CN116240108A - 一种四通道器官芯片及其应用和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种四通道器官芯片，四通道器官芯片包括顶盖和基体，顶盖设有空气通道，基体设有培养层，所述空气通道与培养层流体连通。所述培养层包括多个细胞培养孔、多个血管通道和多个培液通道，所述血管通道、培液通道与细胞培养孔流体连通，且所述空气通道、所述血管通道、所述培液通道内的流体在外力推动下保持流动。本申请的四通道器官芯片通过引入空气通道、血管通道和培液通道，再通过外接驱动泵从而在芯片内实现气体灌流、液体灌流，并实现在同一芯片进行多类型细胞共培养，可以根据实际需要添加循环免疫细胞做共培养，增加器官芯片的细胞复杂度，充分模拟肿瘤在体环境。

Description

一种四通道器官芯片及其应用和使用方法

技术领域

本发明涉及3D肿瘤细胞培养芯片技术领域，特别是涉及一种四通道器官芯片及其应用和使用方法。

背景技术

肺癌是临床上最常见的呼吸系统恶性肿瘤，多年以来，肺癌的发病率和致死率始终占据各类恶性肿瘤的第一位，根据美国癌症协会2021年的统计数据，肺癌的发病率占到了各类癌症总发病率的11.4％，引起的死亡率更是占到了癌症总死亡率的18％，与之相比，肺癌新药的研发速度则相对比较缓慢，因此开发更为高效的抗肺癌药物是十分有必要的。

肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两大类，其中，非小细胞肺癌约占肺癌总发病量的85％。已有的临床研究表明，肺癌往往起源于支气管上皮细胞层，其中，肺鳞癌和大细胞肺癌一般起源于较大支气管，因此被称为中央型肺癌，而肺腺癌通常起源于较小的支气管，因此也被称为周围型肺癌，恶性增殖的肺癌组织寄生在支气管上皮层，向外突破支气管黏膜下层甚至支气管软骨，与循环系统直接接触，外周血免疫细胞可通过直接接触的形式与肿瘤细胞发生相互作用；肿瘤组织向内生长则可占据支气管腔形成占位，从而引起部分肺叶功能衰退甚至萎缩。

传统的细胞系2D培养是研究肺癌发病机制和做药物筛选的重要研究手段，但是这种细胞培养模式使得癌细胞丧失了与其他细胞、细胞外基质的相互作用，静态的培养环境也无法为细胞提供流体切应力等物理作用，因此，体外实验得出的结果往往很难在体内实验中被完全重现，这导致了药物研发速度的迟滞和经济、时间的浪费；而动物实验尽管结果更为可靠，但往往投入的时间周期和成本十分惊人，随着近几年伦理审查和动物福利政策的逐步收紧，动物实验也面临着日益严重的限制，因此，开发更为高效的、能够更好地反映细胞在体内对于药物刺激真实反映的体外工作平台是十分有必要的，出于这方面的考量，器官芯片技术应运而生，有望成为新一代高效药物筛选平台，从而加速抗肿瘤药物的研发进程。

目前已有的基于3D肿瘤微球研发的器官芯片，其搭载的细胞培养体系通常是单一的肿瘤细胞或者肿瘤细胞混合正常上皮细胞共同培养成的比较简单的肿瘤微球，对肿瘤来说，失去了原本的微环境中其他细胞与肿瘤细胞本身的相互作用，而对于肺癌这个癌种来说，这些芯片的设计往往缺乏了气体灌流，因此也不能很真实地反映肺癌在体内的真实状况。

本申请发明人旨在提供一种多通道器官芯片，可以同时提供气体和液体灌流、血管内皮细胞共培养、并且能根据实际需要额外添加循环免疫细胞做共培养，尤其适用于进行肺癌研究。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种四通道器官芯片，可以搭载3D肿瘤微球体培养体系并在此基础上充分模拟肿瘤在体环境并实现药物的高通量筛选。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过包括如下技术方案实现的。

