KR100992387B1

KR100992387B1 - 자극체를 이용한 세포 배양기 및 세포 배양 방법

Info

Publication number: KR100992387B1
Application number: KR1020080009635A
Authority: KR
Inventors: 정효일; 김태진; 이흥용
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2008-01-30
Filing date: 2008-01-30
Publication date: 2010-11-05
Also published as: KR20090083679A

Abstract

본 발명은 자극체를 이용한 세포 배양기 및 세포배양 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자극체로 마이크로 비드(micro-bead)를 이용하여 세포를 물리적으로 자극함으로써 그 증식 속도를 극대화하여 적은 양의 샘플로도 원하는 양의 세포를 얻을 수 있고, 사용원리가 간편하면서도 적용이 쉬운 세포배양기 및 세포 배양 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 미세유로 채널을 구비하는 세포 배양기를 이용하여 세포를 배양하는 방법으로서, 상기 미세유로 채널의 내부 표면을 친수성 표면으로 처리하는 표면 처리 단계, 상기 미세유로 채널에 배양할 세포를 주입하는 세포 주입 단계, 및 상기 미세유로 채널에 세포 배양액과 함께 상기 세포를 물리적으로 자극시키기 위한 마이크로 비드를 주입하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법이 제공된다.

자극체, 마이크로 비드, 세포 배양, 증식, 미세유로 채널

Description

자극체를 이용한 세포 배양기 및 세포 배양 방법 {Microfluidic cell stimulation device utilizing micro-bead impact}

최근 바이오 공학이 발전하면서 세포 배양 및 세포 자극에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

지금까지 연구되어 온 세포 자극을 이용한 세포 배양 방법으로는, 압축을 이용한 세포 가능 방법, 기판상에 세포를 올려놓고 상기 기판에 인장력을 가하여 세포에 간접적으로 자극을 주는 방법, 세포가 놓여있는 기판 표면을 구부려 세포에 인장력과 공간적인 변화를 주며 자극하는 방법, 유체 내에 세포를 위치시킨 후 전단력을 가하여 세포를 자극하는 방법, 유체의 팽창력을 이용하여 유체 내의 세포에 물리적 자극을 주는 방법, 세포 자체를 팽창시켜 자극시키는 방법 등이 있다.

한편, 해외에서는 사이언티피카(Scientifica)사의 슬라이스 메이트(SliceMate), 웨이퍼젠 사(Wafergen co.)의 스마트 슬라이드(SmartSlide), 하버버드 어퍼러투스(Harvard Apparatus) 사의 오픈 퍼퓨젼 마이크로인큐베이터(Open Perfusion Micro-Incubator), 클로즈드 퍼퓨젼 마이크로인큐베이터(Closed Perfusion Micro-Incubator) 등이 개발되었다.

상기 장치들 또한 위에 열거된 방법들 중의 하나 또는 일부를 이용하여 세포 또는 조직을 배양하는 방법을 적용하고 있으며, 원하는 양의 샘플을 조절하거나 온도를 조절할 수 있는 등의 기능을 가지고 있다.

그러나, 상기 장치들은 한번에 한 가지의 실험 밖에 수행할 수 없거나 복잡한 구조의 장비이기 때문에 공간적 효율성이 떨어지거나 전문가가 아니면 장비 조작의 어려움이 있으며 세포 배양 시간이 오래 걸리는 등의 문제점을 가지고 있다. 또한, 세포 배양 장치들은 많은 양의 세포와 배양액이 요구될 뿐만 아니라 배양 관련 소모품들도 적지 않게 소비되는 등의 문제가 있으며, 기존의 소형 세포 배양기 또한 현미경을 이용한 실시간 관찰은 가능하지만 세포 배양기 내부 자체의 공간적 여유도 제한적인 점 등의 문제가 있다.

줄기 세포들을 비롯한 일부 세포들은 배양 조건이 매우 까다로우며 오랜 시간동안 배양해야 비로소 원하는 양의 세포를 얻을 수 있으며, 많은 실험자들은 적은 양의 세포만으로도 다양한 실험을 수행하고자 하는데, 위와 같은 장비로는 적은 양의 세포를 빠르게 증식시키지 못할 뿐만 아니라 장치의 복잡성 등의 문제로 인해 이러한 실험자들의 욕구를 채워줄 수 없다.

한편, 세포에 보다 능동적인 자극을 가하는 기술은 전무한 상태이며 세포 자극과 관련한 연구는 활발하게 진행되고 있으나 아직까지 직접적이고 적극적인 자극 시스템과 통합된 세포 배양기는 개발되지 않은 실정이다.

