KR101747378B1

KR101747378B1 - 단방향성 신경축삭의 3차원 배양을 위한 미세유체장치

Info

Publication number: KR101747378B1
Application number: KR1020140083944A
Authority: KR
Inventors: 전누리; 트렁; 장재명; 방석영
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-07-04
Filing date: 2014-07-04
Publication date: 2017-06-15
Also published as: KR20160005279A

Abstract

본 발명은 3차원 미세유체 배양 플랫폼 및 이를 이용한 젤 정렬 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 정렬된 젤 내에서 배양하여 일정한 방향성을 갖는 축삭 및 이의 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 특별한 장치 및 추가적인 재료 없이 미세유체 장치 내에서 매트리젤을 간단히 정렬할 수 있다. 본 발명에 따라 정렬된 젤 내에서 배양된 신경구세포는 축삭을 완벽하게 직선 형태로 진행시킬 수 있으며, 신경 줄기세포에서 유래한 축삭(axon)의 3차원 배양을 실시할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 젤 정렬은 세포 신호전달, 이동, 조직 공학용 분화에 적용할 수 있다.

Description

단방향성 신경축삭의 3차원 배양을 위한 미세유체장치{Three-dimensional Microfluidic device for culturing unidirectional neuron axon}

본 발명은 단방향성 신경축삭 배양을 위한 3차원 미세유체 장치에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 미세유체장치 내에 구비된 젤에서 신경축삭을 직진의 단방향성으로 성장시키는 방법 및 이에 의해 제조된 단방향성으로 직렬 배열된 신경축삭에 관한 것이다.

뇌는 축삭(axon)을 통해 신체 내 기관과 구조를 조절하고 조정하며, 세포 및 분자 수준에서 여러 축삭의 연결성을 이해하는 것은 뇌 과학에서 매우 중요하다. 이에 생체 외에서 신경세포를 배양하고자 하는 연구가 20세기 초부터 시작되었고 생체 외에서 뉴런을 배양하고, 관찰하며, 성장시키고자 하는 다양한 방법들이 보고되었으며, 현적배양법(hanging drop)과 같은 배양기술, 카렐 플라스크 및 롤러 튜브 같은 배양 도구들이 개발되었다. 또한, 배양된 세포의 시각화 및 배지 교환을 개선하기 위한 수단으로, 여러 형태의 슬라이드 챔버가 제작되었다. 이들 챔버들 중, Furshpand 등에 의해 1976년에 개발한 미세섬(micro island) 배양 챔버 및 1977년에 개발된 캠페놋(campenot) 챔버는 종래방법보다 더 향상된 조건에서 뉴런을 탐지, 조절 및 배양할 수 있도록 하였다 [비특허문헌 1, 비특허문헌 2]. 미세섬배양은 300 ㎛ 내지 500 ㎛ 범위의 작은 섬으로 구성된다. Furshpand 등은 미세섬 기질 상에서 교감신경 뉴런과 심근세포 사이의 세포 간 물리적 상호작용을 제한함으로써, 신경근 연결을 완성하였다 [비특허문헌 1]. 한편, 캠페놋챔버는 래트 상경 신경절의 신경세포체를 신경염 (neuritis)으로부터 분리하기 위해 테플론분리기(Teflon divider)를 사용한다. 미세유체 장치의 개발은 개별적인 뉴런과 이의 개별적인 신경염을 둘러싸는 미세환경에 대한 고해상도의 시공간적 조절에 대한 필요성을 충족시켰다. 케럴플라스크 또는 페트리디쉬를 사용하는 종래방법과 달리, 미세유체 장치는 뉴런 환경을 유체학적으로 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 생체 외에서 뇌층(brain layer)을 모방하는 축삭 분리, 신경근 연결, 지향성 신경회로를 제공한다. 이러한 미세유체 장치는 증가된 실험적 복잡성을 조절하고 미세환경 조작을 가능하게 하였다.

