CN107955784B - 一种基于微流控芯片技术的三维细胞球迁移监测方法 - Google Patents

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Abstract

一种提供基于微流控芯片技术的三维细胞球迁移监测方法，特别针对三维细胞球迁移运动到三维基质中的过程。该微流控芯片主要由由细胞入口池，胶原入口池，培养基入口池，废液池，细胞培养室，培养基灌流室，细胞球捕获槽，细胞迁移室组成。该方法主要有以下步骤：(1)芯片胶原灌注；(2)芯片细胞球接种及培养；(3)芯片细胞迁移实时监测。基于该微流控芯片的三维细胞球迁移动力学监测方法具有对细胞运动实时追踪的特点，同时能够实现对细胞运动之初的准确定位。

Description

一种基于微流控芯片技术的三维细胞球迁移监测方法
技术领域
本发明涉及将微流控芯片技术应用到实时监测的细胞生物学研究的技术领域，具体涉及一种基于微流控芯片的三维细胞球迁移监测方法。
背景技术
细胞生物学发展至今，主要的培养和研究依赖于是孔板和商品化的transwell小室，集中观察单一或者多种因素刺激下细胞形态变化、生长过程、迁移和增值行为等。而在众多的细胞行为研究中，细胞迁移作为生物体发育和形态建成等重要生命过程的基础，而备受关注。细胞迁移一般起始于细胞对其微环境刺激的感应，微环境刺激通过细胞表面受体激活一系列的胞内信号转导通路与基因转录，并进而通过细胞极性的改变、细胞的粘附及去粘附、细胞骨架的重排等多个环节，最终完成细胞形态和位置的改变。对于细胞而言，其在体内实际是三维生长，三维细胞球更符合细胞的生理状态。孔板、transwell小室很难在体外构建二维平面到三维空间的界面转换，目前有利用芯片的胶原界面监测侵袭的方法都是直线的界面，所以想模拟和重现上述三维细胞球迁移过程是比较困难的。
微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代细胞研究的重要平台。它对于实验结果能够实时追踪，不仅能够获得最终结果，也可以得到三维细胞球迁移过程中出现的暂时性信息，为细胞迁移过程提供常规分析中有可能缺失的重要生物学信息。而目前，利用微流控芯片进行三维细胞球迁移动力学过程监测，观察三维细胞球从二维平面迁移运动到三维基质过程的研究分析还处于空白阶段。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的三维细胞球迁移动力学监测方法，特别针对三维细胞球从二维平面迁移运动到三维基质中的过程，该方法具有对细胞运动实时追踪的特点，同时能够实现对细胞运动之初的准确定位。
本发明提供了一种基于微流控芯片技术的三维细胞球迁移监测方法，监测的对象为三维细胞球或微组织。
本发明提供的微流控芯片，该微流控芯片由上下两层PDMS粘合封接而成，包括细胞入口池，胶原入口池，培养基入口池，废液池，细胞培养室，培养基灌流室，细胞球捕获槽，细胞迁移室；
细胞迁移室两端为胶原入口池，中间部分为“丰”字形，中间的横向结构为对称排列着的7～10个细胞球捕获槽，细胞迁移室通过一边的细胞球捕获槽与培养基灌流室连接，细胞迁移室通过另一边的细胞球捕获槽与细胞培养室连接；
细胞培养室上连细胞入口池，下连废液池；
培养基灌流室为C型，一端为培养基入口池，另一端为废液池。
本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片细胞捕获槽为半球形，可使胶原形成凹面。。
本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，细胞培养室高度为200-1000μm，胶原入口池和细胞迁移室高度为100-300μm。
本发明还提供了一种基于所述的微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法，方法过程如下：
(1)芯片胶原灌注
配制4mg/ml的胶原工作液，用移液器将配制好的胶原工作液加入胶原入口池，每孔0.4μl；加1ml PBS缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育30min，促使胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶，凝胶过程结束后，从细胞入口池、胶原入口池分别顺序加入新鲜的细胞培养液；
(2)芯片细胞球接种及培养
肿瘤细胞球制成悬液，取10μl细胞悬液加入细胞入口池，并迅速从废液池吸走10μl细胞培养液，促使细胞在重力流的作用下快速、均匀地进入细胞培养室；当在光学显微镜下观察到已经有部分细胞流入废液池，而细胞培养室中的细胞也均匀分布时，立即将芯片竖立，并移入37℃培养箱中放置，竖立方向为细胞培养室朝上，而细胞迁移室朝下；竖立放置10min后，取出观察，如果细胞紧贴在细胞培养室与迁移室的交汇处，说明细胞接种比较成功；将芯片放平移入37℃培养箱中继续培养、每隔24h换液一次，并拍照记录三维细胞球所在位置；