本发明第一方面提供一种四通道器官芯片，所述四通道器官芯片包括顶盖和基体；所述顶盖设有空气通道；所述基体设有培养层，所述空气通道与所述培养层流体连通；所述培养层包括多个细胞培养孔、多个血管通道和多个培液通道，所述细胞培养孔分别与所述血管通道、所述培液通道流体连通，且所述空气通道和所述血管通道和所述培液通道内的流体在外力推动下保持流动。通过向芯片中引入空气通道、血管通道和培液通道，且血管通道、空气通道和培液通道均可通过外加驱动力形成流动的流体环境，能够实现多组分的肺癌相关细胞共培养，从而充分模拟肿瘤在体环境。例如，血管通道和培液通道用于通入/流出液体及接种血管内皮细胞，空气通道用于供空气流通，因此可在同一芯片内实现气体灌流、液体灌流和内皮细胞共培养，实现多类型细胞共培养，增加器官芯片的细胞复杂度，充分模拟肿瘤在体环境。并且可以根据需要将免疫细胞单独引入器官芯片中，用来筛选经T细胞等免疫细胞途径发挥功能的肿瘤药物。

在一些优选实施方案中，所述细胞培养孔与所述血管通道的连通处设有多孔间隔膜，所述细胞培养孔与所述培液通道的连通处也设有多孔间隔膜，多孔间隔膜设置目的在于限制细胞透过，而多孔的存在使多孔间隔膜两侧形成一个液体交换平面，可以使液体、小分子或一些生物大分子透过，实现了培液的自由交换。优选的，多孔间隔膜上的孔径为0.4～5μM。

在一些优选实施方案中，所述细胞培养孔的孔底内表面设置低细胞粘附层；所述低细胞粘附层的材料为仿细胞外基质成分；优选的，所述低细胞粘附层的材料为基质胶。用于降低细胞培养孔板材对细胞的吸附性，便于肿瘤微球的3D培养。

在一些优选实施方案中，所述多个细胞培养孔呈多排排列；每排所述细胞培养孔的一侧至少设有一个所述血管通道，另一侧至少设有一个所述培液通道；且各所述细胞培养孔不连通，各所述培液通道不连通。即每排细胞培养孔和其对应的血管通道和培液通道均形成一个相对独立的且封闭的培养单元，多个相对封闭的培养单元集成在一起能够实现在同一块芯片上同时检测不同药物抑制肿瘤细胞的能力。优选的，空气通道位于所有培养单元的上方且与各培养单元流体连通，即多个相对封闭的培养单元共用一个空气通道输送的空气。

在一些优选实施例方案中，所述顶盖设有至少两个空气孔，各所述空气孔与所述空气通道流体连通，且各所述空气孔用于设置或外接通气管路。所述顶盖上设有多个血管通道口，各所述血管通道的两端分别与两个所述血管通道口连通，各所述血管通道口用于通过外接通液管路。所述顶盖上设有多个培液通道口，各所述培液通道的两端分别与两个所述培液通道口连通，各所述培液通道口用于通过外接通液管路。通过各通道口外接驱动泵从而实现自动流体控制。优选的，通过各空气孔、通道口、外接驱动泵管路的连接方式实现闭环的单向流动方式。单向流动方式如何形成本领域技术人员已知，例如沿着某一方向依次设置一个进口和一个出口，进口和出口分别外接驱动泵即可，驱动泵的种类根据实际实验要求进行选择，这里不作限制，例如选用微流控泵、空气泵。

本发明第二方面提供一种四通道器官芯片系统，包括上述四通道器官芯片和驱动泵。

本发明第三方面提供一种所述的四通道器官芯片或系统在药物研发或营养学研究中的用途。具体的，在研究候选抗肿瘤药物对肺癌细胞的杀伤作用中的用途。

本发明第四方面提供一种所述的四通道器官芯片或系统在研究药物对肺癌细胞的杀伤作用中的使用方法，包括如下步骤：

1)提供肺肿瘤微球体；优选的，所述肺肿瘤微球体由人肺癌细胞和人呼吸道上皮细胞混合培养获得；

2)提供内皮细胞培液；优选的，所述内皮细胞培液由人血管内皮细胞制备获得；

3)将步骤2)的内皮细胞培液注入血管通道，封闭静置培养，血管通道内的细胞贴壁后，弃掉血管通道内的原培液，通入新鲜培液；

4)将培液通道内灌注新鲜培液，将步骤1)的所述肺肿瘤微球体连同部分培液一起注入细胞培养孔；

5)封闭四通道器官芯片后，通过外加驱动力分别使所述空气通道、血管通道和培液通道内的流体流通进行封闭培养。

值得说明的，是本发明所述的四通道器官芯片，四通道分别是指芯片内流动的空气形成的空气通道、细胞培养孔排列成的癌细胞通道、血管通道(含内皮细胞)和培液通道。其中，肿瘤微球在细胞培养孔中培养，还可以加入免疫细胞(例如人外周血单个核细胞(PBMC))；血管通道内可灌注血管内皮细胞或其他。并通过空气通道、培液通道、血管通道内的流体流动形成了同时提供气体和液体灌流、带有血管内皮细胞共培养、并且能根据实际需要额外添加循环免疫细胞做共培养的肺癌器官芯片模型。同时，该器官芯片上的细胞培养体系赋予气体/液体流动支持的前提下，达成了很好的集成化，能够在同一块芯片上实现多种药物各自独立的刺激实验的目的，因此有利于进行高通量的药物筛选。

