CN106581761A - 一种人工肝脏组织及其制作方法 - Google Patents
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Abstract
一种人工肝脏组织及其制作方法，该人工肝脏组织包括自下而上依次层叠的下方芯片、第一微孔膜、中间芯片、第二微孔膜和上方芯片，在下方芯片、中间芯片和上方芯片上分别形成下、中、上三层腔室，三层腔室中分别灌注含生长因子的培养液、含肝实质细胞的细胞外基质和含内皮细胞的悬液，相邻腔室之间通过微孔膜隔离，微孔膜能够阻隔细胞外基质的流动而不影响细胞的迁移运动，通过上、下腔室的出、入口供液并培养，在生长因子的诱导下内皮细胞穿过中间腔室的细胞外基质并形成管腔，形成含毛细血管的人工肝脏组织。该人工肝脏组织能很好地仿生人体的肝脏组织，模拟肝脏内部毛细血管的传质、选择透过性、毒性反应等功能。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程领域，特别是涉及一种人工肝脏组织及其制作方法。
背景技术
目前，由于缺乏足够的人源捐献者，而动物来源的肝脏组织与人源的肝脏有着较大差别，为了满足人类肝脏病理研究和药物检测筛选的来源需求，使用人源细胞构建体外肝脏模型已经成为一种广泛认可的方式。
微流控芯片由于其具有体积小、消耗少、集成度高、可控性好并且可以构建复杂结构等优势，成为构建体外肝脏模型的优选方案之一。常用的微流控芯片材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，其具有良好的生物相容性，理化、生化稳定性，透光性和透氧性，使其便于构建体外肝模型，也有利于后期对肝模型的观察。
现有的体外肝模型大多都仅使用肝实质细胞来构建，少有的多种细胞共培养模型也并没有还原肝脏内部的毛细血管结构和功能。由于肝脏中的毛细血管在肝脏中包含物质传递、选择透过性、大分子毒物筛选和毒性反应等多种功能，对于缺乏毛细血管的模型，无论是用于肝脏的病理研究还是用于药物检测筛选，都存在不准确的问题。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术的不足，提供一种人工肝脏组织及其制作方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种人工肝脏组织，包括微流控芯片，所述微流控芯片设置有五层结构，包括自下而上依次层叠的下方芯片、第一微孔膜、中间芯片、第二微孔膜和上方芯片，在所述下方芯片、所述中间芯片和所述上方芯片上分别形成下、中、上三层腔室，自下而上的三层腔室中分布灌注含生长因子的培养液、含肝实质细胞的细胞外基质和含内皮细胞的悬液，相邻腔室之间通过所述第一微孔膜与所述第二微孔膜隔离，所述微孔膜能够阻隔细胞外基质的流动而不影响细胞的迁移运动，通过上、下腔室的出、入口供液并培养，在生长因子的诱导下内皮细胞穿过中间腔室的细胞外基质并形成管腔，形成含毛细血管的人工肝脏组织。
进一步地：
所述下方芯片、所述中间芯片和所述上方芯片为PDMS芯片，通过氧等离子键合的方式组装，所述微孔膜通过其与所述PDMS芯片的形变夹紧在所述PDMS芯片之间。
所述微孔膜为胶原蛋白制作成厚度在0.1±0.05mm范围的薄膜，具有孔径在0.03±0.01mm范围、孔轴心距在0.06±0.02mm范围的微孔阵列。
在至少一腔室的入口集成测试模块，在至少一腔室的出口集成检测模块，用于病理研究和药物检测，优选地，所述测试模块为含病毒、毒素或药物的培养液的芯片，所述检测模块为肝脏活性检测模块、代谢完整性检测模块或功能性产物的表达量检测模块。
