CN104611224A - 一种细胞共培养微流控芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细胞共培养微流控芯片及其应用，所述细胞共培养微流控芯片包括培养通道和微通道，所述培养通道通过微通道进行连接，所述培养通道的高度为100-300μm，所述微通道的高度≤5μm。本发明通过所述微流控芯片构建了肿瘤的神经微环境，为研究肿瘤微环境、神经-癌症相互作用的基本研究提供了平台，同时还可应用于基于细胞和细胞之间作用的药物检测，用以筛选相关神经药物的抗肿瘤效果，为发现抗癌药物的分析提供新的途径。

Description

一种细胞共培养微流控芯片及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种微流控芯片及其应用，尤其涉及一种细胞共培养微流控芯片及其应用。

背景技术

肿瘤微环境对于肿瘤形成、发展、转移和复发具有重要作用。神经系统是组织微环境的一个共同特征，但目前神经系统在肿瘤生长和发展中的认识仍较肤浅。已有报道，在动物模型中，在肿瘤内及肿瘤周围的高密度神经生长可以帮助癌症的生长和扩散。之前的研究也曾表明癌细胞有时候会沿着神经迁移，但是对于其中具体的作用机制，科学家们尚不十分了解。因此，建立肿瘤的神经微环境的体外模型，不仅有利于阐明神经在癌症生长和转移中的作用，而且有可能引导我们进一步开发治疗癌症的新策略。

细胞共培养技术能有效地模拟体内微环境，是目前细胞生物学的常用手段之一。目前常用的细胞共培养装置需要联合使用昂贵的基质胶(Matrix gel)以及Transwell培养小室。目前最常见的神经-癌细胞共培养体系主要是将神经元和癌细胞分别接种于胶中，然后将这两种细胞置于同一培养环境中进行培养和观察(Ayala et al.,In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell lineinteraction:redefining perineural invasion in prostate cancer.The Prostate,49(3):213-23,2001)。这种传统的培养装置存在诸多缺点：价格昂贵，细胞分布不均，难以精确的模拟体内真实情况、操作难度大等。由于现有的共培养装置存在的种种缺陷，因此急需研发一种更加便捷、实用、直观的细胞共培养装置。

近年来，微流控芯片技术作为一门迅速发展的科学技术，已经在生物医学领域展现了独特的优势。微流控芯片作为一种新型的研究平台，具有高密度、高通量、集成化、样品消耗量低、多重平行分析、便携式、成本低等优势，已经在生命科学研究领域发挥着重要的作用。比如图案化细胞共培养，其采用将不同细胞选择性地粘附在材料表面的不同区域，来调控多种细胞之间的相互作用(Li et al.,A method for patterning multiple types of cells by using electrochemicaldesorption of self-assembled monolayers within microfluidic channels.Angew ChemInt Ed Engl.46(7):1094-6)。特别是近年来发展的区室化微流控芯片(microfluidiccompartmentalized chip)，因其具有高度差的区室化结构，可以精确控制神经突(树突和轴突)的区域化定向生长(Taylor et al.,A microfluidic culture platform forCNS axonal injury,regeneration and transport.Nature Methods,2(8):599-605,2005)，该技术为构建神经微环境提供可能，在神经细胞生物学中被广泛采用。然而，利用类似的区室化微流控芯片同时完成神经-癌细胞的植入共培养及研究其相互作用，并进一步进行抗肿瘤药物的筛选研究工作，在目前的应用领域尚处于空白阶段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微流控芯片及其应用，特别是一种细胞共培养微流控芯片及其应用。通过该细胞共培养微流控芯片可以构建肿瘤的神经微环境，为研究肿瘤微环境、神经-癌症相互作用的基本研究以及抗肿瘤药物的筛选提供了平台。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种细胞共培养微流控芯片，该微流控芯片包括培养通道和微通道，所述培养通道通过微通道进行连接，其中，所述培养通道的高度为100-300μm，所述微通道的高度≤5μm。

本发明采用含有两层高度不同的嵌套微流控通道结构，并对其中微通道的高度进行了特殊设计，使其高度控制在5μm以内。该高度设计保证了微通道只允许神经突的生长和通过，有助于诱导神经突的定向生长，以便直观地研究在神经微环境中神经-癌细胞的相互作用。

本发明通过采用将培养通道和微通道设置成上述特定的高度比，由于培养通道的高度限制，中间的微通道只允许神经突的生长和通过，而神经元胞体和癌细胞则被限制在各自的培养通道中，从而形成区室化细胞共培养微流控芯片。

本发明中，所述培养通道的高度为100-300μm，例如可以是100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、220μm、250μm、280μm、300μm，优选为150μm。