그러나, 뇌 및 이의 신경계는 3차원 환경 상에서 형태 및 구조적 특성을 가지는 바, 2차원 세포배양을 얻어지는 생리학적, 생물학적 및 유전학적 지식은, 이들의 생체 내 특성을 실질적으로 제시할 수 없다. 또한, 최근의 연구는 배양의 차원이 세포행동에 영향을 미치며, 2차원 세포배양보다 3차원 세포배양이 생체 내와 유사한 세포 행동을 모방할 수 있음을 보고한 바 있다. 이러한 결과는 2차원 미세유체 배양에도 적용된다. 미세유체 플랫폼 내 분자기질은 실제 뇌에서 발견되는 세포 외 매트릭스를 정확하게 표현하지 못한다. 따라서, 다수의 복잡한 생물학적 반응, 세포이동 및 세포사멸은 실제 뇌 또는 신경조직에서는 생체 외와 비교하여 현저히 다를 수 있다. 이러한 한계점을 극복하기 위해, 젤과 같은 매트릭스 소재를 사용하는 다수의 3차원 배양모델이 3차원 방향성을 모방하기 위해 연구되었다. 2007년 LaPlaca MC 등은 분리된 1차 세포 및 매트릭스 소재를 혼합하여 3차원 뉴런 배양을 위한 활성화된 미세유체 시스템을 개발한 바 있다 [비특허문헌 3]. 또한, Renaud P 등은 미세유체 채널이 층을 형성한 젤 스캐폴드와 쉽게 결합될 수 있다는 아이디어를 기반으로 교차층 배아 래트 피질 뉴런을 완성한 바 있다 [비특허문헌 4]. 그러나, 이들 미세유체 플랫폼 내 3차원 배양은 세포와 매트릭스간 상호작용에만 의존하고, 축삭이 뇌에서 발견되는 것보다 더 무질서하게 성장하도록 하였다. 이와 같이, 종래 미세유체 장치를 이용한 3차원 신경축삭 배양기술은, 배양된 축삭이 배양 중 서로 무질서하게 얽히고, 이에 따라 축삭들 간에 서로 구분이 어렵다는 문제가 있어 왔다.

이에 본 발명자들은 생체 내에서 배양된 신경축삭과 유사하게 일정한 방향성을 갖는 신경축삭을 배양하기 위한 3차원 미세유체장치를 개발하고자 노력하였다. 본 발명자들은 미세유체 내에서 직선형 패턴을 갖도록 제작한 젤 내에서 신경축삭을 배양한 결과, 신경축삭이 젤 조직의 직선형 패턴을 따라 직진의 단방향성 배열을 형성하며 배양된 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

Ruiz A, Biomaterals, 2008, 29, 4766~4774. Hurtado A, Biomaterials, 2011, 32, 6068~6079 Cullen DK, Ann Biomed Eng, 2007, 35, 835~846. Kunze A, Biomaterials, 2011, 32, 2088~2098.

이와 같이, 본 발명의 목적은 생체 외에서 단방향성 배열을 갖는 신경축삭 (axon)을 배양하기 위한 3차원 미세유체 장치를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 생체 외에서 배양된 단방향성 배열을 갖는 신경축삭을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 미세유체장치 내에 축삭 배양을 위한 젤을 포함하는 미세유체 장치를 제공한다.

본 발명에서 상기 미세유체장치는, 리저버(100), 배양채널(200), 및 연결채널(300)을 포함하고, 상기 배양채널은 젤(210)이 로딩되어 채워지며, 연결채널(300)의 말단은 리저버(100)와 접하여 유체간 상호작용(fluid communication) 할 수 있다. 또한, 연결채널(300)의 일 측면의 일부는 배양채널(200)의 일 측면의 일부와 접하며, 연결채널(300)과 배양채널(200)이 접하는 경계면을 따라 포스트(400)가 배열되어, 상호 간에 유체의 이동이 방지되면서 화학물질 또는 생화학적 물질이 교환 될 수 있다. 연결채널과 배양채널 간의 유체의 이동을 효과적으로 방지하기 위해서는, 포스트 사이의 간격이 채널의 높이보다 좁아야 한다(도 1b). 일 양태에서, 채널의 높이가 250 ㎛, 배양채널의 폭이 1,000 ㎛ 및 포스트 간격 100 ㎛인 미세유체 장치가 실험에 이용되었다. 리저버(100)에는 세포증식에 필요한 배지가 공급된다.