따라서, 빠른 증식 속도를 이용하여 적은 양의 샘플로도 원하는 양의 세포를 얻을 수 있고, 사용원리가 간편하면서도 적용이 쉬운 세포 배양법에 대한 개발이 필요하다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 물리적인 자극체(마이크로 비드)를 이용하여 세포를 직접적으로 자극함으로써 적은 양의 세포로도 빠른 증식 속도를 얻을 수 있게 하는 세포 배양 방법 및 세포 배양기를 제공하는 것에 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는, 누구나 쉽고 빠르게 세포를 배양할 수 있고 적은 수의 세포로도 빠른 시간내에 다양한 실험을 실시할 수 있게 하는 세포 배양 방법 및 세포 배양기를 제공하는 것에 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는, 미세유로 환경 내에서 최대한의 세포 배양 효과를 얻을 수 있게 하는 초미세 세포 배양기 및 세포 배양 방법을 제공하는 것에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징은 다음과 같다.

본 발명의 일 실시형태에 따르면, 주입구, 미세유로 채널, 배출구로 이루어져 상기 미세유로 채널에서 세포를 배양하기위한 세포배양기에 있어서,상기 주입구에 장착, 탈착되도록 이루어지며, 세포를 포함하는 배양액을 상기 주입구로 주입하는 제1주입튜브;상기 주입구에 장착, 탈착되도록 이루어지며, 마이크로 비드를 포함하는 배양액을 상기 주입구로 주입하는 제2주입튜브;상기 주입구에 장착, 탈착되도록 이루어지며, 순수 배양액(clean media)을 상기 주입구로 주입하는 제3주입튜브;를 더 구비하여 이루어진 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 일 실시형태에 따르면, 세포배양기는, 배양하고자 하는 세포를 포함하는 배양액 또는 마이크로 비드를 포함하는 배양액 또는 순수 배양액을 주입하는 주입구; 그 일측이 상기 주입구에 연결되어, 상기 주입구로 부터 흘러들어온 세포를 배양하며, 상기 주입구로 부터 흘러들어온 마이크로 비드가 통과하는 미세유로 채널;상기 미세유로 채널의 다른 일측에 연결되어 있으며, 상기 미세유로 채널에서 흘러나오는 배양액 또는 마이크로 비드를 배출하는 배출구;를 적어도 구비하여 이루어진 것을 특징으로 한다.

상기 세포배양기는 PDMS(Polydimethylsiloxane)으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

삭제

상기 제1주입 튜브, 상기 제2주입튜브, 상기 제3주입튜브는 실리콘(silicone)으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

상기 배출구에 장착되는 배출 튜브를 더 구비하며

상기 배출 튜브는 실리콘(silicone)으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

상기 세포배양기가 유리 기판상에 복수개 장착되어 이루어진 것을 특징으로 한다.

상기 미세유로 채널에서 길이는 약 7mm이며, 폭은 약 0.5mm 이며, 높이는 약 0.1mm 인것을 특징으로 한다.

상기 마이크로 비드의 종류는 폴리스티렌(Polystyrene)이며, 그 직경은 약 2 내지 11㎛ 인것을 특징으로 한다.

상기 미세유로 채널의 일측에는 길이 표시자(0.1mm의 위치마다 표시하는 표시자)를 더 구비한다.

주입구에 제1주입튜브를 연결하여 미세유로 채널로 세포를 포함하는 배양액을 흘린 후, 세포가 자라도록 기다린 다음에, 제2주입튜브가 주입구에 연결되어 미세유로 채널로 마이크로 비드가 들어 있는 배양액을 흘리게 되고, 제3주입 튜브를 주입구에 연결하여 순수배양액을 미세유로 채널에 흘려 잔여 마이크로 비드를 배출시키도록 하여 세포를 배양하는 것을 특징으로 한다.

상기 주입구에 제1주입튜브를 연결하여 미세유로 채널로 세포를 포함하는 배양액을 흘린 후, 세포가 자라도록 기다리는 시간은 약 8 내지 12시간인 것을 특징으로 한다.

상기 제2주입튜브가 주입구에 연결되어 미세유로 채널로 마이크로 비드가 들어 있는 배양액을 흘리고, 제3주입 튜브를 주입구에 연결하여 순수배양액을 미세유로 채널에 흘려 잔여 마이크로 비드를 배출시키도록 하는 것을 반복하여 세포를 배양하는 것을 특징으로 한다.

상기 반복간격은 12시간인 것을 특징으로 한다.

총 반복회수는 5회인 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 일 실시형태에 따르면, 미세유로 채널을 구비하는 세포 배양기를 이용하여 세포를 배양하는 세포배양방법에 있어서,상기 미세유로 채널의 내부 표면을 친수성 표면으로 처리하는 표면 처리 단계; 상기 미세유로 채널에 배양할 세포를 주입하는 세포 주입 단계; 및 상기 미세유로 채널에 세포 배양액과 함께 상기 세포를 물리적으로 자극시키기 위한 마이크로 비드를 주입하는 단계를 포함한다.

