CN111218401A - 一种基于肿瘤芯片的新生血管形成及药物评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于肿瘤芯片的新生血管形成及药物评价方法，特别针对三维肿瘤细胞诱导的新生血管生成及抗肿瘤药物评价。所涉及的芯片主要由两个细胞入口池，三维基质入口池，废液池，细胞培养室和三维基质室组成；基于该芯片的肿瘤新生血管模拟及药物抗血管形成评估方法可实现对3D肿瘤细胞诱导的血管内皮细胞出芽、在基质中的迁移和类血管样条索形成进行实时观察与动态追踪，并同时观测药物作用下肿瘤及内皮细胞的形态、增殖、凋亡以及迁移，获得细胞对药物响应的多参数信息。
Description
技术领域
本发明属于微流控技术、组织工程等领域，具体涉及一种基于肿瘤芯片的新生血管形成及药物评价方法。
背景技术
恶性肿瘤最显著的表型是血管内皮细胞的失控性生长及异常血管增生，血管生成是肿瘤生长、转移的必备条件。研究肿瘤血管形成对于了解恶性肿瘤发生、发展、侵袭和转移的生物学行为和机制，以及抗肿瘤药物开发具有重要的应用价值。目前，传统的肿瘤血管形成研究主要依赖孔板实验和血管形成实验。通过血管内皮细胞的条件培养基观察其对血管内皮官腔样结构形成的影响。该方法虽然操作简便，但这种基于二维细胞培养的方式与体内的血管形成过程差异较大。不仅难以反映体内血管内皮细胞的3D细胞团生长状态，也难以观察血管形成中的出芽这一关键始动步骤。而且，条件培养基这种刺激方式也使血管内皮细胞生长与血管形成两个病理过程产生了时空断裂，无法观察到肿瘤生长与血管新生之间的直接关联和相互影响。
器官芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代细胞研究的重要平台。本发明致力于提供一种肿瘤细胞3D生长与内皮细胞出芽血管形成的3D共培养研究体系，以模拟体内的肿瘤细胞诱导的新生血管形成这一典型病理变化，可同时实现对3D肿瘤细胞增殖、迁移、内皮细胞形变、穿胶、管腔样结构形成等一系列变化的仿生模拟和动态实时观察，为抗肿瘤药物开发提供了一种有力的多因素评估手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于肿瘤芯片的新生血管形成及药物评价方法，特别是一种针对3D肿瘤细胞诱导血管形成研究的芯片系统。
本发明提供一种肿瘤芯片由上下两层PDMS粘合封接而成，包括肿瘤细胞团入口池，细胞外基质入口池，血管内皮细胞入口池，废液池，肿瘤细胞团培养室，血管内皮细胞培养室，基质室；
所述肿瘤细胞培养室上连肿瘤细胞入口池，下连1#废液池；
所述血管内皮细胞培养室上连血管内皮细胞入口池，下连2#废液池；
所述基质室两端为细胞外基质入口池，中间部分为“丰”字形，中间的横向结构为对称排列着7～10个栅栏结构，基质室通过两边的栅栏结构与两侧的肿瘤细胞培养室和血管内皮细胞培养室连接；
本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，细胞培养室高度为200-1000μm，基质入口池和基质室高度为50-300μm。
本发明还提供了一种基于肿瘤芯片的新生血管形成及药物评价方法，具体过程如下：
(1)芯片基质灌注
采用matrigel工作液，用移液器将其加入基质入口池，每孔0.5-10μl；加适量PBS缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育10-60min凝胶，凝胶过程结束后，从肿瘤细胞入口池和血管内皮细胞入口池分别加入两种细胞的培养液；
(2)芯片细胞接种及培养
肿瘤细胞制成悬液，取10-100μl悬液加入入口池，移入37℃培养箱中放置，过夜；取10-100μl血管内皮细胞悬液加入入口池，芯片侧立90度，竖立方向为肿瘤细胞培养室朝下，而血管内皮细胞培养室朝上；竖立放置1-6h后，取出观察，血管内皮细胞紧贴在细胞培养室与基质室的交汇处形成薄层细胞层，形成统一的细胞运动起始位置；拍照记录细胞位置，将芯片放平移入37℃培养箱中培养、每隔24h换液一次，并定时拍照；