如上所述，本发明的四通道器官芯片，主要具有以下有益效果：

1)本申请的四通道器官芯片通过引入四通道、各通道进行物质交换、以及用多类型细胞进行混合成球的方式，增加器官芯片中的细胞复杂度。

2)将免疫细胞单独引入器官芯片中，可以用来筛选通过T细胞执行抗肿瘤功能的肿瘤药物。

3)驱动泵和外接流体管路的设置，能够为芯片上培养的细胞提供气体和液体剪切力，增加细胞能够接受的外界刺激因子的复杂度，从而更充分模拟肿瘤在体环境。

4)本申请的四通道器官芯片通过设置多个相对独立的且封闭的培养单元，能够达成在同一块芯片上同时检测不同药物抑制肿瘤细胞生长能力的目的。

5)本申请的四通道器官芯片通过外接驱动泵，实现细胞培养的自动化控制，提高工作效率。

附图说明

图1显示为本发明的四通道芯片的整体结构示意图。

图2显示为本发明的四通道芯片顶盖的俯视示意图。

图3显示为本发明的四通道芯片的培养层的俯视示意图。

图4显示为本发明的四通道芯片的培养层的侧视示意图。

图5显示为本发明的四通道芯片的部分培养层的侧视示意图。

图1～图5中附图标记如下：

1 顶盖

11 空气通道

111 腔底

12 空气孔

13 血管通道口

14 培液通道口

15 血管通液口

16 培液通液口

2 基体

21 培养层

211 细胞培养孔

212 血管通道

213 培液通道

214 多孔间隔膜

22 支撑层

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所述内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1至图6。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

如图1-6所示，本发明提供四通道器官芯片，四通道器官芯片顶盖1和基体2，所述顶盖1设有空气通道11，所述基体2设有培养层21和支撑层22。所述空气通道11与所述培养层21流体连通。其中，培养层21包括多个细胞培养孔211、多条血管通道212和多条培液通道213，血管通道212和培液通道213分别与细胞培养孔211流体连通，且空气通道11、血管通道212、培液通道213内的流体在外力推动下保持流动。培液通道22主要供培液流动，血管通道212作为血管内皮细胞生存的主要场所。细胞培养孔21用于接种3D肿瘤细胞微球体和实验结束后取出培液进行检测，另外还可以根据需要引入上皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞，即多种细胞能共同存活于同一个培养环境下。空气通道11可用于通入空气和使气体离开，从而在芯片内部形成流动的气体层。本申请通过向芯片中引入空气通道11、血管通道212和培液通道213，且空气通道11、血管通道212和培液通道213均可通过外接驱动泵形成流动的液体环境，实现多组分的肺癌相关细胞共培养并同时进行不同组分的培液灌流，从而能够充分模拟肿瘤在体环境。一般的，通过在顶盖1上设置用于通气和通液的通孔分别与空气通道11、血管通道212和培液通道213连通，通过外接泵提供驱动力在芯片内部形成一个闭环的单向流动系统。

在一具体实施例中，四通道器官芯片的材料为透明材料。具体的，顶盖1和/所述基体2的材料为高分子聚合材料；更具体的，顶盖1和/基体2的材料选自聚苯乙烯(PS)或聚乙烯(PE)。