所述下方芯片、所述中间芯片和所述上方芯片的长×宽×高为25mm×25mm×1mm；下腔室的长×宽×高为5mm×5mm×0.2mm，腔室出入口的孔心距为18mm；中间腔室的长×宽×高为5mm×5mm×1mm，腔室出入口的孔心距为15mm，所述中间芯片在所述下方芯片的腔室出入口对应部位设有通孔；上腔室的长×宽×高为5mm×5mm×0.2mm，腔室出入口的孔心距为12mm，所述上芯片在所述中间芯片、所述下方芯片的腔室出入口对应部位设有通孔；各腔室出入口的孔径为1.5mm，各腔室出入口和腔室之间通过0.4mm宽且与腔室等高的通道连通；优选地，各腔室中的所有竖向边都倒出半径为1mm的圆角，以避免形成湍流和气泡；所述微孔膜的长×宽×厚为10mm×10mm×0.1mm。
优选采用以下配置中的至少一种：所述肝实质细胞为人的原代肝实质细胞或人的肝实质细胞的细胞系HepG2；所述细胞外基质为凝胶状的鼠尾I型胶原蛋白、或纤维蛋白、猪皮I型胶原蛋白；所述生长因子为VEGF、EGF和FGF中任一种或多种的组合，所述基础培养液为DMEM+RPMI的组合或ECM+DMEM的组合，优选各50％；所述内皮细胞为HUVECs或HMEC-1。
一种制作所述的人工肝脏组织的制作方法，包括：制作所述微流控芯片的5层单层结构；使用氧等离子溅射处理所述下方芯片的下表面和所述中间芯片的上表面，在所述中间芯片的下表面上垫上所述第一微孔膜使其覆盖腔室而不覆盖出入口，然后通过出入口对齐所述下方芯片和所述中间芯片并使所述下方芯片的下表面和所述中间芯片的上表面扣合，将所述第一微孔膜夹紧在其中；使用相同的操作扣合所述中间芯片的上表面和所述上方芯片的下表面，并将所述第二微孔膜夹紧在其中；此后将扣合好的微流控芯片放在烤箱中烘烤使其粘合紧密。
进一步地：
所述微孔膜是使用胶原通过静电纺丝的方法制作成生物相容性的薄膜，再使用激光打孔的方法在膜上加工出微孔阵列。
从所述中间腔室的入口向所述中间腔室灌入均匀混有肝实质细胞的细胞外基质，直到所述中间腔室的出口的孔道中灌满，其后从所述下腔室的入口向下腔室注入含有生长因子的培养液，从所述上腔室的入口向所述上腔室中注入内皮细胞悬液，直到所述上腔室的出口的孔道中灌满，静置一段时间使内皮细胞沉积并贴壁生长在微孔膜上，此后从所述上腔室的入口向所述上腔室连续注入培养液；在生长因子的驱动下，内皮细胞血管化并竖向迁移穿透所述中间腔室的细胞外基质层，此后停止生长因子的供给改为连续注入培养液，最终在所述中间腔室形成含有毛细血管的人工肝脏组织。
一种使用所述的人工肝脏组织的方法，包括：向腔室的入口注入病毒、毒素或者待检测药物，注入物通过成形的血管向人工肝脏组织中传递和扩散，并产生相应的反应；通过腔室的出口处的检测模块进行检测，优选包括肝脏活性检测、代谢完整性检测和功能性产物的表达量检测。
本发明的有益效果：
本发明提供一种含有定向毛细血管的人工肝脏组织，该组织由于包含功能性的血管组织，可以更好的仿生人体的肝脏组织，模拟肝脏内部毛细血管的传质、选择透过性、毒性反应等功能，能够使其用于肝脏的病理研究和药物毒性测试筛选时更加准确。同时，由于肝组织在微流控芯片上构建，可以很容易地集成其他处理和检测模块，使得肝组织成形后，可以方便地实现后期的研究和检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明的人工肝脏组织构建于微流控芯片上，可以方便地与环境控制模块和后期检测模块集成，便于此人工肝脏组织的多方面应用；使用的微孔膜可通过静电纺丝结合激光打孔制作，通过静电纺丝过程的材料选择实现良好的生物相容性和生化、理化稳定性，不会对组织产生损伤且有利于细胞贴附和迁移以加快肝组织中的血管形成；构建出的人工肝脏组织具备功能性毛细血管，能够更好的仿生人体的肝脏组织，模拟肝脏内部毛细血管的传质、选择透过性、毒性反应等功能，以使其在病理研究和药物筛选检测等领域的应用得到更加准确的结果。
附图说明
图1为本发明实施例人工肝脏组织的芯片各层结构示意图。
图2为本发明实施例的芯片组装完成的结构示意图。
