CN111607519A - 药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板及其使用方法，芯板的正面设有上层细胞培养区、背面设有下层细胞培养区和浓度梯度发生区，上层细胞培养区内设有上层细胞培养孔，下层细胞培养区内设有下层细胞培养孔，上、下层细胞培养孔之间位置相对应并通过透液膜分隔，浓度梯度形成通道的上游端分别与第一进液口和第二进液口连通、下游端分别与对应浓度梯度级的下层细胞培养孔连通，芯板上设有液体出口，下层细胞培养孔末端与液体出口连通，芯板背面的下层细胞培养区和浓度梯度发生区通过封液膜覆盖密封。本发明能够实现体外多(两种以上)细胞共培养模型的构建，能够实现细胞的灌注培养，实现药物浓度的梯度分配以提高药物浓度筛选效率。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养器具的技术领域，特别是涉及一种药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板及其使用方法。
背景技术
癌症的治疗通常伴随着药物的使用，通常情况下，药物使用在人体前需要进行大量的细胞实验、动物模型实验才能运用于临床人体实验，该阶段耗时较长，需要耗费大量的资金资源，临床新药的开发需要经历几年甚至几十年一个漫长的过程。因此开发更为有效的体外筛选药物模型，成为缩短药物开发时间，提高药物开发的效率的关键途径。
传统的体外细胞研究模型，大多基于癌细胞的单层培养，尽管这种单层培养细胞模型能在一定程度上反映癌细胞在体内的状态，但由于单一的培养环境，缺乏疾病发展的相关协同因素，并不能完全反应体内癌症发生过程，因此在体外构建多层细胞共培养模型有利于研究往更贴合生物体实际的方向发展。
近年来，随着对于肿瘤细胞生长、增殖、分化等行为的不断研究，肿瘤细胞微环境的研究取得了飞速的发展。对于癌症的发生、发展、免疫等过程有许多机制尚不明确，在体外建立相关的环境模型，可以用于肿瘤的发生、发展、转移以及耐药机制的观察，为癌症的治疗提供新的方案和靶点。
模拟生物体内的浓度梯度的环境对于生物学细胞分析具有重要意义，而迅速发展的微流控技术使得模拟生物体内的浓度梯度成为可能，在微流控芯片上构建具有浓度梯度的发生单元具有精确、快速、稳定等优势。使得在细胞培养的过程中，获得与体内类似的具有浓度梯度的微环境。
现有的细胞培养平台多为静态培养，不能及时地为细胞生长提供新鲜的养料，也不能为细胞生长提供剪切力，而使用灌注培养方式是提高动物细胞密度的有效方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板及其使用方法，实现体外多(两种以上)细胞共培养模型的构建，能够实现细胞的灌注培养，实现药物浓度的梯度分配以提高药物浓度筛选效率。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是提供一种药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板，包括芯板，所述芯板的正面设有上层细胞培养区、背面设有下层细胞培养区和浓度梯度发生区，所述上层细胞培养区内设有若干浓度梯度级的上层细胞培养孔，所述下层细胞培养区内设有若干浓度梯度级的下层细胞培养孔，所述上层细胞培养孔与下层细胞培养孔之间位置相对应且通过透液膜分隔，所述浓度梯度发生区包括第一进液口、第二进液口和浓度梯度形成通道，所述浓度梯度形成通道的上游端分别与第一进液口和第二进液口连通、下游端分别与对应浓度梯度级的下层细胞培养孔连通，所述芯板上设有液体出口，所述下层细胞培养孔末端与液体出口连通，所述芯板背面的下层细胞培养区和浓度梯度发生区通过封液膜覆盖密封。
所述浓度梯度发生区位于芯板背面的中间位置，所述芯板背面位于浓度梯度发生区的两侧分别设有下层细胞培养区，所述芯板正面的两侧位置分别设有与下层细胞培养区位置相对应的上层细胞培养区，所述浓度梯度发生区设有两套流向相反的浓度梯度形成通道，各套浓度梯度形成通道的上游端分别设置有第一进液口和第二进液口。