상기 표면 처리 단계 이후에 상기 미세유로 채널 내부를 소독하는 내부 소독 단계를 더 포함한다.

상기 미세유로 채널은, 실리콘 웨이퍼 상에 SU-8 를 코팅하고, 그 위에 미세유로가 형상화된 포토마스크를 덮고 노광시킨 후, 상기 포토마스크를 제거하고, 액상의 PDMS 를 주입한 후 고형화시킴으로써 제조된다.

상기 표면 처리 단계는, 상기 미세유로 채널의 내부 표면을 O₂ 플라즈마 처리하여 친수성 표면으로 개선시키는 단계; 및 상기 미세유로 채널에 증류수를 밀어넣어 친수성 표면이 소수성 표면으로 변질되는 것을 방지하는 단계를 포함한다.

상기 세포는 인간 암세포(HeLa Cell), 쥐의 조골세포계(osteoblast cell line)인 MC3T3 세포(cell), 또는 뼈세포이다.

삭제

상기 세포 배양액과 상기 마이크로 비드를 주입하는 단계는, 상기 마이크로 비드가 섞인 세포 배양액을 12시간 단위로 주입하는 단계를 포함한다.

본 발명의 세포 배양 방법에 따르면, 물리적인 자극체인 마이크로 비드를 이용하여 세포를 직접적으로 자극함으로써 적은 양의 세포로도 빠른 세포 증식 속도를 얻을 수 있다.

또한, 누구나 쉽고 빠르게 세포를 배양할 수 있고 적은 수의 세포로도 빠른 시간내에 다양한 실험의 실시가 가능하다.

한편, 미세유로 환경 내에서 최대한의 세포 배양 효과를 얻을 수 있게 함으로써 초미세 세포 배양기의 개발에 있어 통합된 시스템의 구축이 가능하다.

이하, 첨부되는 도면을 참조하여 본 발명의 다양한 실시형태들을 상세히 설명한다. 본 발명에서는 자극체로서 마이크로 비드를 사용한다.

도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 자극체를 이용한 세포 배양기를 설명하기 위한 설명도로, 주입구(100), 미세유로 채널(300), 배출구(400)를 구비하여 이루어진다. 주입구(100), 미세유로 채널(300), 배출구(400)는 PDMS(Polydimethylsiloxane)으로 이루어질 수 있으며, 경우에 따라서는 슬라이드 글라스(slideglass), 유리 등의 다른 재질로 이루어질 수 있다.

주입구(100)는 배양하고자 하는 세포를 포함하는 배양액 또는 자극체를 포함하는 배양액을 주입하는 주입구로서, 미세유로 채널(300)의 일측에 위치된다. 즉, 주입구(100)에는 세포를 포함하는 배양액 또는 자극체를 포함하는 배양액을 주입하는 주입 튜브(110)가 장착되어 진다. 여기서 자극체는 마이크로 비드 일 수도 있으며, 주입 튜브(110)는 실리콘(silicone)으로 이루어질 수 있다. 주입 튜브(110)는 세포를 포함하는 배양액을 주입하기 위한 주입 튜브(제1주입튜브), 자극체를 포함하는 배양액을 주입하기 위한 주입 튜브(제2주입튜브), 순수배양액을 주입하기 위한 주입 튜브(제3주입튜브)를 포함할 수 있다.

주입구(100)에는 세포를 포함하는 배양액이 들어 있는 주입 튜브가 장착되어 미세유로 채널(300)로 상기 세포를 포함하는 배양액을 흘린 후, 세포가 자라도록 소정시간(약 8~12시간) 기다린 다음에, 자극체(예로, 마이크로 비드)가 들어 있는 배양액이 들어 있는 주입 튜브가 주입구(100)에 장착되어 미세유로 채널(300)로 자극체가 들어 있는 배양액을 흘리게 되고, 그러면 세포는 바닥에 붙어 있으므로 자극체 만이 배출구(400)로 배출되나 일부의 자극체가 미세유로 채널(300)에 남아 있을 수 있으며 이의 제거를 위해서 그리고 세포의 배양을 돕기 위해서, 순수배양액(clean media)이 들어 있는 주입 튜브를 주입구(100)에 장착하여 순수배양액을 미세유로 채널(300)에 흘려 남아 있는 자극체를 배출시킨다. 약 12시간 후에 이를 반복하며, 이렇게 총 5회 반복할 수 있으며, 이러할 경우 이를 종합하여 약 60시간 걸린다.

미세유로 채널(300)는 미세유로 채널로 시료 주입이 용이한 직선 형태를 이루며, 주입구(100)와 배출구(400)의 사이에 위치되어, 주입구(100)로부터 배양액과 같이 주입된 세포가 여기서 성장되며, 주입구(100)에서 들어온 자극체가 들어 있는 배양액, 또는 순수배양액이 미세유로 채널(300)를 거쳐 배출구(400)로 배출한다. 특히, PDMS는 생물학적 적합성이 있고 뛰어난 산소 투과성을 갖고 있기 때문에, 세포를 배양하기 위한 미세유로 채널의 재료로서 적합하다.