图3为本发明实施例的三层相互隔离腔室的剖面图。
图4为本发明实施例最终构建出的含毛细血管的人工肝脏组织的剖面示意图。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
参阅图1至图4，在一种实施例中，一种人工肝脏组织，包括微流控芯片，微流控芯片有五层结构，自下而上依次为灌注生长因子的PDMS芯片1、微孔膜2、灌注肝实质细胞的PDMS芯片3、微孔膜4、灌注内皮细胞的PDMS芯片5，通过氧等离子键合的工艺完成PDMS芯片的粘合组装，微孔膜则通过其与PDMS的形变夹紧在PDMS芯片之间，由此自下而上形成三层通过微孔膜隔离的腔室；从下往上的三层腔室中分布注入含生长因子的培养液、含肝实质细胞的细胞外基质和内皮细胞悬液，通过上、下腔室的出、入口供液并培养，在生长因子的诱导下内皮细胞穿过中间腔室的细胞外基质并形成管腔，形成含毛细血管的人工肝脏组织。在出入口集成测试模块，在出口集成检测模块，即可实现该模型在病理研究和药物检测等方面的具体应用。
在优选的实施例中，可使用PDMS芯片、静电纺丝结合激光打孔制作的微孔膜来构建微流控芯片，通过在芯片上通过生长因子诱导内皮细胞穿透微孔膜并在含肝实质细胞的细胞外基质中萌发血管，从而构建出含有定向毛细血管的人工肝脏组织。
在一种具体实施例中，图1所示为芯片的5层结构，其中，PDMS芯片1、3、5的外部尺寸均为25mm×25mm×1mm长×宽×高，腔室的所有竖边均倒有半径为1mm的圆角，出入口孔径均为1.5mm，且所有上方芯片在其下芯片的出入口对应处都留有通孔以避免封闭下方芯片的出入口，通道的宽度均为0.4mm，含腔室的PDMS芯片均使用标准软光刻的方法制作，使用打孔器进行打孔；芯片1上的腔室尺寸为5mm×5mm×0.2mm长×宽×高，出入口孔间距为18mm；芯片3上的腔室尺寸为5mm×5mm×1mm长×宽×高，出入口孔间距为15mm；芯片5上的腔室尺寸为5mm×5mm×0.2mm长×宽×高，出入口孔间距为15mm；微孔膜2和微孔膜4的外部尺寸为10mm×10mm×0.1mm长×宽×厚，使用鼠尾I型胶原蛋白通过静电纺丝制作，而后使用激光打孔加工出孔径为0.03mm、孔轴心距为0.06mm的微孔阵列。组装的方式是：在制作出芯片的5层单层结构后，使用氧等离子溅射处理芯片1的下表面和芯片3的上表面，3～5min后取出，在芯片3的下表面上垫上微孔膜2使其覆盖腔室而不覆盖出入口孔，然后在显微镜下通过出入口孔对齐芯片1和3并使芯片1的下表面和芯片3的上表面扣合，将微孔膜2夹紧在其中；使用相同的操作扣合芯片3的上表面和芯片5的下表面，并将微孔膜4夹紧在其中；此后将扣合好的微流控芯片放在80℃烤箱中烘烤0.5小时左右使粘合更加紧密，即可完成芯片的组装。
所述微孔膜优选使用的材料为鼠尾I型胶原蛋白，通过静电纺丝的方法制作成0.1mm的薄膜，裁减成10mm×10mm长×宽后使用激光打孔的方法在其上加工出孔径为0.03mm、孔轴心距为0.06mm的微孔阵列，以使微孔膜能够阻隔细胞外基质的流动而不影响细胞的迁移运动。
所述微孔膜使用静电纺丝和激光打孔的工艺方法制作，优选的流程为：先使用胶原通过静电纺丝的方法制作膜厚约为0.1mm的具备生物相容性的薄膜，切割出10mm×10mm的方形薄片，之后使用激光打孔的方法在膜上加工出密集的、孔径约0.03mm的通孔，此膜厚可以保证微孔膜不会对内皮细胞的迁移产生过大影响并提供足够的强度，此孔径可以保证微孔膜能对中间通道的细胞外基质形成阻隔而不会阻隔内皮细胞的跨膜运动。