所述芯板包括上芯板层、透液膜和下芯板层，所述上芯板层设有上层细胞培养区，所述下芯板层设有下层细胞培养区和浓度梯度发生区，所述上芯板层和下芯板层上下复合，所述上芯板层与下芯板层之间对应上层细胞培养区和下层细胞培养区的位置复合有透液膜，所述第一进液口和第二进液口贯穿上芯板层。
所述上层细胞培养孔在同一浓度梯度级设置为相互独立的两个以上，所述上层细胞培养孔在上层细胞培养区内整体呈矩阵式分布。
所述下层细胞培养孔在同一浓度梯度级设置为相互连通的两个以上，所述下层细胞培养孔在下层细胞培养区内整体呈矩阵式分布。
所述下层细胞培养孔的浓度梯度为N级，N≥3，所述浓度梯度形成通道整体呈树状图结构，所述浓度梯度形成通道的上游端设有三个混合通道单元、下游端设有N个混合通道单元且各阶级的混合通道单元的数量依次增加，所述上游端的三个混合通道单元中中间混合通道单元同时与第一进液口和第二进液口连通、一侧的混合通道单元与第一进液口连通、另一侧的混合通道单元与第二进液口连通，所述下游端的N个混合通道单元分别与对应的下层细胞培养孔连通，所述混合通道单元为连续的S型弯道。
所述芯板的正面设有储液槽，所述储液槽设置在上层细胞培养区外围。
所述芯板的正面设有盖板。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是提供一种上述的药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板的使用方法：包括以下步骤：
(1)制备第一细胞培养悬液，将第一细胞接种至各浓度梯度级的下层细胞培养孔中，静置培养使第一细胞贴壁；
(2)所述第一细胞贴壁后，将所述封液膜结合到芯板的背面对下层细胞培养区和浓度梯度发生区进行封液；
(3)制备第二细胞培养悬液，将第二细胞接种至各浓度梯度级的上层细胞培养孔中，静置培养使第二细胞贴壁；
(4)通过第一进液口和第二进液口分别向芯板中注入培养液对细胞进行灌注培养。
所述步骤(4)中，所述第一进液口中注入高浓度待检测药物的培养液，所述第二进液口中注入低浓度待检测药物的培养液或者不含待检测药物的培养液，通过浓度梯度形成通道对待检测药物形成浓度梯度并输送至对应浓度梯度级的下层细胞培养孔中，并通过透液膜7逐步渗透至上层细胞培养孔5中。
有益效果
第一，在本发明中，上层细胞培养孔与下层细胞培养孔之间通过透液膜分隔，通过在上、下层细胞培养孔中分别接种不同种细胞，能够保证上下层细胞之间的物理隔离，同时能够实现上下层培养液之间的交互，实现了体外多(两种以上)细胞共培养模型的构建，能够用于研究细胞间的相互作用及机制，有利于细胞研究向更贴合生物体实际的方向发展。
第二，在本发明中，下层细胞培养孔的上游通过浓度梯度形成通道与进液口连通，下游与液体出口连通，上层细胞培养孔与下层细胞培养孔之间通过透液膜可实现培养液交互，通过从进液口中注入培养液，能够对上层细胞培养孔和下层细胞培养孔中的细胞实现灌注培养，能够为细胞提供甚至连续提供新鲜的营养物质，及时排出代谢废物，同时还能够提供与体内环境更加接近的渗透压、剪切力、溶解氧环境，为细胞提供更适宜生长的微环境。
第三，在本发明中，通过双进液口与浓度梯度形成通道的结构，能够实现药物浓度的梯度分配，从而可以得到按照药物浓度分配的细胞培养梯度组合，有利于提高药物浓度筛选效率。
附图说明
图1为本发明的整体布局结构示意图。
图2为本发明芯板的分层结构示意图。
图3为本发明芯板的正面局部结构示意图。
图4为本发明芯板的背面局部结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
如图1所示的一种药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板，包括芯板1和盖板(图中未示出)，盖板设置于芯板1的正面。其尺寸大小与目前常用的96孔细胞培养板的大小一致，可与现有的细胞检测装置和设备兼容，方便地实现细胞的高内涵分析。
