进液口,1-6、腔室a,1-7、出液口c,2、多孔膜,3、下层基板,3-1、进液微通道b,3-2、出液微通道b,3-3、出液口b,3-4、第三进液口,3-5、腔室b。
图2是本发明所述牙周软组织仿生芯片中牙龈上皮细胞的血管内皮细胞活性图。
图3是本发明所述牙周软组织仿生芯片中牙龈上皮细胞的血管内皮细胞共培养分布图。
图4是本发明所述牙周软组织仿生芯片中检测牙周软组织血管屏障分布图。
图5是本发明所述牙周软组织仿生芯片中检测牙周软组织血管通透性分布图。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
实施例1
如图1所示,一种基于微流控芯片技术构建的牙周软组织仿生芯片,一种基于微流控芯片技术构建的牙周软组织仿生芯片,从上到下依次包括上层基板1、多孔膜2和下层基板3,所述上层基板1上设有2条平行的出液微通道a 1-2,上层基板1上还设有进液微通道a1-1,进液微通道a 1-1与出液微通道a 1-2垂直形成“土”字状结构,其中出液微通道a 1-2的4个端点上各设有一个出液口a 1-3,进液微通道a 1-1上不与出液微通道a 1-2相交的端点上设有第一进液口1-4,2条出液微通道a 1-2上均分别设有两个腔室a 1-6,且每条出液微通道a 1-2上的两个腔室a 1-6以进液微通道a 1-1为对称轴分布在两侧;
下层基板3上设有2条平行的出液微通道b 3-2,下层基板3上还设有进液微通道b3-1,进液微通道b 3-1与出液微通道b 3-2垂直形成“土”字状结构,其中出液微通道b 3-2的4个端点上各设有一个出液口b 3-3,进液微通道b 3-1上不与出液微通道b 3-2相交的端点上设有第三进液口3-4,2条出液微通道b 3-2上均分别设有两个腔室b 3-5,且每条出液微通道b 3-2上的两个腔室b 3-5以进液微通道b 3-1为对称轴分布在两侧;
上层基板1与下层基板3紧密压紧后,所述进液微通道a 1-1与进液微通道b 3-1呈垂直角度,腔室a 1-6与腔室b 3-5在竖直方向上完全重合,且腔室a 1-6与腔室b 3-5之间均设有多孔膜2,多孔膜2的大小形状与腔室相同;上层基板1上还设有4个出液口c 1-7,出液口c 1-7位于出液口b 3-3的竖直方向上的正上方;上层基板1上还设有第二进液口1-5,第二进液口1-5位于第三进液口3-4的竖直方向上的正上方。
第一进液口1-4与进液微通道a 1-1之间连通;出液微通道a 1-2、腔室a 1-6与出液口a 1-3之间连通;进液微通道a 1-1与出液微通道a 1-2的交汇处连通;第三进液口3-4与进液微通道b 3-1之间连通;出液微通道b 3-2、腔室b 3-5与出液口b 3-3之间连通;进液微通道b 3-1与出液微通道b 3-2的交汇处连通。
所述腔室a 1-6和腔室b 3-5的形状包括圆形、矩形、半圆形或半椭圆形。
所述上层基板1和下层基板3的材料包括石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物、聚碳酸酯、聚酯、琼脂糖、壳聚糖或海藻酸钠;所述多孔膜2的材料包括PDMS、聚偏氟乙烯或聚碳酸酯。
第二进液口1-5和出液口c 1-7为通孔结构。
所述上层基板1,多孔膜2和下层基板3之间可拆卸连接。
所述多孔膜2的上、下两表面可分别接种牙龈上皮细胞和血管内皮细胞;所述牙龈上皮细胞和血管内皮细胞的来源包括人或任何一种哺乳动物,或原代细胞、细胞系以及干细胞诱导分化的功能细胞。
实施例2
本发明选取将原代细胞人牙龈上皮细胞(HGE)(人牙龈上皮细胞的原代培养:经患有牙周炎疾病的患者书面知情同意后,切取下来“领圈”牙龈组织(领圈:即为包裹牙颈部的牙龈组织),立即放入含3~4倍双抗的D-Hanks液中37℃约1h。将牙龈组织置于2.5g/LDispaseⅡ酶中4℃过夜,上皮组织与结缔组织分离剪碎后,将分离下的上皮组织置于0.025%不含EDTA的胰蛋白酶2mL中轻轻摇晃混匀,静置消化10min,加入含10%血清DMEM培养基中止消化,1000r/min离心5min并弃去上清液,保留组织块,加适量上皮专用含添加物培养基HuMedia-KG2「Kurabo,Osaka,Japan,KK-2150S」,重悬组织块及细胞沉淀并计数接种,每2天换液1次。待细胞融合率达到80%-95%进行细胞传代培养用于试验)和人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)【LONZA;C2517A】种在多孔膜的两个表面上,仿龈沟液流体培养液(HuMedia-KG2,Kurabo,Osaka,Japan,KK-2150S)通过上层基板的第一进液口进入上层基板的进液微通道a,进一步进入出液微通道a,流经人牙龈上皮细胞侧的腔室,通过出液微通道a从上层基板的出液口a离开芯片。仿血液流体培养液(Lnoza;CC3162)通过贯穿上层基板的第二进液口进入第三进液口,进一步进入下层基板的进液微通道b,进一步进入出液微通道b,流经人脐静脉血管内皮细胞侧的腔室,通过出液微通道b进入出液口b,通过贯穿上层基板的出液口c离开芯片。仿血液和仿龈沟液液流体在上面种有人牙龈上皮细胞,下面种有人脐静脉血管内皮细胞的多孔膜处发生物质交换,模拟牙周软组织中屏障的周围微环境。
