CN111269830A - 一种基于微流控技术的多器官芯片及其应用 - Google Patents

一种基于微流控技术的多器官芯片及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于微流控技术的多器官芯片及其应用。该器官芯片由上而下包括液池层、微坑阵列层、多孔弹性膜层和液路层四层结构通过氧气等离子体不可逆封接而成。该器官芯片既可以实现不同器官的单独培养，又可以实现不同器官共同培养。当多个器官需要单独培养时，液路层不注入液体，各器官模块的培养基由于在微孔处的表面张力的作用不会相通。当需要两个器官进行相互作用时，将液体注入液路即可破除表面张力从而多器官连通。再利用气体实现在线蠕动泵的功能，使液体定向流动，实现两器官的灌流培养并相互作用。本发明克服了传统细胞培养的缺点，在初始阶段可以三器官独立培养，同时也可以实现灌流培养，有利于物质交换以及维持细胞活性。

Description

一种基于微流控技术的多器官芯片及其应用
技术领域
本发明涉及多器官芯片在器官共培养和疾病模型构建方面应用领域，具体涉及一种基于微流控技术的多器官芯片及其应用。
背景技术
现在全球每年有数十亿美元的经费浪费在最终失败的药物的筛选上。目前常用的药物筛选模型有细胞模型和动物模型。动物模型与人有种属差异，无法很好地预测药物的效用。细胞模型往往是单一一种的细胞，且为二维培养，无法重现器官之间的相互作用。
细胞(包括器官)间的相互作用是多细胞生物的基本特征。细胞间相互作用可以通过直接接触而产生，如在组织中不同的细胞之间的相互作用；细胞间相互作用也可以间接产生，如细胞通过分泌物相互作用。研究细胞相互作用(如癌症的发展和迁移，伤口愈合和干细胞发育)对药物筛选和组织工程都有重要作用，尤其是用于全身性药物的评价。为了建立研究细胞/细胞相互作用的模型，需要进行两种或更多种细胞类型的共培养。传统共培养方法包括将不同细胞类型直接添加到相同的培养孔中，或者用Transwell系统进行细胞培养。尽管由于该方法比较简单，但该模型基于2D单层细胞，其与体内细胞的形态，生理学和基因表达等品质不同。同时tanswell这种形式也无法重现三个及以上器官之间的相互作用。器官芯片技术作为一种新兴技术受到越来越多的关注。可通量化，可以精准控制理化因素，可方便实现灌流培养，可集成在线检测等特点让器官芯片技术成为最出色的构建新的药物评价模型的技术之一。多器官芯片更是器官芯片发展的重要趋势。
现有的多器官芯片往往只能实现器官共培养，无法进行单独培养。但是在疾病模型构建等应用中，往往需要只对某一种器官进行单独刺激与培养。所以学者们迫切需要一种新型的多器官芯片，既可以实现共培养，又可以实现单独培养。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种基于微流控技术的多器官芯片以及其在细胞培养过程中的应用。本发明既可以实现多个器官共培养，又可以实现多个器官单独培养。
一种基于微流控技术的多器官芯片，该芯片由上而下包括液池层1、微坑阵列层2、多孔弹性膜层3和液路层4四层结构；所述上述四层结构通过氧气等离子体不可逆封接而成。
所述液池层1包括培养基输入孔1a、气压输入孔1b、培养基蓄液池1c、通孔Ⅰ8；其中气压输入孔1b用于通气体，培养基蓄液池1c和培养基输入孔1a通过液路层4的液路相连通。
所述微坑阵列层2设有无底通透的微坑阵列7和通孔Ⅱ12；所述微坑陈列7由微坑10组成；所述多孔弹性膜层3在微坑阵列层2的微坑10对应位置设有微孔阵列9，在培养基输入孔1a对应位置设有通孔Ⅲ13使液池层4与培养基输入孔1a相通。
所述微坑陈列7和微孔阵列9底部为通透孔结构。
所述液路层4设有培养基灌流通道11，通过微坑陈列7和微孔阵列9底部的通透孔结构和液池层1相通，使液池层1的培养基蓄液池1c相连形成液体回路；所述培养基灌流通道11上设有在线蠕动泵5，在线蠕动泵5内设有PDMS隔断6。
进一步，多孔弹性膜层3厚度100-200微米。
进一步，微坑底部直径100-800微米，微坑侧壁倾斜角度20°～90°。
优选的，所述微孔阵列的直径为1-10微米。
优选的，所述多器官芯片材质为PDMS。
所述整个芯片设计可并排封接以实现通量设计，个数1-10。
微坑阵列层2的微坑10是无底通透的，下侧与多孔弹性膜层3封接在一起。微坑10尺寸与所需细胞球大小相适应；多孔弹性膜层3在微坑阵列层2的微坑位置处呈现直径约10微米的微孔，用于培养基在液池层1和液路层4的交换。除了微坑之处，多孔弹性膜层3均为无孔结构，作为在线蠕动泵5设计中液路和气路的媒介；液路层4主要为培养基灌流通道11。在在线蠕动泵5处有隔断，隔断充当阀的作用。芯片有多个并列重复单元组成，可实现通量设计。
本发明多器官芯片培养器官的种类不限于肝、胰与脂肪；肝、肠与心脏。
本发明提供了一种利用上述多器官芯片进行器官培养的方法，主要步骤为：