(3)在肿瘤细胞培养室中加入一定浓度的化合物或刺激因子，定时拍照记录肿瘤细胞形态及血管内皮细胞在基质室中的位置，实时记录细胞运动位置及形态改变。
所述化合物为：huAA98抗体，所述化合物的浓度为：100μg/mL
所述血管内皮细胞在细胞接种时通过芯片侧立，使其粘附于基质表面，形成统一的细胞运动起始位置。本发明所提供的基于肿瘤芯片的新生血管形成及药物评价方法，能够更好地模拟体内肿瘤细胞团的三维生长环境以及所诱导肿瘤新生血管形成，可同时实现对3D肿瘤细胞增殖、迁移、内皮细胞形变、穿胶、管腔样结构形成等一系列变化的仿生模拟、动态实时观察及细胞学实验表征。
本发明提供的基于肿瘤芯片的新生血管形成及药物评价方法，所述基质成分为Matrigel，4℃以下时下它是呈粘稠状的液体，当pH＝7，温度达到常温的情况下，5min，即可呈现果冻状的凝胶。
本发明提供基于肿瘤芯片的新生血管形成及药物评价方法，可采用生物学上常用的细胞检测手段对共培养体系的细胞进行实时观察和细胞学检测，包括细胞死活标记染色、细胞免疫荧光染色、PCR检测、蛋白质检测等，并能够实现对血管内皮细胞提供统一的迁移运动起始位置。
本发明利用器官芯片技术，以具有良好生物相容性，透光性的PDMS为芯片材料，设计的装置可横向直接记录和观察药物作用下肿瘤细胞团的生长、凋亡及迁移行为变化，以及所诱导的血管内皮细胞迁移及类管腔样结构形成的变化。功能完备，操作简单，并且在芯片上可以独立完成各项信号检测，如细胞蛋白表达，细胞因子分泌，细胞增殖，凋亡检测等。
附图说明
图1本发明器官芯片整体结构示意图，
图2为本发明器官芯片上下层示意图；
其中，1血管内皮细胞入口池，2细胞外基质入口池，3肿瘤细胞团入口池，41#废液池，52#废液池，6肿瘤细胞团培养室，7血管内皮细胞培养室，8基质室，9芯片上层PDMS整体结构，10芯片下层结构。
图3黑色素瘤A375细胞团对血管内皮细胞迁移的作用研究；
图4huAA98抗体对黑色素瘤A375细胞团诱导的血管内皮迁移的影响；
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
利用实验室自行设计并制作的微流控芯片，构型见图1和图2。该芯片由上下两层PDMS粘合封接而成，包括血管内皮细胞入口池1，细胞外基质入口池2，肿瘤细胞入口池3，废液池4，5，肿瘤细胞培养室6，血管内皮细胞培养室7，基质室8，芯片上层PDMS整体结构9，芯片下层结构10。
基质室8两端为细胞外基质入口池，中间部分为“丰”字形，中间的横向结构为对称排列着7～10个栅栏结构；基质室8通过两边的栅栏结构与两侧的肿瘤细胞培养室6和血管内皮细胞培养室7连接；
肿瘤细胞培养室6上连肿瘤细胞入口池3，下连废液池4；血管内皮细胞培养室7上连血管内皮细胞入口池1，下连废液池5；
本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，两个细胞培养室高度为200-1000μm，基质入口池和基质室高度为50-300μm。
实施例2
一种基于肿瘤芯片的新生血管形成方法，具体过程如下：
配制matrigel工作液，用移液器将其加入基质入口池，每孔1μl；加1ml PBS缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育30min凝胶，促使matrigel由粘稠状液体变为果冻状凝胶。黑色素瘤A375细胞制成悬液，用带有微坑的芯片进行培养。当细胞团直径长至200微米左右，用玻璃吸管吹打芯片表面，收集细胞团至离心管中，自然沉降后去除培养基。将细胞团与matrigel工作液混合，取10μl悬液加入肿瘤细胞入口池，促使细胞团在重力流的作用下进入细胞培养室，放入培养箱中孵育30min凝胶。在血管内皮细胞培养室中接种人脐静脉内皮细胞，将芯片竖立1-4h，竖立方向为血管内皮细胞培养室朝上。取出观察，血管内皮细胞紧贴在细胞培养室与基质室的交汇处形成薄层细胞层。将芯片放平移入37℃培养箱中培养，每隔24h换液一次，并拍照记录细胞形态及位置，其结果如图3所示。可见随着时间的延长，A375细胞团直径增大，细胞团周边的肿瘤细胞从细胞团内迁移入matrigel中，细胞变形为细长状。内皮细胞发生变形，拉长等形变，并突破matrigel界面迁移入matrigel内。随着时间的延长，胶内的内皮细胞逐渐呈现条索状获类管腔样。
