CN110055176A - 仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片及模型构建方法 - Google Patents

Abstract

针对目前的肺癌脑转移构建血脑屏障困难，无法形成直观观察，等问题，本发明为一种仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片，其包括仿生肺部分与仿生脑部分，其特征在于，所述仿生肺部分设置在芯片的上游，其包括3层结构，分别为上层基片层，中间多孔膜层及下层基片层；3层结构上设置气体通道，液体通道，及真空通道；仿生脑部分设置在芯片的下游，包括2层结构，分别为上层基片层与下层基片层，上层基片层为覆盖层，下层基片层包括设置脑实质室，在脑实质室外侧设置血脑屏障环；血脑屏障环外侧设置血管腔室；血管腔室与仿生肺部分下层基片的液体流通通道通过连接通道连接；血脑屏障环上设置连通脑实质室与血管腔室的微缝结构；血管腔室与脑实质室上设置液体进出的入口与出口。

Description

仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片及模型构建方法

技术领域

本发明属于癌症转移用微流控芯片及模型构建技术领域，尤其是肺癌脑转移领域应用的微流控芯片及模型构建方法，具体涉及为一种仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片及模型构建方法。

背景技术

肺癌脑转移是一系列复杂的病理生理级联过程，可大致分为“三步曲”—肿瘤在原位肺的发生发展，肿瘤细胞入侵肺血管进入循环系统成为循环肿瘤细胞，循环肿瘤细胞滞留于脑微血管并突破血脑屏障进入脑实质发展为脑转移瘤。由于中枢神经系统解剖及功能上的特殊性，脑相对于其他转移靶器官有其独特性，故明确肺癌脑转移的特异性转移机制对其诊疗具有重大意义。然而，目前传统的肿瘤生物研究手段难以在体外模拟复杂的病理过程和仿生微环境，而动物体内模型也受到了实时监测和伦理方面的限制。

现有技术多利用Transwell侵袭实验对脑转移过程进行研究，但该过程需要固定染色，不能实现实时动态的观察，实用性差。

虽然微流控芯片技术已经发展起来，但多是针对组织三维细胞培养的相关芯片，或者癌细胞在组织内部的转移侵袭的相关的微流控芯片。但因为肺癌脑转移是一个更为复杂的过程，转移过程需要癌细胞穿过血脑屏障，并构建有效的血脑屏障，而应用现有的微流控芯片无法构建有效的血脑屏障，因此也无法实现仿生的实现肺癌脑转移这个过程。

本发明针对现有技术的微流控芯片无法有效构建血脑屏障，也无法实现动态实时仿生肺癌脑转移过程的问题，提供一种仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片及模型构建方法。

发明内容

为了克服现有技术中微流控芯片无法有效构建血脑屏障，也无法实现动态实时仿生肺癌脑转移过程的问题，本发明提供一种仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片及模型构建方法。

一种仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片，其包括仿生肺部分与仿生脑部分，其特征在于，所述仿生肺部分设置在芯片的上游，其包括3层结构，分别为上层基片层，中间多孔膜层及下层基片层；上层基片层上设有供空气流通的气体通道、供气液体进出的入口和出口、真空通道的上半部分；下层基片上设有供液体流通的液体通道、供液体进出的入口和出口、真空通道的下半部分；气体通道与液体通道在上层基片层与下层基片层的位置对应；仿生脑部分设置在芯片的下游，其包括2层结构，分别为上层基片层与下层基片层，上层基片层为覆盖层，下层基片层包括设置在中心的圆形的脑实质室，在脑实质室外侧设置血脑屏障环；血脑屏障环外侧设置血管腔室；血管腔室与仿生肺部分下层基片的液体流通通道通过设置在下层基片层的连接通道连接；所述血脑屏障环上设置连通脑实质室与血管腔室的微缝结构；血管腔室与脑实质室上设置液体进出的入口与出口。通过此微流控芯片的构建，可以很好的实现模拟呼吸运动，并可以实现肺癌的脑转移，使肺癌转移过程呈现在微流控芯片上，可以实现在显微镜下直观动态观察。

进一步，血管腔室分为分离的两部分，且每一部分都分别设置供液体进出的入口与出口；一部分为通过连接通道与仿生肺部分连接的仿生肺侧，另一部分为设置在另一侧的对照侧。此种设置方式可以利用仿生肺侧接收上游来源的肿瘤细胞模拟肺转移，利用对照侧对照了解未发生肿瘤细胞转移的情况。