배출구(400)는 배출 튜브(410)가 장착되어 미세유로 채널(300)에서 흘러나오는 자극체가 들어 있는 배양액, 또는 순수배양액 등을 배출한다. 배출 튜브(410)는 실리콘(silicone)으로 이루어질 수 있다.

도 2는 도 1의 세포 배양기의 일예이다.

도 2의 a)는 복수의 세포 배양기(10)를 나타낸다. 즉, 도 2의 a)는 복수의 세포 배양기(10)가 슬라이드글라스 등의 유기 기판에 장착되어 있다. 그리고 도 2의 b)는 하나의 세포 배양기를 설명하기 위한 설명도이다.

도 2는 유기 기판상에 세포 배양기(10)가 5개 부착된 경우를 나타내고 있지만 이에 한정되지 않으며, 배양하고자 하는 세포 종류의 수, 원하는 배양 실시 횟수에 따라 다양한 개수의 세포 배양기(10)를 포함할 수 있다.

세포 배양부는 PDMS로 제작된 미세유로 채널으로 이루어지는데, PDMS는 생물학적 적합성이 있고 뛰어난 산소 투과성을 갖고 있기 때문에, 세포를 배양하기 위해 적합하다.

주입구(100)와 배출구(400)의 반경은 약 2mm이고, 미세유로 채널(300)의 길이는 약 7mm, 폭은 약 0.5mm, 높이는 약 0.1mm이고, 미세유로 채널(300)의 일측에는 0.1mm의 위치마다 표시하는 표시자들이 있어, 소정 면적당 세포수 등을 알 수 있다.

도 3은 도 1의 자극체를 이용한 세포 배양기를 제작하는 방법의 일 실시예를 설명하는 설명도이다.

SU-8을 이용하여 미세유로 채널 제작 틀을 만든다(S110).

PDMS에 경화제를 섞은 후에 고온(90℃)에서 보관하여 고체로 한다(S120). PDMS는 그 전에는 액체 상태이기 때문에 이때는 미세유로 채널 제작틀에 부은후 오븐(oven)에 저장하면 된다.

충분히 굳힌 후 떼어내면 고체화된 PDMS는 미세유로 채널 모양대로 성형된다(S130).

PDMS채널, 즉, PDMS로 만들어진 미세유로 채널을 유리기판에 붙이면 디바이스가 완성된다. 이때 후처리를 통해 PDMS와 유리기판을 붙인다.

미세유로 채널을 제작하는 방법을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

우선, 실리콘 웨이퍼 상에 음의 포토레지스트(negative photoresist)인 SU-8 를 코팅한다. 이 과정에서 코팅기의 회전속도를 조절하여 코팅의 높이를 적절하게 조절할 수 있다.

그 후, SU-8이 코팅된 실리콘 웨이퍼 상에 미세유로 채널이 형상화된 포토마스크를 덮고 노광시킨다. 여기서의 포토마스크에는 배양 세포, 배양액 등의 유체, 및 세포 자극체를 주입하기 위한 시료 주입구 및 시료 배출구가 추가로 형상화될 수 있다.

그 후, 포토마스크를 제거하여 미세유로 채널 제작 틀을 제작한다. 이렇게 만들어진 미세유로 채널 제작 틀에 PDMS를 부어 미세유로 채널을 제작시에 PDMS 와 SU-8 를 분리해낼 때 원치않는 접합부 형성을 방지하기 위해, 트리클로 로(trichloro; 1H,1H,2H,2H-perfluor-ooctyl) 실란(silane) 처리를 수행할 수 있다. 미세유로 채널 제작 틀은 SU-8로 미세유로 채널패턴이 형성되어있는 실리콘 웨이퍼로 이루어진다.

다음으로, SU-8로 채널패턴이 형성되어있는 실리콘 웨이퍼, 즉 미세유로 채널 제작 틀 상에 액상의 PDMS를 주입한다. 이 PDMS는 젤(gel) 혼합물 형태일 수도 있다.

그 후, 미세유로 채널 제작 틀 상에 주입된 PDMS에 진공을 걸어 PDMS 주입시 발생한 기포를 모두 제거하고, 70℃ 에서 2시간 정도 열처리하여 PDMS를 고형화시키고, 고형화된 PDMS를 실리콘 웨이퍼에서 떼어낸다.

마지막으로, 실리콘 웨이퍼에서 떼어낸 PDMS를 기판 표면에 부착함으로써 미세유로 채널로 형성되는 세포 배양기(10)가 얻어질 수 있다.

