CN111218402A - 一种基于器官芯片的肿瘤免疫微环境模拟及毒性评估方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于器官芯片的肿瘤免疫微环境模拟及毒性评估方法，特别针对肿瘤细胞免疫微环境的体外3D模拟以及毒性评估。所述器官芯片主要由两个细胞入口池，三维基质入口池，废液池，细胞培养室和三维基质室组成；基于该芯片的肿瘤免疫微环境模拟及毒性评估方法可实现对肿瘤免疫细胞和肿瘤细胞的三维分区共培养，并可实现外界刺激物对于免疫细胞共培养体系下肿瘤细胞增殖、形变、运动的实时追踪，获得共培养体系对外界刺激的多参数响应信息。
Description
技术领域
本发明属于微流控技术、组织工程等领域，具体涉及一种基于器官芯片的肿瘤免疫微环境模拟及毒性评估方法。
背景技术
肿瘤微环境是指肿瘤在其发生发展过程中所处的内外环境的综合，是一个复杂多变的综合体系。组织缺氧、周围间质高压形成、大量细胞生长因子、趋化因子和蛋白水解酶的产生及免疫炎症反应共同构成了肿瘤微环境特殊的生物学特征。肿瘤细胞的生长、迁移、血管化等进程受到微环境内免疫细胞的调控，多种免疫细胞在肿瘤产生及转移中的作用机制研究是当前肿瘤学研究的热点。
目前，传统的细胞生物学研究主要依赖孔板实验和商品化的transwell小室，集中观察单一或者多种因素刺激下细胞形态变化、生长过程、迁移和增值行为等。对于肿瘤细胞学研究而言，孔板实验以及transwell小室很难在体外构建二维平面到三维空间的界面转换。transwell小室虽然可以构建免疫细胞和肿瘤细胞的共培养体系，但由于其采用上下夹膜的设计，难以实现对共培养体系下细胞形变、运动等行为的实时追踪，也难以获得多参数的动态信息。
器官芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代细胞研究的重要平台。本发明致力于提供一种免疫细胞与肿瘤细胞的3D共培养研究体系，以模拟体内的3D肿瘤免疫微环境，为研究刺激因素作用下免疫细胞与肿瘤细胞间的信息传递，以及所引起的细胞学改变提供了实时观察的新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于器官芯片的肿瘤免疫微环境模拟及毒性评估方法特别是一种针对免疫细胞3D共培养下肿瘤细胞行为学研究芯片系统。
本发明一种器官芯片，该芯片由上下两层PDMS粘合封接而成，包括免疫细胞入口池，细胞外基质入口池，肿瘤细胞入口池，两个废液池，免疫细胞培养室，肿瘤细胞培养室，基质室；
所述免疫细胞培养室上连免疫细胞入口池，下连1#废液池；
所述肿瘤细胞培养室上连肿瘤细胞入口池，下连2#废液池；所述基质室两端为细胞外基质入口池，中间部分为“丰”字形，中间的横向结构为对称排列着7～10个栅栏结构，基质室通过两边的栅栏结构与两侧的肿瘤细胞培养室和免疫细胞培养室连接；
本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，细胞培养室高度为200-1000μm，基质入口池和基质室高度为50-300μm。
本发明还提供了一种基于器官芯片的肿瘤免疫微环境模拟可用于毒性评估的方法，具体过程如下：
(1)芯片基质灌注
采用matrigel工作液，用移液器将其加入基质入口池，每孔0.5-10μl；加适量PBS缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育10-60min凝胶，凝胶过程结束后，从免疫细胞入口池和肿瘤细胞入口池分别加入两种细胞的培养液；
(2)芯片细胞接种及培养
将免疫细胞制成悬液，取10-100μl悬液加入免疫细胞入口池，移入37℃培养箱中放置，过夜；取10-100μl肿瘤细胞悬液加入肿瘤细胞入口池，芯片侧立90度，竖立方向为免疫细胞培养室朝下，而肿瘤细胞培养室朝上；竖立放置1-6h后，取出观察，肿瘤细胞紧贴在细胞培养室与基质室的交汇处形成薄层细胞层,形成统一的细胞运动起始位置。拍照记录细胞位置，将芯片放平移入37℃培养箱中培养、每隔24h换液一次，并定时拍照；