在一具体实施例中，如图2和图4所示，顶盖1设有至少两个空气孔12，各空气孔12与空气通道11流体连通，且各空气孔12向上凸出基体形成一段外接口，用于设置或外接通气管。优选的，需要提供外力驱动时，将各外接口与通气管路接通后再与驱动泵连接，形成流动系统，优选为单向流动系统。另外，顶盖1上设有多个血管通道口13，各血管通道212至少对应两个血管通道口13，各血管通道口13用于通过外接的通液管路，将通液管路穿过血管通道口13后、再穿过血管通液口15与血管通道212连通。其中血管通液口15设置于基体2，并且通过一段穿过设于基体通道与血管通道212连通。所述顶盖1上设有多个培液通道口14，各培液通道213至少对应两个培液通道口14，各培液通道口14用于通过外接的通液管路，将通液管路穿过培液通道口14后、再穿过培液通液口16与培液通道213连通。其中培液通液口16设置于基体2，并且通过一段穿过设于基体通道与培液通道213连通。当需要提供外力驱动时，将各通液管路与驱动泵连接，形成流动系统，优选为单向流动系统。优选的，芯片盖体1上的血管通道口13和基体2上的血管通液口15是一一对应的，但盖体1上血管通道口13的孔径略大于基体2的血管通液口15，通液管路穿过时能正好卡住整个孔，从而使得芯片内部形成相对封闭的空间。芯片盖体1上的培液通道口14和基体2上的培液通液口16是一一对应的，但盖体1上培液通道口14的孔径略大于基体2的培液通液口165，通液管路穿过时能正好卡住整个孔，从而使得芯片内部形成相对封闭的空间。

在一具体实施例中，顶盖1与所述基体2可拆卸连接，顶盖1与基体2可拆卸连接方式为滑动连接、插接、螺纹连接或卡扣连接。例如，顶盖1包括顶部和连接部，所述连接部与基体2可拆卸连接，顶盖1与基体2连接状态下形成空腔部，所述空腔部形成所述空气通道11。更具体的，顶盖1与所述基体2连接状态下，所述空腔部远离所述基体2一侧的腔底111至所述细胞培养孔211的孔顶所在平面的垂直距离为3～8mm，可选3-6或6-8mm。保持特定的腔底111与细胞培养孔21的距离，以使形成的空气通道11，即在所述空气通道形成一个可以流动的空气层。

在一些优选实施例中，细胞培养孔211与血管通道212的连通处设有多孔间隔膜214，所述细胞培养孔211与培液通道213的连通处设有多孔间隔膜214，其中血管通道和培液通道不直接连接。通过设置多孔间隔膜214起到分隔的作用。优选的，多孔间隔膜上的孔径为0.4～5μM，这个范围内的孔径能够使得液体、小分子、生物大分子自由透过，但对细胞具有一定的限制性。在膜的材质可支持细胞生长、孔大小不会使得细胞不会通过的前提下，实验者可根据自身需求，对孔径大小和膜的材质进行自定义。一般的，多孔间隔膜214的材料为能形成多孔结构的高分子聚合材料；具体的，所述多孔间隔膜214的材料选自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)或聚对苯二甲酸丁二酯(PET)中的至少一种。

如图5所示，本发明通过在细胞培养孔211和血管通道212的连通处设置多孔间隔膜214，细胞培养孔211和培液通道213的连通处设置多孔间隔膜214，确保培液能扩散，实现液体交换，并且将肿瘤细胞和其他各种细胞分隔在了相对独立又互有联系的空间中生长，该体系中还可另外再引入循环免疫细胞，能够更好地模拟肿瘤在人体内的微环境以及其他组分的细胞与肿瘤细胞的相互作用。例如，可向细胞培养孔211内引入人外周血单个核细胞(PBMC)具体的，肿瘤微球和PBMC及部分培液通过细胞培养孔的顶端开口被接入孔中，PBMC经活化后可进一步分化为为T细胞，因此本申请的器官芯片可以更精确地对机制为通过T细胞介导的肿瘤杀伤效应的化合物/生物大分子进行药效评估。

在一些优选实施例中，多孔间隔膜214选用聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

在一些优选实施例中，多个细胞培养孔211呈多排排列，每排细胞培养孔211的一侧设有一个血管通道212，另一侧设有一个培液通道213。具体的，各所述细胞培养孔211不连通，各所述血管通道212不连通，各所述培液通道212不连通。更具体的，细胞培养孔211的孔腔为U形腔，所述细胞培养孔211的孔深为8～12mm，可选8～9mm、9～10mm、10～11mm或11～12mm；所述血管通道212的横截面边长为4～8mm，可选4～6mm或6～8mm；所述培液通道212的横截面边长为4～8mm，可选4～6mm或6～8mm。更具体的，细胞培养孔211的孔底与血管通道212的通道底在一个水平面，细胞培养孔211的孔底面与培液通道213的通道底在一个水平面。即参照图4，血管通道212和培液通道213分别位于细胞培养孔211的两侧，血管通道212和培液通道213的底部与细胞培养孔211的底部齐平，深度为细胞培养孔的1/3～2/3，血管通道212和培液通道213与细胞培养孔211的相接处的壁采用多孔间隔膜214制成。也就是说，每排贯穿设置细胞培养孔211、位于其两侧的多孔间隔膜214、血管通道212和培液通道213形成一个相对封闭的培养单元，可以通过设置多个如上的培养单元来提高芯片通量和实现多种不同组分的培液各自进行细胞培养。