进一步，仿生肺侧与对照侧均分的围绕脑实质室设置。

进一步，所有入口与出口通过细通道与对应的气体通道，液体通道，血管腔室及脑实质室连接。

进一步，仿生肺侧与对照侧之间的空隙大于脑实质与脑实质出口及入口间细通道的宽度，此种设置可以保证细通道从仿生肺侧与对照侧之间的空隙通过。

进一步，所有入口与出口的上方开口都设置在上层基片层的对应位置处。此种设置方便对个通道及腔室加液。

或者，上层基片层的入口与出口在基片层的开口设置在上层基片层上，下层基片层的入口与出口在基片层的开口设置在下层基片层上。

进一步，所有开口处都设置封堵帽，防止不加液体时的液体流出。

进一步，所述气体通道与液体通道的入口与出口总共的4个口，设置在长方形结构的4个角上，其中2个入口设置在上游侧，两个出口设置在下游侧。

进一步，所述气体通道的入口与出口分别设置在一条长边的两侧，或者分别设置在对角线位置两侧；此种设置可以有效实现

进一步，与液体通道的入口与出口分别设置在一条长边的两侧，或者分别设置在对角线位置两侧。

进一步，所述真空通道设置为方形或椭圆形结构。

进一步，真空通道的上下两部分的深度相同，上半部分与下半部分的深度与对应层上的气体通道与液体通道相同。

进一步，真空通道为方形结构，其长度范围为5-8mm；宽度范围为1-2mm；其中优选，长度为7mm；宽度为2mm；或者长度为5mm，宽度为1.5mm。

或者，真空通道的为椭圆形结构，椭圆形的长轴长度范围为5-8mm；短轴的长度范围为1-2mm。长轴长度为7mm；宽轴长度为2mm；或者长轴长度为5mm，宽轴长度为1.5mm。

进一步，细通道、气体通道、液体通道、血管腔室、脑实质室及微缝结构的深度为80-100μm。

进一步，血脑屏障环的宽度为50μm；微缝结构为长50μm；宽20μm。

进一步，气体通道与液体通道的长度范围为4-7mm；宽度范围为为2-4mm；

进一步，脑实质室的直径范围为800-1600μm；其中优选脑实质室的直径为1200μm。

进一步，血管腔室的环宽度范围为200-400μm；其中优选，血管腔室的环宽度为300μm。

进一步，所述连接通道的宽度与液体通道宽度相同。

进一步，入口与出口的直径范围为1-1.5mm；其中优选为1.5mm。

进一步，中间多孔膜层的厚度为10μm；孔径为10μm。

进一步，上层基片层及下层基片层的厚度为0.5-1mm。

进一步，上层基片层，中间多孔膜层及下层基片层为由PDMS制成的。PDMS为聚二甲基硅氧烷。

使用时，上层基片层，下层基片层与中间多孔膜层相互交错不可逆地键合在一起；液体通道仿生微血管通道；气体通道仿生气管通道。

本发明还公开了一种利用上述微流控芯片的仿生肺癌脑转移模型构建方法，具体为，

上游仿生肺的构建：

1)对芯片进行预处埋，以利细胞更好的附着在芯片多孔膜表面；按1:10比例稀释BME(Cultrex basement membrane extract，R&D Systems，Mckinley PlaceN，USA)，充分混合后用微量加样器注入微流控芯片的样本入口，孵箱过夜等待胶凝固；

2)巨噬细胞的培养，将单核细胞THP-1重悬于佛波酯PMA，用微量加样器通过下层通道入口注入；将芯片倾斜向一侧30度，以使单核细胞沉降到中央培养通道的一侧，置于孵箱培养；48h后的单核细胞被刺激为巨噬细胞；将芯片倾斜向一侧30度，以使混合细胞沉降到中央培养通道的一侧，置于孵箱培养，48h后的单核细胞被刺激为巨噬细胞；

3)成纤维细胞的培养:将肺成纤维细胞W138接种到巨噬细胞的同侧，使其附着到多孔膜表面，置于孵箱静态培养；

4)血管内皮细胞的培养:将脐静脉血管内皮细胞HUVEC经由下层入口注入芯片，使其静念附着在膜表面4小时后，通过微泵连续泵入新鲜培养基；

5)支气管上皮细胞的培养:待芯片多孔膜下侧细胞均贴壁生长后，翻转芯片从上侧通过入ロ将支气管上皮细胞16HBE注入芯片，静态使其附着在膜表面4小时后，小心从对应出口将培养基轻轻地从上部通道抽吸，继续通过入口1连续泵入混合培养基，置于孵箱培养；