芯板1的正面两侧位置分别设有上层细胞培养区3。芯板1的背面设有下层细胞培养区和浓度梯度发生区4，浓度梯度发生区4位于芯板1背面的中间位置，芯板1背面位于浓度梯度发生区4的两侧分别设有下层细胞培养区，上层细胞培养区3与下层细胞培养区的上下位置相对应。
如图3所示，上层细胞培养区3内设有矩阵式排布的上层细胞培养孔5，上层细胞培养孔5沿芯板1的宽度方向设置为六个，沿芯板1的长度方向设置为三个，各上层细胞培养孔5之间相互独立，且分布位置与96孔板中孔的位置对应，兼容于多种检测仪器。。如图4所示，下层细胞培养区内设有6×3个下层细胞培养孔6，且分布位置与96孔板中孔的位置对应，兼容于多种检测仪器。且上层细胞培养孔5与下层细胞培养孔6之间位置相对应并通过透液膜7分隔。沿芯板1长度方向分布的下层细胞培养孔6之间相互连通，芯板1上设有液体出口11，下游端的下层细胞培养孔6与液体出口11连通。培养孔具有能够容纳不同细胞和容纳不同浓度药物或者生长因子的独立空间，由此可以简化细胞培养和药物筛选。
浓度梯度发生区4包括两套第一进液口8、第二进液口9和浓度梯度形成通道10，且两套浓度梯度形成通道10的流向相反。各浓度梯度形成通道10的上游端分别与第一进液口8和第二进液口9连通、下游端分别与对应浓度梯度级的下层细胞培养孔6连通。浓度梯度形成通道10在双进液口进液后，液体的流动过程中能够实现混合，并形成药物浓度梯度，进行药物浓度分配。
如图1所示，浓度梯度形成通道10整体呈树状图结构，浓度梯度形成通道10的上游端设有三个混合通道单元10-1，下游端设有6个混合通道单元10-1，各阶级的混合通道单元10-1的数量依次增加一个。上游端的三个混合通道单元10-1中中间混合通道单元10-1同时与第一进液口8和第二进液口9连通、一侧的混合通道单元10-1与第一进液口8连通、另一侧的混合通道单元10-1与第二进液口9连通，下游端的6个混合通道单元10-1分别与对应的6个下层细胞培养孔6连通。混合通道单元10-1为连续的S型弯道，S型弯道具有三到四个弯曲的U型通道，确保液体的高效混合。
芯板1的背面通过封液膜2覆盖封装，能够实现对下层细胞培养区和浓度梯度发生区4的封液效果。芯板1的正面设有储液槽12，储液槽12设置在上层细胞培养区3的外围，可以通过在储液槽12中储存一定的液体来排除掉细胞培养芯板1的边缘效应，有效防止细胞在培养过程中由于水分蒸发而造成的细胞生长受损的情况。
芯板1自上至下的结构如图2的分层示意图所示，芯板1包括上芯板层1-1、透液膜7、下芯板层1-2和封液膜2。上芯板层1-1设有上层细胞培养区3的培养孔通孔和储液槽12，下芯板层1-2设有下层细胞培养区的培养孔通孔、浓度梯度发生区4以及液体出口11。上芯板层1-1和下芯板层1-2前后复合，上芯板层1-1与下芯板层1-2之间对应上层细胞培养区3和下层细胞培养区的位置复合有透液膜7，可采用不同孔径(0.22μm、0.4μm、1μm)的塑料多孔薄膜，材质可以为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚碳酸酯(PC)，作为上层细胞培养区3和下层细胞培养区的物理分隔薄膜，同时能够实现上下层之间的培养液的交互。第一进液口8和第二进液口9贯穿上芯板层1-1，使得能够从芯板1的正面注入培养液。其中上芯板层1-1、透液膜7和下芯板层1-2可在实验前进行组装，针对封液膜2，其由高弹力粘性膜组成，可以与下芯板层1-2形成紧密贴合状态，可以有效防止培养基外漏。通过将上述4层结构通过粘胶复合在一起，就完成了芯板1的封装。
下面提供上述的药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板的使用方法：包括以下步骤：
(1)制备第一细胞培养悬液，将第一细胞接种至各浓度梯度级的下层细胞培养孔6中，静置培养使第一细胞贴壁；