实施例3
一种基于肿瘤芯片的抗新生血管形成药物评价方法，具体过程如下：
操作流程如前所示。在构建肿瘤细胞团与血管内皮细胞三维共培养体系的基础上，在在肿瘤细胞团培养室中加入抗肿瘤抗体药物huAA98，拍照。每隔24h拍照记录两种细胞的形态及血管内皮细胞在基质室中迁移的距离，huAA98抗体对黑色素瘤A375细胞团诱导的血管内皮迁移的影响如图4所示。加入抗体药物后，黑色素瘤细胞团直径减小，迁移入matrigel内的肿瘤细胞数目减少，而血管内皮细胞在matrigel内的迁移和管腔样结构形成也受到抑制。
Claims (5)
1.一种肿瘤芯片，其特征在于：该芯片由上下两层PDMS粘合封接而成，包括血管内皮细胞入口池(1)，细胞外基质入口池(2)，肿瘤细胞入口池(3)，1#废液池(4)，2#废液池(5)肿瘤细胞培养室(6)，血管内皮细胞培养室(7)，基质室(8)；
所述肿瘤细胞培养室(6)上连肿瘤细胞入口池(3)，下连1#废液池(4)；
所述血管内皮细胞培养室(7)上连血管内皮细胞入口池(1)，下连2#废液池(5)；
所述基质室(8)连接细胞外基质入口池(2)，中间部分为“丰”字形，中间的横向结构为对称排列着7～10个栅栏结构，基质室(8)通过两边的栅栏结构与两侧的肿瘤细胞培养室(6)和血管内皮细胞培养室(7)连接；
该芯片通过分别在肿瘤细胞培养室和血管内皮细胞培养室中培养肿瘤细胞及血管内皮细胞，构建肿瘤的免疫微环境，实现在肿瘤细胞共培养条件下的血管内皮细胞行为监测。
2.按照权利要求1所述的肿瘤芯片，其特征在于：所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，细胞培养室高度为200-1000μm，基质入口池和基质室高度为50-300μm。
3.一种基于肿瘤芯片的新生血管形成及药物评价方法，其特征在于采用权利要求1所述芯片，按照如下步骤进行：
(1)芯片基质灌注
采用matrigel工作液，用移液器将其加入基质入口池，每孔0.5-10μl；加适量PBS缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育10-60min凝胶，凝胶过程结束后，从肿瘤细胞入口池和血管内皮细胞入口池分别加入两种细胞的培养液；
(2)芯片细胞接种及培养
肿瘤细胞制成悬液，取10-100μl悬液加入入口池，移入37℃培养箱中放置，过夜；取10-100μl血管内皮细胞悬液加入入口池，芯片侧立90度，竖立方向为肿瘤细胞培养室朝下，而血管内皮细胞培养室朝上；竖立放置1-6h后，取出观察，血管内皮细胞紧贴在细胞培养室与基质室的交汇处形成薄层细胞层，形成统一的细胞运动起始位置；拍照记录细胞位置，将芯片放平移入37℃培养箱中培养、每隔24h换液一次，并定时拍照；
(3)在肿瘤细胞培养室中加入一定浓度的化合物或刺激因子，定时拍照记录肿瘤细胞形态及血管内皮细胞在基质室中的位置，实时记录细胞运动位置及形态改变。
4.按照权利要求3所述的一种基于肿瘤芯片的新生血管形成及药物评价方法，其特征在于：所述化合物为：huAA98抗体，所述化合物的浓度为：100μg/mL。
5.按照权利要求3所述的一种基于肿瘤芯片的新生血管形成及药物评价方法，其特征在于：所述血管内皮细胞在细胞接种时通过芯片侧立，使其粘附于基质表面，形成统一的细胞运动起始位置。
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