本发明中，所述微通道的高度≤5μm，例如可以是2μm、2.2μm、2.5μm、2.8μm、3μm、3.2μm、3.5μm、3.8μm、4μm、4.2μm、4.5μm、4.8μm、5μm，优选为5μm。

本发明中，所述培养通道的长度为1-2cm，例如可以是1cm、1.1cm、1.2cm、1.3cm、1.4cm、1.5cm、1.6cm、1.7cm、1.8cm、1.9cm、2cm。

本发明中，所述培养通道的宽度为1-3mm，例如可以是1mm、1.2mm、1.5mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.5mm、2.8mm、3mm。

本发明中，所述微通道的长度为300-500μm，例如可以是300μm、320μm、350μm、380μm、400μm、420μm、450μm、480μm、500μm。

本发明中，所述微通道的宽度为3-5μm，例如可以是3μm、3.2μm、3.5μm、3.8μm、4μm、4.2μm、4.5μm、4.8μm、5μm。

本发明中，所述培养通道的间距为300-500μm，即为微通道的长度，例如可以是300μm、320μm、350μm、380μm、400μm、420μm、450μm、480μm、500μm。

本发明中，所述微通道的间距为10-20μm，例如可以是10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm。

本发明中，所述细胞共培养微流控芯片的材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料。

第二方面，本发明还提供了一种细胞共培养的方法，所述方法采用如本发明第一方面所述细胞共培养微流控芯片。

本发明中，所述细胞共培养的方法包括以下步骤：分别将神经细胞和癌细胞通入不同的培养通道，并诱导神经突沿着微通道定向生长，构建神经-癌细胞共培养体系。

优选地，所述神经细胞的密度为4×10⁷-7×10⁷cells/mL，优选为6×10⁷cells/mL。

优选地，所述癌细胞的密度为4×10⁶-7×10⁶cells/mL，优选为6×10⁶cells/mL。

优选地，所述神经细胞和癌细胞通入位于微通道两侧不同的培养通道。

作为优选的技术方案，本发明中所述细胞共培养的方法包括以下步骤：

(1)制备神经元的悬浮溶液，细胞密度为4×10⁷-7×10⁷cells/mL，恒温培养30-60min后，神经元细胞贴壁在培养通道中，72-96h后，所述神经元细胞被限制在培养通道中，形成神经元培养通道，并诱导神经突沿着微通道定向生长；

(2)制备癌细胞的悬浮溶液，细胞密度为4×10⁶-7×10⁶cells/mL，恒温培养6-8h后，癌细胞贴壁在步骤(1)对面的培养通道中，所述癌细胞被限制在该培养通道中，形成癌细胞培养通道；

(3)待神经突生长并达到对面的癌细胞培养通道时，揭去聚二甲基硅氧烷印章，在开放体系下观察神经-癌细胞的相互作用。

本发明的细胞共培养方法中，通过采用细胞共培养微流控芯片，可以有效建立神经-癌细胞共培养体系，例如可以在微流控芯片两侧的培养通道中分别通入神经元和癌细胞，中间连接微通道，该微通道可以诱导神经突的定向生长，研究在神经纤维的引导下癌细胞的迁移活动，从而明确了神经微环境中神经-癌细胞的相互作用，为研究肿瘤生长和发展提供了新思路。

第三方面，本发明还提供了一种药物筛选的方法，该方法采用如本发明第一方面所述细胞共培养微流控芯片。

有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明利用区室化微流控芯片技术来控制神经突的定向生长，模拟并构建肿瘤的神经微环境，为研究肿瘤微环境、神经-癌症相互作用的基本研究提供了平台，同时还可以用于基于细胞和细胞之间作用的药物检测，用以筛选相关神经药物的抗肿瘤效果，为发现抗癌药物的分析提供了新的途径；

(2)本发明利用体外微流控芯片的研究方法，便于观察，设备简单，样本和试剂用量小，平行培养能力强，能更真实地反映人体肿瘤微环境中的神经系统的作用，有利于观察细胞与细胞之间相互作用，也有利于快速筛选新药的疗效和毒性，在细胞生物学、肿瘤、药物筛选等相关领域具有广泛的应用价值。

附图说明

图1是本发明的细胞共培养微流控芯片的结构示意图；

图2是基于微流控芯片的神经元-癌细胞共培养模型；

其中，图2-a表示微流控芯片中含有中间连接的微通道，图2-b表示微流控芯片中不含有中间连接的微通道；

图3表示癌细胞在有/无神经突引导下的迁移情况；

其中，图3-a表示癌细胞在有神经突引导下的迁移情况，图3-b表示癌细胞在无神经突引导下的迁移情况，图3-c表示癌细胞在有/无神经突引导下的平均迁移距离比较；

图4表示癌细胞在有/无神经损伤时的迁移情况；

其中，图4-a表示无神经损伤时癌细胞的迁移情况，图4-b表示用化学方法诱导神经纤维的损伤，癌细胞在24h内的迁移情况，图4-c表示癌细胞在有/无神经损伤时，癌细胞在24h的平均迁移距离比较；