6)肺癌细胞的培养:待多孔膜上下两侧细胞均生长至紧密连接后，从肺癌细胞接种到芯片上层支气管上皮细胞区，置于孵箱培养。

下游关键结构血脑屏障的构建：

1)为了模拟生理细胞外基质ECM，将胶原蛋白I和纤连蛋白混合注入血管，置于孵箱培养，待其凝固；

2)将人脑微血管内皮细胞hBMVEC通过血管腔室入口接种到两侧血管通道中，在孵箱中静态条件下培养，使其附着于通道的底部表面；培养4小时后再次在血管通道中接种人脑微血管内皮细胞hBMVEC，将芯片垂直侧置静置4小时，使内皮细胞附着于血管腔室微缝结构侧面；

3)待血管腔形成完整内皮细胞层后，将人星形胶质细胞HA-1800接种到圆形脑实质室中以构建共培养微环境，使其在孵箱中附着4小时，以形成仿生血脑屏障生理结构；

4)最后使用Pump 11Elite Series Pumps来驱动细胞培养基持续流过微血管通道，模拟生理下血液对微血管通道的血管剪切力。

与现有技术的芯片及其他脑转移方法相比，本发明的技术方案可以很好的三维仿生肺癌脑转移的过程，且可在倒置荧光显微镜实时检测观察肺癌脑转移的过程，非常简单方便。

附图说明

图1为本发明微流控芯片整体上视结构透视示意图；

图2为本发明微流控芯片开口在上层基片层的3层分开非透视结构示意图；

图3为本发明微流控芯片开口在上层基片层的3层分开透视结构示意图；

图4为本发明微流控芯片开口分别在上下基片层上是，上下基片层分开结构透视结构示意图；

图5为本发明微流控芯片下层基片结构示意图；

图6为本发明微流控芯片下层仿生脑部分结构示意图；

图7为本发明微流控芯片中间多孔膜层结构示意图；

图8为本发明微流控芯片上层基片层结构示意图；

图9为本发明微流控芯片上层基片层的结构放大示意图；

图10为本发明微流控芯片仿生肺部分纵切结构示意图。

图11为本发明芯片重现肺癌脑转移完整病理过程示意图；

图12为本发明仿生血脑屏障(BBB)构建过程图，内皮细胞(hBMVEC)+星形胶质细胞共培养(HA)+动态流体剪切力；

图13为本发明血脑屏障侧壁结构；

图14为hBMVEC生长状况图；

图15为本发明仿生血脑屏障的紧密连接蛋白表达，证明形成紧密连接结构

图16为本发明跨膜电阻试验:证明芯片构建的仿生血脑屏障形成完整的血管层；

图17为本发明小分子渗透试验：证明芯片构建的仿生血脑屏障具备生理屏障功能

图18为本发明癌细胞穿血脑屏障的动态脑转移图；红色：血管腔(BBB)；绿色：肺癌细胞。运用肺癌脑转移芯片成功捕获同一肺癌细胞(白色箭头)的整个穿血脑屏障的脑转移过程。0h：从上游到达下游并黏附与血管层；12h：开始向脑实质腔侵袭；24h：突破血脑屏障；36h：到达脑实质腔；48h:开始增殖；

图19为第48小时血管腔内皮细胞中ZO-1和VE-Cad的表达情况图

图20为本发明胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色检测微环境的活化情况。

图中，01、仿生肺部分；1、上层基片层；11、气体通道；12、真空通道的上半部分；2、中间多孔膜层；3、下层基片层；31、液体通道；32、真空通道的下半部分；04、仿生脑部分；41、脑实质室；42、血管腔室；421、仿生肺侧；422、对照侧；43、连接通道；44、血脑屏障环；45、微缝结构；51、开口；52、封堵帽；53、入口；54、出口；55、细通道。

英文标示：为附图11-20中的英文注解

Primary tumor原发性肿瘤；Circulation循环；Brain metastasis脑转移；Blood-brain barrier BBB血脑屏障；Fibroblasts成纤维细胞；Intravasation血管内渗漏；Immune cells免疫细胞；Pulmonary vascular肺血管；Epithelial上皮的；Endothelia内皮细胞；vacuum pump真空室；fibroblasts immune cells成纤维细胞免疫细胞；extracellular matrix ECM细胞外基质，Astrocytes星形胶质细胞；Secondary tumor继发性肿瘤；Metastatic cells转移细胞；Brain microvessel(as control)脑微血管(作为对照)；Brain parenchyma脑实质；Micro-gaps微缝结构45；hBMVEC人微血管内皮细胞；Parenchyma实质。