一种利用基于微流控芯片技术的牙周软组织仿生芯片构建的牙周软组织血管屏障模型的功能监测方法:
1)基质胶包被多孔膜
将matrigel基质胶加入盛有多孔膜的培养皿中,将装有多孔膜和materigel基质胶的培养皿放入细胞培养箱中孵育20-60min凝胶,凝胶过程结束后,磷酸盐缓冲液清洗至少3遍后待用;
2)细胞接种及牙周软组织血管屏障模型构建
人脐静脉血管内皮细胞制成悬液,以(1*10^5cell/ml-1*10^6cell/ml)的接种密度接种到包被好的多孔膜的一面上,于37℃细胞培养箱中培养,待人脐静脉血管内皮细胞贴壁后,将接种有人脐静脉血管内皮细胞的多孔膜面朝向腔室b组装到牙周软组织仿生芯片上,夹紧固定上层基板和下层基板,通过第二进液口向下层基板注入细胞培养液,使细胞培养液通过第三进液口进入腔室b;将人牙龈上皮细胞制成悬液,以(1*10^5cell/ml-1*10^6cell/ml)的接种密度通过第一进液口进入腔室a,将牙周软组织仿生芯片放入37℃细胞培养箱中培养,每隔24h换一次液;培养2-3天后,得到牙周软组织血管屏障模型构建。采用细胞Dead/live试剂盒「invitrogen;L3224」」检测细胞在芯片内的成活情况如图2(红色代表死亡细胞,绿色代表活细胞,结果数据表明芯片内细胞成活率达到95%以上),拍照记录细胞位置及形态如图3(此图为HGE和HUVEC在芯片中共培养情况,分别使用红色和绿色细胞示踪剂[life technologies;c34551;]标记HGE和HUVEC以便观察拍摄细胞在芯片内是否分布均匀以及存活情况(具有细胞形态的为活细胞,若细胞在芯片内变为点状失去细胞形态为死细胞)。
3)牙周软组织血管屏障模型功能监测
采用人脐静脉血管内皮细胞VE-cadherin(血管内皮钙粘蛋白)检测牙周软组织血管屏障模型牙龈血管屏障的完整性,其结果如图4所示。细胞间连接蛋白分布于细胞间,形成完整的细胞间连接。采用FITC标记的右旋糖苷(FITC-Dextran)监测牙周软组织血管屏障模型牙周软组织屏障的通透性如图5(对于HUVEC细胞层,70kDa分子量的葡聚糖的渗透速率最低,40kDa的次之,而两个小分子较为接近,这种渗透速率的变化趋势符合待测物分子量的差异,图示可见HUVEC细胞层具有依赖于分子量大小选择性透过性,且其对于大分子物质的拦截能力(一般认为表观渗透率<10-7,可视为难以透过)符合毛细血管的特性,另外也证明依赖于洁净PDMS材质表面间的可逆紧密粘合,通过两层PMMA板夹紧多层PDMS垫片和多孔膜的方法具有良好的密封性,各层间的传质只有通过细胞层进行)。
Claims (9)
1.一种基于微流控芯片技术构建的牙周软组织仿生芯片,其特征在于,从上到下依次包括上层基板(1)、多孔膜(2)和下层基板(3),所述上层基板(1)上设有2条平行的出液微通道a(1-2),上层基板(1)上还设有进液微通道a(1-1),进液微通道a(1-1)与出液微通道a(1-2)垂直形成“土”字状结构,其中出液微通道a(1-2)的4个端点上各设有一个出液口a(1-3),进液微通道a(1-1)上不与出液微通道a(1-2)相交的端点上设有第一进液口(1-4),2条出液微通道a(1-2)上均分别设有两个腔室a(1-6),且每条出液微通道a(1-2)上的两个腔室a(1-6)以进液微通道a(1-1)为对称轴分布在两侧;
下层基板(3)上设有2条平行的出液微通道b(3-2),下层基板(3)上还设有进液微通道b(3-1),进液微通道b(3-1)与出液微通道b(3-2)垂直形成“土”字状结构,其中出液微通道b(3-2)的4个端点上各设有一个出液口b(3-3),进液微通道b(3-1)上不与出液微通道b(3-2)相交的端点上设有第三进液口(3-4),2条出液微通道b(3-2)上均分别设有两个腔室b(3-5),且每条出液微通道b(3-2)上的两个腔室b(3-5)以进液微通道b(3-1)为对称轴分布在两侧;