图5表示在有/无药物处理时阻断癌细胞的迁移情况；

其中，图5-a表示未进行药物处理时癌细胞的迁移情况，图5-b表示药物处理时癌细胞的迁移情况，图5-c表示癌细胞在有/无药物处理时，癌细胞在24h的平均迁移距离比较。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

细胞共培养微流控芯片的制作方法如下：

1)培养皿的涂层：在干净的培养皿(Corning，直径35mm)里加入1mL0.1mg/mL多聚赖氨酸(PDL)，37℃孵育1-2小时后，制得表面涂覆有PLD的培养皿表面，用无菌水洗涤3次以便除去未吸附的分子，无菌操作台中晾干备用。

2)SU-8光刻模具的制作：使用多次光刻技术在硅片上制备出双层结构的凸型微结构单元。首先用作图软件autoCAD设计出所需要的双层套刻结构，该图结构包括：位于左右位置的直线型凸型线，以及连接所述左右凸型线的微凸型线阵列。所述的左右两条凸型线的长度为2cm，宽度2mm，高度150μm，左右两条凸型线平行且间距为450μm。所述微凸型线阵列的长度为450μm，宽度为5μm，高度为5μm，微凸型线阵列平行且相互间距为15μm。所述左右直线型凸槽和连接的微凸槽阵列的底部在同一水平面上；然后打印为分别率为3600dpi的胶片。

利用甩胶机在干净的硅片基底上均匀的甩涂SU-8光刻胶，厚度5μm，热板上65℃烘烤1min，在光刻机上第一次曝光后，将硅片放到热板上进行曝光后烘烤，65℃烘烤1min，这样第一层的凸型就转移到SU-8光刻胶上。再将SU-8甩涂到基片上，厚度150μm，完成前烘烤，将第二层掩膜板与第一层光刻图形进行对准，第二次曝光后和后烘烤，形成双层图形结构的SU-8模板。

3)制作PDMS芯片：将聚二亚甲基硅氧烷(PDMS)单体和固化剂按照10:1质量比均匀混合，抽真空脱气后，倒入上述的凸型微结构单元的模具进行翻模，80℃烘烤4-5小时固化，得到与所述微结构相对应的、具有双层凹型图案的PDMS印章。最后，将PDMS从硅片上剥离，并在左右凹槽的两端打孔作为进行口和出样口，并切割合适大小。

4)利用高压灭菌锅，对PDMS印章进行灭菌，121℃灭菌15min。然后置于80℃烘箱烘干，备用。

5)将步骤4)得到的PDMS印章取出，把有凹型图案的面向下与步骤1)的培养皿表面接触，形成封闭的流通管腔，得到的细胞共培养微流控芯片如图1所示。

实施例2

利用本发明的细胞共培养微流控芯片进行细胞共培养，具体步骤如下：

1)制备DRG神经元的悬浮溶液，细胞密度为6 x 10⁷cells/ml，然后把DRG神经元通入左边的管腔中，在对面通道中加入培养基作为平衡，并用培养基浸泡芯片。培养基为基础培养基+2％B27补体+1％PS双抗。恒温培养箱中培养，培养30-60分钟，神经元细胞贴壁在右侧通道的培养皿表面上；72-96小时之后，由于高度限制，神经元胞体限制在神经元通道中生长，而神经突生长并通过微凹型通道到达对面通道。

2)制备不同的癌细胞(人前列腺癌细胞PC-3，人胰腺癌细胞Panc-1，或人乳腺癌细胞MCF-7等)的悬浮溶液，调整密度至6 x 10⁶cells/ml。吸出PDMS印章周围及右侧空白通道内的细胞培养液，在空白通道内种入癌细胞，并再次加入培养基浸泡芯片。移入恒温培养箱中继续培养6-8小时，癌细胞贴壁在右侧通道的培养皿表面上。轻轻揭掉PDMS印章，洗除未贴壁的细胞，并加入培养基，形成神经-癌细胞共培养体系，该体系如图2所示，以培养通道中间无连接微通道作为对照，其中，图2-a是微流控芯片中含有中间连接的微通道，图2-b是微流控芯片中不含有中间连接的微通道，通过图2可以看出，当培养通道中含有中间连接的微通道时，可诱导神经突的定向生长，而当培养通道中不含有中间连接的微通道时，无神经突的形成和作用。