(1)器官芯片在应用时，需要多器官芯片高温灭菌，烘干温度80℃烘干2h。
(2)将细胞消化成单细胞后用新鲜培养基重悬，不同细胞分别接种在不同的液池当中，约12h后细胞会聚集成3D球。
(3)器官单独培养的步骤，它包括如下步骤：只在液池层1添加培养基，液路层4为空气，由于微孔层液体的表面张力作用，液体不会流入液路层4；此时可以对单个器官进行特殊刺激，如病理模型处理等。
(4)多种器官共培养的步骤，它包括如下步骤：从培养基输入孔1a添加培养基，液路充满液体，破除微孔阵列处液体表面张力，实现液路层4和培养基蓄液池1c处器官的物质交换及器官和器官之间的物质交换；将培养基输入孔1a用PDMS小塞塞住，三个气压输入孔1b交替通气体正压和负压，使多孔弹性膜层3对应位置产生形变，推动液体定向移动，实现在线蠕动泵5功能运行，实现多个器官灌流培养，促进物质交换。
本发明的优点：
1、既可以实现器官单独培养，又可以实现器官之间的相互作用。
2、在线蠕动泵形式减少了流路之中的液体体积，提升了细胞/培养基比例，有利于器官分泌因子浓度的提升，有利于重现器官之间的相互作用。
3、灌流培养促进代谢废物移除和营养物质流入，提升3D细胞球的活性。
4、芯片上单细胞悬液直接成球，无需在芯片外利用其他手段形成3D细胞球。
5、多器官共培养可以重现器官之间的相互作用，对药物筛选有着重要意义。
附图说明
为了更清楚的说明本发明的技术方案，将技术方案描述中所需使用的附图作简单的介绍。
图1为本发明多器官芯片立体示意图；
图2为本发明多器官芯片结构示意图；
图3为本发明多器官芯片纵切示意图；
图4为本发明多器官芯片细胞培养原理图；
其中，A器官模块单独培养原理图；B整个芯片纵切示意图；C器官共培养原理示意图；
图5为在线蠕动泵示意图图；箭头代表气体正压和负压；
其中，液池层1、微坑阵列层2、多孔弹性膜层3、液路层4、在线蠕动泵5、PDMS隔断6、微坑陈列7、通孔Ⅰ8、微孔阵列9、微坑10、培养基灌流通道11、通孔Ⅱ12、通孔Ⅲ13、养基输入孔(1a)、气压输入孔(1b)、培养基蓄液池(1c)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围不受实施例的限制，如果该领域的技术熟练人员根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
肝/胰/脂肪药物代谢模型
将制备得到的液池层1、微坑阵列层2、多孔弹性膜层3和液路层4四层结构通过氧气等离子体不可逆封接而成。
将多器官芯片进行高温高压灭菌，80℃2h烘干。分别将hepg2(肝细胞)，TC6(胰岛细胞)，原代脂肪细胞消化成单细胞分别接种在不同液池当中。12h后细胞成球。液路此时为空气，不添加培养基，器官进行单独培养。其中胰岛的培养基中添加链脲佐菌素，致使胰岛收到损伤，建立一型糖尿病模型。
此时从培养基输入孔1a添加培养基，液路充满液体，破除微孔阵列处液体表面张力，实现液路层4和培养基蓄液池1c处器官的物质交换及器官和器官之间的物质交换，即实现胰岛/肝/脂肪的物质交换。将培养基输入孔1a用PDMS小塞塞住，三个气压输入孔1b交替通气体正压和负压，使多孔弹性膜层3对应位置产生形变，推动液体定向移动，实现在线蠕动泵5功能运行，实现三个器官灌流培养，促进物质交换。
检测连通前后以及是否造模情况下的培养基糖浓度，胰岛素浓度等指标，研究一型糖尿病情况下，三种器官的相互作用；以及额外添加胰岛素(模拟一型糖尿病病人注射胰岛素)时糖浓度，分泌胰岛素浓度变化。这对一型糖尿病的机理研究以及注射胰岛素的释放模型的建立都有重要的作用。
实施例2
肝/肠/心药物代谢模型
将制备得到的液池层1、微坑阵列层2、多孔弹性膜层3和液路层4四层结构通过氧气等离子体不可逆封接而成。
将多器官芯片进行高温高压灭菌，80℃2h烘干。分别将hepg2(肝细胞)，caco2(肠上皮细胞)，ips-cardiocytes(心肌细胞)消化成单细胞分别接种在不同液池当中，12h后细胞成球。液路此时为空气，不添加培养，器官进行单独培养。其中肝和肠的培养基正常更换，心脏培养基不更换，3天后心脏跳动明显下降，成病理状态。
此时从培养基输入孔1a添加培养基，液路充满液体，破除微孔阵列处液体表面张力，实现液路层4和培养基蓄液池1c处器官的物质交换及器官和器官之间的物质交换，实现肝/肠/心的物质交换。将培养基入口用PDMS小塞子塞住，从三个气压输入孔1b交替通气体正压和负压，使多孔弹性膜层3对应位置产生形变，推动液体定向移动，实现在线蠕动泵5功能运行，实现三个器官灌流培养，促进物质交换。此时在肠器官处添加哌唑嗪(β-受体阻断剂，可降低心肌收缩性、自律性、传导性和兴奋性，可治疗心绞痛、急性心梗、高血压)，检测该药物在三种器官中的分布，吸收，转化，代谢等情况，探究其在心脏功能衰退的情况下的作用。

