CN108117990B - 一种基于微流控技术的仿生气血屏障模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于微流控芯片技术的仿生肺气血屏障模型构建方法,特别针对模拟构建肺气血屏障的主要细胞组成和基质的三维排布。该微流控芯片主要由由基质入口池,两个细胞入口池,废液池,细胞培养室,基质室组成。该方法主要有以下步骤:(1)芯片基质灌注;(2)芯片细胞接种及培养;(3)芯片气血屏障功能监测。基于该微流控芯片的肺气血屏障模型构建方法具有更接近于体内气血屏障组成和结构层次的特点,同时能够实现对细胞层位置的准确定位。
Description
技术领域
本发明涉及将微流控芯片技术应用到肺部生理/病理研究的技术领域,具体涉及一种基于微流控技术的仿生气血屏障模型的构建方法。
背景技术
肺气血屏障(Air-Blood Barrier,ABB),又称肺泡毛细血管屏障,是使肺泡与肺毛细血管紧密相连的组织结构,主要介导外界环境中的气体与毛细血管内的血流之间的气体交换。肺气血屏障主要由肺泡表面液体层、I型肺泡上皮细胞层、细胞外基质和毛细血管内皮细胞层构成。肺气血屏障的完整性对于维持肺脏正常气体交换、防止血液中物质返流入间质和肺泡腔等至关重要。体外构建肺气血屏障模型是开展肺部生理/病理相关机制研究的前提和基础。然而,目前的研究手段主要依赖于孔板和商品化的transwell小室,以静态二维细胞培养为基础。但这种方式与体内细胞所处的三维微环境完全不同,也难以反映体内肺气血屏障所包含的气液界面、多细胞空间排列、血液流动等复杂的三维组织结构与生物力学微环境。
微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术,已经在生物医学领域展现了其独特的优势,更因其具有与细胞大小相匹配的微米尺寸构件,可在芯片微通道内进行多种细胞培养和流体刺激,构建与生理环境接近并具有时空分辨特点的三维微环境,已成为组织器官构建的重要创新技术。特别是微流控技术在多种微通道集成、流体界面形成及复杂细胞微环境模拟方面的功能特点,尤其适合于构建包含气液界面、细胞、基质和流体等多因素共同构成的肺气血屏障,是建立体外肺气血屏障研究体系的理想平台。该方面研究国内外尚无报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的仿生气血屏障模型的构建方法,特别针对模拟构建肺气血屏障的主要细胞组成和基质的三维排布,该方法具有接近体内肺气血屏障细胞和基质组成的特点,同时能够实现对肺气血屏障细胞和基质成分的动态变化进行实时动态观察。
本发明提供了一种基于微流控芯片技术的屏障功能监测方法,监测的对象为两层细胞和基质成分共同构成的仿生气血屏障模型。
本发明提供的一种微流控芯片,该微流控芯片由上下两层PDMS粘合封接而成,包括血管内皮细胞入口池,细胞外基质入口池,肺泡上皮细胞入口池,废液池,血管内皮细胞培养室,肺泡上皮细胞培养室,基质室;
所述基质室两端为细胞外基质入口池,中间部分为“丰”字形,中间的横向结构为对称排列着7~10个栅栏结构,基质室通过两边的栅栏结构与血管内皮细胞培养室和肺泡上皮细胞培养室连接;
所述血管内皮细胞培养室上连血管内皮细胞入口池,下连废液池;肺泡上皮细胞培养室上连肺泡上皮细胞入口池,下连废液池;
本发明提供的微流控芯片,所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成,血管内皮细胞培养室和肺泡上皮细胞培养室高度为200-1000μm,基质入口池和基质室高度为100-300μm。
本发明还提供了一种基于微流控芯片技术的肺气血屏障功能监测方法,方法过程如下:
(1)芯片基质灌注
采用matrigel工作液,用移液器将其加入基质入口池,每孔0.5-100μl;加PBS缓冲液于培养皿中,将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育20-60min凝胶,促使matrigel由粘稠状液体变为果冻状凝胶,凝胶过程结束后,从血管内皮细胞入口池和肺泡上皮细胞入口池分别加入两种细胞的新鲜培养液;
(2)芯片细胞接种及培养