(3)芯片细胞迁移实时监测
采用活细胞工作站CO2显微载物台培养箱进行细胞长期观察，60min拍照一张，实时记录细胞运动位置及形态改变。
开启仪器，同时打开空气、二氧化碳气瓶，调节阀门，保持气体保持在刻度值0.8,0.04，两种空气在此比例下，可以保证载物台培养箱内5％的CO2浓度，调节其温度在37℃，仪器稳定30min左右，将固定芯片的培养皿放入载物台培养箱，调节焦距及拍摄参数，每隔60min拍照一张，实时记录细胞运动位置及形态改变。
本发明提供的基于微流控芯片技术的三维细胞球迁移动力学监测方法，所述胶原为I型鼠尾胶原，常温下它是呈粘稠状的液体，当pH＝7，温度达到37℃的情况下，孵育30min，即可呈现果冻状的凝胶。
本发明提供的基于微流控芯片技术的三维细胞球迁移动力学监测方法，可采用生物学上常用的细胞检测手段对迁移运动到胶原中的细胞进行检测，包括细胞死活标记染色、细胞免疫荧光染色、PCR检测、蛋白质检测。还可以对不同大小尺寸的组织细胞球单个或是多个进行生物学行为进行分析，可以观察细胞球内细胞的迁移过程中形态变化，蛋白表达差异，球内细胞的迁移速度差异等。本发明利用微流控技术，以具有良好生物相容性，透光性的PDMS为芯片材料，设计的装置可横向直接记录和观察细胞迁移行为的芯片，功能完备，操作简单，并且在芯片上可以独立完成各项信号检测，如细胞蛋白表达，细胞因子分泌，细胞增殖，凋亡检测等。
附图说明
图1本发明微流控芯片整体结构示意图；
其中，1细胞入口池，2胶原入口池，3培养基入口池，4废液池，5细胞培养室，6培养基灌流室，细7胞球捕获槽，8细胞迁移室，9芯片下层PDMS整体结构，10芯片下层PDMS整体结构。
图2微流控芯片胶原加入后形成的二维平面与三维基质的清晰界面；
图3芯片细胞接种后竖立10min时的细胞贴附情况；
图4三维细胞球迁移进入胶原前后形态变化，
图5细胞迁移面积与培养时间的关系；
图6细胞随时间变化迁移进胶原内随波形蛋白表达。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
利用实验室自行设计并制作的微流控芯片，构型见图1。该微流控芯片由上下两层PDMS粘合封接而成，包括细胞入口池1，胶原入口池2，培养基入口池3，废液池4，细胞培养室5，培养基灌流室6，细胞球捕获槽7，细胞迁移室8；
细胞迁移室8两端为胶原入口池2，中间部分为“丰”字形，中间的横向结构为对称排列着的7～10个细胞球捕获槽7，细胞迁移室8通过一边的细胞球捕获槽7与培养基灌流室6连接，细胞迁移室8通过另一边的的细胞球捕获槽7与细胞培养室5连接；
细胞培养室5上连细胞入口池1，下连废液池4；
培养基灌流室6为C型，一端为培养基入口池3，另一端为废液池4。
细胞捕获槽7为半球形，可使胶原形成凹面。。
本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，细胞培养室5高度为200-1000μm，胶原入口池2和细胞迁移室8高度为100-300μm。
实施例2
一种基于微流控芯片技术的三维细胞球迁移监测方法，采用上述微流控芯片，按照以下步骤进行：
配制胶原浓度为4mg/ml，由胶原入口灌注到芯片胶原通道，37℃，孵育30min待胶原凝固后，可以看到胶原与二维平面的清晰的半弧形界面如图2所示。从细胞入口池以较低密度104cm-2加入三维细胞球悬液，将芯片竖立芯片10min，使细胞贴附在胶原通道一侧的细胞球捕获区，如图3所示，将芯片细胞通道内和培养基通道内充满细胞培养基。采用活细胞工作站CO2显微载物台培养箱进行细胞长期观察，开启仪器，同时打开空气、二氧化碳气瓶，调节阀门，保持气体保持在刻度值0.8,0.04，两种空气在此比例下，可以保证载物台培养箱内5％的CO2浓度，调节其温度在37℃，仪器稳定30min左右，将固定芯片的培养皿放入载物台培养箱，调节焦距及拍摄参数，每隔60min拍照一张，实时记录细胞运动位置及形态改变，拍照记录细胞初始位置，每隔24h换液一次，并拍照记录细胞移动情况。统计三维细胞球迁移进入胶原中的面积及细胞移动距离，其结果如图4所示。随培养时间增长，细胞球迁移进细胞的距离增加，并且细胞迁移进细胞迁移通道的胶原区内，细胞呈三维培养状态，细胞形态发生变化，二维细胞通道与细胞迁移通道的细胞形态如图5所示，二维细胞呈传统贴壁样生长，呈铺路石状，而在胶原中三维培养状态下突触增长呈上皮样改变，考察细胞迁移进三维通道内细胞的上皮样改变既细胞侵袭能力的改变，用波形蛋白进行细胞免疫荧光表征波形蛋白(Vimentin)的表达，结果如图6所示,细胞迁移进入细胞迁移区内，波形蛋白表达较强。