上层基板(1)与下层基板(3)紧密压紧后,所述进液微通道a(1-1)与进液微通道b(3-1)呈垂直角度,腔室a(1-6)与腔室b(3-5)在竖直方向上完全重合,且腔室a(1-6)与腔室b(3-5)之间均设有多孔膜(2),多孔膜(2)的大小形状与腔室相同;上层基板(1)上还设有4个出液口c(1-7),出液口c(1-7)位于出液口b(3-3)的竖直方向上的正上方;上层基板(1)上还设有第二进液口(1-5),第二进液口(1-5)位于第三进液口(3-4)的竖直方向上的正上方。
2.根据权利要求1所述的一种基于微流控芯片技术构建的牙周软组织仿生芯片,其特征在于,第一进液口(1-4)与进液微通道a(1-1)之间连通;出液微通道a(1-2)、腔室a(1-6)与出液口a(1-3)之间连通;进液微通道a(1-1)与出液微通道a(1-2)的交汇处连通;第三进液口(3-4)与进液微通道b(3-1)之间连通;出液微通道b(3-2)、腔室b(3-5)与出液口b(3-3)之间连通;进液微通道b(3-1)与出液微通道b(3-2)的交汇处连通。
3.根据权利要求1所述的一种基于微流控芯片技术构建的牙周软组织仿生芯片,其特征在于,所述腔室a(1-6)和腔室b(3-5)的形状包括圆形、矩形、半圆形或半椭圆形。
4.根据权利要求1所述的一种基于微流控芯片技术构建的牙周软组织仿生芯片,其特征在于,所述上层基板(1)和下层基板(3)的材料包括石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物、聚碳酸酯、聚酯、琼脂糖、壳聚糖或海藻酸钠;所述多孔膜(2)的材料包括PDMS、聚偏氟乙烯或聚碳酸酯,多孔膜(2)的孔径为0.45μm—10μm。
5.根据权利要求1所述的一种基于微流控芯片技术构建的牙周软组织仿生芯片,其特征在于,第二进液口(1-5)和出液口c(1-7)为通孔结构。
6.根据权利要求1所述的一种基于微流控芯片技术构建的牙周软组织仿生芯片,其特征在于,所述上层基板(1),多孔膜(2)和下层基板(3)之间可拆卸连接。
7.根据权利要求1所述的一种基于微流控芯片技术构建的牙周软组织仿生芯片,其特征在于,所述多孔膜(2)的上、下两表面可分别接种牙龈上皮细胞和血管内皮细胞;所述牙龈上皮细胞和血管内皮细胞的来源包括人或任何一种哺乳动物,或原代细胞、细胞系以及干细胞诱导分化的功能细胞。
8.权利要求1-7中任一项所述的基于微流控芯片技术构建的牙周软组织仿生芯片的应用,其特征在于,利用牙周软组织仿生芯片构建牙周软组织血管屏障模型,应用于细胞共培养、构建细胞屏障、牙周软组织血管屏障以及功能监测,细胞迁移,药物筛选。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述牙周软组织血管屏障模型的构建方法,包括如下步骤:
1)基质胶包被多孔膜
将matrigel基质胶加入盛有多孔膜的培养皿中,将装有多孔膜和materigel基质胶的培养皿放入细胞培养箱中孵育20-60min凝胶,凝胶过程结束后,磷酸盐缓冲液清洗至少3遍后待用;
2)细胞接种及牙周软组织血管屏障模型构建
血管内皮细胞制成悬液,以1*10^5cell/ml-1*10^6cell/ml的接种密度接种到包被好的多孔膜的一面上,于细胞培养箱中培养,待血管内皮细胞贴壁后,将接种有血管内皮细胞的多孔膜面朝向腔室b组装到牙周软组织仿生芯片上,夹紧固定上层基板和下层基板,通过第二进液口向下层基板注入细胞培养液,使细胞培养液通过第三进液口进入腔室b;将牙龈上皮细胞制成悬液,以1*10^5cell/ml-1*10^6cell/ml的接种密度通过第一进液口进入腔室a,将牙周软组织仿生芯片放入细胞培养箱中培养,培养至细胞融合率达到90%以上,得到牙周软组织血管屏障模型;
3)牙周软组织血管屏障模型功能监测
采用血管内皮细胞血管内皮钙粘蛋白检测牙周软组织血管屏障模型屏障功能的完整性,采用FITC标记的右旋糖酐监测牙周软组织血管屏障模型屏障的通透性。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011192879.6A CN112300940B (zh) | 2020-10-30 | 2020-10-30 | 一种基于微流控技术构建的牙周软组织仿生芯片及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011192879.6A CN112300940B (zh) | 2020-10-30 | 2020-10-30 | 一种基于微流控技术构建的牙周软组织仿生芯片及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112300940A true CN112300940A (zh) | 2021-02-02 |
CN112300940B CN112300940B (zh) | 2023-06-16 |