通过显微镜观察神经-癌细胞两种细胞在生长过程中的互相作用，以及癌细胞在神经纤维作用下的迁移活动，结果如图3所示。其中，图3-a是癌细胞在有神经突引导下的迁移情况，图3-b是癌细胞在无神经突引导下的迁移情况，通过图3可以看出，癌细胞在有神经突的引导时，其24h的平均迁移距离要远大于无神经突引导的情况。

3)诱导神经损伤：在制备细胞共培养微流控芯片的过程中，在揭掉PDMS之前，在神经细胞通道中通入浓度为100μM的6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导神经及神经突的损伤，培养1小时。由于中间微凹槽的流体力作用，该处理不会对癌细胞造成影响。之后揭掉PDMS印章，记录观察癌细胞的迁移情况，并以无神经损伤为对照，结果如图4所示。其中，图4-a是无神经损伤时癌细胞的迁移情况，图4-b是用化学方法诱导神经纤维的损伤，癌细胞在24h内的迁移情况，通过图4可以看出，癌细胞在有神经损伤时，其24h的平均迁移距离远小于无神经损伤的情况。

4)在步骤2)之前，对癌细胞进行预处理。将PC-3与相关表面受体拮据剂进行孵育，37℃隔夜孵育。用到的药物属于抑制神经作用的药物，包括肾上腺素受体阻滞剂(propranolol和penbutolol)，乙酰胆碱受体拮据剂(atropine,hyoscine和mecamylamine)等，处理癌细胞使用的药物浓度均为10μM。然后按照步骤2)将PC-3细胞种入通道，观察癌细胞迁移速度的改变，并以未进行药物处理为对照，结果如图5所示。其中，图5-a是未进行药物处理时癌细胞的迁移情况，图5-b是药物(比如10μM propranolol)处理时癌细胞的迁移情况，通过图5可以看出，采用药物处理癌细胞时，其24h内的平均迁移距离要远小于未进行药物处理时癌细胞的平均迁移距离。

通过上述实施例可以看出，本发明采用含有两层高度不同的嵌套微流控通道结构，并对微通道的高度进行特殊设计，有助于诱导神经突的定向生长，以便直观地研究在神经微环境中神经-癌细胞的相互作用，同时还可以用于基于细胞和细胞之间作用的药物检测，用以筛选相关神经药物的抗肿瘤效果，为发现抗癌药物的分析提供了新的途径，具有广泛的应用价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞共培养微流控芯片，其特征在于，所述细胞共培养微流控芯片包括培养通道和微通道，所述培养通道通过微通道进行连接，所述培养通道的高度为100-300μm，所述微通道的高度≤5μm。

2.如权利要求1所述的细胞共培养微流控芯片，其特征在于，所述培养通道的高度为100-300μm，优选为150μm；

优选地，所述微通道的高度为3-5μm，优选为5μm。

3.如权利要求1或2所述的细胞共培养微流控芯片，其特征在于，所述培养通道的长度为1-2cm；所述培养通道的宽度为1-3mm，优选地，所述培养通道的宽度为2mm；

优选地，所述微通道的长度为300-500μm；优选地，所述微通道的宽度为3-5μm。

4.如权利要求1-3任一项所述的细胞共培养微流控芯片，其特征在于，所述培养通道的间距为300-500μm；

优选地，所述微通道的间距为10-20μm。

5.如权利要求1-4任一项所述的细胞共培养微流控芯片，其特征在于，所述细胞共培养微流控芯片的材料为聚二甲基硅氧烷。

6.一种细胞共培养的方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求1-5任一项所述细胞共培养微流控芯片。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：分别将神经细胞和癌细胞通入不同的培养通道，并诱导神经突沿着微通道定向生长，构建神经-癌细胞共培养体系。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述神经细胞的密度为4×10⁷-7×10⁷cells/mL，优选为6×10⁷cells/mL；

优选地，所述癌细胞的密度为4×10⁶-7×10⁶cells/mL，优选为6×10⁶cells/mL；

优选地，所述神经细胞和癌细胞通入位于微通道两侧不同的培养通道。

9.如权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制备神经元的悬浮溶液，细胞密度为4×10⁷-7×10⁷cells/mL，恒温培养30-60min后，神经元细胞贴壁在培养通道中，72-96h后，所述神经元细胞被限制在培养通道中，形成神经元培养通道，并诱导神经突沿着微通道定向生长；

(2)制备癌细胞的悬浮溶液，细胞密度为4×10⁶-7×10⁶cells/mL，恒温培养6-8h后，癌细胞贴壁在步骤(1)对面的培养通道中，所述癌细胞被限制在该培养通道中，形成癌细胞培养通道；

(3)待神经突生长并达到对面的癌细胞培养通道时，揭去聚二甲基硅氧烷印章，在开放体系下观察神经-癌细胞的相互作用。

10.一种药物筛选的方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求1-5任一项所述细胞共培养微流控芯片。