도 4는 도 1의 세포 배양기의 미세유로 채널의 단면을 모식적으로 나타낸 모식도이며, 도 5는 본 발명의 일 실시형태에 세포 배양 방법의 과정의 흐름도이다. 이하, 도 4 및 도 5를 참조하여 본 발명의 세포 배양기(10) 및 이를 이용한 세포 배양 방법에 대해 설명한다.

도 4에서와 같이, 본 발명의 세포 배양 방법에 적용되는 세포 배양기(10)는 미세유로 채널(300), 미세유로 채널(300)의 양단에 각각 형성되는 시료의 주입구(100) 및 시료의 배출구(400)를 포함한다. 주입구(100) 및 배출구(400)는 미세유로 채널(300)의 제작시에 함께 형성될 수 있다. 주입구(100)로부터 배양액과 같이 주입된 세포가 미세유로 채널(300)에서 바닥에 붙어 자라는데, 여기에 마이크로 비드 등의 자극체를 포함하는 배양액을 주입구(100)로 주입하면 자극체를 포함하는 배양액은 미세유로 채널(300)을 통해 배출구(400)로 배출된다. 이때 미세유로 채널(300)을 통과할 때 미세유로 채널(300)의 바닥에 붙어 자르는 세포를 자극하게 되며, 이로 인해 세포는 보다 빠른 증식 속도 증식하게 된다.

도 5에서와 같이, 본 발명의 세포 배양법은 미세유로 채널(300) 내부의 표면을 산소플라즈마(O₂ 플라즈마) 처리법 등에 의해 처리한다(S310). 이는 미세유로 채널(300) 내에 주입되어 배양되는 세포가 미세유로 채널(300) 내부의 표면에 부착되기 쉽도록 하기 위해 미세유로 채널(300) 내부 표면을 처리하는 것이며, 이를 위해서는 미세유로 채널(300) 내부 표면이 친수성을 유지할 수 있도록 처리하는 것이 바람직하다.

즉, PDMS로 제작된 미세유로 채널(300)의 내부 표면을 친수성으로 개선시키고 이를 유지할 수 있게 하는 방법으로서는 공지된 여러가지 기술을 사용할 수 있다. 일례로서, 미세유로 채널(300)의 내부에 O₂ 플라즈마 처리를 하여 친수성 표면으로 개선시키고, 증류수를 밀어넣어 친수성 표면이 소수성 표면으로 변질되는 것을 방지함으로써 친수성 표면을 유지할 수 있도록 처리할 수 있다.

다음으로, 미세유로 채널(300) 내부를 소독한다(S320). 미세유로 세포 배양기(200)는 제작된 후에 실험실 외부 공기와 접촉하면서 변질되거나 다른 화학물질을 포함할 가능성이 높기 때문에 실험 실시 저에 반드시 소독 과정을 거쳐야 한다.

이렇게 하여 미세유로 채널(300) 내부 표면을 친수성으로 처리하고 소독을 하였다면, 배양할 세포를 주입시킨다(S330). 즉, 주입구에 세포를 포함하는 배양액이 들어 있는 주입 튜브가 장착되어 미세유로 채널(300)로 상기 세포를 포함하는 배양액을 흘린다. 후술하는 바와 같이, 본 발명에 따른 세포 배양은 마이크로 비드(micro-bead)등의 물리적 자극체를 이용하는 것이기 때문에 최대한 물리적 자극체의 자극에 민감한 세포를 택하는 것이 바람직하다. 이러한 세포의 일례로서는 인간 중간엽 줄기세포(Human Mesenchymal Stem Cell)를 비롯한 뼈세포들을 들 수 있다.

한편, 미세유로 채널(300)을 포함하는 세포 배양기(200)가 복수 개 사용되어 실험이 진행되는 경우에는 다른 세포 배양기(200)에서 배양되는 세포가 실험상 대조군 또는 비교군이 될 수 있으므로 최대한 각 세포 배양기(200)에 주입되는 세포수를 맞춰주는 것이 바람직하다. 또한, 세포의 농도가 매우 높게 되면 증식된 세포가 단시간에 미세유로 채널(300)의 내부 표면을 덮게 되어 세포의 증식률 등의 파악이 어려울 수 있으므로, 주입되는 세포의 농도를 적절하게 유지하는 것이 바람직하다.

다음으로, 미세유로 채널(300)에 주입한 세포를 배양시킨다(S340).즉, 미세유로 채널(300)에 주입한 세포가 자라도록 소정시간(약 8~12시간) 기다린다. 미세유로 환경에 있는 세포는 유체의 변화에 민감하게 반응할 수 있기 때문에 최대한 유체의 흐름을 주의해서 조절한다.