Family
ID=74332978
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011192879.6A Active CN112300940B (zh) | 2020-10-30 | 2020-10-30 | 一种基于微流控技术构建的牙周软组织仿生芯片及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112300940B (zh) |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113070108A (zh) * | 2021-03-01 | 2021-07-06 | 清华大学 | 图案化水凝胶微粒制备方法及微流控装置 |
CN114015568A (zh) * | 2021-10-08 | 2022-02-08 | 北京龙迈达斯科技开发有限公司 | 一种类器官芯片及其制备方法 |
CN114028609A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-02-11 | 中新国际联合研究院 | 一种电活性口腔引导骨再生屏障膜及其制备方法 |
CN114196539A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-03-18 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于微流控技术的体外无泵组织培养芯片 |
CN114231414A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-25 | 大连医科大学 | 一种基于微流控技术构建的骨组织仿生芯片及其应用 |
CN114410470A (zh) * | 2022-01-19 | 2022-04-29 | 大连理工大学 | 即插式仿生生理屏障动态培养装置 |
CN114437932A (zh) * | 2022-02-14 | 2022-05-06 | 重庆医科大学附属第二医院 | 多胎胎盘血管吻合模型的微流控芯片、系统及使用方法 |
CN115386492A (zh) * | 2022-08-29 | 2022-11-25 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种微流控3d仿生牙齿周围组织类器官芯片及其构建方法 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080118474A1 (en) * | 2004-04-25 | 2008-05-22 | Cellseed Inc. | Cultured Periodontal Membrane Cell Sheet, Process for Producing the Same and Method of Use Thereof |
CN103831140A (zh) * | 2014-03-07 | 2014-06-04 | 博奥生物集团有限公司 | 一种多指标检测的微流控芯片 |
CN206512226U (zh) * | 2017-02-16 | 2017-09-22 | 梵美国际再生医学科技有限公司 | 一种细胞培养装置 |
CN107312713A (zh) * | 2017-07-28 | 2017-11-03 | 中科芯瑞(苏州)生物科技有限公司 | 一种微流控芯片及其应用 |
CN107312743A (zh) * | 2017-06-18 | 2017-11-03 | 广东博溪生物科技有限公司 | 一种牙龈上皮模型及其体外构建方法 |
CN107502547A (zh) * | 2017-09-25 | 2017-12-22 | 中科芯瑞(苏州)生物科技有限公司 | 一种实现多种细胞共培养的微流控芯片及其应用 |
CN108117990A (zh) * | 2016-11-29 | 2018-06-05 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于微流控技术的仿生气血屏障模型的构建方法 |
CN110055176A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-07-26 | 大连医科大学附属第二医院 | 仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片及模型构建方法 |
-
2020