본 발명은 일 구체예에서, 축삭 배양을 위한 젤을 포함하는 미세유체장치를 제조하는 방법을 제공한다. 즉, 리저버(100), 배양채널(200) 및 연결채널(300)으로 구성된 미세유체플랫폼을 제작한 후, 상기 플랫폼 내의 배양채널(200)에 신경축삭의 증식 및 길이성장을 위한 젤을 로딩하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 일 양태에서, i) 포토리소그래피 기술을 사용하여 음성 포토레지스트인 SU-8로부터 마스터를 제작하고, 실리콘웨이퍼 상에 마스크를 설계하며; ii) 상기 마스터에 소프트리소그래피 기술을 이용하여 폴리디메틸실록산(PDMS)을 덮은 후 경화시키고; iii) PDMS를 제거한 후 유리 커버슬립과 결합시킨 다음, 에어플라즈마 공정을 통해 미세유체 플랫폼을 제작하고; iv) 상기 미세유체 플랫폼을 2 내지 5분, 바람직하게는 약 3분간, 자외선 조사하여 멸균한 후 얼음에서 냉각시키며; v) 액체 상태의 감소된 성장인자(RGF, Reduced Growth Factor, RGF)를 함유하는 젤(210)을 상기 냉각된 미세유체플랫폼의 배양채널(200)에 로딩하고, 젤이 굳는데 필요한 일정 시간, 바람직하게는, 3 내지 10분간 미세유체 장치를 세워두며; vi) 37℃에서 40분 내지 2시간, 바람직하게는 약 60 분간 젤화 시키면서 미세유체 플랫폼 내의 젤 조직을 직진의 단방향성으로 배열시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 배양채널(200) 내의 직선형 패턴을 지닌 젤 조직은 그 정렬된 중심방향(0°)을 기준으로 ±15°범위 내에 집중 분포된 방향성을 갖는다.

다른 일 구체예는, 본 발명의 3차원 미세유체장치에서 생체 외 배양된 직진의 단방향성으로 배열된 신경축삭으로서, 축삭이 배열 중심방향(0°)을 기준으로 ±10° 범위 내에 분포된 직진 방향성을 갖는 축삭이 제공된다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 생체 외 신경축삭 배양을 위한 젤 또는 매트리젤(matrigel)은, 마우스 내 Englebreth-Holm-Swarm(EHS) 종양으로부터 추출된 세포외기질(ECM) 단백질을 포함한다. 상기 매트리젤은 자체-재생 및 전분화능을 유지하는, 줄기세포 배양에 가장 적합한 매트릭스로써 이용될 수 있고, 확인된 1,851종의 단백질 중, 라미닌(800,000 Da), 콜라겐 IV(540,000 Da) 및 Enactin(158,000 Da)은 매트리젤 구조를 구성하는 주요한 요소들이다. 매트리젤은 염기성 섬유아세포성장인자(b-FGF), 상피세포성장인자(EGF), 인슐린-유사성장인자-1(IGF-1), 혈소판-유래성장인자(PDGF), 형질전환(transforming) 성장인자 베타(TGF-β) 및 신경성장인자(NGF)와 같은 다수의 성장인자를 포함할 수 있다. 신경축삭을 배양하는 경우, 성장인자가 축삭 성장에 영향을 주므로, 감소된 성장인자(Reduced Growth Factor, RGF) 매트리젤이 사용될 수 있다. 본 발명에서는 이처럼 감소된 성장인자 매트리젤을 실험에 사용하였다.

본 발명에서, "신경구체(neurosphere)"는 이식 및 뉴런 세포연구를 위한 줄기세포원으로 사용되는 세포이다.

본 발명에서, "화학물질 또는 생화학적 물질"은 화학화합물(chemical compound), 펩티드, 폴리펩티드, 당류, 지질, 단백질, 항체 또는 항원 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "정렬" 또는 "배열"은 하나 이상의 직선형 패턴 또는 직진의 단방향성 축삭(들)이 거의 동일한 방향성을 유지하며 나란히 배치된 형태를 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명에서 "포스트"는 기판에서 돌출된 구조를 갖는 것으로서, 복수 개의 포스트가 채널 높이보다 좁은 간격을 형성하며 배양채널과 연결채널이 접하는 경계면에 일렬 배열된다.