(2)第一细胞贴壁后，将所述封液膜2结合到芯板1的背面对下层细胞培养区和浓度梯度发生区4进行封液；
(3)制备第二细胞培养悬液，将第二细胞接种至各浓度梯度级的上层细胞培养孔5中，静置培养使第二细胞贴壁；
(4)通过第一进液口8和第二进液口9分别向芯板1中注入培养液对细胞进行灌注培养。
步骤(4)中，通过第一进液口8中注入高浓度待检测药物的培养液，通过第二进液口9中注入低浓度待检测药物的培养液或者不含待检测药物的培养液，能够通过浓度梯度形成通道10对待检测药物形成浓度梯度并输送至对应浓度梯度级的下层细胞培养孔6中，并通过透液膜7逐步渗透至上层细胞培养孔5中。
多层细胞共培养实施例：
以肝脏内所存在的两种细胞：肝细胞(HepaG2)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，作为本实施例的实验细胞。
将传代至第三代或者第四代的HUVEC细胞用胰蛋白酶从培养瓶中消化下来，离心，加入新鲜培养基制成细胞悬液；将芯板1倒置，使得芯板1的背面朝上，如图4所示，使用移液枪，将HUVEC细胞通过下层细胞培养孔6接种在透液膜7底部，静置四小时，使得HUVEC细胞贴壁；贴壁后，使用粘性封液膜2对芯板1底部进行覆盖封装，此时应注意，培养孔中应尽可能的保证少量液体，以免造成封装失败；将封装好的芯板1正置，如图3所示，进行第二种HepaG2细胞接种，将传至第三代或者第四代生长状态良好的肝癌细胞(HepaG2)用胰蛋白酶消化离心，制备成细胞悬液，用移液枪吸取一定量的液体，通过上层细胞培养孔5接种到透液膜7上；静置等待细胞在透液膜7上进行贴壁；贴壁后的细胞可以用于灌注培养，细胞活性测定，以及药物浓度梯度筛选。
不同浓度药物筛选案例：
以常见治疗癌症药物槲皮素为例，采用试剂槲皮素(Sigma公司)进行细胞抑制率实验。
按照上述多层细胞共培养的实施例，在芯板1的上、下层细胞培养区分别接种一定数量的HepaG2与HUVEC；配制最高槲皮素浓度160μmol/L细胞完全培养液，与最低槲皮素浓度0mol/L的细胞完全培养液；通过芯板1上的第一进液口8和第二进液口9分别注入上述两种溶液，以30-120μL/h的速度进行灌流，利用浓度梯度形成通道10进行药液混合和浓度分配；在12h、24h进行细胞存活率测定。
Claims (10)
1.一种药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板，包括芯板(1)，其特征在于：所述芯板(1)的正面设有上层细胞培养区(3)、背面设有下层细胞培养区和浓度梯度发生区(4)，所述上层细胞培养区(3)内设有若干浓度梯度级的上层细胞培养孔(5)，所述下层细胞培养区内设有若干浓度梯度级的下层细胞培养孔(6)，所述上层细胞培养孔(5)与下层细胞培养孔(6)之间位置相对应且通过透液膜(7)分隔，所述浓度梯度发生区(4)包括第一进液口(8)、第二进液口(9)和浓度梯度形成通道(10)，所述浓度梯度形成通道(10)的上游端分别与第一进液口(8)和第二进液口(9)连通、下游端分别与对应浓度梯度级的下层细胞培养孔(6)连通，所述芯板(1)上设有液体出口(11)，所述下层细胞培养孔(6)末端与液体出口(11)连通，所述芯板(1)背面的下层细胞培养区和浓度梯度发生区(4)通过封液膜(2)覆盖密封。
2.根据权利要求1所述的一种药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板，其特征在于：所述浓度梯度发生区(4)位于芯板(1)背面的中间位置，所述芯板(1)背面位于浓度梯度发生区(4)的两侧分别设有下层细胞培养区，所述芯板(1)正面的两侧位置分别设有与下层细胞培养区位置相对应的上层细胞培养区(3)，所述浓度梯度发生区(4)设有两套流向相反的浓度梯度形成通道(10)，各套浓度梯度形成通道(10)的上游端分别设置有第一进液口(8)和第二进液口(9)。