实施例1

参阅图1～6，芯片整体为全透明结构，其外观结构近似于传统的24孔细胞培养板，包含有一个能独立拆卸的顶盖1和基体2，基体2设有若干细胞培养孔211、血管通道212和多个培液通道213的培养层21和设于培养层21下方的支撑层22。其中顶盖1上带有2个通气口及其外接口、8个血管通道口13和8个培液通道口14，未使用时，顶盖1的所有与芯片外连通的孔和口等均带有可拆卸的硅胶盖。培养层21含有4个独立的重复培养单元，每个培养单元包含1条血管通道212、6个细胞培养孔211和1条培液通道213，血管通道212和培液通道213与芯片长轴平行且等水平排列，细胞培养孔211纵轴与芯片平面和2条通道垂直排列，自芯片平面上方自左向右依次为血管通道212-细胞培养孔211-培液通道213。所有独立培养单元共用培养层21上平面至顶盖内壁之间的气体流动层，上平面具体为细胞培养孔211孔顶所在的水平面，即所有的培养单元共用一个空气通道11，以上结构连通通气管路和通液管路及驱动泵后形成完整的芯片。

具体的，1)芯片的顶盖1为连通通气管路、通液管路的位置，顶盖1上带有2个空气孔12及其通气管，在各自连通外接的通气管路和空气泵后，气体可由空气泵自其中一个空气孔12孔泵入芯片，在芯片内部形成一个流动的空气层，并在微流控系统的驱动下，自另一个空气孔12中被泵出。2)芯片的顶盖1的短轴两侧各自带有4个培液通道口14，能够容纳通液管路经该培液通道口14和培液通液口16后接入培养层21，培液自一侧培液通道口14流入芯片再经另一侧培液通道口14离开。3)芯片的顶盖1的短轴两侧各自带有4个血管通道口14，同样可容纳通液管路经该血管通道口13和血管通液口15后接入培养层21，含血管内皮细胞的单细胞悬液或普通培液可经一侧血管通道口13流入芯片再经另一侧血管通道口13离开。

更具体的，1)芯片的培养层21含有4条独立的培液通道213及两端的培液通液口16，可通过多孔间隔膜214连通每个培养单元的6个细胞培养孔211。每条培液通道213的培液通液口16可连接通液管路再穿过顶盖1的培液通道口14连接微流控系统。芯片运转时，培液可经一侧的培液通道口14的外接口灌流入芯片，再从另一侧培液通道口14的外接口流出芯片。2)芯片的培养层21含有24个细胞培养孔211，每6个细胞培养孔211两侧各自通过多孔间隔膜214分别与培液通道213和血管通道212间接连通。细胞培养孔211向上开口，培养好的肿瘤微球可经此开口进入细胞培养孔211中进行3D培养，实验结束后，培液或肿瘤微球或其他细胞组分可经此开口被取出并进行后续检测。3)芯片的含有4条独立的血管通道212及两端的血管通液口15，血管通道212与细胞培养孔211相邻的侧壁通过一层多孔膜间接连通，每条通道的血管通液口15可连接通液管道再穿过顶盖1的血管通道口13连接微流控系统。芯片正式运转前，含有内皮细胞的培液可经一侧的血管通道口13的外接口灌流入芯片先进行静态培养，至内皮细胞长成连续的细胞层后，不含细胞的新鲜培液再经一侧的血管通道口13的外接口灌流入血管通道，最后从另一侧的外接口流出。

综上，本申请将内皮细胞固定在一个专门的通道中进行培养，而肿瘤细胞形成的微球则在另一个相对独立的环境中进行培养，此外，肿瘤微球的培养环境中还可以加入悬浮生长的免疫细胞，因此在一块芯片上实现了多组重复的多类型细胞的共培养。

更具体的，参阅图4，由4列独立的、重复的三通道细胞培养单元构成，每一列单元自左向右水平排列一条血管通道212、6个独立的细胞培养孔211和一条培液通道213，血管通道212和培液通道213两端带有向上的通道和开口以及外接口，通道的横截面均为圆角矩形，培养层上侧和顶盖1之间的气体空间用作4列培养单元共用的空气通道11，细胞培养孔211顶端开口，细胞培养孔211底部铺有一层基质胶以便形成低细胞吸附层，使得肿瘤微球体在细胞培养孔211中能维持其原有形态，细胞培养孔211的底部形状为U形。

