CN105925480B - 用于血脑屏障药物通透性高通量筛选的微流控芯片及制备方法 - Google Patents

用于血脑屏障药物通透性高通量筛选的微流控芯片及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于药物血脑屏障通透性和高通量筛选研究的微流控芯片,该芯片以弹性聚二甲基硅氧烷为材料，采用塑模法制备。芯片为三层结构，含9组并行的微反应单元阵列，各微反应单元由上下两层细胞培养腔层和微孔膜层组成，并含有芯片微电极和液体流通管道。通过向细胞培养腔中连续注入培养液，可模拟血管内的流体状态，更接近人体真实内环境。通过芯片微电极对电阻抗信号进行采集，可实时监测芯片内细胞层的生理活性情况。透过微孔膜和细胞层的药物分子沉积在芯片下方的液体流通管道中，通过管道洗脱，可以收集透膜药物以进行后续分析。本发明较现有方法能更真实地反应出药物的血脑屏障通透性，可以一次针对9种药物进行高通量筛选。

Description

用于血脑屏障药物通透性高通量筛选的微流控芯片及制备 方法
技术领域
本发明属于生物医学检测分析领域，具体涉及一种用于血脑屏障药物通透性高通量筛选的微流控芯片。
背景技术
血脑屏障(Blood Brain Barrier，BBB)是介于血液和脑组织之间的一层对物质的通透具有选择性的屏障，由内皮细胞、连续的基底膜和星形胶质细胞脚板组成的断续膜构成。通常情况下，血脑屏障对物质多表现为阻碍作用，仅允许气体分子及相对分子质量较小的脂溶性分子通过，有利于保护脑组织免受侵害及稳定神经系统的内环境。不过，这个特性也使得95％以上的药物无法穿透血脑进入中枢神经系统，难以发挥药物作用，这极大降低了针对中枢神经系统疾病的药物治疗效果。因此，研究如何使药物穿透血脑进入中枢神经系统从而达到治疗目的，是治疗中枢神经系统疾病的关键。为了排除体内多重复杂因素的影响，目前常通过体外模型对血脑屏障的工作机制和药物的通透性进行研究。
近年来，中枢神经系统疾病的发病率不断增加，因此药物的血脑屏障通透性检测已经成为相关药物研发过程中的关键环节。当前已有的药物通透性测定方法主要有体内评价和体外评价两类，均存在很多缺陷(1)体内评价，即在活体内对透过血脑屏障的药物分子进行分析，单由于透过血脑屏障的药物浓度较低，难以进行精准的定量分析，同时在活体内进行检测的操作极为复杂。(2)体外评价，即利用与血脑屏障结构有共同特性的细胞模型作为研究对象，但现有的模型往往难以模拟活体内的真实内环境(如血管腔内的流体环境)，同时难以对模型的生理活性情况进行实现监测。对于体外活体器官或组织的模拟分析技术，未来的发展主要集中在分析模型及设备的模拟真实化和检测高通量上，即通过内环境模拟，使建立的模型或设备更接近人体内的真实环境，同时能一次针对大量靶标药物进行高通量筛选研究。
微流控技术是近年来发展迅速的交叉学科技术，通过在芯片内构建微型反应单元、操控单元和检测单元，可以实现多种精确复杂的应用。聚二甲基硅氧烷具有良好的化学特性和生物相容性，因此可以作为构建模拟人体内环境的材料。目前，利用微流控芯片和电阻抗信号采集的方法来模拟人血脑屏障的真实生理环境，特别是具有三维功能性结构的动态血脑屏障以及具有高通量药物通透性筛选能力的研究尚处于空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于血脑屏障药物通透性高通量筛选的微流控芯片，本发明采用的技术方案为：
一种用于血脑屏障药物通透性高通量筛选的微流控芯片,该微流控芯片包括多个相互独立的微反应单元2，每个微反应单元包括液体流通管道、微孔膜层6、上层细胞培养腔3、下层细胞培养腔4和芯片微电极1。
微孔膜层6位于上层细胞培养腔3和下层细胞培养腔4之间，通过氧离子体法进行不可逆的封接键合，组成三层芯片结构，微孔膜层6上表面与血管内皮细胞层7接触，下表面与星状胶质细胞层8接触。微孔膜层的孔径为4.0μm，截面积为1.0mm2。液体流通管道为光滑平直的凹槽，宽度均为300μm，深度为40μm，位于细胞培养腔的底部。通过位于上层细胞培养腔底部的液体流通管道向细胞培养腔内连续流动注入培养液，可以模拟人血管内血流供应的真实情况，实现动态培养。上、下两层细胞培养腔均与液体流通管道和芯片微电极1连接，上层细胞培养腔内注入培养血管内皮细胞，下层细胞培养腔内注入培养星状胶质细胞。芯片微电极1位于上层细胞培养腔3的顶部以及下层细胞培养腔4的底部，通过对微电极电阻抗变化值的实时采集和分析，可以实时监测微流控芯片内微孔膜细胞层的生长活性情况。待测药物溶液经由液体流通管道注入上层细胞培养腔，作用于微孔膜细胞层后，透膜药物溶液经由位于下层细胞培养腔的液体流通管道流出芯片外进行收集。