图2-图3所示分别为本发明实施例的人工肝脏组织构建过程使用的芯片完成组装后的整体结构示意图和腔室剖面示意图，组装完成后进行高温灭菌，此后使用微流控芯片构建含毛细血管的人工肝脏组织的具体操作步骤包括：从中间腔室的入口6向中间腔室13灌入均匀混有肝实质细胞的细胞外基质，直到中间腔室出口9的孔道中灌满后停止灌注，其后使用微量注射泵或者气泵连续从下腔室入口8向下腔室注入含有生长因子的培养液并在下腔室出口11收集废液，从上腔室入口7向上腔室14中注入内皮细胞悬液，直到上腔室出口10的孔道中灌满后停止灌注，静置12小时使内皮细胞沉积并贴壁生长在微孔膜4上，此后开始使用微量注射泵或者气泵从上腔室入口7向上腔室14连续注入培养液并在上腔室出口10处收集废液；之后每隔6小时观察一次，在3～6天之间，在生长因子的驱动下，内皮细胞血管化并竖向迁移穿透中间腔室13的细胞外基质层，此时停止生长因子的供给改为连续注入培养液，则在中间腔室形成了含有毛细血管的人工肝脏组织。
优选的肝实质细胞为人的原代肝实质细胞，优选的细胞外基质为凝胶状的鼠尾I型胶原蛋白；优选的生长因子为VEGF、EGF和FGF的组合，所述生长因子的成分可以包括但不限于血管内皮生长因子VEGF、成纤维细胞生长因子FGF、表皮细胞生长因子EGF等可以促血管生成的生长因子；优选的基础培养液使用的是DMEM+RPMI各50％的组合；优选的内皮细胞为HUVECs。肝细胞还可以是人的肝实质细胞的细胞系HepG2等等，细胞外基质还可以是纤维蛋白、猪皮I型胶原蛋白等多种胶原蛋白，基础培养液还可以是ECM+DMEM等多种培养基，内皮细胞还可以是HMEC-1等。
图4所示为构建完成的含毛细血管的人工肝脏组织的剖面结构示意图，内皮细胞15在上腔室14中贴附在微孔膜4上，在生长因子的诱导下迁移并绕过微孔膜4的无孔区19、穿过微孔20，进入到中间腔室13的均匀混有肝实质细胞16的细胞外基质18中，并贴着微孔膜4再次形成内皮层，生长因子持续诱导后，内皮细胞在基质18中聚团迁移挤开肝实质细胞16，并自组织形成管道，即为含毛细血管17的人工肝脏组织。
该肝组织成型后，可以在入口前集成病毒、毒素或者药物芯片模块，出口后集成检测模块，通过入口前的芯片模块向入口7、8中注入病毒、毒素或者待检测药物，并通过出口10、11处的检测模块进行检测，即可实现此人工肝脏组织在病理研究和药物检测等方面的具体应用。
所述的入口测试模块可以包括但不限于含病毒、毒物、药物等的培养液的芯片，注入上、下腔室后通过成形的血管向肝组织中传递和扩散，并产生相应的反应。所述的出口测试模块可以包括但不限于肝脏活性检测模块、代谢完整性检测模块和功能性产物的表达量检测模块等。
综上，本发明在微流控芯片上通过生长因子诱导内皮细胞穿透微孔膜并在含肝实质细胞的细胞外基质中萌发血管，产生含有定向毛细血管的人工肝脏组织，该组织由于包含功能性的血管组织，可以更好的仿生人体的肝脏组织，模拟肝脏内部毛细血管的传质、选择透过性、毒性反应等功能，能够使其在肝脏的病理研究和药物毒性测试及筛选等方面的应用更加准确。同时，由于人工肝脏组织在微流控芯片上构建，可以很容易地集成其他测试模块和检测模块，使得组织成形后，可以方便地实现后期的相关研究和检测。
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种人工肝脏组织，其特征在于,包括微流控芯片，所述微流控芯片设置有五层结构，包括自下而上依次层叠的下方芯片、第一微孔膜、中间芯片、第二微孔膜和上方芯片，在所述下方芯片、所述中间芯片和所述上方芯片上分别形成下、中、上三层腔室，自下而上的三层腔室中分别灌注含生长因子的培养液、含肝实质细胞的细胞外基质和含内皮细胞的悬液，相邻腔室之间通过所述第一微孔膜与所述第二微孔膜隔离，所述微孔膜能够阻隔细胞外基质的流动而不影响细胞的迁移运动，通过上、下腔室的出、入口供液并培养，在生长因子的诱导下内皮细胞穿过中间腔室的细胞外基质并形成管腔，形成含毛细血管的人工肝脏组织。
2.如权利要求1所述的人工肝脏组织，其特征在于，所述下方芯片、所述中间芯片和所述上方芯片为PDMS芯片，通过氧等离子键合的方式组装，所述微孔膜通过其与所述PDMS芯片的形变夹紧在所述PDMS芯片之间。