更具体的，芯片外观整体长宽高尺寸为：127mm x 85mm x 22mm，顶盖1内表壁与细胞培养孔孔顶所在平面之间的高度为：3～8mm。顶盖1上带有2个空气孔12、4个培液通道口14和4个血管通道口13，2个空气孔12带有向上的固定外接口，用于使通气管路通过；空气孔及其外接口横截面为圆形，直径为：5-8mm，外接口高度为：8mm，培液和血管通道孔相间排列在盖子的两侧短轴上，横截面均为圆形，培液通道口14和4个血管通道口13的孔略大于培养层上对应的培液通道孔。

更具体的，细胞培养孔211按照6行(每行4孔)x 4列(每行6孔)排列，培养孔横截面呈正方的圆角矩形，边长为：6-8mm，每一列两个孔横截面圆心之间的间距为：18mm，每一行两个孔横截面圆心之间的间距为：20mm，培养孔侧剖面呈“U”型，最底部到孔顶平面的高度为：12mm；培养孔位于血管通道212和培液通道213之间，与其他通道垂直。孔壁与血管通道212和培液通道213相邻侧壁用聚二甲基硅氧烷(PDMS)多孔膜制造，其微孔直径为：0.4 -5μM，能够透过水、小分子及生物大分子，但无法透过细胞，该结构可以实现培液的自由交换；孔顶开口与上层空气层联通，以便于接种多细胞肿瘤微球和取出其中的培养基进行后续检测；孔底铺有一层基质胶，其目的在于形成低细胞粘附层，以便于肿瘤微球的3D培养。

更具体的，血管通道212与芯片长轴平行并贯穿在培养板中，通道横截面呈正方的圆角矩形，通道总长度为：118mm，宽度为：4-8mm；通道在与细胞培养孔211相邻的侧壁采用PDMS制造，其他侧壁的制造材料为聚苯乙烯；通道两端向上至培养层顶部延伸出两条向上通道，延伸通道横截面为圆形，直径为：4mm，延伸通道在培养层顶面形成一个开口，能够连接管道系统，便于向芯片中灌注内皮细胞及其培养基。

更具体的，培液通道213与血管通道212平行并贯穿芯片长轴，与血管通道212分别分布在细胞培养孔211两侧，通道横截面呈正方的圆角矩形，通道长度为：108mm，宽度为：5-8mm；该通道与细胞培养孔211相邻的侧壁用多孔PDMS膜制造，其他侧壁由聚苯乙烯材料制造；通道两端向上延伸出开口，向上的通道横截面呈圆形，直径为：4mm，延伸通道在培养板顶面形成一个开口，可以向外接入管道，便于灌注用于支持肿瘤微球生长的培液和待筛选的抗肿瘤化合物。

更具体的，血管通道212和培液通道213内的液体由微流控系统控制使其流动，并在芯片内形成一定压力，使得液体能通过多孔膜进入细胞培养孔中，并始终维持一定的液面高度。细胞培养孔开口仅用于接种肿瘤微球和实验结束后取出培液进行检测，不用于日常培养时灌注培液。培液通道213和血管通道212中液流方向是单向的，两条通道内液流方向是一致的。

实施例2

上述实施方案所述的四通道器官芯片的对应系统，包括上述所述的四通道器官芯片四通道器官芯片和驱动泵，所述驱动泵用于为空气通道和培液通道内的流体提供动力，能够实现芯片上细胞培养的自动化控制，驱动泵的型号根据需要进行选择或定制。

实施例3

器官芯片使用方法为：

在芯片正式使用前，首先将人肺癌细胞和人正常呼吸道上皮细胞按照2：1的比例接种并混合培养3-5天使其形成肿瘤微球，同时，对人血管内皮细胞进行扩增培养以获取到足够多的内皮细胞；接下来，打开芯片顶盖1并揭掉顶盖1一侧的血管通道口212上的硅胶盖，将含有内皮细胞的培液从血管通道212的一侧外接口处灌注进通道中，使培液充盈血管通道212，随后静置培养，待内皮细胞贴壁并长满通道后，弃掉含有悬浮细胞的原培液，通入新鲜的内皮细胞培液；再从芯片中的培液通道213中灌注新的培液直至通道内充满培液且细胞培养孔中培液液面能维持足够肿瘤微球正常生长的高度(1/2左右)，随后挑取培养好的肿瘤微球(直径一般在300μm以上)接种进细胞培养孔211中；最后连接通气、通液管路以及外部的微流控系统，扣合盖体，打开微流控系统，使得芯片中的流体流动起来。根据实验需求，除维持细胞生存的基础培液外，芯片的培液体系中可以加入待检测的抗肿瘤药物用于肿瘤杀伤。在整个培养过程中，微流控系统负责驱动芯片内的流体流动，因此无需频繁的人工换液操作。