血管内皮细胞制成悬液,取5-100μl悬液加入血管内皮细胞入口池,并迅速从废液池吸走5-100μl细胞培养液,促使细胞在重力流的作用下快速、均匀地进入细胞培养室;当在光学显微镜下观察到已经有部分细胞流入废液池,而细胞培养室中的细胞也均匀分布时,立即将芯片竖立,并移入37℃培养箱中放置;竖立方向为血管内皮细胞培养室朝上,而肺上皮细胞培养室朝下;竖立放置1-12h后,取出观察,细胞紧贴在细胞培养室与基质室的交汇处形成薄层细胞层。采用同样的方法在肺上皮细胞培养室中接种肺上皮细胞并竖立5-60min,将芯片放平移入37℃培养箱中培养、每隔24h换液一次,并拍照记录两种细胞层所在位置;
(3)芯片肺气血屏障功能监测
采用肺泡上皮细胞钙粘蛋白E-cadherin和血管内皮细胞VE-cadherin检测芯片肺气血屏障的完整性,采用FITC标记的右旋糖苷(FITC-Dextran)监测芯片肺气血屏障的通透性。
本发明提供的基于微流控芯片技术的肺气血屏障功能监测方法,所述基质成分为matrigel,常温下呈粘稠状的液体,当pH=7,温度达到37℃的情况下,孵育30min,即可转化为果冻状的凝胶。
本发明提供的基于微流控芯片技术的肺气血屏障功能监测方法,可采用生物学上常用的细胞检测手段对分别排列于基质两侧的细胞进行检测,包括细胞死活标记染色、细胞免疫荧光染色、TEER电阻检测、蛋白质检测。可以观察细胞在多种刺激作用下的形态变化,蛋白表达差异,以及两种细胞的共同培养对于刺激的不同反应等。本发明利用微流控技术,以具有良好生物相容性,透光性的PDMS为芯片材料,设计的装置可横向直接记录和观察肺气血屏障细胞形态和功能的芯片,功能完备,操作简单,并且在芯片上可以独立完成各项信号检测,如细胞蛋白表达,细胞因子分泌,细胞增殖,凋亡检测等。
附图说明
图1本发明微流控芯片整体结构示意图;a为上层PDMS整体结构示意图,b为整体微流控芯片示意图;
其中,1血管内皮细胞入口池,2细胞外基质入口池,3肺泡上皮细胞入口池,4废液池,5血管内皮细胞培养室,6肺泡上皮细胞培养室,7基质室,8芯片栅栏结构,9芯片上层PDMS整体结构,10芯片下层结构。
图2微流控芯片分别加入血管内皮细胞和肺泡上皮细胞后形成的两种细胞和基质清晰的细胞层排列,以及二维和三维之间清晰的界面;
图3芯片细胞培养四天后的细胞形态及细胞层排列;
图4芯片上肺气血屏障完整性监测-肺泡上皮细胞层的钙粘蛋白E-cadherin表达和血管内皮细胞VE-cadherin表达;
图5采用FITC标记的右旋糖苷(FITC-Dextran)监测芯片肺气血屏障的通透性;
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明,但并不因此而限制本发明。实施例1
利用实验室自行设计并制作的微流控芯片,构型见图1。该微流控芯片芯片上层PDMS整体结构9和芯片下层结构10两层PDMS粘合封接而成,包括血管内皮细胞入口池1,细胞外基质入口池2,肺泡上皮细胞入口池3,废液池4,血管内皮细胞培养室5,肺泡上皮细胞培养室6,基质室7;
基质室7两端为细胞外基质入口池,中间部分为“丰”字形,中间的横向结构为对称排列着7~10个栅栏结构8,基质室通过两边的栅栏结构与血管内皮细胞培养室5和肺泡上皮细胞培养室6连接;
血管内皮细胞培养室5上连血管内皮细胞入口池1,下连废液池4;肺泡上皮细胞培养室6上连肺泡上皮细胞入口池3,下连废液池4;
本发明提供的微流控芯片,所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成,血管内皮细胞培养室和肺泡上皮细胞培养室高度为200-1000μm,基质入口池和基质室高度为100-300μm。
实施例2
一种基于微流控芯片技术的肺气血屏障功能监测方法,采用上述微流控芯片,按照以下步骤进行:
配制matrigel工作液,用移液器将其加入基质入口池,每孔1μl;加1ml PBS缓冲液于培养皿中,将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育30min凝胶,促使matrigel由粘稠状液体变为果冻状凝胶,凝胶过程结束后,从血管内皮细胞入口池和肺泡上皮细胞入口池分别加入两种细胞的新鲜培养液;将血管内皮细胞制成悬液,取10μl悬液加入血管内皮细胞入口池,并迅速从废液池吸走10μl细胞培养液,促使细胞在重力流的作用下快速、均匀地进入细胞培养室。当在光学显微镜下观察到已经有部分细胞流入废液池,而细胞培养室中的细胞也均匀分布时,立即将芯片竖立,并移入37℃培养箱中放置;竖立方向为血管内皮细胞培养室朝上,而肺上皮细胞培养室朝下;竖立放置4h后,取出观察,细胞紧贴在细胞培养室与基质室的交汇处形成薄层细胞层。