본 발명에서 "단방향성"은 정방향 또는 직진방향을 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명에 따른, 신경축삭 배양을 위한 젤을 함유하는 미세유체장치 내에서 배양된 신경세포는, 직진의 단 방향성으로 배열된 축삭을 거의 완벽한 직선 형태로 성장시킬 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 미세유체장치는 신경 줄기세포에서 유래한 축삭(axon)의 3차원 배양을 효과적으로 실현할 수 있다. 따라서, 본 발명의 미세유체장치는 생체 내에서와 유사한 특성을 갖도록 축삭을 배양할 수 있으며, 이는 세포 신호전달, 세포이동, 및 조직 공학용 분화 등의 연구에 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 미세유체장치 및 축삭 단방향성 배열에 관한 것으로, 도 1a는 미세유체 장치의 구조를 나타낸 것이고, 도 1b는 직선형 패턴이 배열된 젤 조직, 및 직진의 단방향성으로 배열된 신경축삭을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 미세유체장치의 최적화된 설계를 위한 유체 시뮬레이션을 나타낸 것이다. 도 2a는 다양한 높이 및 넓이를 갖는 채널에서 유속을 나타낸 그래프이다 (청색선 ●: 물의 유속; 녹색선 ▼: 매트리젤의 유속; 적색선 ○: 매트리젤 및 물의 유속). 도 2b는 전체 채널 내 유체의 방향 및 말단부와 중간 부분의 차이점을 나타낸 것이다.
도 3은 직선형 패턴의 배열을 지닌 조직을 갖는 젤을 제작하는 공정을 나타낸 도면이다. 도 3a 내지 도 3c는 포토리소그래피 및 소프트리소그래피 공정을 나타내고, 도 3d 내지 도 3e는 얼음 위(4 ℃)에서 젤을 주입하는 공정을 나타내며, 도 3f는 젤 조직의 직선형 패턴화를 위해 미세유체장치를 얼음 상에서 수직으로 기울인 것으로 나타내고, 도 3g는 상부 리저버(100)에 배지를 첨가하는 것을 나타내며, 도 3h는 직선형 패턴 배열이 형성된 젤 조직을 갖는 미세유체장치를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 매트리젤 구조를 나타낸 현미경 사진이다. 도 4a는 패턴화 되지 않은 조직을 갖는 매트리젤 및 이에 대한 콜라겐 IV 염색결과를 나타내고, 도 4b는 직선형으로 패턴화된 조직을 갖는 매트리젤 및 이에 대한 콜라겐 IV 염색결과를 나타낸 것이다. 도 4c는 직선형 패턴이 배열된 조직을 갖는 젤 및 패턴화되지 않은 조직을 갖는 젤에서, 정렬 중심방향(0°)을 기준으로 분포된 방향성을 각각 나타낸 것이다.
도 5는 매트리젤 내에서 배양된 축삭의 증식 및 길이성장을 나타낸 것이다. 도 5a 및 도 5b는 패턴화되지 않은 조직을 갖는 젤 내에서 무질서한 축삭의 증식 및 이에 대한 젤과 축삭의 방향성 분포도 (±90°내 10% 미만)를 나타낸다. 도 5c 및 도 5d는 직선형 패턴화 조직을 갖는 젤 내에 형성된 직진의 단방향성 축삭의 배열 및 이에 대한 젤과 축삭의 방향성 분포도 (중심방향을 기준으로 ±10°내에 75% 축삭이 증식되고 분포함)를 나타낸 것이다.
도 6은 다른 세포에서 축삭의 배열을 나타내는 것이다. 도 6a는 전체 채널 내에 배열된 축삭의 사진을 나타낸 것이고, 도 6b는 마우스 신경 세포체에서 배열된 축삭을 나타내며, 도 6c는 래트 피질 뉴런에서 배열된 축삭을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