该芯片上的细胞培养结束后，其检测过程如下：首先关闭微流控系统，弃掉各外接管路中的培液，随后拆除管路和盖体1，暴露细胞培养孔211，取培养后的培液进行ATP含量或某些外分泌蛋白测定，或用显微镜拍照测定肿瘤微球体的直径变化。在实验结束后，肿瘤微球体和培液可移除，贴壁生长的内皮细胞可用胰蛋白酶消化再灌流去除，以使得芯片能重复使用。

具体的，

1)未使用时，芯片的顶盖1与基体2扣合在一起，顶盖1上所有的孔均由硅胶塞塞住，芯片内部是洁净无菌的环境。

2)当芯片使用时，首先，打开顶盖1一侧的血管通道口212上的硅胶盖，从培养层21一侧的血管通道外接口中缓慢灌注含有血管内皮细胞的培养基悬液至水平的血管通道212中充满细胞悬液，随后静置培养2-3天，待内皮细胞贴壁后，连通各种管路，并使这些管路穿过顶盖。待扣上顶盖后，打开气体微流控系统通入空气并使得芯片内的空气保持流动状态，接下来打开控制培液通道213的微流控系统将原有的培液泵出芯片，随后向培液通道213和血管通道212通入新鲜的培液，使得细胞培养孔中液面高度维持一定高度。

芯片的培养层21包含细胞培养孔211及培液通道213和血管通道212，芯片正式运转前，肿瘤微球及部分培液直接从细胞培养孔211顶端的开口处被接入芯片中。芯片正式运转后，培液通道213和血管通道212自芯片一侧的外接口及管道流入芯片，在贯穿整块芯片后，再从另一侧离开，细胞培养孔211中的培液也是由通道中的液体经多孔膜流入的。在培养结束后，待检测的培液和肿瘤微球可经细胞培养孔211顶端开口再次被取出。

上述所述芯片的培养层至多可灌注4种成分不同的培液，肿瘤杀伤实验所需的药物需要预先在培液中充分混匀，再经由微流控系统被通入芯片中进行实验。

实施例4

肺癌器官芯片中额外加入免疫相关细胞的搭载方式。

在肿瘤细胞-上皮细胞-内皮细胞的三细胞类型培养基础上，人外周血单个核细胞(PBMC)可作为免疫细胞组分被引入芯片培养体系中，芯片正式使用前，肿瘤微球和PBMC及部分培液通过细胞培养孔的顶端开口被接入孔中，随后按照实施例3的操作流程进行正常的3D培养。当培养结束后肿瘤微球可经由培养孔开口取出后检测肿瘤杀伤效果，如有必要，PBMC也可被重新收集后进行检测。

PBMC经活化后主要组成成分为T细胞，可以更精确地对机制为通过T细胞介导的肿瘤杀伤效应的化合物/生物大分子进行药效评估。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (12)

1.一种四通道器官芯片，其特征在于，所述四通道器官芯片包括顶盖(1)和基体(2)；

所述顶盖(1)设有空气通道(11)；所述基体(2)设有培养层(21)，所述空气通道(11)与所述培养层(21)流体连通；

所述培养层(21)包括多个细胞培养孔(211)、多个血管通道(212)和多个培液通道(213)；所述血管通道(212)和所述培液通道(213)与所述细胞培养孔(211)流体连通，且所述空气通道(11)和所述培养层(21)内的流体在外力推动下保持流动。

2.根据权利要求1所述的四通道器官芯片，其特征在于，所述细胞培养孔(211)与所述血管通道(212)的连通处设有多孔间隔膜(214)；所述细胞培养孔(211)与所述培液通道(213)的连通处设有多孔间隔膜(214)；

和/或，所述顶盖(1)设有至少两个空气孔(12)，各所述空气孔(12)与所述空气通道(11)流体连通，且各所述空气孔(12)用于设置或外接通气管；

和/或，所述空气通道(11)和/或所述血管通道(212)和/或所述培液通道(213)内的流体在外力推动下保持单向流动。

3.根据权利要求2所述的四通道器官芯片，其特征在于，所述多个细胞培养孔(211)呈多排排列；每排所述细胞培养孔(211)的一侧至少设有一个所述血管通道(212)，另一侧至少设有一个所述培液通道(213)；