그 후, 세포의 배양을 돕기 위해, 자극체를 포함하는 세포 배양액을 공급한다(S350). 배양액은 최소한의 세포 배양을 위한 것으로서 세포에 따라 증식 속도가 다르기 때문에 세포의 종류에 따라 그 공급 시기에 차이가 있을 수 있으나, 일반적으로 12시간 단위로 새로운 배양액을 공급하는 것이 바람직하다.

세포 배양기(200)의 미세유로 채널(300)에 주입된 자극체는 미세유로 채널(300)을 통과하면서 세포에게 물리적으로 자극시켜 주며, 이때 자극체가 미세유로 채널(300)을 통과하여 배출되는 것을 돕기 위해 순수배양액을 공급한다(S360).

여기서, 자극체로서는 여러가지 종류의 마이크로 비드 등을 사용할 수 있으며 일반적으로 다른 유체, 예컨데 배양액과 혼합된 상태로 유입될 수 있다. 세포의 크기는 일반적으로 높이가 5㎛, 길이가 100㎛ 이하이기 때문에 자극체의 크기는 이를 고려하여 세포에 무리를 주지 않는 범위에서 선택하는 것이 바람직하되, 마이크로 비드의 크기는 약 2 내지 11㎛인 것이 보다 바람직하다.
한편, 자극체의 재질의 경우에도 지나치게 밀도가 높아 세포에 과다한 자극을 주지 않는 범위 내에서 물보다 밀도가 약간 높은 정도의 종류를 선택하는 것이 바람직하며, 밀도는 약 1.05 g/㎠ 인 것이 보다 바람직하다.
이러한 자극체는 단계 S350에서 주입된 세포 배양액과 따로 주입될 수도 있으나, 세포 배양액과 혼합되어 함께 주입될 수도 있으며, 이러한 경우 전술한 바와 같이 일반적으로 12시간마다 주입하는 것이 바람직하다.

이러한 세포 배양액 및 자극체의 주입을 반복적으로 수행함으로써 원하는 만큼의 세포를 배양할 수 있으며, 어느 정도의 목표 증식량을 달성하였다면 선택적으로 결과 분석 등을 수행할 수도 있다(S370).

이렇게 물리적인 자극체를 이용함으로써 물리적인 자극에 노출되어 있는 세포에 매우 가깝게 접근하여 보다 효율적으로 세포를 자극할 수 있으며, 이로 인해 세포를 빠르고 쉽게 증식할 수 있어 실험 시간을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 적 은 수의 세포로도 원하는 양의 샘플을 쉽게 얻어 다양한 실험을 실시할 수 있다.

한편, 세포 배양기(200)를 복수로 구비할 수 있기 때문에 적은 양의 세포를 이용한 다양한 형태의 실험이 가능하다.

이하, 지금까지 설명한 본 발명의 세포 배양 방법을 이용한 실험예를 설명하도록 한다.

우선, 본 발명에 따른 세포 자극 실험에 대해 설명한다.

세포 배양기(10)의 미세유로 채널(300)로서는 가장 단순한 형태인 직선 형태의 미세유로 장치를 적용하였다. 이 미세유로 채널(300)은 4인치 웨이퍼 기판에 음의 포토레지스트(negative photoresist)인 SU-8을 코팅한 상태이다.

배양할 세포로서는 물리적 자극에 노출되어 있는 인간의 자궁암세포인 헬라 세포(HeLa cell)와 쥐의 조골세포계(osteoblast cell line)인 MC3T3 세포(cell)을 이용하여 실험을 진행하였다.

먼저, 미세유로 채널(300)의 내부 표면을 친수성 표면으로 만들고, 이를 지속적으로 유지시키는 처리를 한 후, 소독을 시키고 미세유로 채널(300)의 시료 주입구(230)를 이용하여 상기 세포들을 주입하였다.

그 후, 주입구(100)를 통해 자극체를 섞은 배양액을 흘려보내 세포에 양분을 공급하는 동시에 자극을 가했다.

상기 자극체로는 마이크로 비드가 사용되었으며, 선정된 마이크로 비드의 제원은 아래의 표와 같다.

종류	크기(직경)	밀도
Polystyrene	2㎛	1.05 g/㎠
Polystyrene	11㎛	1.05 g/㎠

상기 헬라 세포와 MC3T3 세포에 무리를 주지 않을 정도의 크기를 선정했으며, 상기 세포들에 과다한 자극을 주지 않는 범위 내에서 물보다 약간 높은 정도의 밀도를 택하여, 본 실시예에서는 마이크로 비드의 크기는 약 2 내지 11㎛ 로 하였으며, 밀도는 약 1.05 g/㎠으로 하였다.

상기 자극체를 섞은 배양액은 12시간 단위로 주입하였으며, 배양액의 유속은 1mm/s 로 하였다. 또한, 자극체가 섞인 배양액을 20분 동안 주입한 후, 잔류 자극체를 제거하기 위해서 깨끗한 배양액을 5분 동안 주입하였다. 이러한 과정을 반복하여 4~8 시간가량 방치하면 세포들이 증식하여 미세유로 채널(300) 내부 표면에 부착되는 모습을 관찰할 수 있다.