所述的微流控芯片材料为光学透性良好且具有弹性的聚二甲基硅氧烷聚合物(PDMS)。所述的微流控芯片可同时具有9个并行的微反应单元，能够同时针对9种药物的血脑屏障通透性进行高通量筛选，每一个微反应单元的容积为1.0μl。所述的细胞培养腔、微孔膜和芯片微电极的数量均可根据待分析药物的检测通量需要而确定，可根据实际需求增加或减少数量。所述的微流控芯片通过芯片微电极测量电阻抗的变化，从而对每一个微反应单元内位于微孔膜上下表面的血管内皮细胞层和星状胶质细胞层(即芯片血脑屏障模型)的生理活性情况进行实时监测。
本发明的微流控芯片可显著降低试剂及细胞的消耗量；芯片具有成本低、通量高和精确度高的特点，可用于血脑屏障的体外模拟及透膜药物的分析研究；芯片具有真实模拟内环境、电阻抗实时监测和高通量的药物通透性筛选的优势，可以满足现代血脑屏障医学研究的需要。
附图说明
图1为含有9组微反应单元的微流控芯片结构示意图。
图2为一个微反应单元的结构示意图。
图3为复合层的结构示意图。
图中：1芯片微电极；2微反应单元；3上层细胞培养腔；4下层细胞培养腔；5复合层；6微孔膜层；7血管内皮细胞层；8星状胶质细胞层。
具体实施方式
一种用于血脑屏障药物通透性高通量筛选的微流控芯片,该微流控芯片包括多个相互独立的微反应单元2，每个微反应单元包括液体流通管道、微孔膜层6、上层细胞培养腔3、下层细胞培养腔4和芯片微电极1。
微孔膜层6位于上层细胞培养腔3和下层细胞培养腔4之间，微孔膜层6上表面与血管内皮细胞层7接触，下表面与星状胶质细胞层8接触。液体流通管道位于细胞培养腔的底部。通过位于上层细胞培养腔3底部的液体流通管道向细胞培养腔内连续流动注入培养液。上、下两层细胞培养腔3、4均与液体流通管道和芯片微电极1连接，上层细胞培养腔3内注入培养血管内皮细胞，下层细胞培养腔4内注入培养星状胶质细胞。芯片微电极1位于上层细胞培养腔3的顶部以及下层细胞培养腔4的底部。待测药物溶液经由液体流通管道注入上层细胞培养腔3，作用于微孔膜细胞层后，透膜药物溶液经由位于下层细胞培养腔4的液体流通管道流出芯片外进行收集。
图1所示为用于药物血脑屏障通透性高通量筛选的微流控芯片结构图，包含9组微反应单元和18条芯片微电极；图2所示为芯片内一个微反应单元的放大结构图，为三层结构，包括上下两层细胞培养腔层和微孔膜层；图3所示为0.4μm孔径的微孔膜层以及血管内皮细胞层和星状胶质细胞层。
通过向芯片内的上层细胞培养腔和下层细胞培养腔内分别注入血管内皮细胞和星状胶质细胞悬液各10μl，细胞悬液的浓度为1×101–1×103Cell/μl，将芯片置于37℃，CO25％条件下孵育10小时，使细胞贴附于微孔膜表面；通过芯片内液体流通管道向细胞培养腔内连续流动注入培养液；对芯片微电极施加200mV电压，通过实时记录电流信号，对芯片内微孔膜和细胞层的细胞阻抗和生长活性情况进行实时监测；通过液体流通管道向位于微孔膜上方的细胞培养腔内注入待测药物，透过芯片血脑屏障模型的药物沉淀于位于微孔膜下方的细胞培养腔内，通过冲洗芯片下层液体流通管道，可对透膜药物进行洗脱收集。收集到的洗脱液可用于药物标准含量分析或进行质谱分析等。
芯片所有的微管道和腔室均采用模塑法进行制备，具体方法为：
(1)清洗单晶硅片：Piranha溶液(清洗液)清洗单晶硅片20分钟后，氮气吹干，置于200℃烘焙20-30分钟；Piranha溶液为30％双氧水和98％浓硫酸按照3：7的体积比混合；
(2)涂胶：将负光刻胶倾倒于单晶硅片表面，利用旋涂机进行甩涂，转速2100转/分钟，甩涂时间3分钟；
(3)前烘焙：将甩涂后的单晶硅片在95℃静置5分钟后，在调温至63℃静止3分钟；
(4)曝光：将带有细胞培养腔和液体流通管道结构图案的光掩膜板置于光刻胶表面，用紫外曝光机进行曝光；
(5)显影：利用丙二醇甲醚酯酸酯PGMEA对曝光后的单晶硅片进行浸泡轻微振荡显影10-20分钟后，用异丙醇和去离子水清洗单晶硅片的表面；氮气吹干；
(6)后烘：将单晶硅片于120℃烘焙15-30分钟，使硅片表面的光胶固化完全，得到含有液体流通管道和细胞培养腔的硅基模具。
(7)构建细胞培养腔层：聚二甲基硅氧烷聚合物和固化剂按照体积比10:1的比例混合后，倾倒于含有细胞培养腔和液体流通管道结构的硅基模具上，用抽真空泵除去气泡，置于80℃烘焙40-60分钟使PDMS固化，再将固化后的两层PDMS分别从硅基模具上揭下，在液体流通管道结构的末端进行打孔(直径为600-700μm)。
(8)构建微孔膜：将上下两层细胞培养腔PDMS层分别用等离子体处理1分钟后，将孔径为4.0μm的聚碳酸酯微孔膜置于两层PDMS之间，沿微孔膜边缘滴加100-200μl液态PDMS胶，使膜的外围部分与两层细胞培养腔层相黏附。
(9)键合：将两层细胞培养腔层和微孔膜层对合夹紧，置于80℃烘焙8-12小时，完成芯片构建。