- 2020-10-30 CN CN202011192879.6A patent/CN112300940B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080118474A1 (en) * | 2004-04-25 | 2008-05-22 | Cellseed Inc. | Cultured Periodontal Membrane Cell Sheet, Process for Producing the Same and Method of Use Thereof |
CN103831140A (zh) * | 2014-03-07 | 2014-06-04 | 博奥生物集团有限公司 | 一种多指标检测的微流控芯片 |
CN108117990A (zh) * | 2016-11-29 | 2018-06-05 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于微流控技术的仿生气血屏障模型的构建方法 |
CN206512226U (zh) * | 2017-02-16 | 2017-09-22 | 梵美国际再生医学科技有限公司 | 一种细胞培养装置 |
CN107312743A (zh) * | 2017-06-18 | 2017-11-03 | 广东博溪生物科技有限公司 | 一种牙龈上皮模型及其体外构建方法 |
CN107312713A (zh) * | 2017-07-28 | 2017-11-03 | 中科芯瑞(苏州)生物科技有限公司 | 一种微流控芯片及其应用 |
CN107502547A (zh) * | 2017-09-25 | 2017-12-22 | 中科芯瑞(苏州)生物科技有限公司 | 一种实现多种细胞共培养的微流控芯片及其应用 |
CN110055176A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-07-26 | 大连医科大学附属第二医院 | 仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片及模型构建方法 |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113070108A (zh) * | 2021-03-01 | 2021-07-06 | 清华大学 | 图案化水凝胶微粒制备方法及微流控装置 |
CN113070108B (zh) * | 2021-03-01 | 2022-05-06 | 清华大学 | 图案化水凝胶微粒制备方法及微流控装置 |
CN114015568A (zh) * | 2021-10-08 | 2022-02-08 | 北京龙迈达斯科技开发有限公司 | 一种类器官芯片及其制备方法 |
CN114015568B (zh) * | 2021-10-08 | 2024-02-23 | 北京龙迈达斯科技开发有限公司 | 一种类器官芯片及其制备方法 |
CN114028609A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-02-11 | 中新国际联合研究院 | 一种电活性口腔引导骨再生屏障膜及其制备方法 |
CN114196539A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-03-18 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于微流控技术的体外无泵组织培养芯片 |
CN114196539B (zh) * | 2021-12-15 | 2023-11-28 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于微流控技术的体外无泵组织培养芯片 |
CN114231414A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-25 | 大连医科大学 | 一种基于微流控技术构建的骨组织仿生芯片及其应用 |
CN114410470A (zh) * | 2022-01-19 | 2022-04-29 | 大连理工大学 | 即插式仿生生理屏障动态培养装置 |
CN114410470B (zh) * | 2022-01-19 | 2024-05-24 | 大连理工大学 | 即插式仿生生理屏障动态培养装置 |
CN114437932A (zh) * | 2022-02-14 | 2022-05-06 | 重庆医科大学附属第二医院 | 多胎胎盘血管吻合模型的微流控芯片、系统及使用方法 |