采用同样的方法在肺上皮细胞培养室中接种肺上皮细胞并竖立35min,将芯片放平移入37℃培养箱中培养、每隔24h换液一次,并拍照记录两种细胞层所在位置,其结果如图2所示;培养4天后,拍照记录细胞位置及形态,其结果如图3所示。采用肺泡上皮细胞钙粘蛋白E-cadherin和血管内皮细胞VE-cadherin检测芯片肺气血屏障的完整性,其结果如图4所示。细胞间连接蛋白分布于细胞间,形成完整的细胞间连接。采用FITC标记的右旋糖苷(FITC-Dextran)监测芯片肺气血屏障的通透性,其结果如图5所示,随着时间的延长,FITC-Dextran逐渐渗透至基质室内,表示所构建的肺气血屏障具有与体内相似的通透性。
实施例3
制作微流控芯片,由上下两层PDMS构成,包括血管内皮细胞入口池、细胞外基质入口池、肺泡上皮细胞入口池、废液池、血管内皮细胞培养室、肺泡上皮细胞培养室和基质室等结构。血管内皮细胞培养室和肺泡上皮细胞培养室高度为200-1000μm,基质入口池和基质室高度为200μm。将matrigel工作液1μl加入基质入口池,30℃孵育30min。将血管内皮细胞细胞悬液20μl加入血管内皮细胞入口池,将芯片竖立90度,37℃培养箱中放置6h。采用同样的方法在肺上皮细胞培养室中接种肺上皮细胞并竖立1h,将芯片放平移入37℃培养箱中培养,每隔24h换液一次。培养48h后,采用肺泡上皮细胞钙粘蛋白E-cadherin和血管内皮细胞VE-cadherin检测芯片肺气血屏障的完整性,采用FITC标记的右旋糖苷(FITC-Dextran)监测芯片肺气血屏障的通透性。
Claims (3)
1.一种基于微流控芯片技术的肺气血屏障功能监测方法,其特征在于采用用于仿生气血屏障模型构建的微流控芯片,所述微流控芯片用于仿生气血屏障模型的构建,该微流控芯片由上下两层PDMS粘合封接而成,包括血管内皮细胞入口池(1),细胞外基质入口池(2),肺泡上皮细胞入口池(3),废液池(4),血管内皮细胞培养室(5),肺泡上皮细胞培养室(6),基质室(7);
所述基质室(7)两端为细胞外基质入口池(2),中间部分为“丰”字形,中间的横向结构为对称排列着7~10个栅栏结构(8),基质室(7)通过两边的栅栏结构(8)与血管内皮细胞培养室(5)和肺泡上皮细胞培养室(6)连接;
所述血管内皮细胞培养室(5)上连血管内皮细胞入口池(1),下连废液池(4);
所述肺泡上皮细胞培养室(6)上连肺泡上皮细胞入口池(3),下连废液池(4);
所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成,血管内皮细胞培养室(5)和肺泡上皮细胞培养室(6)高度为200-1000μm,基质入口池(2)和基质室(7)高度为100 -300μm;
按照以下步骤进行:
(1) 芯片基质灌注
采用matrigel工作液,用移液器将其加入基质入口池,每孔0.5-100μl ;加PBS 缓冲液于培养皿中,将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育20-60min凝胶,凝胶过程结束后,从血管内皮细胞入口池和肺泡上皮细胞入口池分别加入两种细胞的培养液;
(2) 芯片细胞接种及培养
血管内皮细胞制成悬液,取5-100μl悬液加入血管内皮细胞入口池,并迅速从废液池吸走5-100μl细胞培养液,将芯片竖立,并移入37℃培养箱中放置;竖立方向为血管内皮细胞培养室朝上,而肺上皮细胞培养室朝下;竖立放置1-12h后,取出观察,细胞紧贴在细胞培养室与基质室的交汇处形成薄层细胞层;采用同样的方法在肺上皮细胞培养室中接种肺上皮细胞并竖立5-60min,将芯片放平移入37℃培养箱中培养、每隔24h 换液一次,并拍照记录两种细胞层所在位置;
(3) 芯片肺气血屏障功能监测
采用肺泡上皮细胞钙粘蛋白E-cadherin和血管内皮细胞VE-cadherin检测芯片肺气血屏障的完整性,采用FITC标记的右旋糖苷(FITC-Dextran) 监测芯片肺气血屏障的通透性。
2.按照权利要求1所述的基于微流控芯片技术的肺气血屏障功能监测方法,其特征在于:监测的对象为接近体内肺气血屏障细胞和基质组成的三维模型。
3.按照权利要求1所述的基于微流控芯片技术的肺气血屏障功能监测方法,其特征在于:可对肺气血屏障细胞和基质成分的动态变化进行实时动态观察。
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