도 6은 이러한 과정을 통해 자극체로부터 자극받은 헬라 세포의 현미경 사진이다. 헬라 세포의 표면이 자극체로부터 많은 물리적 자극을 받았음을 알 수 있다.

도 7a 및 도 7b는 각각 헬라 세포와 MC3T3 세포의 증식에 있어서 자극체가 없는 순수 세포 배양액만 흘려보낸 세포의 배양 결과와, 2㎛ 및 11㎛ 자극체를 흘려보낸 세포의 배양 결과를 증식 속도를 기준으로 비교한 그래프이다.

도 7a 및 도 7b의 그래프에서 볼 수 있는 바와 같이, 물리적 자극체에 의해 세포들의 증식속도가 증가한다는 것을 알 수 있으며, 특히 11㎛ 자극체에 의해 자극받은 세포들이 가장 빠르게 증식했다는 사실을 확인할 수 있다.

이렇게 본 발명은 세포를 직접적으로 자극함으로써 세포 증식에 걸리는 시간을 단축시킬 수 있고, 적은 수의 세포를 이용하더라도 다양한 실험을 실시할 수 있게 한다.

또한, 복수의 세포 배양기를 작은 공간에 구비할 수 있기 때문에, 적은 양의 시료로도 다양한 실험을 수행할 수 있으며, 실험 효율을 극대화할 수 있다.

이상 본 발명의 구체적 실시형태와 관련하여 본 발명을 설명하였으나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 설명된 실시형태를 변경 또는 변형할 수 있으며, 이러한 변경 또는 변형도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본 명세서에서 설명한 각 구성요소는 당업자가 공지된 다양한 구성요소들로부터 용이하게 선택하여 대체할 수 있다. 또한 당업자는 본 명세서에서 설명된 구성요소 중 일부를 성능의 열화 없이 생략하거나 성능을 개선하기 위해 구성요소를 추가할 수 있다. 따라서 본 발명의 범위는 설명된 실시형태가 아니라 특허청구범위 및 그 균등물에 의해 결정되어야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 마이크로 비드를 이용한 세포 배양 장치를 설명하기위한 설명도이다.

도 2는 도 1의 세포 배양 장치의 일예이다.

도 3은 도 1의 마이크로 비드를 이용한 세포 배양기를 제작하는 방법의 일 실시예를 설명하는 설명도이다.

도 4는 도 1의 세포 배양기의 미세유로 채널의 단면을 모식적으로 나타낸 모식도이다.

도 5은 본 발명의 일 실시형태에 세포 배양 방법의 과정의 흐름도이다.

도 6은 본 발명의 세포 배양 방법에 따라 마이크로 비드로부터 자극받은 헬라 세포의 현미경 사진이다.

도 7a 및 도 7b는 각각 헬라 세포와 MC3T3 세포를 이용하여 본 발명의 세포 배양 방법을 수행한 결과를 증식 속도를 기준으로 나타낸 그래프이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

10: 세포 배양기

100: 주입구

110:주입튜브

300: 미세유로 채널

400: 배출구

410: 배출튜브

Claims

주입구, 미세유로 채널, 배출구로 이루어져 상기 미세유로 채널에서 동물 세포를 배양하기 위한 세포 배양기에 있어서,

상기 주입구에 장착, 탈착되도록 이루어지며, 동물 세포를 포함하는 배양액을 상기 주입구로 주입하는 제1주입튜브;

상기 주입구에 장착, 탈착되도록 이루어지며, 마이크로 비드를 포함하는 배양액을 상기 주입구로 주입하는 제2주입튜브;

상기 주입구에 장착, 탈착되도록 이루어지며, 순수 배양액(clean media)을 상기 주입구로 주입하는 제3주입튜브;

를 구비하여 이루어진 것을 특징으로 하는 동물세포의 세포배양기.
배양하고자 하는 동물 세포를 포함하는 배양액 또는 마이크로 비드를 포함하는 배양액 또는 순수 배양액을 주입하는 주입구;

그 일측이 상기 주입구에 연결되어, 상기 주입구로 부터 흘러들어온 상기 세포를 배양하며, 상기 주입구로 부터 흘러들어온 마이크로 비드가 통과하는 미세유로 채널;

상기 미세유로 채널의 다른 일측에 연결되어 있으며, 상기 미세유로 채널에서 흘러나오는 배양액 또는 마이크로 비드를 배출하는 배출구;

를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 동물세포의 세포배양기.
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 세포배양기는 PDMS(Polydimethylsiloxane)으로 이루어진 것을 특징으로 하는 동물세포의 세포배양기.
삭제
제1항에 있어서,