具体实施方式

实施例1一种仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片

一种仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片，其包括仿生肺部分01与仿生脑部分04，其特征在于，所述仿生肺部分01设置在芯片的上游，其包括3层结构，分别为上层基片层1，中间多孔膜层2及下层基片层3；上层基片层1上设有供空气流通的气体通道11、供气液体进出的入口53和出口54、真空通道的上半部分12；下层基片上设有供液体流通的液体通道31、供液体进出的入口53和出口54、真空通道的下半部分32；气体通道11与液体通道31在上层基片层1与下层基片层3的位置对应；仿生脑部分04设置在芯片的下游，其包括2层结构，分别为上层基片层1与下层基片层3，上层基片层1为覆盖层，下层基片层3包括设置在中心的圆形的脑实质室41，在脑实质室41外侧设置血脑屏障环44；血脑屏障环44外侧设置血管腔室42；血管腔室42与仿生肺部分01下层基片的液体流通通道通过设置在下层基片层3的连接通道43连接；所述血脑屏障环44上设置连通脑实质室41与血管腔室42的微缝结构45；血管腔室42与脑实质室41上设置液体进出的入口53与出口54。通过此微流控芯片的构建，可以很好的实现模拟呼吸运动，并可以实现肺癌的脑转移。

血管腔室42分为分离的两部分，且每一部分都分别设置供液体进出的入口53与出口54；一部分为通过连接通道43与仿生肺部分01连接的仿生肺侧421，另一部分为设置在另一侧的对照侧422。此种设置方式可以利用仿生肺侧421接收上游来源的肿瘤细胞模拟肺转移，利用对照侧422对照了解未发生肿瘤细胞转移的情况。

仿生肺侧421与对照侧422均分的围绕脑实质室41设置。

所有入口53与出口54通过细通道55与气体通道11，液体通道31，血管腔室42及脑实质室41连接。仿生肺侧421与对照侧422之间的空隙大于脑实质与脑实质出入口53间细通道55的宽度，此种设置可以保证细通道55从仿生肺侧421与对照侧422之间的空隙通过。

所有入口53与出口54的上方开口51都设置在上层基片层的对应位置处。此种设置方便对个通道及腔室加液。

所有开口51处都设置封堵帽52，防止不加液体时的液体流出。

所述气体通道11与液体通道31的入口53与出口54总共的4个口，设置在长方形结构的4个角上，其中2个入口53设置在上游侧，两个出口54设置在下游侧。

所述气体通道11的入口53与出口54分别设置在对角线位置两侧；此种设置可以有效实现。与液体通道31的入口53与出口54分别设置在对角线位置两侧。

真空通道的上下两部分的深度相同，上半部分与下半部分的深度与对应层上的气体通道11与液体通道31相同。

真空通道的为椭圆形结构，椭圆形的长轴长度范围为5-8mm；短轴的长度范围为1-2mm。长轴长度为7mm；宽轴长度为2mm；或者长轴长度为5mm，宽轴长度为1.5mm。

细通道55、气体通道11、液体通道31、血管腔室42、脑实质室41及微缝结构45的深度为100μm；

血脑屏障环44的宽度为50μm；微缝结构45为长50μm；宽20μm。

气体通道11与液体通道31的长度范围为7mm；宽度范围为为3mm；

脑实质室41的直径为1200μm。血管腔室42的环宽度为300μm。

所述连接通道43的宽度与液体通道31宽度相同。入口53与出口54的直径为1.5mm。

中间多孔膜层2的厚度为10μm；孔径为10μm。上层基片层1及下层基片层3的厚度为0.5-1mm。

上层基片层1，中间多孔膜层2及下层基片层3为由PDMS制成的。PDMS为聚二甲基硅氧烷。使用时，上层基片层1，下层基片层3与中间多孔膜层2相互交错不可逆地键合在一起。

实施例2一种仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片

一种仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片，其包括仿生肺部分01与仿生脑部分04，其特征在于，所述仿生肺部分01设置在芯片的上游，其包括3层结构，分别为上层基片层1，中间多孔膜层2及下层基片层3；上层基片层1上设有供空气流通的气体通道11、供气液体进出的入口53和出口54、真空通道的上半部分12；下层基片上设有供液体流通的液体通道31、供液体进出的入口53和出口54、真空通道的下半部分32；气体通道11与液体通道31在上层基片层1与下层基片层3的位置对应；仿生脑部分04设置在芯片的下游，其包括2层结构，分别为上层基片层1与下层基片层3，上层基片层1为覆盖层，下层基片层3包括设置在中心的圆形的脑实质室41，在脑实质室41外侧设置血脑屏障环44；血脑屏障环44外侧设置血管腔室42；血管腔室42与仿生肺部分01下层基片的液体流通通道通过设置在下层基片层3的连接通道43连接；所述血脑屏障环44上设置连通脑实质室41与血管腔室42的微缝结构45；血管腔室42与脑实质室41上设置液体进出的入口53与出口54。通过此微流控芯片的构建，可以很好的实现模拟呼吸运动，并可以实现肺癌的脑转移。