3.如权利要求1所述的人工肝脏组织，其特征在于,所述微孔膜为胶原蛋白制作成厚度在0.1±0.05mm范围的薄膜，具有孔径在0.03±0.01mm范围、孔轴心距在0.06±0.02mm范围的微孔阵列。
4.如权利要求1所述的人工肝脏组织，其特征在于,在至少一腔室的入口集成测试模块，在至少一腔室的出口集成检测模块，用于病理研究和药物检测，优选地，所述测试模块为含病毒、毒素或药物的培养液的芯片，所述检测模块为肝脏活性检测模块、代谢完整性检测模块或功能性产物的表达量检测模块。
5.如权利要求1至4任一项所述的人工肝脏组织，其特征在于,所述下方芯片、所述中间芯片和所述上方芯片的长×宽×高为25mm×25mm×1mm；下腔室的长×宽×高为5mm×5mm×0.2mm，腔室出入口的孔心距为18mm；中间腔室的长×宽×高为5mm×5mm×1mm，腔室出入口的孔心距为15mm，所述中间芯片在所述下方芯片的腔室出入口对应部位设有通孔；上腔室的长×宽×高为5mm×5mm×0.2mm，腔室出入口的孔心距为12mm，所述上芯片在所述中间芯片、所述下方芯片的腔室出入口对应部位设有通孔；各腔室出入口的孔径为1.5mm，各腔室出入口和腔室之间通过0.4mm宽且与腔室等高的通道连通；优选地，各腔室中的所有竖向边都倒出半径为1mm的圆角，以避免形成湍流和气泡；所述微孔膜的长×宽×厚为10mm×10mm×0.1mm。
6.如权利要求1至5任一项所述的人工肝脏组织，其特征在于,采用以下配置中的至少一种：所述肝实质细胞为人的原代肝实质细胞或人的肝实质细胞的细胞系HepG2；所述细胞外基质为凝胶状的鼠尾I型胶原蛋白、或纤维蛋白、猪皮I型胶原蛋白；所述生长因子为VEGF、EGF和FGF中任一种或多种的组合，所述基础培养液为DMEM+RPMI的组合或ECM+DMEM的组合，优选各50％；所述内皮细胞为HUVECs或HMEC-1。
7.一种制作如权利要求1至6任一项所述的人工肝脏组织的制作方法，其特征在于,包括：制作所述微流控芯片的5层单层结构；使用氧等离子溅射处理所述下方芯片的下表面和所述中间芯片的上表面，在所述中间芯片的下表面上垫上所述第一微孔膜使其覆盖腔室而不覆盖出入口，然后通过出入口对齐所述下方芯片和所述中间芯片并使所述下方芯片的下表面和所述中间芯片的上表面扣合，将所述第一微孔膜夹紧在其中；使用相同的操作扣合所述中间芯片的上表面和所述上方芯片的下表面，并将所述第二微孔膜夹紧在其中；此后将扣合好的微流控芯片放在烤箱中烘烤使其粘合紧密。
8.如权利要求7所述的制作方法，其特征在于,所述微孔膜是使用胶原通过静电纺丝的方法制作成生物相容性的薄膜，再使用激光打孔的方法在膜上加工出微孔阵列。
9.如权利要求7或8所述的制作方法，其特征在于,从所述中间腔室的入口向所述中间腔室灌入均匀混有肝实质细胞的细胞外基质，直到所述中间腔室的出口的孔道中灌满，其后从所述下腔室的入口向下腔室注入含有生长因子的培养液，从所述上腔室的入口向所述上腔室中注入内皮细胞悬液，直到所述上腔室的出口的孔道中灌满，静置一段时间使内皮细胞沉积并贴壁生长在微孔膜上，此后从所述上腔室的入口向所述上腔室连续注入培养液；在生长因子的驱动下，内皮细胞血管化并竖向迁移穿透所述中间腔室的细胞外基质层，此后停止生长因子的供给改为连续注入培养液，最终在所述中间腔室形成含有毛细血管的人工肝脏组织。
10.一种使用如权利要求1至6任一项所述的人工肝脏组织的方法，其特征在于,包括：向腔室的入口注入病毒、毒素或者待检测药物，注入物通过成形的血管向人工肝脏组织中传递和扩散，并产生相应的反应；通过腔室的出口处的检测模块进行检测，优选包括肝脏活性检测、代谢完整性检测和功能性产物的表达量检测。
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