상기 제1주입 튜브, 상기 제2주입튜브, 상기 제3주입튜브는 실리콘(silicone)으로 이루어진 것을 특징으로 하는 동물세포의 세포배양기.
제1항에 있어서,

상기 배출구에 장착되는 배출 튜브를 더 구비하며

상기 배출 튜브는 실리콘(silicone)으로 이루어진 것을 특징으로 하는 동물세포의 세포배양기.
제3항에 있어서,

상기 세포배양기가 유리 기판상에 복수개 장착되어 이루어진 것을 특징으로 하는 동물세포의 세포배양기.
제3항에 있어서

상기 미세유로 채널에서 길이는 7mm이며, 폭은 0.5mm 이며, 높이는 0.1mm 인것을 특징으로 하는 동물세포의 세포배양기.
제3항에 있어서

상기 마이크로 비드의 종류는 폴리스티렌(Polystyrene)이며, 그 직경은 2 내지 11㎛ 인것을 특징으로 하는 동물세포의 세포배양기.
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 미세유로 채널의 일측에는 길이 표시자를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 동물세포의 세포배양기.
제1항에 있어서,

주입구에 제1주입튜브를 연결하여 미세유로 채널로 동물 세포를 포함하는 배양액을 흘린 후, 상기 세포가 자라도록 기다린 다음에, 제2주입튜브가 주입구에 연결되어 미세유로 채널로 마이크로 비드가 들어 있는 배양액을 흘리게 되고, 제3주입 튜브를 주입구에 연결하여 순수배양액을 미세유로 채널에 흘려 잔여 마이크로 비드를 배출시키도록 하여 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 동물세포의 세포배양기.
제11항에 있어서,

상기 주입구에 제1주입튜브를 연결하여 미세유로 채널로 동물 세포를 포함하는 배양액을 흘린 후, 상기 세포가 자라도록 기다리는 시간은 8 내지 12시간인 것을 특징으로 하는 동물세포의 세포배양기.
제11항에 있어서,

상기 제2주입튜브가 주입구에 연결되어 미세유로 채널로 마이크로 비드가 들어 있는 배양액을 흘리고, 제3주입 튜브를 주입구에 연결하여 순수배양액을 미세유로 채널에 흘려 잔여 마이크로 비드를 배출시키도록 하는 것을 반복하여 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 동물세포의 세포배양기.
제13항에 있어서,

상기 반복간격은 12시간인 것을 특징으로 하는 동물세포의 세포배양기.
제14항에 있어서,

총 반복회수는 5회인 것을 특징으로 하는 동물세포의 세포배양기.
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 동물 세포는 쥐의 조골세포계(osteoblast cell line)를 비롯한 뼈세포들인 것을 특징으로 하는 동물세포의 세포배양기.
미세유로 채널을 구비하는 세포 배양기를 이용하여 동물 세포를 배양하는 세포배양방법에 있어서,

상기 미세유로 채널의 내부 표면을 친수성 표면으로 처리하는 표면 처리 단계;

상기 미세유로 채널에 배양할 동물 세포를 주입하는 세포 주입 단계; 및

상기 미세유로 채널에 세포 배양액과 함께 상기 동물 세포를 물리적으로 자극시키기 위한 마이크로 비드를 주입하는 단계를 포함하는 동물세포의 세포 배양 방법.
제17항에 있어서,

상기 표면 처리 단계 이후에 상기 미세유로 채널 내부를 소독하는 내부 소독 단계를 더 포함하는 동물세포의 세포 배양 방법.
제17항에 있어서,

상기 미세유로 채널은,

실리콘 웨이퍼 상에 SU-8 를 코팅하고, 그 위에 미세유로가 형상화된 포토마스크를 덮고 노광시킨 후, 상기 포토마스크를 제거하고, 액상의 PDMS 를 주입한 후 고형화시킴으로써 제조되는 동물세포의 세포 배양 방법.
제17항에 있어서,

상기 표면 처리 단계는,

상기 미세유로 채널의 내부 표면을 O₂ 플라즈마 처리하여 친수성 표면으로 개선시키는 단계; 및

상기 미세유로 채널에 증류수를 밀어넣어 친수성 표면이 소수성 표면으로 변질되는 것을 방지하는 단계를 포함하는 동물세포의 세포 배양 방법.
제17항에 있어서,

상기 동물 세포는 인간 암세포(HeLa Cell), 쥐의 조골세포계(osteoblast cell line)인 MC3T3 세포(cell), 또는 뼈세포인 것을 특징으로 하는 동물세포의 세포 배양 방법.
삭제
제17항에 있어서,

상기 세포 배양액과 상기 마이크로 비드를 주입하는 단계는,

상기 마이크로 비드가 섞인 세포 배양액을 12시간 단위로 주입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물세포의 세포 배양 방법.