Claims (3)

1.一种基于微流控芯片技术的三维细胞球迁移监测方法，其特征在于采用微流控芯片，按照以下步骤进行：
(1) 芯片胶原灌注
配制4mg/ml的胶原工作液，用移液器将胶原工作液加入胶原入口池，每孔0.4μl ；加1ml PBS 缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育30min凝胶，凝胶过程结束后，从细胞入口池、胶原入口池分别顺序加入细胞培养液；
(2) 芯片细胞球接种及培养
肿瘤细胞球制成悬液，取10μl悬液加入细胞入口池，并迅速从废液池吸走10μl细胞培养液，将芯片竖立，并移入37℃培养箱中放置；竖立方向为细胞培养室朝上，而细胞迁移室朝下；竖立放置10min 后，取出观察，细胞紧贴在细胞培养室与迁移室的交汇处将芯片放平移入37℃培养箱中培养、每隔24h 换液一次，并拍照记录三维细胞球所在位置；
(3) 芯片细胞迁移实时监测
采用活细胞工作站CO2显微载物台培养箱进行细胞长期观察，每隔60min 拍照一张，实时记录细胞运动位置及形态改变；
所述微流控芯片由上下两层PDMS粘合封接而成，包括细胞入口池（1），胶原入口池（2），培养基入口池（3），废液池（4），细胞培养室（5），培养基灌流室（6），细胞球捕获槽（7），细胞迁移室（8）；
细胞迁移室（8）两端为胶原入口池（2），中间部分为“丰”字形，中间的横向结构为对称排列着7~10个细胞球捕获槽（7），细胞迁移室（8）通过一边的细胞球捕获槽（7）与培养基灌流室（6）连接，细胞迁移室（8）通过另一边的细胞球捕获槽（7）与细胞培养室（5）连接；
细胞培养室（5）上连细胞入口池（1），下连废液池（4）；
培养基灌流室（6）为C型，一端为培养基入口池（3），另一端为废液池（4）；
所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，细胞培养室（5）高度为200-1000μm，胶原入口池（2）和细胞迁移室（8）高度为100 -300μm；
细胞球捕获槽（7）为半球形，可使胶原形成凹面。
2.按照权利要求1所述的基于微流控芯片技术的三维细胞球迁移监测方法，其特征在于：监测的对象为三维细胞球或微组织。
3.按照权利要求1所述的基于微流控芯片技术的三维细胞球迁移监测方法，其特征在于：接种的三维细胞球通过侧立固定在球形界面。
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