(3)在免疫细胞培养室中加入一定浓度的化合物或刺激因子，定时拍照记录免疫细胞形态及肿瘤细胞在基质室中的位置，实时记录细胞运动位置及形态改变。
所述化合物为：碳纳米管(CNT)，所述化合物的浓度为：10-500μg/ml。
所述肿瘤细胞在细胞接种时通过芯片侧立，使其粘附于基质表面，形成统一的细胞运动起始位置。
本发明所提供的肿瘤免疫微环境模拟及毒性评估方法，能够更好地模拟出肿瘤细胞所处的3D免疫微环境，并可实时观测到刺激因素作用下免疫细胞与肿瘤细胞间的信息传递，以及所引起的细胞形变、运动及凋亡等改变。
本发明提供的肿瘤免疫微环境模拟及毒性评估方法，所述基质成分为Matrigel，4℃以下时下它是呈粘稠状的液体，当pH＝7，温度达到常温的情况下，5min，即可呈现果冻状的凝胶。
本发明提供的肿瘤免疫微环境模拟及毒性评估方法，可采用生物学上常用的细胞检测手段对共培养体系的细胞进行实时观察和细胞学检测，包括细胞死活标记染色、细胞免疫荧光染色、PCR检测、蛋白质检测等，并能够实现对肿瘤细胞提供统一的运动起始位置。
本发明利用器官芯片技术，以具有良好生物相容性，透光性的PDMS为芯片材料，设计的装置可横向直接记录和观察刺激因素作用下免疫细胞反映对于肿瘤细胞的影响，并实时记录共培养体系下细胞的形变及运动等行为改变。功能完备，操作简单，并且在芯片上可以独立完成各项信号检测，如细胞蛋白表达，细胞因子分泌，细胞增殖，凋亡检测等。
附图说明
图1本发明器官芯片整体结构示意图，
图2为本发明器官芯片上下层示意图；
其中，1肿瘤细胞入口池，2细胞外基质入口池，3免疫细胞入口池，4，5废液池，6免疫细胞培养室，7肿瘤细胞培养室，8基质室，9芯片上层PDMS整体结构，10芯片下层结构。
图3碳纳米管颗粒作用下单核细胞THP-1和肿瘤细胞MCF-7细胞的形态和侵袭能力变化；
图4碳纳米管颗粒作用下单核细胞RAW264.7和肿瘤细胞4T1细胞的形态和侵袭能力变化。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
利用实验室自行设计并制作的微流控芯片，构型见图1和图2。该芯片由上下两层PDMS粘合封接而成，包括1肿瘤细胞入口池，2细胞外基质入口池，3免疫细胞入口池，4，5废液池，6免疫细胞培养室，7肿瘤细胞培养室，8基质室，9芯片上层PDMS整体结构，10芯片下层结构。
所述基质室8两端为细胞外基质入口池，中间部分为“丰”字形，中间的横向结构为对称排列着7～10个栅栏结构；基质室(8)通过两边的栅栏结构与两侧的免疫细胞培养室(6)和肿瘤细胞培养室(7)连接；
所述免疫细胞培养室6上连免疫细胞入口池3，下连1#废液池4；
所述肿瘤细胞培养室7上连肿瘤细胞入口池1，下连2#废液池5；
本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，两个细胞培养室高度为200-1000μm，基质入口池和基质室高度为50-300μm。
实施例2
一种基于器官芯片的人乳腺癌免疫微环境模拟及毒性评估方法，具体过程如下：
配制matrigel工作液，用移液器将其加入基质入口池，每孔1μl；加1ml PBS缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育30min凝胶，促使matrigel由粘稠状液体变为果冻状凝胶，凝胶过程结束后，从免疫细胞入口池和肿瘤细胞入口池分别加入两种细胞的新鲜培养液；将PMA激活后的单核细胞thp-1细胞制成悬液，取10μl悬液加入免疫细胞入口池，置入37℃培养箱过夜。采用同样的方法在肿瘤细胞培养室中接种人乳腺癌细胞MCF-7，当在光学显微镜下观察到已经有部分细胞流入废液池，而细胞培养室中的细胞也均匀分布时，立即将芯片竖立，并移入37℃培养箱中放置；竖立方向为肿瘤细胞培养室朝上，竖立放置4h后，取出观察，细胞紧贴在细胞培养室与基质室的交汇处形成薄层细胞层。