3.根据权利要求1或2所述的一种药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板，其特征在于：所述芯板(1)包括上芯板层(1-1)、透液膜(7)和下芯板层(1-2)，所述上芯板层(1-1)设有上层细胞培养区(3)，所述下芯板层(1-2)设有下层细胞培养区和浓度梯度发生区(4)，所述上芯板层(1-1)和下芯板层(1-2)前后复合，所述上芯板层(1-1)与下芯板层(1-2)之间对应上层细胞培养区(3)和下层细胞培养区的位置复合有透液膜(7)，所述第一进液口(8)和第二进液口(9)贯穿上芯板层(1-1)。
4.根据权利要求1或2所述的一种药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板，其特征在于：所述上层细胞培养孔(5)在同一浓度梯度级设置为相互独立的两个以上，所述上层细胞培养孔(5)在上层细胞培养区(3)内整体呈矩阵式分布。
5.根据权利要求1或2所述的一种药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板，其特征在于：所述下层细胞培养孔(6)在同一浓度梯度级设置为相互连通的两个以上，所述下层细胞培养孔(6)在下层细胞培养区内整体呈矩阵式分布。
6.根据权利要求1或2所述的一种药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板，其特征在于：所述下层细胞培养孔(6)的浓度梯度为N级，N≥3，所述浓度梯度形成通道(10)整体呈树状图结构，所述浓度梯度形成通道(10)的上游端设有三个混合通道单元(10-1)、下游端设有N个混合通道单元(10-1)且各阶级的混合通道单元(10-1)的数量依次增加，所述上游端的三个混合通道单元(10-1)中中间混合通道单元(10-1)同时与第一进液口(8)和第二进液口(9)连通、一侧的混合通道单元(10-1)与第一进液口(8)连通、另一侧的混合通道单元(10-1)与第二进液口(9)连通，所述下游端的N个混合通道单元(10-1)分别与对应的下层细胞培养孔(6)连通，所述混合通道单元(10-1)为连续的S型弯道。
7.根据权利要求1或2所述的一种药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板，其特征在于：所述芯板(1)的正面设有储液槽(12)，所述储液槽(12)设置在上层细胞培养区(3)外围。
8.根据权利要求1或2所述的一种药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板，其特征在于：所述芯板(1)的正面设有盖板。
9.一种权利要求1所述的药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板的使用方法：包括以下步骤：
(1)制备第一细胞培养悬液，将第一细胞接种至各浓度梯度级的下层细胞培养孔(6)中，静置培养使第一细胞贴壁；
(2)所述第一细胞贴壁后，将所述封液膜(2)结合到芯板(1)的背面对下层细胞培养区和浓度梯度发生区(4)进行封液；
(3)制备第二细胞培养悬液，将第二细胞接种至各浓度梯度级的上层细胞培养孔(5)中，静置培养使第二细胞贴壁；
(4)通过第一进液口(8)和第二进液口(9)分别向芯板(1)中注入培养液对细胞进行灌注培养。
10.根据权利要求9所述的一种药物浓度筛选多细胞共培养的培养孔板的使用方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述第一进液口(8)中注入高浓度待检测药物的培养液，所述第二进液口(9)中注入低浓度待检测药物的培养液或者不含待检测药物的培养液，通过浓度梯度形成通道(10)对待检测药物形成浓度梯度并输送至对应浓度梯度级的下层细胞培养孔(6)中，并通过透液膜(7)逐步渗透至上层细胞培养孔(5)中。
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