血管腔室42分为分离的两部分，且每一部分都分别设置供液体进出的入口53与出口54；一部分为通过连接通道43与仿生肺部分01连接的仿生肺侧421，另一部分为设置在另一侧的对照侧422。此种设置方式可以利用仿生肺侧421接收上游来源的肿瘤细胞模拟肺转移，利用对照侧422对照了解未发生肿瘤细胞转移的情况。

仿生肺侧421与对照侧422均分的围绕脑实质室41设置。

所有入口53与出口54通过细通道55与气体通道11，液体通道31，血管腔室42及脑实质室41连接。仿生肺侧421与对照侧422之间的空隙大于脑实质与脑实质出入口53间细通道55的宽度，此种设置可以保证细通道55从仿生肺侧421与对照侧422之间的空隙通过。

上层基片层1的入口53与出口54在基片层的开口51设置在上层基片层1上，下层基片层3的入口53与出口54在基片层的开口51设置在下层基片层3上。

所有开口51处都设置封堵帽52，防止不加液体时的液体流出。

所述气体通道11与液体通道31的入口53与出口54总共的4个口，设置在长方形结构的4个角上，其中2个入口53设置在上游侧，两个出口54设置在下游侧。

所述气体通道11的入口53与出口54分别设置在一条长边的两侧，此种设置可以有效实现；与液体通道31的入口53与出口54分别设置在一条长边的两侧。

真空通道的上下两部分的深度相同，上半部分与下半部分的深度与对应层上的气体通道11与液体通道31相同。

真空通道为方形结构，长度为7mm；宽度为2mm；

细通道55、气体通道11、液体通道31、血管腔室42、脑实质室41及微缝结构45的深度为100μm；

血脑屏障环44的宽度为50μm；微缝结构45为长50μm；宽20μm。气体通道11与液体通道31的长度范围为7mm；宽度范围为为3mm；脑实质室41的直径为1200μm。血管腔室42的环宽度为300μm。所述连接通道43的宽度与液体通道31宽度相同。入口53与出口54的直径为1.5mm。中间多孔膜层2的厚度为10μm；孔径为10μm。上层基片层1及下层基片层3的厚度为0.5-1mm。

上层基片层1，中间多孔膜层2及下层基片层3为由PDMS制成的。PDMS为聚二甲基硅氧烷。使用时，上层基片层1，下层基片层3与中间多孔膜层2相互交错不可逆地键合在一起。

实施例3一种仿生肺癌脑转移模型构建方法

上游仿生肺的构建：

对芯片进行预处埋，以利细胞更好的附着在芯片多孔膜表面。按1:10比例稀释BME(Cultrex basement membrane extract，R&D Systems，Mckinley PlaceN，USA)，充分混合后用微量加样器注入微流控芯片的样本入口，孵箱过夜等待胶凝固。

巨噬细胞的培养，将单核细胞THP-1以10³个细胞/cm²的细胞密度重悬于佛波酯PMA(100pg/m1)，用微量加样器通过下层通道入口注入，过量的将从出口排出。将芯片倾斜向一侧30度，以使单核细胞沉降到中央培养通道的一侧，置于37℃、5％C0₂孵箱培养。48h后的单核细胞被刺激为巨噬细胞。将芯片倾斜向一侧30度，以使混合细胞沉降到中央培养通道的一侧，置于孵箱培养，48h后的单核细胞被刺激为巨噬细胞。

成纤维细胞的培养:将肺成纤维细胞W138以10⁴个细胞/cm²的细胞密度接种到巨噬细胞的同侧，使其附着到多孔膜表面，置于37℃、5％C0²將箱静态条件下培养4小时。

血管内皮细胞的培养:将脐静脉血管内皮细胞HUVEC以10⁴个细胞/cm²的组胞密度经由下层通道入口注入芯片，使其静态附着在膜表面4小时后，通过微泵以24mm/h的流速连续泵入新鲜培养基。

支气管上皮细胞的培养:待芯片多孔膜下侧细胞均贴壁生长后，翻转芯片从上层芯片通道入ロ以10⁴个细胞/cm²的细胞密度将支气管上皮细胞16HBE注入芯片，静态使其附着在膜表面4小时后，小心从出口2将培养基轻轻地从上部通道抽吸，继续通过入口1连续泵入混合培养基，置于37℃、5％C0₂孵箱培养。