미세유체 뉴런 배양 플랫폼

1.1 미세유체 장치의 개요

젤 및 미세유체장치를 제조하였다(도 1). 젤 형성은 젤이 채워지는 공간에 의존하므로, 미세채널의 구조는 직선형 패턴화되는 젤 조직 및 젤 구조에 중요한 작용을 한다. 유량(flow rate) 및 속도는 미세채널의 차원(크기) 및 젤 특성에 의해 제한되며, 시뮬레이션 소프트웨어를 사용하여 적합한 채널 크기를 계산할 수 있다(도 2). 매트리젤의 특성 및 배지에 의한 압력 인가를 고려하고, 채널의 높이와 폭이 유량에 미치는 영향의 경향성을 판단하였다(도 2a). 배양 차원(크기)은 이러한 경향성의 수치에 따라 결정하였고, 유량은 부위에 따라 다른 결과를 제시하였다. 채널 중간부는 층류를 제공하였으나. 말단부는 다른 형태로 변환되었다. 말단 부의 축삭성장을 배제하고, 연결영역(union area) 즉, 배양채널과 연결채널이 접하는 경계면의 중간 부분에서의 결과를 분석하였다(도 2b).

포토리소그래피(Photolithography) 및 소프트리소그래피(soft-lithography) 기술은 미세유체플랫폼 제작에 일반적으로 사용되는 기술이다. 본 발명자들은 포토리소그래피 장비를 사용하여 일종의 음성 포토레지스트인 SU-8로부터 마스터를 제작하고, 실리콘웨이퍼 상에 마스크를 설계하였다(도 3a). 다음, SU-8 마스터를 폴리디메틸실록산(PDMS) 및 소프트리소그래피 기술을 사용하여 덮었다. 경화시킨 후, PDMS를 제거하고 유리 커버슬립과 결합시킨 다음 에어플라즈마 공정을 통해 미세유체 플랫폼을 완성하였다(도 3b). 제작된 플랫폼을 젤 로딩 및 세포배양 전에 3분간 자외선 조사하여 멸균하였다(도 3c). 젤의 제조를 위해, 프리-폴리머 온도(약 4℃)에서 매트리젤을 녹여서 고정시켰다. 상기 온도에서, RGF 매트리젤은 액체상태를 유지하였고, 채널 내로 주입하기에 용이하였다. 또한, 유리 커버슬립과 결합된 멸균된 미세유체플랫폼은, 젤 주입 전에 얼음에서 냉각시켰다(도 3d). 액체 상태의 RGF 매트리젤을 배양채널(200)에 로딩하고, 상부 리저버(100) 내에 배지를 첨가하기 전에, 5분간 미세유체플랫폼을 수직으로 세워두었다(도 3e ~ 3g). 대기 시간은 젤의 안정화 및 강도형성에 필요하였고, 이를 통해 배지가 젤 내에서 부분적으로 누출되지 않았다. 배지의 흐름은 배지 안정화 후에 전체 채널 내에서 젤 조직(구조)에 침투함과 동시에 젤 조직을 변형시켰다. 젤화, 즉 프리-폴리머 시점부터 젤화 시점까지, 미세유체플랫폼을 37℃ 배양기 내에서 수직으로 유지시켰다. 37℃로 유지되는 동안, 매트리젤은 직선형으로 패턴화된 젤 조직을 형성하며 굳어지기 시작하였다. 1시간 후에, 직선형으로 패턴화된 조직을 갖는 젤을 포함하는 미세유체장치를 수득하였으며, 이를 다음 실험에 사용하였다(도 3h).

1.2 세포 배양

직선형으로 패턴화된 젤 조직을 포함하는 미세유체장치 내에서 뉴런의 분화 및 축삭 성장을 위해 신경구체를 배양하였다. 신피질 부위 내 마우스 배아 뇌(TP 12.5, 입수처: 코아텍(031-611-8221))에서 유래된 신경구체를 배양하였다. 단일 줄기세포는 구체(sphere)의 크기를 균일하게 하려는 목적으로 마이크로-웰 하이드로젤 플레이트 내에서 신경구세포 배양 배지를 사용하여 배양하였다. 상기 배지는 5가지 주요 인자인 DMEM, B27(1X), N2보조제(1X), EGF(20ng/㎖) 및 b-FGF(10ng/㎖)을 포함하였다. 구체는 2시간 후에 형성되었고 4일째에 100 ~ 200 ㎛ 직경으로 성장하였다. 5일째, 여러 구체들의 균일한 크기는 평균직경 250 ㎛ 도달하였다. 수거한 신경구체를 배열된 젤 채널로 도입하고 세포분화를 위해 EGF 및 b-FGF 없이 연속 배양하였다. 1일 후에, 젤 말단 위치에서 초기 축삭을 관찰하였다. 5일째, 축삭을 고정하고, 신경 마커 항체를 사용하여 축삭을 표지 한 후 공초점현미경으로 표지 된 이미지를 획득하였다.