Claims (3)

1.一种用于血脑屏障药物通透性高通量筛选的微流控芯片,其特征在于,该微流控芯片包括多个相互独立的微反应单元(2)，所述的每个微反应单元(2)包括液体流通管道、微孔膜层(6)、上层细胞培养腔(3)、下层细胞培养腔(4)和芯片微电极(1)；所述的微流控芯片材料为聚二甲基硅氧烷聚合物PDMS；
所述的微孔膜层(6)位于上层细胞培养腔(3)和下层细胞培养腔(4)之间，上层细胞培养腔(3)内注入培养血管内皮细胞，下层细胞培养腔(4)内注入培养星状胶质细胞，通过氧离子体法进行不可逆的封接键合，组成三层芯片结构，微孔膜层(6)上表面与血管内皮细胞层(7)接触，下表面与星状胶质细胞层(8)接触；所述的微孔膜层(6)的孔径为4.0μm，截面积为1.0mm2；
所述的液体流通管道为光滑平直的凹槽，宽度均为300μm，深度为40μm，位于上、下两层细胞培养腔(3、4)的底部；
所述的上、下两层细胞培养腔(3、4)均与液体流通管道和芯片微电极(1)相连，芯片微电极(1)位于上层细胞培养腔(3)的顶部以及下层细胞培养腔(4)的底部，通过对芯片微电极(1)电阻抗变化值的实时采集和分析；待测药物溶液经由液体流通管道注入上层细胞培养腔(3)，作用于微孔膜层(6)后，透膜药物溶液经由位于下层细胞培养腔(4)的液体流通管道流出进行收集；
所述的上、下两层细胞培养腔(3、4)、微孔膜层(6)和芯片微电极(1)的数量均根据待分析药物的检测通量确定。
2.根据权利要求1所述的一种用于血脑屏障药物通透性高通量筛选的微流控芯片,其特征在于,所述的每个微反应单元(2)的容积为1.0μl。
3.上述权利要求1或2所述的微流控芯片制备方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
1)清洗单晶硅片：用Piranha溶液清洗单晶硅片，氮气吹干，在200℃条件下烘焙20-30分钟；所述的Piranha溶液为30％双氧水和98％浓硫酸按照体积比3：7混合而成的溶液；
2)涂胶：将负光刻胶倾倒于单晶硅片表面，用旋涂机甩涂3分钟，所述的旋涂机的转速为2100转/分钟；
3)前烘焙：将步骤2)甩涂后的单晶硅片在95℃静置5分钟，调温至63℃后静止3分钟；
4)曝光：将带有细胞培养腔和液体流通管道结构图案的光掩膜板置于光刻胶表面，用紫外曝光机进行曝光处理；
5)显影：利用丙二醇甲醚酯酸酯PGMEA对曝光后的单晶硅片进行浸泡，轻微振荡显影10-20分钟后，用异丙醇和去离子水清洗单晶硅片的表面，氮气吹干；
6)后烘：将单晶硅片于120℃烘焙15-30分钟，使硅片表面的光胶完全固化，得到含有液体流通管道和细胞培养腔的硅基模具；
7)构建细胞培养腔层：聚二甲基硅氧烷聚合物和固化剂按照体积比10:1的比例混合后，倾倒于含有细胞培养腔和液体流通管道结构的硅基模具上，用抽真空泵除去气泡，置于80℃烘焙40-60分钟使PDMS固化，再将固化后的两层PDMS分别从硅基模具上揭下，在液体流通管道结构的末端进行打孔，孔直径为600-700μm；
8)构建微孔膜层(6)：将上下两层细胞培养腔(3、4)层分别用等离子体处理1分钟后，将孔径为4.0μm的聚碳酸酯微孔膜置于两层细胞培养腔(3、4)之间，沿微孔膜边缘滴加100-200μl液态PDMS胶，使微孔膜的外围部分与两层细胞培养腔层相黏附，得到微孔膜层(6)；
9)键合：将两层细胞培养腔(3、4)和微孔膜层(6)对合夹紧，置于80℃烘焙8-12小时，构建完成微流控芯片。
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