肺癌细胞的培养:待多孔膜上下两侧细胞均生长至紧密连接后，从肺癌细胞以10³个细胞/cm²的细胞密度接种到芯片上层支气管上皮细胞区，置于37℃5％C0₂孵箱培养。

下游关键结构血脑屏障的构建：

为了模拟生理细胞外基质ECM，首先将胶原蛋白I和纤连蛋白混合(各100μg/ml)注入血管，置于37℃、5％CO₂孵箱培养2小时，待其凝固。

然后将人脑微血管内皮细胞hBMVEC以1×107个细胞/ml的密度通过血管腔入口接种到两侧血管通道中，在37℃、5％CO₂孵箱中静态条件下培养，使其附着于通道的底部表面；培养4小时后再次在血管通道中接种1×10⁶个细胞/ml的人脑微血管内皮细胞hBMVEC，将芯片垂直侧置静置4小时，使内皮细胞附着于血管腔微缝结构侧面；

待血管腔形成完整内皮细胞层后，将人星形胶质细胞HA-1800以106/ml的浓度接种到圆形脑实质室中以构建共培养微环境，使其在37℃、5％CO₂孵箱中附着4小时，以形成仿生血脑屏障生理结构；

最后使用Pump 11Elite Series Pumps来驱动细胞培养基持续流过微血管通道，流速0.1μl/min，模拟生理下血液对微血管通道的血管剪切力。

与现有技术的芯片及其他脑转移方法相比，本发明的技术方案。

实施例4血脑屏障进行验证实验

为了建立仿生BBB结构，在将细胞外基质(ECM)包被血管腔通道后，将hBMVEC注入血管通道并粘附到通道的底壁和侧壁(图12(i)，图13)，底壁及侧壁形成连续细胞层后，将人星形胶质细胞(HA)引入脑实质室(图12(ii))以与内皮细胞共培养。将共培养的细胞暴露于通过血管通道的连续流体剪切(0.1μl/min)，模拟脑中的血流(图12(iii))。在这些条件下，hBMVEC生长良好(图14)并在与星形胶质细胞动态共培养后48小时形成完全屏障。

为了评估血脑屏障结构，我们通过免疫荧光染色检测紧密连接蛋白表达、跨膜电阻试验、小分子渗透试验评估血脑屏障的完整性和功能性。

3.1免疫荧光染色检测紧密连接蛋白表达

免疫荧光染色将芯片系统通道中培养液吸去，向芯片通道内注入PBS，清洗不同处理组的细胞2次。之后泵入4％多聚甲醛溶液固定细胞15分钟，向芯片通道内注入PBS，清洗2次。按照1：100的比例稀释，配制5％BSA稀释羊封闭血清原液，用振荡器混匀。将5％BSA封闭血清稀释液注入芯片培养池中，放入湿盒内，37℃孵育1小时。将通道内封闭血清吸干，向芯片内加入一抗稀释液，稀释比例按说明书，放入湿盒，37℃孵育细胞2小时。取出用PBS冲洗细胞两次，向芯片细胞培养池内注入一抗对应的荧光二抗PBS稀释液，稀释比例按说明书，37℃避光孵育1小时。室温下，向芯片通道内注入PBS，清洗2次。在激光共聚焦显微镜下，观察在相应激发光激发下的荧光强度并照相记录。

zonal occludin-1(ZO-1)和vascular endothelial-cadherin(VE-Cad)是已知的表示血脑屏障紧密连接形成的蛋白质。我们每12小时测量一次共动态监测4天。当hBMVECs在仿生血脑屏障状态(血管内皮细胞与星形胶质细胞，流体培养48小时)下培养时，ZO-1和VE-Cad广泛高表达(图15)

3.2跨膜电阻试验

将芯片平衡至室温并根据细胞电阻分析仪仪器说明书连接芯片通道与电极。每个电阻值(R)读取三次，将仅涂覆细胞外基质ECM(无细胞)的通道的电阻设为初始背景电阻(R0)，将电阻值用检测侧面积(A)归一化，此芯片中血脑屏障面积为1.884×10-3cm 2，最终跨膜电阻TEER计算公式如下：TEER＝(R-R0)x A。

TEER，广泛用于评估屏障完整性，TEER也相较血管内皮细胞单独培养组超过2倍(图16)

3.3小分子渗透试验

通过检测FITC-小分子葡聚糖(40kDa，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)从脑血管腔进去脑实质室的实时荧光强度来评估内皮屏障对小化合物的渗透性。在构建形成血脑屏障后，向芯片血管通道中以0.1μl/min的流速持续泵入FITC-葡聚糖(0.5mg/ml)，收集芯片上FITC-葡聚糖渗透的时间图像，并使用Image J软件(National Institutes of ofNational)定量血管通道测和脑实质腔侧的三个随机感兴趣区域(ROI)的FITC的绝对荧光强度。ROI具有相同的尺寸并沿着圆形曲线均匀分布，如图所示。为了评估和比较血脑屏障的渗透性，通过计算脑实质腔侧的荧光强度与血管通道的荧光强度的比率来定量FITC-葡聚糖渗透率，血管通道的荧光强度定义为标准化的100％。