다음, 래트 배아 뇌(TP17)로부터 유래된 1차 세포(primary cell) (입수처: 코아텍(031-611-8221))를 다른 세포 원으로서 사용하였다. 절개 후, 피질세포(세포밀도 5×10⁶ 세포/㎖)는 뉴런 기본 배지(NBM), 글루타맥스(glutamx, 2mM) 및 B27(2%)를 갖추어 정렬시킨 젤 모델 내에서 배양하였다. 하루 후에, 미세유체 장치 내에서 축삭의 돌출이 관찰되었고, 이를 계수하였다. 모든 축삭을 Tuj-1 항체로 표지하고, 공초점현미경으로 포획하였다.

1.3 표지 및 젤 고정

세포를 배양하여 제조한 시료를 PBS 중 4% 포름알데히드 내에서 10분간 고정시켰다. 그 후에, 상기 시료는 PBS 중 0.5% 트리톤 X-100 내에서 5분간 투과성 상태로 만들었다. 세포를 블로킹 완충액 내에서 15분간 배양하였다. 다음, 뉴런 마커에 대해서는 마우스 단일클론 항체 Tuj-1(뉴런-특이 종 III 베타-튜블린, 1:100)(입수처: SigmaAldrich, US)을, 성상세포 마커에 대해서는 신경교섬유 산성 단백질(GFAP, 1:80)(입수처: SigmaAldrich, US)을, 세포 핵에 대해서는 DAPI)(입수처: Life Technologies, US)를 사용하여 시료를 염색하였다. 한편, 시료는 항-콜라겐 IV 항체(1:100)를 사용하여 염색하였는데, 콜라겐 IV 항체는 매트리젤 내 콜라겐 섬유 및 콜라겐 구조를 탐지하기 위해 사용하였다.

또한, 젤 고정 공정은 형광표지방법을 사용하지 않고 젤 구조(조직)을 관찰하기 위해 실시하였다. 직선형으로 패턴화된 시료에서 배지는 흡입하여 완전히 제거하였고 PBS를 사용하여 5분씩 2회 세척하였다. 그 후에, 3가지 다른 농도의 에탄올 용매(50%, 70% 및 99%)를 사용하여 매트리젤을 고정하였다. 각각의 농도는 상온에서 5분간 유지하였다. 탈수공정은 99% 알코올을 사용하여 매우 빠르게 진행하였다. 젤 구조를 역상현미경(IX81, Olympus)을 사용하여 수득하였다.

1.4 이미지 획득 및 자료 분석

신경돌기 증식물(outgrowth)은 뉴런세포가 살아 있음을 나타내는 기초적인 증거이다. 증식물은 세포배양 기간(5 및 12 DIV(day in vitro))중에 미분간섭현미경(DIC, different interference contrast)을 사용하여 분석하였다. Tujβ-3, GFAP 및 DAPI 항체의 형광이미지는 올림푸스 공초점현미경을 사용하여 나타내었다. 이미지 J 소프트웨어 분석기를 사용하여, 각각의 시료 상에서 축삭 증식물 및 가용할 수 있는 세포를 확인하고 계수하였다. 정렬 정도를 측정하기 위해, 커브 정렬(curve align) 탐지법 및 Hugh 변형 탐색법(Matlab 소프트웨어 기반의 2가지 소프트웨어 사용)을 사용하였다. 이러한 탐색을 기반으로, 패턴화되지 않은 젤 시료와 직선형 패턴 배열을 갖는 젤 시료 간의 방향성 각도 측정 및 기타 자료를 계산하였다. 모든 비교 결과는 t-테스트 분석으로 검사하였다.