在免疫细胞培养室中加入碳纳米管颗粒，拍照。每隔24h拍照记录两种细胞的形态及肿瘤细胞在基质室中迁移的距离。纳米颗粒作用5天后，DAPI染色标示细胞核的位置和形态，其结果如图3所示。可见加入碳纳米管颗粒后，单核细胞内出现黑色纳米颗粒团聚，单核细胞发生变形，皱缩，凋亡等一系列改变。对细胞进行DAPI染色显示，30μg/ml的碳纳米管作用下，肿瘤细胞MCF-7在maitrigel中的侵袭能力增强，而150μg/ml的碳纳米管对于肿瘤细胞侵袭没有明显作用。
实施例3
一种基于器官芯片的鼠乳腺癌免疫微环境模拟及毒性评估方法，具体过程如下：
操作流程如前所示，接种免疫细胞为鼠RAW24.7，肿瘤细胞为鼠乳腺癌细胞系4T1。在免疫细胞培养室中加入碳纳米管颗粒，拍照。每隔24h拍照记录两种细胞的形态及肿瘤细胞在基质室中迁移的距离。纳米颗粒作用2天后，DAPI染色，其结果如图4所示。加入碳纳米管颗粒后，RAW24.7细胞内出现黑色纳米颗粒团聚，但未见明显细胞学形态改变。对细胞进行DAPI染色显示，30μg/ml的碳纳米管作用下，肿瘤细胞4T1在maitrigel中的侵袭能力增强，而150μg/ml的碳纳米管对于肿瘤细胞侵袭没有明显作用。
Claims (5)
1.一种器官芯片，其特征在于：该芯片由上下两层PDMS粘合封接而成，包括肿瘤细胞入口池(1)，，细胞外基质入口池(2)，免疫细胞入口池(3)，1#废液池(4)，2#废液池(5)免疫细胞培养室(6)，肿瘤细胞培养室(7)，基质室(8)；
所述免疫细胞培养室(6)上连免疫细胞入口池(3)，下连1#废液池(4)；
所述肿瘤细胞培养室(7)上连肿瘤细胞入口池(1)，下连2#废液池(5)；
所述基质室(8)连接细胞外基质入口池(2)，中间部分为“丰”字形，中间的横向结构为对称排列着7～10个栅栏结构，基质室(8)通过两边的栅栏结构与两侧的免疫细胞培养室(6)和肿瘤细胞培养室(7)连接；
该芯片通过分别在免疫细胞培养室和肿瘤细胞培养室中培养免疫细胞及肿瘤细胞，构建肿瘤的免疫微环境，实现在免疫细胞共培养条件下的肿瘤细胞行为监测。
2.按照权利要求1所述的一种器官芯片，其特征在于所述芯片是由高度不同的两部分组成，细胞培养室高度为200-1000μm，基质入口池和基质室高度为50-300μm。
3.一种基于器官芯片的肿瘤免疫微环境模拟及毒性评估方法，其特征在于；采用权利要求1所述器官芯片，按照如下步骤进行：
(1)芯片基质灌注
采用matrigel工作液，用移液器将其加入基质入口池，每孔0.5-10μl；加适量PBS缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育10-60min凝胶，凝胶过程结束后，从免疫细胞入口池和肿瘤细胞入口池分别加入两种细胞的培养液；
(2)芯片细胞接种及培养
将免疫细胞制成悬液，取10-100μl悬液加入免疫细胞入口池，移入37℃培养箱中放置，过夜；取10-100μl肿瘤细胞悬液加入肿瘤细胞入口池，芯片侧立90度，竖立方向为免疫细胞培养室朝下，而肿瘤细胞培养室朝上；竖立放置1-6h后，取出观察，肿瘤细胞紧贴在细胞培养室与基质室的交汇处形成薄层细胞层,形成统一的细胞运动起始位置。拍照记录细胞位置，将芯片放平移入37℃培养箱中培养、每隔24h换液一次，并定时拍照；
(3)在免疫细胞培养室中加入一定浓度的化合物或刺激因子，定时拍照记录免疫细胞形态及肿瘤细胞在基质室中的位置，实时记录细胞运动位置及形态改变。
4.按照权利要求3所述的一种基于器官芯片的肿瘤免疫微环境模拟及毒性评估方法，其特征在于：所述化合物为：碳纳米管(CNT)，所述化合物的浓度为：10-500μg/ml。
5.按照权利要求3所述的一种基于器官芯片的肿瘤免疫微环境模拟及毒性评估方法，其特征在于：所述肿瘤细胞在细胞接种时通过芯片侧立，使其粘附于基质表面，形成统一的细胞运动起始位置。
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