体外功能性BBB的另一个重要特征是其对小分子的不可渗透性。为了验证构建的BBB的屏障功能，我们将FITC-小分子葡聚糖引入血管通道，记录分析了两组的葡聚糖渗透率，发现在动态BBB屏障中葡聚糖渗透率远远低于内皮细胞单独培养组(图17)。

因此，通过上述3个实验可知在芯片上构建的BBB在结构和功能方面都是仿生的。

实施例5监测肺癌细胞穿血脑屏障的动态脑转移病理过程

为了可视化动态监测肿瘤细胞脑转移过程，我们使用稳定表达绿色荧光蛋白GFP的肺癌细胞PC9，并用红色活细胞示踪剂标记内皮细胞使脑血管腔显示为红色。肺癌细胞被引入上游“仿生肺”，在原位生长，侵袭，侵入循环并随流体培养基一起被输送到下游”仿生脑”单元。当观测到有肿瘤细胞侵袭转移到达，下游关闭注射泵以允许转移细胞附着于血管壁并突破血脑屏障发生脑转移。指定第一个肺癌细胞被观察到到达下游的时间为第0小时，使用倒置荧光显微镜在第0，12，24，36和48小时的时间点观察肿瘤细胞的转移路径。

为了可视化动态监测肿瘤细胞脑转移过程，我们使用稳定表达绿色荧光蛋白GFP的肺癌细胞PC9，并用红色活细胞示踪剂标记内皮细胞使脑血管腔显示为红色。肺癌细胞被引入上游“仿生肺”，在原位生长，侵袭，侵入循环并随流体培养基一起被输送到下游”仿生脑”单元。当观测到有肿瘤细胞侵袭转移到达，下游关闭注射泵以允许转移细胞附着于血管壁并突破血脑屏障发生脑转移。指定第一个肺癌细胞被观察到到达下游的时间为第0小时，使用倒置荧光显微镜在第0，12，24，36和48小时的时间点观察肿瘤细胞的转移路径。如图18所示，肿瘤细胞在到达下游血管通道后第12小时开始粘附于内皮层。在第24小时有细胞开始侵袭血脑屏障，并在第36小时内侵入脑实质。在到达下游血管通道后48小时，转移细胞开始定植并开始增殖。(图18，白色箭头)。

为了确定在脑转移过程中血脑屏障结构是否被破坏，我们比较了肿瘤细胞作用组与无肿瘤细胞作用组第48小时血管腔内皮细胞中ZO-1和VE-Cad的表达，免疫荧光染色显示与肿瘤细胞相互作用的血管腔中ZO-1和VE-Cad的表达大大减少，表明脑转移过程中血脑屏障的结构被破坏(图19)。

同时，我们对脑转移前后脑实质腔中的脑微环境改变进行检测，通过对人星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色检测微环境的活化，发现肿瘤细胞进入脑实质腔使脑实质中的星形胶质细胞活化(图20)。

最终研究结果表明，芯片上肿瘤细胞脑转移途径与微环境改变与脑转移体内病理改变一致，这表明我们的芯片平台是研究肺癌脑转移的有效工具。

上述实施例的说明只是用于理解本发明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进，这些改进也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片，其包括仿生肺部分(01)与仿生脑部分(04)，其特征在于，所述仿生肺部分(01)设置在芯片的上游，其包括3层结构，分别为上层基片层(1)，中间多孔膜层(2)及下层基片层(3)；上层基片层(1)上设有供空气流通的气体通道(11)、供气液体进出的入口(53)和出口(54)、真空通道的上半部分(12)；下层基片上设有供液体流通的液体通道(31)、供液体进出的入口(53)和出口(54)、真空通道的下半部分(32)；气体通道(11)与液体通道(31)在上层基片层(1)与下层基片层(3)的位置对应；仿生脑部分(04)设置在芯片的下游，其包括2层结构，分别为上层基片层(1)与下层基片层(3)，上层基片层(1)为覆盖层，下层基片层(3)包括设置在中心的圆形的脑实质室(41)，在脑实质室(41)外侧设置血脑屏障环(44)；血脑屏障环(44)外侧设置血管腔室(42)；血管腔室(42)与仿生肺部分(01)下层基片的液体流通通道通过设置在下层基片层(3)的连接通道(43)连接；所述血脑屏障环(44)上设置连通脑实质室(41)与血管腔室(42)的微缝结构(45)；血管腔室(42)与脑实质室(41)上设置液体进出的入口(53)与出口(54)。

2.根据权利要求1所述的仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片，其特征在于，血管腔室(42)分为分离的两部分，且每一部分都分别设置供液体进出的入口(53)与出口(54)；一部分为通过连接通道(43)与仿生肺部分(01)连接的仿生肺侧(421)，另一部分为设置在另一侧的对照侧(422)。

3.根据权利要求2所述的仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片，其特征在于，仿生肺侧(421)与对照侧(422)均分的围绕脑实质室(41)设置。

4.根据权利要求2所述的仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片，其特征在于，所有入口(53)与出口(54)通过细通道(55)与对应的气体通道(11)，液体通道(31)，血管腔室(42)及脑实质室(41)连接。

5.根据权利要求4所述的仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片，其特征在于，仿生肺侧(421)与对照侧(422)之间的空隙大于脑实质与脑实质出口及入口(53)间细通道(55)的宽度。

6.根据权利要求1所述的仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片，其特征在于，所有入口(53)与出口(54)的上方开口(51)都设置在上层基片层的对应位置处；上层基片层(1)的入口(53)与出口(54)在基片层的开口(51)设置在上层基片层(1)上，下层基片层(3)的入口(53)与出口(54)在基片层的开口(51)设置在下层基片层(3)上。

7.根据权利要求1所述的仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片，其特征在于，所述气体通道(11)与液体通道(31)的入口(53)与出口(54)总共的4个口，设置在长方形结构的4个角上，其中2个入口(53)设置在上游侧，两个出口(54)设置在下游侧。

8.根据权利要求1所述的仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片，其特征在于，真空通道的上下两部分的深度相同，上半部分与下半部分的深度与对应层上的气体通道(11)与液体通道(31)相同。

9.根据权利要求1所述的仿生肺癌脑转移模型构建的微流控芯片，其特征在于，真空通道设置为方形或椭圆形结构。

10.一种仿生肺癌脑转移模型构建构建方法，其特征在于，

上游仿生肺的构建：

1)对芯片进行预处埋，以利细胞更好的附着在芯片多孔膜表面；按1:10比例稀释BME，充分混合后用微量加样器注入微流控芯片的样本入口(53)，孵箱过夜等待胶凝固；

2)巨噬细胞的培养，将单核细胞TIP-1重悬于佛波酯PMA，用微量加样器通过下层通道入口(53)注入；将芯片倾斜向一侧30度，以使单核细胞沉降到中央培养通道的一侧，置于孵箱培养；48h后的单核细胞被刺激为巨噬细胞；将芯片倾斜向一侧30度，以使混合细胞沉降到中央培养通道的一侧，置于孵箱培养，48h后的单核细胞被刺激为巨噬细胞；

3)成纤维细胞的培养:将肺成纤维细胞W138接种到巨噬细胞的同侧，使其附着到多孔膜表面，置于孵箱静态培养；

4)血管内皮细胞的培养:将脐静脉血管内皮细胞HUVEC经由下层入口(53)注入芯片，使其静念附着在膜表面4小时后，通过微泵连续泵入新鲜培养基；

5)支气管上皮细胞的培养:待芯片多孔膜下侧细胞均贴壁生长后，翻转芯片从上侧通过入ロ将支气管上皮细胞16HBE注入芯片，静态使其附着在膜表面4小时后，小心从对应出口(54)将培养基轻轻地从上部通道抽吸，继续通过入口(53)1连续泵入混合培养基，置于孵箱培养；

6)肺癌细胞的培养:待多孔膜上下两侧细胞均生长至紧密连接后，从肺癌细胞接种到芯片上层支气管上皮细胞区，置于孵箱培养；

下游关键结构血脑屏障的构建：

1)为了模拟生理细胞外基质ECM，将胶原蛋白I和纤连蛋白混合注入血管，置于孵箱培养，待其凝固；

2)将人脑微血管内皮细胞hBMVEC通过血管腔室(42)入口(53)接种到两侧血管通道中，在孵箱中静态条件下培养，使其附着于通道的底部表面；培养4小时后再次在血管通道中接种人脑微血管内皮细胞hBMVEC，将芯片垂直侧置静置4小时，使内皮细胞附着于血管腔室(42)微缝结构(45)侧面；

3)待血管腔形成完整内皮细胞层后，将人星形胶质细胞HA-1800接种到圆形脑实质室(41)中以构建共培养微环境，使其在孵箱中附着4小时，以形成仿生血脑屏障生理结构；

4)最后使用Pump 11Elite Series Pumps来驱动细胞培养基持续流过微血管通道，模拟生理下血液对微血管通道的血管剪切力。