젤 정렬

젤 중합화 후에, 패턴화되지 않은 젤 시료 및 직선형 패턴 배열을 지닌 젤 시료에 대하여 이들의 구조를 관찰하였다. 젤 구조는 2가지 탐색법(에탄올세척 및 콜라겐IV 염색)으로 나타냈다. 에탄올 세척법을 사용하여, 매트리젤 구조를 탈수시키고, 그 스캐폴드(지지체)가 드러나게 했다. 방향성 없이, 젤 구조는 다중-상의 복잡한 배치를 나타내었다. 이와 유사하게, 콜라겐 IV 섬유는 형광의 무질서한 지지체를 제시했다. 정렬 중심방향(0°)을 기준으로 분산된 각도의 평균값은 전 범위(±90°)에 걸쳐 분산되었고 빈도 분포는 10% 미만이었다. 대조적으로, 직선화 패턴 배열을 지닌 젤 시료는 -15°부터 15°까지 약 20%의 높은 분포도 및 ±5°에서 가장 높은 집중도(30%)를 보였다(도 4a-현미경 사진, 4b-도수 분포). 또한, 같은 결과를 직선형 패턴화된 콜라겐 IV 섬유를 사용하여 수득하였다. 직선형으로 패턴화된 젤 내에서, 대부분의 섬유(70%)는 방향성이 있었고, 나머지는 각각의 각도에 있어 5% 미만으로 분산 분포하였다.

본 발명의 장치는 젤 형성 시간 중 젤 내부 조직에 급속히 발생된 층류(laminar flow)를 갖는다. 이러한 흐름은 찢고, 확장하며 회전하는 공정에 의해 이방성 구조를 등방성 구조로 변환시킬 수 있다.

축삭 정렬

균일한 신경구체를 수거한 후, 이를 배양채널(200)에 채워진 매트리젤로 주입하였다. 세포 시딩(seeding) 24시간 후 5일간 배양한 후, 세포를 다른 시료 상에 고정, 표지 및 부착시켰다. 축삭을 Tuj-1 항체로 표지하고 핵은 DAPI로 염색하였다. 신경구체-유래 뉴런으로부터의 직렬 배열된 성장 및 축삭의 확장을 측정하고 컴퍼스 플롯(compass plot)으로 나타내었다. 축삭의 각도 및 양을 그래프 상에서 다르게 표시하였다. 정렬 중심방향(0°방향)을 기준으로, 각도 분포는 10% 미만인 전체 범위(-90°내지 90°) 내에서 비슷하였지만, 정렬된 분포(-10°내지 10°)는 20% 이상이었다. 좁은 각도(대략 10°) 범위 내의 높은 집중도는 직선형 패턴 배열된 젤 내에서 직진의 단방향성 축삭의 배열을 제시하였다(도 5). 상기 결과는 잘 배열되고 확장된 축삭을 나타내었다. 축삭의 배열을 매트리젤 구조의 배열과 비교하였다. 패턴이 없는 경우, 젤 섬유조직 및 축삭은 무질서한 방향성을 가질 것이다. 매트리젤의 조직이 일렬로 정렬된 플랫폼 상에서, 방향성의 정렬 범위의 분포는 정렬 중심방향(0°)을 기준으로 ±10°범위 내에 있음이 확인되었다.

젤 조직의 직선형 패턴화 배열이 다른 세포 종에도 활용할 수 있는지 확인하기 위해, 마우스 배아 뇌(TP 12.5)에서 유래된 신경구체를 직선형 패턴 배열을 갖는 조직으로 구성된 매트리젤에 도입하였다. 신경구체 유래 뉴런에 의해 성장시킨(projected) 축삭은 배양 12일 후에 측정하였다. 직진의 단방향성 배열에서 방향성 평균 값을 정렬되지 않은 방향성과 비교하였다(도 6a). 또한, 형광염료를 사용하여, 방향성을 따라 이동하는 신경교세포의 분화를 인식할 수 있다. 신경구체는 젤 내에서 직진의 단방향성 배열의 증식, 이동 및 분화에 대한 잠재능력을 보여주었다. 직선형 패턴 배열을 지닌 조직을 갖는 젤 내에서, 뉴런 분화가 향상될 수 있고, 신경교세포의 이동 또한 젤 내 섬유조직에 의해서 변화될 수 있었다. 피질세포를 같은 방식으로 배양하면, 직진의 단방향성으로 배열된 축삭이 직선형 패턴 배열 조직을 갖는 매트리젤 내에서 형성되었다. 이러한 결과는 3차원 배양에서 축삭이 직진 단방향성으로 길이성장 하는 것을 유도하는데 있어 매우 유용한 방법을 제시한다(도 6b. 도 6c).