Claims (9)

1.一种基于微流控技术的多器官芯片，其特征在于：该芯片由上而下包括液池层(1)、微坑阵列层(2)、多孔弹性膜层(3)和液路层(4)四层结构；所述上述四层结构通过氧气等离子体不可逆封接而成；
所述液池层(1)包括培养基输入孔(1a)、气压输入孔(1b)、培养基蓄液池(1c)、通孔Ⅰ(8)；其中气压输入孔(1b)用于通气体，培养基蓄液池(1c)和培养基输入孔(1a)通过液路层(4)的液路相连通；
所述微坑阵列层(2)设有无底通透的微坑阵列(7)和通孔Ⅱ(12)；所述微坑陈列(7)由微坑(10)组成；
所述多孔弹性膜层(3)在微坑阵列层(2)的微坑(10)对应位置设有微孔阵列(9)，在培养基输入孔(1a)对应位置设有通孔Ⅲ(13)使液池层(4)与培养基输入孔(1a)相通；
所述微坑陈列(7)和微孔阵列(9)底部为通透孔结构；
所述液路层(4)设有培养基灌流通道(11)，通过微坑陈列(7)和微孔阵列(9)底部的通透孔结构和液池层(1)相通，使液池层(1)的培养基蓄液池(1c)相连形成液体回路；所述培养基灌流通道(11)上设有在线蠕动泵(5)，在线蠕动泵(5)内设有PDMS隔断(6)。
2.根据权利要求1所述的多器官芯片，其特征在于：所述多孔弹性膜层(3)厚度100-200微米。
3.根据权利要求1所述的多器官芯片，其特征在于：所述微坑底部直径100-800微米，微坑侧壁倾斜角度20°～90°。
4.根据权利要求1所述的多器官芯片，其特征在于：所述微孔阵列的直径为1-10微米。
5.根据权利要求1所述的多器官芯片，其特征在于：所述多器官芯片材质为PDMS。
6.根据权利要求1所述的多器官芯片，其特征在于：整个芯片设计可并排封接以实现通量设计，个数1-10。
7.根据权利要求1所述的基于微流控技术的多器官芯片的应用，其特征在于：器官的种类不限于肝、胰与脂肪；肝、肠与心脏。
8.一种利用权利要求1-6中任一项所述的多器官芯片进行器官培养的方法，其特征在于：包括以下主要步骤：
(1)多器官芯片高温灭菌；
(2)将细胞消化成单细胞后用新鲜培养基重悬，不同细胞分别接种在不同的液池当中，约12h后细胞会聚集成3D球；
(3)器官单独培养的步骤，它包括如下步骤：只在液池层(1)添加培养基，液路层(4)为空气，即液体不会流入液路层(4)；
(4)多种器官共培养的步骤，它包括如下步骤：从培养基输入孔(1a)添加培养基，液路充满液体，实现液路层(4)和培养基蓄液池(1c)处器官的物质交换及器官和器官之间的物质交换；将培养基输入孔(1a)用PDMS小塞塞住，三个气压输入孔(1b)交替通气体正压和负压，使多孔弹性膜层(3)对应位置产生形变，推动液体定向移动，实现在线蠕动泵(5)功能运行，实现多个器官灌流培养，促进物质交换。
9.根据权利要求8所述的多器官芯片进行器官培养的方法，其特征在于：所述步骤(1)中烘干温度为80℃，烘干时间为2h。
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