和/或，各所述细胞培养孔(211)不连通；和/或，各所述血管通道(212)不连通；和/或，各所述培液通道(212)不连通；

和/或，所述顶盖(1)上设有多个血管通道口(13)，各所述血管通道(212)的两端分别对应两个所述血管通道口(13)，各所述血管通道口(13)用于通过外接通液管路；

和/或，所述顶盖(1)上设有多个培液通道口(14)，各所述培液通道(212)的两端分别对应两个所述培液通道口(14)，各所述培液通道口(14)用于通过外接通液管路；

和/或，所述细胞培养孔(211)的孔腔为U形腔，所述细胞培养孔(211)的孔深为8～12mm；

和/或，所述血管通道(212)和培液通道(213)横截面为正方的圆角矩形，所述血管通道(212)的横截面边长为4～8mm；所述培液通道(213)的横截面边长为4～8mm。

4.根据权利要求3所述的四通道器官芯片，其特征在于，所述细胞培养孔(211)的孔底与所述血管通道(212)和所述培液通道(213)的通道底在同一个水平面。

5.根据权利要求2所述的四通道器官芯片，其特征在于，所述多孔间隔膜(214)的材料为能形成多孔结构的高分子聚合材料；优选的，所述多孔间隔膜(214)的材料选自聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯或聚对苯二甲酸丁二酯中的一种；

和/或，所述多孔间隔膜(214)上的孔径为0.4～5μM；

和/或，所述细胞培养孔(211)的孔底内表面设置低细胞粘附层；优选的，所述低细胞粘附层的材料为仿细胞外基质成分；更优选的，所述低细胞粘附层的材料为基质胶。

6.根据权利要求2所述的四通道器官芯片，其特征在于，所述顶盖(1)与所述基体(2)可拆卸连接；优选的，可拆卸连接方式为滑动连接、插接、螺纹连接或卡扣连接。

7.根据权利要求6所述的四通道器官芯片，其特征在于，所述顶盖(1)包括顶部和连接部，所述连接部与所述基体(2)可拆卸连接；所述顶盖(1)与所述基体(2)连接状态下形成空腔部，所述空腔部形成所述空气通道(11)。

8.根据权利要求7所述的四通道器官芯片，其特征在于，所述连接部位于所述顶盖(1)四周外缘；

和/或，所述顶盖(1)与所述基体(2)连接状态下，所述空腔部远离所述基体(2)一侧的内壁至所述细胞培养孔(211)的孔顶所在平面的垂直距离为3～8mm。

9.根据权利要求1-8任一项所述的四通道器官芯片，其特征在于，所述四通道器官芯片的材料为亲和细胞的全透明材料；优选的，所述顶盖(1)和/所述基体(2)的材料为高分子聚合材料；更优选的，所述顶盖(1)和/所述基体(2)的材料选自聚苯乙烯或聚乙烯。

10.一种四通道器官芯片系统，包括如权利要求1-9任一项所述的四通道器官芯片和驱动泵，所述驱动泵用于为空气通道(11)、血管通道(212)和培液通道(213)内的流体提供动力。

11.如权利要求1-9任一项所述的四通道器官芯片或权利要求10所述的四通道器官芯片系统在研究候选抗肿瘤药物对肺癌细胞的杀伤作用中的应用。

12.权利要求1-9任一项所述的四通道器官芯片或权利要求10所述的四通道器官芯片系统在研究药物对肺癌细胞的杀伤效果中的使用方法，包括如下步骤：

1)提供肺肿瘤微球体；优选的，所述肺肿瘤微球体由人肺癌细胞和人呼吸道上皮细胞混合培养获得；更优选的，所述肺肿瘤微球体的直径大于300μm；

2)提供内皮细胞培液；优选的，所述内皮细胞培液由人血管内皮细胞制备获得；

3)将步骤2)的内皮细胞培液注入血管通道，封闭静置培养，待血管通道内的细胞贴壁后，弃掉血管通道内的原培液，通入新鲜的步骤2)的内皮细胞培液；

4)将培液通道内灌注新鲜培液，将步骤1)的所述肺肿瘤微球体连同部分培液一起注入细胞培养孔；

5)封闭四通道器官芯片后，通过外加驱动力分别使所述空气通道、血管通道和培液通道内的流体流通，随后进行封闭培养。

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