CN115386492A (zh) * | 2022-08-29 | 2022-11-25 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种微流控3d仿生牙齿周围组织类器官芯片及其构建方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112300940B (zh) | 2023-06-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112300940B (zh) | 一种基于微流控技术构建的牙周软组织仿生芯片及其应用 | |
Ashammakhi et al. | Gut-on-a-chip: Current progress and future opportunities | |
Zheng et al. | Organ‐on‐a‐Chip Systems: microengineering to biomimic living systems | |
US10928382B2 (en) | Microfluidic device and method for analysis of tumor cell microenvironments | |
Li et al. | Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays | |
Gao et al. | Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research | |
CN112680348B (zh) | 基于器官芯片的器官模型构建方法及器官模型 | |
CN108117990B (zh) | 一种基于微流控技术的仿生气血屏障模型的构建方法 | |
CN106581761A (zh) | 一种人工肝脏组织及其制作方法 | |
JP5177774B2 (ja) | 細胞の3次元階層的共培養法 | |
Lee et al. | Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction | |
US20130344529A1 (en) | Vascular model, method for producing said model and use thereof | |
US20160130543A1 (en) | Modular Microtube Network for Vascularized Organ-On-A-Chip Models | |
CN107881106A (zh) | 一种阵列式细胞动态培养与区域化处理微流控芯片及其制备方法和应用 | |
CN105695328A (zh) | 细胞培养和细胞间相互作用的共培养装置及其使用方法 | |
CN114317272B (zh) | 一种多细胞共培养的培养装置及细胞培养方法 | |
CN114231414A (zh) | 一种基于微流控技术构建的骨组织仿生芯片及其应用 | |
US20230203417A1 (en) | Microfluidic device | |
US20200190456A1 (en) | Native Extracellular Matrix-Derived Membrane Inserts for Organs-On-Chips, Multilayer Microfluidics Microdevices, Bioreactors, Tissue Culture Inserts, and Two-dimensional and Three-dimensional Cell Culture Systems | |
CN117721019A (zh) | 一种血管化器官芯片及其应用 | |
JP7413644B2 (ja) | バイオウォール、ビーズ床、及びバイオインターフェースを含む細胞を培養するためのマイクロ流体デバイス、並びにマイクロ流体デバイスのバイオインターフェースをモデル化する方法 | |
CN114574540A (zh) | 一种基于微流控芯片的新型冠状病毒肠道感染模型构建方法 | |
CN102816682B (zh) | 一种微流控芯片及其研究肿瘤细胞团外渗的方法 | |
WO2022163827A1 (ja) | 流路デバイス及びその製造方法 | |
CN116445282B (zh) | 一种微流控系统及其在构建仿生器官微环境中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |