CN107502547A - 一种实现多种细胞共培养的微流控芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微流控芯片及其应用。该芯片设为多层结构，其多层结构具体为：从上至下依次包括上层盖板、上层基板、中间层多孔膜、下层基板；上层基板分布有多个通孔，中间层多孔膜上表面贴着上层基板的下表面，从下方封闭上层基板上的多个通孔，构成腔室作为培养室用于3维培养不同的细胞(组织器官)；下层基板上表面的网络状沟槽与中间层多孔膜的下表面贴合，沟槽的位置与上层基板通孔的位置对应，沟槽内流动的液体可以通过多孔膜与上层的细胞培养室进行物质和能量交换，从而模拟人体内的真实状况。本发明可以进行多器官培养，进一步可以进行生物标记物的测试，实现对药物、化妆品、保健品、环境毒物的评价。

Description

一种实现多种细胞共培养的微流控芯片及其应用

技术领域

本发明属于微流控技术领域，具体涉及一种实现多种细胞共培养的微流控芯片及其应用。

背景技术

微流控芯片(Microfluidics)又称芯片实验室(Lab-on-a-chip)，是在微米量级空间操控流体的一种科学与技术，可将生物和化学实验室的基本功能微缩到一个数平方厘米的芯片上，是21世纪最为重要的前沿技术之一，被认为是解决创新药物、化妆品和保健品研发成本过高、周期过长等关键问题，革新原有技术体系的关键技术，正面临着重大的发展机遇和挑战。

器官微流控芯片(Organ on a chip)是微流控芯片的一个亚类，它是在一块几平方厘米薄片内培养一种或多种功能细胞，从而模拟器官的一种仿生技术，器官芯片里的“器官”非常微小，但是具备真实器官的基本生理功能。器官芯片能仿真地模拟器官原因在于：(1)它不但同时培养器官所包含的多种细胞，而且细胞的空间排列可以模仿器官的生理结构；(2)它可以重建器官在体内的生理环境，比如流体剪切力、信号分子浓度梯度。可以说器官芯片从“组成”、“结构”和“环境”三方面对器官进行了模拟，仿真程度很高。

每一种人体器官都对应一种器官芯片，譬如模拟肝脏的有肝芯片，模拟肾脏的有肾芯片，模拟胰脏的有胰岛芯片，模拟心脏的有心脏芯片等，同一块器官芯片内也可以包含多种“器官”，譬如肠-肝芯片，肾-心脏芯片等。

器官芯片的用途是代替真实的人体或动物的器官进行化学品的测试，常见的化学品包括药物、保健品、化妆品和环境毒物。它可以测定药物的药效、毒性和药代，可以测定保健品在肠道的吸收、肝脏里的代谢和对肠道菌群的保护作用，可以测定化妆品在皮肤内的吸收以及对皮肤的刺激性，还可以测定环境毒物对某一特定脏器的损害作用。

人体是一个复杂的生物环境，各个器官与器官之间、细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间有着紧密的联系与相互作用，所以单一的器官芯片不能满足要求，需要多种器官组成的多器官芯片才能满足药物测试的要求。

现有器官芯片多为一种器官的器官芯片，例如肝芯片、肾芯片、心脏芯片、胰岛芯片等，这类器官芯片缺少与其他器官间的相互联系，所以需要将多种器官集成在一个芯片上，例如Michael L.Shuler,et al利用一种三器官芯片来测试抗癌药物的抗癌活性(JongHwan Sunga,Michael L.ShulerA micro cell culture analog(mCCA)with 3-D hydrogelculture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity ofanti-cancer drugs.Lab on a Chip.2009)，其技术手段为设计了一种带有三个细胞培养腔室的微流体设备，在三个腔室中培养结肠癌细胞(HCT-116)、肝癌细胞(HepG2/C3A)和成骨细胞(Kasumi-1)，这三种细胞包裹在3D水凝胶中，种植于上层空腔内，由通道串联在一起并提供营养——这种结构器官数量较少，并且结构复杂不易于操作，由于三种器官串联在同一通道内，器官间缺少一定的独立性，难以实现多种器官的共培养。An F,et al在2016年提出一种新的多器官芯片设计(An F,Luo Y,et al.A Laminated Microfluidic Devicefor Comprehensive Preclinical Testing in the Drug ADME Process.ScientificReports.2016.)，其技术手段为在6层PDMS微流体芯片上培养4种细胞(肠、肝脏、乳腺、血管)与三种离体组织(心脏、脂肪、肺)，每层PDMS层均有一个空腔，将4种细胞种植在多孔膜上置于空腔之间，通过单独的培养液通道给4种细胞供给营养，三种离体组织置于同一层的PDMS层的三个孔中——该结构实现多种器官共同培养，但是结构复杂难于操作，并且微流体设备腔体体积限制，使得采集的细胞样本较少，难以实现分子生物学表征，例如real-time PCR、western blot等。

发明内容

针对上述现有技术中的不足——上述两种结构设计均有不合理之处，本发明要解决的技术问题是提供一种用于模拟人体的易于实现多种细胞共培养的多器官芯片。本发明模拟人体多种器官，由上层用于器官培养的培养室层，中间多孔膜层和下层微流体通道层组成，上层器官培养室可以培养多种器官(组织、细胞)，并且培养室间相互独立；下层通道层模拟血管，为上层器官提供营养；上层与下层通过多孔膜隔开。

为实现上述目的提供一种微流控芯片，本发明采用了以下技术方案：

一种实现多种细胞共培养的微流控芯片，该芯片为多层结构，所述多层结构包含形成培养室的上层基板和具有沟槽的下层基板，所述上层基板和下层基板之间间隔一层多孔模，所述下层基板的沟槽内流动的液体能够通过多孔膜与上层基板的培养室进行物质和能量交换。

优选地，所述一种实现多种细胞共培养的微流控芯片的多层结构为：上层盖板，培养室，上层基板，多孔膜，沟槽，下层基板；

所述上层基板分布有多个通孔，所述多孔膜的上表面与上层基板的下表面紧贴，从下方封闭所述通孔形成腔室，所述腔室即为培养室，该培养室用于培养各种细胞(例如，3D水凝胶包裹的细胞、贴壁细胞、器官、组织等)；

所述上层盖板位于上层基板上表面，用于盖住培养室，形成封闭的腔室；所述上层盖板表面光滑，用于遮盖器官培养室，防止污染；

所述下层基板部分镂空，其镂空的部分与多孔膜围成封闭的通道，该通道即为沟槽，所述沟槽的各个内壁用于培养不同的细胞；

所述多孔膜位于上层基板和下层基板之间，所述培养室的腔室通过多孔膜与所述沟槽相对应，使得沟槽内流动的液体能够通过多孔膜与培养室进行物质和能量交换。

进一步的，所述培养室的形状为圆柱体或长方体或正方体。

进一步的，所述沟槽的截面为矩形、半圆形或半椭圆形。

进一步的，所述微流控芯片的多层结构：上层盖板、上层基板、多孔膜、下层基板之间可拆卸围接。

进一步的，所述上层盖板、上层基板、下层基板的材料选自石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物、聚碳酸酯、聚酯、琼脂糖、壳聚糖或海藻酸钠中的任一种。

进一步的，所述多孔膜的材料选自PET、PDMS或聚偏氟乙烯或聚碳酸酯。

所述PET是指聚对苯二甲酸乙二酯，所述PDMS是指聚二甲基硅氧烷。

本发明还提供了上述实现多种细胞共培养的微流控芯片的应用，用于模拟人体多器官共培养。

进一步的，所述芯片内所种植的细胞包括肠、心脏、肝、肾、胰岛、皮肤、口腔、胃、子宫、卵巢、眼睛、骨骼、血管、肺、肌肉、脂肪、肿瘤、淋巴和脑器官所包含的细胞；芯片内所种植的细菌包括肠道菌群和胃菌群；从而该芯片应用于模拟人体多器官共培养。进而可进行生物标记物的测试，实现对药物、化妆品、保健品、环境毒物的有效评价。

在本发明的技术方案中，微流控芯片设为多层结构，其多层结构具体为：从上至下依次包括上层盖板、上层基板、中间层多孔膜、下层基板；上层基板分布有多个通孔，中间层多孔膜上表面贴着上层基板的下表面，从下方封闭上层基板上的多个通孔，构成一个个水桶状小腔室，这些腔室用于3维培养不同的细胞(组织器官)；下层基板上表面的网络状沟槽与中间层多孔膜的下表面贴合，沟槽的位置与上层基板孔洞的位置对应，贴合时注意将沟槽与通孔孔腔对准，沟槽中流通模拟的血液，模拟的血液通过中间层多孔膜上的小孔为“小水桶”中的细胞(组织器官)提供营养；不同“小水桶”中的细胞(组织器官)可以通过模拟的血液循环进行物质交换，从而模拟人体内的真实状况。本发明可以进行多器官培养，进一步可以进行生物标记物的测试，实现对药物、化妆品、保健品、环境毒物的评价。

本发明的有益效果在于：

与现有技术相比，本发明在芯片上可同时培养多种细胞(器官、组织)，进而模拟多种器官和组织的体外培养；芯片上培养室大小可变，可以获得不同数量的细胞样本，进而可进行灵活的分子生物学的测试，譬如RT-PCR，Western-blot等实现对药物、化妆品、保健品、环境毒物的有效评价。

附图说明

图1是本发明的结构示意图；图中：1、上层盖板，2、培养室，3、上层基板，4、多孔膜，5、下层通道，6、下层基板。

图2是本发明实施例中普萘洛尔的血药浓度随时间的变化曲线图。

图3是多孔膜上HUVEC通透性表征图，从左至右是荧光素钠、普奈诺尔、40kD的葡聚糖和70kD的葡聚糖的血管内皮细胞通透率。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本技术领域的普通技术人员应该理解的是，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

一种微流控芯片

该芯片设为多层结构，所述多层结构包括培养室和下层通道，其中，下层通道的营养物质可以通过多孔膜与培养室进行物质和能量交换。

具体的，该芯片的多层结构从上至下依次包括：上层盖板1，培养室2，上层基板3，多孔膜4，沟槽5，下层基板6；

所述上层基板3上设有培养室2，培养室2与多孔膜4形成一个上端开口的腔室，该腔室内可以培养多种细胞(组织、器官)，通过上层盖板1将腔室盖住，形成一个封闭的腔室，防止细菌、灰尘污染，且盖板容易打开便于给培养室更换培养液；

所述下层基板6部分镂空，其镂空的部分与多孔膜4围成一个封闭的下层通道，该下层通道即为沟槽5，该通道的各个内壁用于培养不同的细胞；

其中，根据模拟需要，培养室2可采用不规则空腔或规则空腔，规则空腔的形状可以为圆柱体或长方体或正方体。沟槽5的截面可选为矩形、半圆形或半椭圆形或其它需要形状。

所述微流控芯片的多层结构：上层盖板1，培养室2，上层基板3，多孔膜4，沟槽5，下层基板6之间可拆卸围接。

其中，根据模拟需求，所述上层基板3、下层基板6的材料选用石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物、聚碳酸酯、聚酯、琼脂糖、壳聚糖或海藻酸钠中的任一种；所述多孔膜4的材料采用PET、聚碳酸酯、PDMS或聚偏氟乙烯。

一种微流控芯片的应用

用于模拟人体多器官共培养装置。

芯片内所种植的细胞包括肠、心脏、肝、肾、胰岛、皮肤、口腔、胃、子宫、卵巢、眼睛、骨骼、血管、肺、肌肉、脂肪、肿瘤、淋巴和脑器官所包含的细胞；芯片内所种植的细菌包括肠道菌群和胃菌群；从而该芯片应用于模拟器官和组织。

本发明具体应用的实施例将在下面列出。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：模拟药物在人体内ADME(吸收、分布、代谢、排泄)过程的研究

如图1所示，上层盖板1的材料为亚格力，上层基板3、下层基板6材料为PDMS；多孔膜4的材料为聚碳酸酯，上层基板的培养室2为圆柱体，直径为6mm，高为7mm；沟槽5的宽度均为500微米，高度均为200微米；在培养室中培养三维组织(肠、心脏、肝、肾、胰岛、皮肤器官所包含的细胞)，在培养有肠道细胞的培养室中加入普萘洛尔，检测下层通道循环培养液中普萘洛尔的血药浓度，如图2所示，观察到起始阶段普萘洛尔浓度逐渐增高，随着时间的增加，血药浓度缓慢降低，这与口服药物在体内血药浓度变化趋势相符。

在多孔膜4下表面(沟槽5的顶面)培养人脐带血内皮细胞(HUVEC)，与体内相似，血管内皮细胞长成一层致密的细胞膜，具有毛细血管的屏障作用和生理功能，模拟了人的“毛细血管”，细胞与细胞之间形成紧密连接，不漏液。

如附图3所示，该模拟的“毛细血管”具备真实毛细血管的通透性特性，分子量越大，渗透速度越慢(荧光素钠>普奈诺尔>40kD的葡聚糖>70kD的葡聚糖)。

本实施例具有以下优势：传统技术仅模拟单一器官，或者三至四种器官，缺少人体系统的器官完整性，需要多种器官(六种以上)的联合作用才能较为真实的模拟药物在人体的反应过程。本实施例模拟了六种器官(肠、心脏、肝、肾、胰岛、皮肤器官)，应用于普萘洛尔的ADME(吸收、分布、代谢、排泄)过程。

Claims (9)

1.一种实现多种细胞共培养的微流控芯片，其特征在于：该芯片为多层结构，所述多层结构包含形成培养室的上层基板和具有沟槽的下层基板，所述上层基板和下层基板之间间隔一层多孔模，所述下层基板的沟槽内流动的液体能够通过多孔膜与上层基板的培养室进行物质和能量交换。

2.根据权利要求1所述的一种实现多种细胞共培养的微流控芯片，其特征在于该芯片的多层结构为：上层盖板(1)，培养室(2)，上层基板(3)，多孔膜(4)，沟槽(5)，下层基板(6)；

所述上层基板(3)分布有多个通孔，所述多孔膜(4)的上表面与上层基板(3)的下表面紧贴，从下方封闭所述通孔形成腔室，所述腔室即为培养室(2)，该培养室(2)用于培养各种细胞；

所述上层盖板(1)位于上层基板(3)上表面，用于盖住培养室(2)，形成封闭的腔室；

所述下层基板(6)部分镂空，其镂空的部分与多孔膜(4)围成封闭的通道，该通道即为沟槽(5)，所述沟槽(5)的各个内壁用于培养不同的细胞；

所述多孔膜(4)位于上层基板(3)和下层基板(6)之间，所述培养室(2)的腔室通过多孔膜(4)与所述沟槽(5)相对应，使得沟槽(5)内流动的液体能够通过多孔膜(4)与培养室(2)进行物质和能量交换。

3.根据权利要求2所述的一种实现多种细胞共培养的微流控芯片，其特征在于：所述培养室(2)的形状为圆柱体或长方体或正方体。

4.根据权利要求2所述的一种实现多种细胞共培养的微流控芯片，其特征在于：所述沟槽(5)的截面为矩形、半圆形或半椭圆形。

5.根据权利要求2所述的一种实现多种细胞共培养的微流控芯片，其特征在于，该芯片的多层结构：上层盖板(1)、上层基板(3)、多孔膜(4)、下层基板(6)之间可拆卸围接。

6.根据权利要求2所述的一种实现多种细胞共培养的微流控芯片，其特征在于：所述上层盖板(1)、上层基板(3)、下层基板(6)的材料选自石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物、聚碳酸酯、聚酯、琼脂糖、壳聚糖或海藻酸钠中的任一种。

7.根据权利要求2所述的一种实现多种细胞共培养的微流控芯片，其特征在于：所述多孔膜(4)的材料选自PET、PDMS或聚偏氟乙烯或聚碳酸酯。

8.权利要求1-7任一项所述的微流控芯片的应用，其特征在于：用于模拟人体多器官共培养。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述芯片内所种植的细胞包括肠、心脏、肝、肾、胰岛、皮肤、口腔、胃、子宫、卵巢、眼睛、骨骼、血管、肺、肌肉、脂肪、肿瘤、淋巴和脑器官所包含的细胞；芯片内所种植的细菌包括肠道菌群和胃菌群；从而该芯片应用于模拟人体多器官共培养。