지금까지 예시적인 실시예를 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시예로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

100: 리저버
200: 배양채널
210: 젤
300: 연결채널
400: 포스트

Claims

리저버, 연결채널 및 배양채널로 구성된 미세유체장치로서,
상기 연결채널의 말단부는 상기 리저버와 유체간 상호작용(fluid communication)할 수 있도록 연결되고;
상기 배양채널의 일 측면의 일부와 상기 연결채널의 일 측면의 일부가 접하여 경계면을 형성하며, 상기 경계면에 포스트가 배열되고; 및
상기 배양채널에 세포배양을 위한 젤(gel)이 로딩되고, 상기 젤은 직선형으로 패턴화된 조직을 갖는 것인,
생체 외 3차원 세포배양을 위한 미세유체장치.
제 1항에 있어서,
상기 패턴화된 조직의 90% 이상이, 정렬된 중심방향(0°)을 기준으로 ±20°범위 내에 분포된 방향성을 갖는 것을 특징으로 하는, 생체 외 3차원 세포배양을 위한 미세유체장치.
제 2항에 있어서,
상기 패턴화된 조직의 90% 이상이, 정렬된 중심방향(0°)을 기준으로 ±15°범위 내에 분포된 방향성을 갖는 것을 특징으로 하는, 생체 외 3차원 세포배양을 위한 미세유체장치.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
세포가 신경세포인 것을 특징으로 하는, 생체 외 3차원 세포배양을 위한 미세유체장치.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 젤이 염기성 섬유아세포 성장인자(b-FGF), 상피세포성장인자(EGF), 인슐린-유사성장인자-1(IGF-1), 혈소판-유래성장인자(PDGF), 형질전환성장인자 베타(TGF-β) 및 신경성장인자(NGF)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장인자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체 외 3차원 세포배양을 위한 미세유체장치.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 젤이 감소된 성장인자(Reduced Growth Factor, RGF)를 포함하는 것인, 생체 외 3차원 세포배양을 위한 미세유체장치.
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i) 기판 상에 리저버, 연결채널 및 배양채널로 구성되고, 상기 연결채널의 말단부는 상기 리저버와 유체간 상호작용(fluid communication)할 수 있도록 연결되고, 상기 배양채널의 일 측면의 일부와 상기 연결채널의 일 측면의 일부가 접하여 경계면이 형성되며, 상기 경계면에 포스트가 배열되도록 장치를 형성시키고;
ii) 상기 배양채널에 액상의 젤을 로딩하며;
iii) 상기 액상의 젤이 경화되는 동안, 상기 액상의 젤이 상기 배양 채널에서 배지가 흐르는 방향과 수직 방향으로 직선형 패턴이 형성되도록 상기 기판을 기울이는 것을 포함하는, 생체 외 3차원 세포배양을 위한 미세유체장치의 제조방법.
제 11항에 있어서,
상기 iii)에서 액상 젤이 경화되기 전에 배양채널 상부의 리저버에 세포배양을 위한 배지를 가하는 것을 추가로 포함하는, 생체 외 3차원 세포배양을 위한 미세유체장치의 제조방법.
제 11항에 있어서,
상기 젤이 염기성 섬유아세포 성장인자(b-FGF), 상피세포성장인자(EGF), 인슐린-유사성장인자-1(IGF-1), 혈소판-유래성장인자(PDGF), 형질전환성장인자 베타(TGF-β) 및 신경성장인자(NGF)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장인자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체 외 3차원 세포배양을 위한 미세유체장치의 제조방법.
제 11항에 있어서,
상기 ii)에서 액상의 젤이 감소된 성장인자(RGF, Reduced Growth Factor, RGF)를 함유하는 것을 특징으로 하는, 생체 외 3차원 세포배양을 위한 미세유체장치의 제조방법.
제 11항의 방법에 따라 제조한, 생체 외 3차원 세포배양을 위한 미세유체장치.